SK282516B6

SK282516B6 - Farmaceutický prípravok na liečenie pacientov s predĺženým časom zrážania krvi

Info

Publication number: SK282516B6
Application number: SK428-93A
Authority: SK
Inventors: Ole Nordfang; Ulla Hedner; Niels Peter Hundahl Moller
Original assignee: Novo Nordisk A/S
Priority date: 1990-10-31
Filing date: 1991-10-18
Publication date: 2002-10-08
Also published as: ES2083597T3; RU2127600C1; DE69116380D1; DK0558529T3; EP0558529A1; UA35567C2; SK42893A3; AU657926B2; ATE132757T1; GR3019514T3; AU8871191A; DK261490D0; CZ282497B6; HU9301253D0; WO1992007584A1; CA2095356A1; DE69116380T2; EP0558529B1; HUT64236A; CZ78693A3

Abstract

Farmaceutický prípravok, ktorý obsahuje ako aktívnu zložku činidlo, ktoré blokuje účinnosť EPI, teda inhibítora vonkajšej koagulačnej dráhy, a to na použitie pri liečbe pacientov s predĺženým koagulačným časom.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka farmaceutického prípravku na liečenie pacientov s predĺženým časom zrážania krvi, ktorý blokuje inhibítor vonkajšej cesty (EPI, Extrinsic pathway inhibitor), ako aj použitia účinnej zložky na výrobu takýchto prípravkov, ktoré môžu ovplyvniť hemostatickú rovnováhu.

Doterajší stav techniky

Koagulácia je veľmi zložitý postup, zahŕňajúci početné proteínové faktory. Taký koagulačný postup sa môže začať vnútornou cestou stykom s cudzím povrchom alebo vnútornou cestou stykom s poškodeným tkanivom. Vonkajším aktivovaním sa cirkulujúca krv dostáva do styku s tkanivovým faktorom (TF, tissue factor). Je to kofaktor koagulačného faktora VII (F VII) a komplex TF-F VII/TF-F Vila aktivuje F X a F IX. V dôsledku aktivovania F IX je „vnútorná koagulácia“ rovnako ovplyvnená aktivovaním TF; zvyšujúci sa počet dôkazov vedie k názoru, že aktivovanie TF-F VII je najdôležitejšie na začatie koagulačnej reakcie, pozri Ôsterud a Rapaport, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5260 (1977). Koagulačné faktory vonkajšej cesty sú inhibované pôsobením EPI (inhibítora vonkajšej cesty), niekedy tiež pôsobením LACI (koagulačného inhibítora združeného s lipoproteínom), pozri Broze a Miletich, Blood 69, 150 (1987). EPI je proteázový inhibítor typu Kunitz, ktorý viaže a inbihuje koagulačný faktor F Xa. Komplex EPI-F Xa inhibuje F VIIa-TF, pozri Rapaport, Blood 73, 350 (1989). Význam EPI pre koagulačnú reakciu nebol doposiaľ vyhodnotený, pretože pri bežných koagulačných testoch sa prejavujú len nefyziologicky vysoké koncentrácie, pozri Broze a spol., Biochemistry 29, 7539 (1990). Účinnosť EPI sa teda meria sofistickými testami, kedy sa umožní, aby sa EPI naviazal na koagulačný faktor F Xa, a sústava EPI-F Xa sa pridá k reakčnej zložke TF-F VII, ktorá môže aktivovať F IX alebo F X, pozri Bajaj a spol., Clin. Invest. 70, 1974 (1987); Sandset a spol., Thromb Res. 47, 389 (1987).

Pri normálnej zástave krvácania sú koagulačné faktory vzájomne v rovnováhe alebo za niektorých okolností možno pozorovať nadmerné krvácanie a ako príklady možno uviesť: hemofíliu (dedičné krvácanie), spôsobenú tým, že chýba F VIII alebo F IX, idiopatickú trombocytopéniu (nedostatok krvných doštičiek), tzv. ITP (Idiopatic Thrombocytopénia), ktorá je spôsobená zmenšeným počtom krvných doštičiek. Tiež niektoré chirurgické zákroky sú častokrát spojené s nadmerným krvácaním. Ako príklady činidiel, ktoré sa dajú použiť pri prevencii krvácania, možno uviesť: FIX, F VIII, F Vila, aprotinín a kyselinu tranexamovú.

Podstata vynálezu

Tento vynález dokazuje, že činidlá, ktoré blokujú EPI aktivitu sú rovnako schopné znižovať tendencie ku krvácaniu. To je prekvapujúce, pretože doposiaľ nebolo poukázané na to, že by EPI mohlo ovplyvniť samé osebe hemostatickú rovnováhu. Ale urobili sa tieto závažné pozorovania:

1. Pri koagulačnom teste je plazma - EPI účinnejšia ako EPI pripravený rekombinantnou technikou (rEPI).

2. Koagulovanie v dôsledku veľmi zriedeného TF je závislé od plazmy - EPI a tak EPI ovplyvňuje hemostatickú rovnováhu.

3. Antilátky, ktoré blokujú účinnosť EPI (tzv. anti-EPI) skracujú koagulačný čas normálnej plazmy.

4. Anti-EPI skracuje koagulačný čas hemofilickej plazmy.

Z týchto pozorovaní je možno odvodiť, že blokovanie EPI sa prejaví znížením tendencie ku krvácaniu.

Skôr bolo možné jedine urýchlenie koagulačného procesu v normálnej plazme pridaním koagulačného iniciátora (tkanivový faktor, kaolín atď.) alebo aktívneho enzýmu (trombín, F Xa atď.). Podľa našich pokusov je jasné, že je tiež možné urýchliť koagulačný postup blokovaním proteínu plazmy (EPI).

Vnútorná koagulácia sa obyčajne zisťuje testami APTT, kedy sa koagulovanie začína kaolínom, fosfolipidmi a iónmi dvojmocného vápnika. Na ovplyvnenie testu APTT sú nutné vysoké koncentrácie EPI, pozri Bronze, Biochemistry 29, 7539 (1990). Vnútorná koagulácia sa zisťuje v testoch PT, kedy sa koagulovanie vyvolá tkanivovým faktorom (extrakt z mozgu) a iónmi dvojmocného vápnika. Pri štandardnom teste sa použije neriedený tkanivový faktor a pridanie EPI sa prejaví ako veľmi malý účinok na pozorovaný koagulačný čas (pozri príklad 2). Omnoho viac sa z hľadiska fyziologického testu docieli roztokom tkanivového faktora, pokiaľ je podstatne zriedený. V takom prípade je koagulačný čas závislý tak od vonkajšieho, ako i vnútorného koagulačného faktora, pozri Brinkhouse a spol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1382 (1989). Na obr. 1 je jasne zrejmé, že pridaním r EPI sa zväčší koagulačný čas približne o 2 sekundy na každú pridanú jednotku EPI. S prekvapením pridanie antilátky proti EPI (odstránenie jednotiek EPI) skráti koagulačný čas o 30 sekúnd. Kontrolné pokusy boli uskutočnené s úmyslom dokázať, že vplyv bol skutočné daný len inhibovaním EPI.

Dospelo sa k ďalej uvedeným výsledkom:

A. Pridaním antilátky sa ďalej neskracuje koagulačný čas

B. Titer antilátky pri teste inhibičnej účinnosti EPI zodpovedá titru, ktorý bol pozorovaný pri teste skrátenia koagulačného času.

C. Antilátka bola z hľadiska afinity čistená použitím čistého rEPI s väzbou na Sepharozu. Získaný prípravok IpG sa vyznačoval na základe mg 10-násobným zvýšením titru tak proti skrátenému koagulačnému času, ako i v porovnaní s účinnosťou EPI.

D. Pokiaľ sa antilátka pridá v množstve práve dostačujúcom na skrátenie času koagulácie, potom pridanie rEPI má výraznejší vplyv na vzostup koagulačného času v porovnaní s pridaním plazmy bez antilátky (obr. 2).

E. Plazma s nedostatkom EPI bola pripravená z normálnej plazmy imunoabsorbciou. V porovnaní s normálnou plazmou sa vyznačuje taká plazma zníženým časom koagulácie. Pridanie antilátky pri koagulačnej analýze nijak ďalej neskracuje koagulačný čas ochudobnenej plazmy.

Antilátky, blokujúce účinnosť EPI, boli v literatúre opísané, pozri Novotný a spol., Blood 72, 2020 (1988). Ale inhibovanie EPI plazmy antilátkou doposiaľ opísané nebolo a nebolo tiež pozorované, že by mohla mať taká antilátka významný priamy účinok na koagulovanie a v dôsledku toho na hemostatickú rovnováhu.

Na zistenie a vyhodnotenie EPI používa Novotný a spol. komplikovaný trojstupňový koagulačný test. Vzorka EPI sa najprv inkubuje s TF, F Vila, F X a pridajú sa ióny dvojmocného vápnika. Potom sa pridá F X a po jednej minúte inkubovania sa pridá F X -deficitná plazma a cefalín z králičieho mozgu. Pri tomto teste EPI inhibuje účinnosť TF a bolo dokázané, že anti-EPI-antilátka inhibuje účinok EPI.

Pri jednostupňovom koagulačnom teste sa pridá priamo zmes vápenatých iónov a TF do plazmy a sleduje sa čas koagulácie. Broze a spol., Biochemistry 29, 7543 (1990) zistili, že pri takom teste je potrebné pridať 2,5 pg EPI/ml (50 U/ml) na dosiahnutie práve 50 %-ného zníženia údajnej TF-účinnosti.

Prekvapivo sme zistili, že pridanie anti-EPI do plazmy (odstránenie 1 U EPI) podstatne a významne ovplyvňuje koagulačný čas, ak bola koagulácia vyvolaná priamo zriedeným TF. Tento koagulačný test napodobňuje fyziologickú situáciu, pretože je to jediný typ koagulačného testu, ktorý je závislý od prítomnosti ako oboch faktorov F VII a F VIII i všetkých faktorov F IX, ktoré sú nutné na dosiahnutie normálnej hemostázy.

Ďalej potom bol plazmový EPI prečistený, pozri Novotný a spol., J. Biol. Chem. 264, 18832 (1989). Nebolo však pozorované, že by plazmový EPI mal výraznejší vplyv na koagulovanie, pri najmenšom vôbec nie v takej miere , že by inhibovanie EPI malo vplyv na hemostatickú rovnováhu. Z toho vyplýva, že tu zostáva postarať sa o dokumentovanie fyziologickej významnosti EPI, pozri Broze, Biochemistry 29, 7539 (1990). Naše pozorovanie, že totiž plazmový EPI významne ovplyvňuje koagulačný čas plazmy je súčasne dôkazom, že EPI zohráva dôležitú úlohu pri hemostatickej rovnováhe. Ďalej potom z našich pokusov vyplýva, že blokovanie EPI umožní znížiť tendenciu ku krvácaniu.

Je preto predmetom vynálezu farmaceutický prípravok na liečenie pacientov s predĺženým časom zrážania krvi, obsahujúci ako účinnú zložku inhibítor EPI, teda inhibítor inhibítora vonkajšej koagulačnej dráhy, ktorý blokuje inhibítor vonkajšej koagulačnej dráhy pri stanovení podľa „Bcthcsda“ opísanom ďalej a skracuje čas zrážania krvnej plazmy pri opísanom teste zrážania krvi, s výnimkou proteínu viažuceho heparín. Koagulačná disfunkcia je spôsobená hemofíliou A alebo B.

Prípravok podľa vynálezu sa ďalej vyznačuje tým, že koagulačná disfunkcia je spôsobená hemofíliou A alebo B, pripadne idiopatickou trombocytopéniou (ITP), chirurgickým zákrokom alebo roztrúsenou vnútrocievnou koaguláciou.

Ďalším predmetom vynálezu je použitie EPI inhibítora na prípravu farmaceutického prípravku na liečenie pacientov s predĺženým časom zrážania krvi, kde sa uvedený EPI inhibítor vyznačuje tým, že blokuje EPI pri stanovení podľa „Bethesda“ opísanom ďalej a skracuje čas zrážania krvnej plazmy pri opísanom teste zrážania krvi.

Použitie EPI inhibítora je vhodné v prípade, že koagulačná disfunkcia je spôsobená hemofíliou A alebo B trombocytopéniou, chirurgickým zákrokom alebo roztrúsenou vnútrocievnou koaguláciou.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Graf na obrázku 1 znázorňuje čas koagulácie indukovanej zriedeným TF v závislosti od množstva pridaného rEPI.

Os x: množstvo rEPI v jednotkách U/ml

Os y: čas koagulácie v sekundách

Symboly (·) zodpovedajú pridanému rEPI

Symboly (°) zodpovedajú pridanej antilátke proti

EPI

Graf na obrázku 2 znázorňuje čas koagulácie plazmy indukovanej zriedeným TF a plazmy s antilátkou proti EPI v závislosti od množstva rEPI pridaného k plazme v rôznych koncentráciách.

Os x: množstvo rEPI v jednotkách U/ml Os y: čas koagulácie v sekundách

Vzorky boli inkubované s pufrom (°) alebo s antilátkou (·) proti EPI

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príprava anti-EPI antilátok

Rekombinantný ľudský EPI (rEPI) bol získaný z transfikovaných buniek BHK, ako to opísali Pedersen a spol., J. Biol. Chem. 265, 6786 (1990). rEPI bol očistený heparínovou afmitnou chromatografiou, iónomeničovou chromatografiou i chromatografiou v opačnej fáze, pozri Nordfang a spol., Biotech. Plazma Prot. 1990, 98. Takto získaný rEPI bol čistý, súdiac podľa SDS-PAGE. Králiky boli imunizované v nultý deň, 14-ty a 35-ty deň s nasledujúcim odstupom 21 dní. Prvé imunizovanie bolo uskutočnené použitím Freundovho kompletného adjuvans, zatiaľ čo ďalšie boli uskutočnené s nekompletným Freundovým adjuvans. Získané antiséra boli testované na inhibovanie účinnosti EPI testom na účinnosť EPI a inhibovanie bolo kvalitatívne vyhodnotené ako antilátky inhibujúce FVIII v teste Bethesda: rovnaké objemy zriedeného antiséra a EPI (1 U/Ml) boli inkubované 2 hodiny pri 37 °C. Bola zmeraná účinnosť EPI a zriedenie antiséra, ktoré inhibuje účinnosť z 50 %, čo sa rovná titru. Králičie antiséra mali inhibujúce titre medzi 1000 až 4000 jednotiek/ml (U/ml) „typu Bethesda“ na tak rEPI ako i EPI ľudskej plazmy. Sérum pod päťdesiatnásobným riedením z imunizovaných králikov neovplyvňovalo účinnosť vzorky EPI (1 U/ml). Čistenie IgC z antiséra sa uskutočňovalo aniónovou výmennou chromatografiou. Prípravok IgC a 8 mg IgC/ml obsahoval 2000 inhibujúcich jednotiek „typu Bethesda“ (U/ml) oproti ľudskému plazmatickému EPI.

Test na účinnosť EPI

Účinnosť EPI bola zmeraná chromogénnym testom na mikrodoštičke v určitej modifikácii postupu Sandset-a a spol., Tromb. Res. 47. 389 (1989). Ako štandard bola použitá kvapka plazmy, upravenej zahrievaním a taký štandard bol upravený tak, aby obsahoval 1 U/ml účinnosti EPI. Štandardy i vzorky boli riedené pufrom A (0,05 M tris, 0,1 M NaCl, 0,1 M Na-citrátu, 0,02 % azidu sodného, pH 8,0), obsahujúcim 2 pg/ml polybrénu a 0,2 % albumínu z hovädzieho séra. Kombinovaná reakčná zložka FVIIa/TF/FX/CaCl₂ bola rovnako pripravená v pufre A a obsahovala 1,6 ng FVIIa (Novo Nordisk A/S), ľudský tkanivový faktor v šesťdesiatnásobnom zriedení, pozri Hjort, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 9 (1957), 50 ng/ml FX (Sigma) a 18 mM chloridu vápenatého. Pokus bol uskutočnený na mikrodoštičkách pri 37 °C. 50 μί vzoriek i štandardov sa vždy odpipetovalo do prúžkov a do každého žliabku sa pridalo 100 μί kombinovaného reagens. Po desaťminútovovom inkubovaní sa do každého žliabku pridalo 50 μί FX (3,2 pg/ml) a za ďalších 10 minút 25 pl, chromogénneho pre Fxa (S2222) 10 minút po pridaní substrátu. Reakcia bola prerušená pridaním 50 μί 1,0 M roztoku kyseliny citrónovej s pH 3,0. Odpočet na mikrodoštičke pri 405 nm.

Koagulačný test

Koagulačná účinnosť bola zmeraná s použitím ACL-koagulačného aparátku. 20 μί roztoku antilátky alebo roztoku EPI sa inkubuje s 200 μί plazmy 15 minút za teploty miestnosti. Po predhriatí na 37 °C sa primieša 75 μί plazmy a 75 pl zriedeného TF v 20 mM chloridu vápenatého, 50 mM chloridu sodného, 17 mM imidazolu a 33 pg/ml BSA, pH 7,4.

SK 282516 Β6

Príklad 1

Koagulačný test bol uskutočnený, ako bolo práve opísané s použitím 20.000-násobného riedenia tkanivového faktora. V tabuľke 1 je zachytený vplyv pridania anti-EPI do 10-tich vzoriek jednotlivých donorov, 7 vzoriek hemofílie A a 1 vzorky hemofílie B. Je zjavné, že bolo pozorované značné skrátenie času koagulácie, zvlášť u vzoriek hemolfilikov. V týchto údajoch sa odráža pokusne zistená vyššia významnosť závažnej vonkajšej cesty závislosti FVII v prípade vrodenej vnútornej koagulačnej cesty (hemofília A a B).

Tabuľka 1

Vplyv anti-EPI na koagulačný čas individuálnych vzoriek plazmy

	Donor (10)	Hemofília
A (7)	B (D
Koagulačný čas bez AB	102	131	165
rozsah	91-113	104-165
Koagulačný čas a anti-EPI	77	92	116
rozsah	71-87	82-113
Redukcia, sek.	26	39	49
rozsah	11-39	22-63

Príklad 2

Koagulačný test bol uskutočnený s použitím kvapky normálnej plazmy a s použitím rôznych riedení TF. Z tabuľky 2 je zrejmé, že čím viac sa TF zriedi, tým prenikavejší je účinok pridávania anti-EPI k plazme. Z toho vyplýva, že čím dlhší je čas koagulácie, tým účinnejšie sa prejaví anti-EPI na skrátení času koagulácie.

Tabuľka 2

Vplyv pridávania anti-EPI alebo EPI ako funkcie koagulačného času

Koagulačný čas v sekundách

Zriedenie TF	Normálna plazma	Normálna plazma s anti-EPI	NP %	Normálna plazma s pridaním 16 U/ml rEPI	NP %
60	16,6	16,1	97	17,6	106
3C0	28,1	24,5	87	31.4	112
1.500	49,0	38,9	79	59,0	120
7.500	92,0	64,8	70	123	134
15.000	121	80,5	67	> 165	> 136
21.000	143	91,3	64	> 165	>
30.000	> 165	102	<62	> 165	>
45.000	>165	117	<	> 165	>

Príklad 3

Citrátová plazma bola odobratá pacientovi po kardiopulmonámom chirurgickom bypasse. Pri tomto postupe bol pacient antikoagulovaný veľkými dávkami heparínu. Po operácii bol heparín zneutralizovaný injekciou síranu protamínu. Podľa meraní analýzou inhibovania chromogénneho FXa neobsahovala vzorka plazmy heparín. Podľa Sandsetovho EPI-testu vzorka obsahovala 2 U/ml účinnosti EPI. V tabuľke 3 je zachytený koagulačný čas zriedeného TF tejto plazmy pred a po pridaní anti-EPI. Je zrejmé, že koagulačný čas sa predlžuje a že anti-EPI môže skrátiť koagulačný čas. Takže zvýšená hladina EPI môže byť jednou z príčin, prečo CPB-pacienti krvácajú počas operácie a po nej.

Tabuľka 3

Vplyv anti-EPI na koagulačný čas plazmy z CPB-pacienta

Plazma donoru, kvapiek Plazma pacienta CPB

Koagulačný čas bezantílátky 100 >165

Koagulačný Čas s anti-EPI 70 82

Príklad 4

Proteín, viažuci heparín (HBP, heparín binding proteín) W089/08666 je proteín z neurofilných granúl s vysokou homológiou k elastáze. HBP sám osebe enzýmom nie je, ale zrejme viaže enzýmová inhibítory. Pri testovaní s použitím EPI-testu zodpovedá titer HBP proti EPI 10 jednotiek/mg „typu Bethesda“. HBP tiež blokuje inhibovanie FXa pôsobením EPI so zodpovedajúcim titrom. Po pridaní k normálnej plazme v koncentrácii 150 μg/ml indukovaný koagulačný čas (spôsobený zriedeným TF) sa skráti, pozri tabuľka 4.

Tabuľka 4

Vplyv HPB na koagulačný čas normálnej plazmy

Koagulačný čas, sekundy

Normálna plazma	98
Normálna plazma s anti-EPI	70
Normálna plazma s HBP	81

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Farmaceutický prípravok na liečenie pacientov s predĺženým časom zrážania krvi, obsahujúci ako účinnú zložku inhibítor EPI, teda inhibítor inhibítora vonkajšej koagulačnej dráhy, vyznačujúci sa tým, že blokuje inhibítor vonkajšej koagulačnej dráhy pri stanovení podľa „Bethesda“ opísanom v opise a skracuje čas zrážania krvnej plazmy pri teste zrážania krvi opísanom v opise, s výnimkou proteínu viažuceho heparín.
2. Farmaceutický prípravok podľa nároku 1, v y značujúci sa tým, že koagulačná disfúnkcia je spôsobená hemofíliou A alebo B.
3. Farmaceutický prípravok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že koagulačná disfúnkcia je spôsobená idiopatickou trombocytopéniou (ITP), chirurgickým zákrokom alebo roztrúsenou vnútrocievnou koaguláciou.
4. Použitie EPI inhibítora na prípravu farmaceutického prípravku na liečenie pacientov s predĺženým časom zrážania krvi, kde uvedený EPI inhibítor, vyznačujúci sa tým, že blokuje EPI pri stanovení podľa „Bethesda“ opísanom v opise a skracuje čas zrážania krvnej plazmy pri teste zrážania krvi opísanom v opise.
5. Použitie EPI inhibítora podľa nároku 4, v prípade, že koagulačná disfúnkcia je spôsobená hemofíliou A alebo B.
6. Použitie EPI inhibítora podľa nároku 4 v prípade, že koagulačná disfúnkcia je spôsobená idiopatickou trombocytopéniou (ITP), chirurgickým zákrokom alebo roztrúsenou vnútrocievnou koaguláciou.