SK279352B6 - Spôsob prípravy somatotropného prostriedku s kontr - Google Patents

Description

Somatotropné prostriedky, eventuálne formulácie, ktoré sú najviac biologicky aktívne, majú relatívne krátky in vivo polčas. Aby sa dosiahlo dostatočne vysokých biologických účinkov a udržala sa predĺžená biologická účinnosť somatotropínu, podával sa tento prostriedok v prebytku a/alebo veľmi často, čo však môže spôsobiť živočíchom, ktorým sa tento prostriedok podáva, vážne ťažkosti. Preto sa pri podávaní somatotropínu vyžaduje (pri podávaní somatotropínu in vivo) benígna schéma predĺženia jeho účinku, pre uspokojenie týchto požiadaviek boli vyvíjané rôzne spôsoby prípravy takéhoto somatotropného prostriedku, ktorý by mal predĺžené vlastnosti pri uvoľňovaní a súčasne by pri ňom bolo možné podávanie nižších dávok a frekvencia podávania by bola tiež nižšia.

Napríklad v US patente č. 4 985 440 je opísaný prostriedok obsahujúci komplex prechodového kovu, obzvlášť komplex zinku a somatotropínu v oleji suspenzovanom vehikulom, vyrobenom z rastlinného alebo minerálneho oleja, zmiešaného s masťovým základom a adjuvans. Tento spôsob je komplikovaný a vyžaduje komplex somatotropínu s kovom, alebo komplex somatotropínu s prechodovým kovom. Napríklad komplex zinku a somatotropínu sa pripravuje adíciou chloridu, zinku a roztoku somatotropínu za prísne vymedzených podmienok a prebytok chloridu zinku sa potom vymýva z tejto suspenzie, obsahujúcej žiadaný komplex, v niekoľkých stupňoch, pomocou odstreďovania. Potom sa finálny roztok lyofilizuje, čím sa celý spôsob stáva veľmi zdĺhavým a náročným hlavne z časového hľadiska.

European Patent Publication No. 216 485 opisuje prostriedok, obsahujúci komplex zinku a somatotropínu, dispergovaný v niektorom oleji, ako je napríklad arašidový olcj. Typické je podávanie 8 mg prostriedku a 40 mg somatotropínu prasatám, kedy predĺžený účinok pre uvoľňovanie je len krátky a to 9 dní. Okrem tohto je tento spôsob podobne komplikovaný ako v prípade už uvedeného patentu US Patent 4 985 404.

US Patent No. 4 863 736 poskytuje spôsob na výrobu implantovateľných piluliek, obsahujúcich vlákna somatotropínu s parciálnymi priehradkami z ochranných polymérov ako je šelak, včelí vosk a celulóza. Tieto pilulky uvoľňujú somatotropín in vivo. Podobne European Patent No. 374 120 poskytuje spôsob výroby implantovateľného prostriedku, obsahujúceho somatotropín, v osmotickom zariadení. European Patent Publication No. 246 540 hovorí o spôsobe syntetizovania implantovateľných prostriedkov, obsahujúcich polypeptid a mastnú kyselinu.

US Patent No. 4 786 501 ilustruje spôsob výroby implantovateľnej formulácie vo forme piluliek, pričom tento spôsob zahŕňa stupne miešania somatotropínu, sacharózy a etylcelulózy a následné poťahovanie pórovitým a nepórovitým polyetylénom. Us patent No. 1 761 203 opisuje spôsob na výrobu implantovateľnej formulácie, zahrnujúci zmiešanie somatotropínu a vo vode nerozpustných polymérov, pridanie vo vode nerozpustného rozpúšťadla a sušenie. Hoci tieto implantovateľné formulácie majú trvalý účinok, vyžadujú na aplikáciu chirurgickú operáciu alebo špeciálny aparát, teda vyžadujú relatívne komplikované a nekonvenčné spôsoby aplikácie.

Na druhej strane definuje European Patent publication No. 193 917 prostriedok, obsahujúci vo vode dispergovateľné a vo vode rozpustné sacharidové, glycidové polyméry a biologicky aktívnu molekulu rastového hormónu. European Patent Publication No. 314 421 ukazuje prostriedok, obsahujúci polypeptid dispergovaný v oleji so sacharidovým polymérom, ako je dextrán, ako nosným materiálom. European Patent Publication No. 211 691 uvádza prostriedok, dispergovaný v oleji s niekoľkými voskami, ako nosnými materiálmi, ale má podobné chyby ako uvedený prostriedok v European Patent Publication No. 193 917. V prípade týchto prostriedkov často živočíchy reagujú na sacharidový polymér ako je dextrán, ako na antigén a citlivo reagujú, čo znemožňuje trvalé užívanie týchto prostriedkov.

Korean Patent Laid-open Publication No. 91-15302 uvádza prostriedok, obsahujúci živočíšny somatotropín dispergovaný v acetáte tokoferolu a adjuvants pre trvalé zvoľňovanie. Pretože má vysokú viskozitu, obtiažne možno tento prostriedok aplikovať injekčné a je tendencia zotrvávať pri podávaní a aplikovaní v tkanive, čo nepôsobí na tkanivo priaznivo.

Podstata vynálezu

Predmetom tohto vynálezu je poskytnutie spôsobu na prípravu somatotropného prostriedku majúceho dlhý in vivo polčas, s malými vedľajšími účinkami na živočíchy, ktorým sa aplikuje tento prostriedok.

Podľa ďalšieho predmetu tohto vynálezu sa ponúka prostriedok, ktorý je somatotropným prostriedkom, pripraveným podľa spôsobu uvedeného v tomto vynáleze.

V súlade s týmto vynálezom sa poskytuje spôsob prípravy somatotropného prostriedku, ktorého in vivo uvoľňovanie je časovo riadené, pričom tento spôsob pozostáva z nasledujúcich stupňov:

rozpustenie lecitínu a somatotropínu vo vodnom roztoku za vzniku lipozómového somatotropného roztoku; lyofilizácia alebo lyofilizovanie uvedeného lipozómového somatotropného roztoku za podmienok obvyklých pre lyofilizáciu a suspenzovanie uvedeného lyofilizovaného lipozónneho somatotropínu v tokoferolovom deriváte tak, aby sa utvoril nový prostriedok.

Podľa tohto vynálezu sa roztok somatotropínu mieša s lecitínom v homogenizátore a vzniknutý roztok sa spracováva v mikrofluidizéri za vzniku homogénnej zmesi. Táto zmes sa potom lyofilizuje podľa konvenčných spôsobov a suspenzuje sa v tokoferolovom deriváte, čím sa získa prostriedok podľa tohto vynálezu. V tomto vynáleze možno použiť mnoho typov somatotropínu, pokiaľ majú žiadanú biologickú účinnosť. Medzi takéto typy patria napríklad: hovädzí somatotropin, bravčový somatotropín, ovčí somatotropín a pod. Hoci sa nevyžaduje podľa tohto vynálezu použitie komplexov somatotropínu s kovmi alebo s prechodnými kovmi, alebo modifikovaný somatotropín s nízkou hydrogenáciou, možno použiť aj tieto typy somatotropínu. Oblasť použiteľných typov somatotropínu zahrnuje aj tie, ktoré sú produkované za použitia rekombinantnej DNA technológie z hostiteľských buniek ako je E. coli a droždie aj prírodný somatotropín extrahovaný zo žľazy mozgového podvezku takých zvierat, ako hovädzí a bravčový dobytok a ovce.

Medzi tokoferolové deriváty, ktoré môžu byť použité v tomto vynáleze, patria napríklad „dl-a-tokoferol, dl-a-tokoferol acetát, dl-a-tokoľerol sukcinát, dl-a-tokoferol fosfát, 1-a-tokoferol, 1-a-tokoferol acetát, 1-a-tokoferol sukcinát, 1-a-tokoferol fosfát a β, ξ,, g₂-tokofcrolové deriváty, pričom výhodný je α-tokoferol acetát. Tokoferolové

SK 279352 Β6

Ďalej budú uvedené príklady, ktoré majú za úlohu bližšie ilustrovať tento vynález, pričom ho však nijakým spôsobom neobmedzujú a to tak z hľadiska obsahu, ako aj rozsahu.

deriváty podporujú normálny reprodukčný mechanizmus takých živočíchov, ako sú krysy, myši, morské prasce, prasce a hydina, pomáhajú pri prevencii defektov vo vývoji svalov zvierat, a tiež hrajú dôležitú úlohu ako nosiče časovo riadeného uvoľňovania somatotropínu in vivo. Okrem toho majú tokoferolové deriváty sklon zabraňovať nepravidelným pohybom svalov alebo tuhnutiu svalov kurčiat a tiež steatóze noriek, prasiat, mačiek. Množstvo tokoferolových derivátov, používaných v prostriedku, sa pohybuje v rozmedzí od 70 do 90 % hmotnostných vzhľadom na celkovú hmotnosť prostriedku.

Biologicky aktívny somatotropín, používaný v tomto vynáleze, sa mieša s lecitínom v hmotnostnom pomere ležiacom v rozmedzí od 7 : 3 do 8 : 2. Pokiaľ je obsah somatotropínu menší ako nižší limit (t. j. 70 % hmotnostných), prejavuje sa jeho biologická aktivita obtiažne. Pokiaľ obsah somatotropínu prevyšuje horný limit (t. j. 80 % hmotnostných), tvorí obtiažne lipozómnu somatotropnú zmes.

Lecitín, prítomný v prostriedku podľa vynálezu, riadi čas uvoľňovania somatotropínu v tele živočíchov. Lecitín, vhodný na použitie v prostriedku podľa tohto vynálezu, môže byť napríklad: fosfatidylcholin, lysofosfolipid, plazmalogén a sfingomyelín.

Do prostriedku podľa tohto vynálezu môžu byť ďalej pridané vhodné vchikulum a/alebo adjuvans, teda masťové základy a pomocné látky, podľa rôznych druhov aplikácií. Ako už bolo diskutované, je pri známych prostriedkov treba, aby bol somatotropín vo forme komplexu s kovom alebo s prechodným kovom,čo komplikuje spôsoby, ku ktorým patrí dialýza, pretože jeho rozpustnosť in vivo musí byť nižšia, aby sa získal žiadaný účinok riadenia času uvoľňovania. Tiež musí byť somatotropín aplikovaný v nadprebytku, aby sa dosiahol iniciačný efekt prasknutia.

Naproti tomu formulácia, pripravená podľa tohto vynálezu obsahuje lyofllizovaný lipozómny somatotropín, suspenzovaný v tokoferolovom vehikule, uvoľňuje biologicky aktívny somatotropín s riadeným časom uvoľňovania pri aplikovaní živočíchom, bez potreby tvorby uvedeného komplexu, teda uvedená formulácia a spôsob aplikovania je veľmi jednoduchý a ekonomický. Veľmi dôležité je, že formulácia podľa tohto vynálezu prejavuje vynikajúci profil uvoľňovania spolu s nízkym iniciačným uvoľňovaním alebo prasknutím somatotropínu in vivo.

Zatiaľ čo kov alebo prechodný kov, používaný vo formulácii s komplexom somatotropínu s kovom podľa spôsobu známom v danej oblasti techniky, prejavuje nežiaduce vedľajšie účinky, prostriedok podľa tohto vynálezu prejavuje len nepatrné vedľajšie účinky. Okrem toho majú tokoferolové deriváty, tu používané, určité prednostné farmakologické účinky in vivo a zmierňujú alebo zabraňujú negatívnym odozvám a reakciám pri používaní prostriedku.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 a 2 ukazuje vplyv prostriedku podľa tohto vynálezu na produkciu mlieka, ak sa aplikuje kravám, dávajúcim mlieko.

Obr. 3 ukazuje vplyv koncentrácie somatotropínu v sére pri aplikácii nového prostriedku na rast prasiat.

Obr. 4 ukazuje vplyv koncentrácie dusíka močoviny v sére pri aplikácii prostriedku podľa tohto vynálezu na rast prasiat.

Obr. 5 popisuje koncentráciu inzulínu podobného rastového faktoru I v sére, ak sa aplikuje prostriedok podľa tohto vynálezu prasatám, a to vplyv na rast prasiat.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

300 ml roztoku hovädzieho somatotropínu (30,03 mg/1 roztoku hovädzieho somatotropínu vyrobeného pomocou rekombinantnej DNA technológie firmou Lucky Ltd.) sa zmieša s 3 g L-a-fosfatidylcholínu IV-S (L-a-lecitín) extrahovaným zo sóje v homonizéri počas 5 minút pri teplote 4°C, potom sa naleje do banky, rýchle sa ochladí na teplotu - 70 °C, suší sa v ľadovom acetónovom kúpeli a potom sa lyofilizuje. 133,3 mg lyofilizovaného prášku, obsahujúceho L-a-fosfatidylcholin a hovädzí somatotropín, sa homogénne premieša s 1 ml α-tokoferol acetátu v homogenizíri počas 10 min.

Na desiatich Holsteinových kravách v strednej perióde laktácie sa robí nasledujúci test. Uvedená formulácia sa injekčné aplikuje v množstve 5 ml na hlavu a to šesťkrát každé dva týždne. Päť kráv bolo použitých na testovanie a päť kráv bolo v porovnávacej skupine, ktorá injekcie nedostávala. Formulácia bola aplikovaná podkožné v suprascapulámej oblasti. Po aplikácii injekcie sa denne merala produkcia mlieka, ako ukazuje tabuľka 1 a obrázok 1.

Tabuľka 1

Vplyv prostriedku podľa vynálezu na dennú produkciu mlieka (kg)

		Kontrolná skupina	Skupina s injekciami
Pred injekciami	21.50	23.91
1	injekcia	21.66	27.75
	injekcia	21.34	28 .18
3	injekcia	21.51	2B 10
4	injekcia	20.76	27.73
	injekcia	19.59	28 06
6	injekcia	15.51	27.17
	týždne po 6,	injekcií 17.94	23.45

Príklad 2

Formulácia sa pripraví rovnakým spôsobom ako v príklade 1, okrem toho, že sa 333,35 mg lyofilizovaného prášku a 37,02 mg lecitínu mieša s 1 ml a-tokoferolacetátu.

Testovanie sa prevádza na Holsteinových kravách v ich strednom čase laktácie. Uvedená formulácia sa aplikuje injekčné v množstve 2 ml na hlavu vždy dva týždne šesťkrát. Šesť kráv bolo v porovnávacej skupine a šesť kráv bolo v testovacej skupine. Test sa robil rovnakým spôsobom ako v príklade 1 a výsledok je ukázaný v tabuľke 2 a na obrázku 2.

Tabuľka 2

Vplyv prostriedku podľa vynálezu na dennú produkciu mlieka (kg)

	Kontrolná skupina	Skupina s injekciami
Pred injekciami	26.14	25.50
1. injekcia	22.6	23.S
2. injekcia	23.8	25.6
3. injekcia	22.3	24.8
4. injekcia	22.0	24.5
5. injekcia	20.7	23.0
6. injekcia	21.0	23.2
2 týždne po 6.	injekcií 1B.9	19.3

SK 279352 Β6

Príklad 3

Formulácia prasacieho somatotropínu sa pripraví rovnakým spôsobom ako v príklade 1. Test sa prevádza na štrnástich prasatách, z ktorých každé má hmotnosť 60 kg. Formulácia bola aplikovaná injekčné v množstve 1,5 ml na hlavu dvakrát vždy po troch týždňoch a to siedmym prasatám. Ďalších sedem prasiat bolo v porovnávacej skupine, ktorá nedostávala injekcie. Tri týždne po injekcii sa merala spotreba krmiva. Vypočítavala sa účinnosť kŕmenia (feed efficiency - FE). Tabuľka 3 ukazuje priemerný denný prírastok (average daily gain - ADG, kg/deň) a účinnosť kŕmenia (FE =množstvo prijatého krmiva/hodnota zvýšenia telesnej hmotnosti).

Tabuľka 3

Denný prírastok a účinnosť kŕmenia

Kontrolná skupina Skupina s injekciami

Po prvých adg	0.94	0.97
troch týždňoch FE	3.55	3.33
Po druhých ADG	0.B1	0.96
troch týždňoch FE	4.28	3.31

Príklad 4

Formulácia prasacieho somatotropínu sa pripraví rovnako ako v príklade 1. Test sa prevádza na šiestich prasatách, z ktorých každé má hmotnosť 60 kg. Formulácia sa aplikuje injekčné v množstve 1,5 ml na hlavu trom prasatám. Ďalšie tri prasatá sú v kontrolnej skupine bez injekcií. Meralo sa im: koncentrácia séra prasacieho somatotropínu (PST), dusík močoviny v krvi (BUN) a inzulínu podobný rastový faktor I (koncentrácia IGF-I). Výsledky sú v tabuľke 4 a na obrázku 4 a 5.

Tabuľka 4

Koncentrácia séra PST, BUN a inzulínu podob. rastového faktoru I
deň	sérum pst	IGF-I	BUN t	sérum PST	IGF-I	BUN
	(ng/ml}	(ng/ml)	(g/di)	(ng/ml)	(ng/ml)	(»9/dl)
0	1.43	343	14.5	1.44	441	15.0
1	1.52	306	15.7	325	891	4.5
3	1.15	308	17.4	46.9	1135	8.0
6	1.42	356	15.0	8.30	1018	6.0
10	1.44	351	19.8	3.10	692	16.5
14	1.46	354	19.7	1.02	506	19.0
21	1.80	348	23.3	1.10	438	17.7

v zodpovedajúcej oblasti farmaceutických výrob v danom priemyselnom odvetví.

Claims (6)

1. Spôsob prípravy somatotropného prostriedku s kontrolovaným uvoľňovaním, vyznačujúci sa tým, že pozostáva z

- homogénneho zmiešania somatotropínu s lecitínom vo vodnom roztoku v hmotnostnom pomere od 7 : 3 do 8:2,

- lyofilizácie roztoku lecitínu so somatotropínom a

- suspendovania lyofilizovaného roztoku lecitínu so somatotropinom v tokoferolovom deriváte v hmotnostnom pomere od 1 : 9 do 3 : 7.

2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že somatotropín je vybraný zo skupiny, ktorú tvorí hovädzí, prasací a ovčí somatotropín.

3. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že somatotropín je pripravený rekombinantnou DNA technológiou.

4. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že tokoferolový derivát je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z dl-a-tokoferolu, dl-a-tokoferol acetátu, dl-a-tokoferol sukcinátu, dl-a-tokoferol fosfátu, 1-α-tokoferolu, 1-a-tokoferol acetátu, 1-a-tokoferolsukcinátu, 1-a-tokoferol fosfátu a β, ξ_1; ξ₂- tokoferolových derivátov.

5. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že tokoferolový derivát je dl-a-tokoferol acetát.

6. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že lecitín je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z fosfatidyl cholínu, lyzofosfolipidu, plazmogénu a sfingomyelínu.

5 výkresov

Ako je z uvedeného zrejmé, formulácia pripravená podľa tohto vynálezu má dlhý polčas in vivo pri aplikácii živočíchom, pričom má veľmi malé vedľajšie účinky a je vhodná na aplikáciu ako injekcia vzhľadom na svoju nízku viskozitu, ktorá uľahčuje jej používanie. Prostriedok preto možno aplikovať bez chirurgickej operácie alebo špeciálneho aparátu. Ďalej je veľmi výhodné, že spôsob prípravy tohto prostriedku je veľmi jednoduchý a ekonomický.

Tento vynález opisuje uvedený prostriedok predovšetkým z hľadiska uvedeného špecifického prevedenia, ale sú možné rozmanité modifikácie a obmeny, ktoré sa prejavia pri používaní tohto vynálezu, bez akéhokoľvek obmedzovania obsahu a rozsahu vynálezu v zmysle, v ktorom sú ďalej uvedené patentové nároky.

Priemyselná využiteľnosť

Prostriedok podľa tohto vynálezu sa pripravuje spôsobom, uvedeným vo vynáleze a možno jeho prípravy použiť