SK18598A3

SK18598A3 - Oligonucleotides for controlling cd44 gene expression and their therapeutic use

Info

Publication number: SK18598A3
Application number: SK185-98A
Authority: SK
Inventors: Zbigniew Pietrzkow; Cieslak Dariusz; Sabera Ruzdijic
Original assignee: Icn Pharmaceuticals
Priority date: 1995-08-14
Filing date: 1996-07-31
Publication date: 1998-07-08
Also published as: JPH11505129A; AU704579B2; MX9801264A; EP0846001A1; IL122976A0; US5990299A; WO1997006827A1; CN1193280A; PL327628A1; KR19990036277A; AU6686696A; EP0846001A4; CA2228965A1; CZ43898A3

Description

Predkladaný vynález sa týka terapie rakoviny, obzvlášť sa týka využitia protismerných („antisense) oligonukleotidov na kontrolu expresie génov CD44.

Podstata vynálezu

CD44 je polymorfná rodina membránových glykoproteinov, ktoré sú exprimované v mnohých rôznych typoch buniek. CD44 sa môže napríklad nájsť v cirkulujúcich lymfocytoch, kde pôsobia ako receptor, viažuci lymfocyty v lymfatických uzlinách, alebo v epitelových bunkách, kde sa zúčastňuje medzibunkovej adhézie (1) . CD44 sa tiež nachádza v pľúcach, bazálnych bunkách horných priedušiek, plúcnych makrofázach, alveolárnych lymfocytoch a aktivovaných alveolárnych pneumocytoch II. typu, kde sa zúčastňuje opäť medzibunkovej adhézie (2) . CD44 má vysokoafinitné väzbové miesto na hyaluronanové receptory a interakcia CD44-hyaluronan slúži na uchytenie bunky na mieste (3) .

V jednotlivej bunke sa CD44 môže exprimovať vo dvoch alebo aj viacerých variantoch v závislosti na premenlivých potrebách bunky, ako sa usudzuje. Polymorfná diverzita (polymorfizmus) variantov je spôsobená alternatívnym zostrihom mRNA kódujúcou CD44 (mRNA CD44), ku ktorému dochádza tak, že rôzne kódujúce sekvencie (exóny) génu CD44 sa prepisujú (a teda aj exprimujú) v rôznych kombináciách. Výsledné proteíny pochádzajúce z rôznych zostrihových variantov (izoforiem) CD44 sú vo veľkom rozmedzí veľkosti od 110 kDa až po viac ako 250 kDa, a majú tiež rôzne funkcie. Extracelulárna doména proteinu CD44 sa zúčastňuje medzibunkovej adhézie a viaže rôzne prvky medzibunkovej hmoty, vrátane kyseliny hyalurónovej, fibronektinu a kolagénu, zatiaľ čo intracelulárna doména je spojená s ankyrinovými proteínami cytoskletu, ktoré sú kritickým faktorom pre bunkovú mobilitu závislú na CD44. CD44 okrem toho pôsobí v hematopoéze a infiltrácii lymfocytov do celkového obehu (4, 5, 6) . Rozličné funkcie CD44 sú veľmi zaujímavé, lebo môžu vysvetľovať podobné chovanie aktivovaných lymfocytov a metastázujúcich nádorových buniek. Oba typy buniek majú totiž relatívne vysokú mieru expresie CD44, ukazujú invazivne chovanie, migráciu buniek zahŕňajúcu vratné adhezivne kontakty, nahromadenie a rozrastanie lymfoidného tkaniva do krvného obehu (6) . Spojenie s lymfoidnými tkanivami je obzvlášť zaujímavé, lebo ako lymfocyty tak aj metastázujúce bunky používajú varianty CD44 na naviazanie špecifických ligandov v medzibunkovej hmote alebo v lymfatických uzlinách alebo na povrchu dendritických buniek, prípadne aj iných buniek lymfoidného tkaniva. Okrem toho, ako lymfocyty tak aj nádorové bunky sú v dôsledku rastu a diferenciácie lymfatických uzlín synchrónne uvoľňované do eferentných lymfatických ciev. Proces uvoľňovania vyžaduje zložitú sériu interakcii medzi lymfocytmi a nádorovými bunkami, zložkami medzibunkovej hmoty a okolitými bunkami a pravdepodobne zahŕňa aj adhezivne receptory, proteolytické enzýmy, rastové faktory a receptory rastových faktorov. Procesy sú zrejme závislé na spojení molekúl CD44, pričom špecifickosť procesov je sprostredkovaná tkanivovo špecifickými ligandami, ktoré interagujú s izoformami CD44. Expresia CD44 v malígnych bunkách je preto dôležitým faktorom v raste primárnych nádorov, miestnej invazivnosti a sklone/náchylnosti k metastázovaniu (7, 8, 9).

Génové miesto CD44 v ľudskom genóme je na chromozóme llpl3 (10) . V poslednom období sa spoznala väčšina štruktúry tohto génu (11). V celkovej dĺžke génu 60 kilobáz (kb) je rozmiestnených najmenej 20 exónov. Desať z nich kóduje sekvencie štandardnej formy CD44 (exóny 1 až 5 a 16 až 20) . Medzi exóny 5 a 16 sa lokalizuje prinajmenšom desať ďalších exónov, ktoré sú alternatívne zostrihované (exóny 6 až 15). Pri ľuďoch, rovnako ako aj pri iných druhoch, gén CD44 kóduje rôzne alternatívne zostrihované proteiny, ktoré majú rôzne veľkosti, a tiež plnia rôzne funkcie.

Niekoľko izoforiem CD44 sa už izolovalo a charakterizovalo, vrátane glykoproteinu s veľkosťou 89 až 90 kDa, ktorý sa nazýva „štandardnou alebo „hematopoetickou izoformou (CD44s), a tiež glykoproteinu s veľkosťou väčšou ako 180 kDa, nazývanom „epitelová alebo variantná izoforma (CD44v). Izolácia a charakterizácia klonov cDNA pre štandardnú a epitelovú izoformu ukázali, že proteínové sekvencie sú identické až ná to, že epitelová izoforma obsahuje navyše ďalšiu sekvenciu 134 alebo aj viac aminokyselín, ktoré pochádzajú z najmenej 10 exónov (vl až vlO), ktoré kódujú extracelulárne domény, pričom epitelové izoformy sú ešte podstatne viac glykozylované (12, 27) . V súčasnosti sa predpokladá, že štandardná forma CD44 má kľúčovú úlohu pri kontrole bunkovej migrácie, presná funkcia alternatívnych variantov CD44, ktoré vo väčšine buniek prevládajú, je však doteraz neznáma .

Odborná literatúra nie je jednotná v tom, či expresia CD44, či už v štandardnej alebo variantnej forme, je všeobecne spojená zo schopnosťami ľudských nádorov metastázovať. Jedna publikácia z r. 1993 (13) napr. zdôrazňuje, že takáto závislosť sa doposiaľ nepreukázala. Na druhej strane je známe, že bunky exprimujúce vysokú hladinu variantnej izoformy CD44, majú tendenciu k častejšej malígnej transformácii. Nekontrolovaný rast týchto buniek spojený s expresiou izoformy CD44v, a možno ešte ďalších adhezívnych molekúl, môže spôsobovať ich zvýšenú invazívnosť a schopnosť metastázovať. Množstvo štúdií našlo spojenie medzi malígnymi transformáciami alebo rakovinovými metastázami a expresiou variantov izoformy CD44. Napríklad články z r. 1994 (14, 15) podávajú dôkazy, že určité varianty CD44 sa podieľajú na sprostredkovaní adhézie a invázie ľudských gliómových buniek. Zistilo sa, že karcinómy maternicového krčku preukazujú silnú expresiu epitopov kódovaných exónmi v 7 a v8, ktoré sa nenašli v normálnom cervikálnom epiteli (16). V inej štúdii sa zistilo, že špecifické varianty CD44 sa nadmerne exprimovali v určitých štádiách progresie kolorektálneho karcinómu, a tiež sa predpokladá zlá prognóza pri kolorektálnom nádore exprimujúceho izo formu CD44v, skôr spojovanou s nádorovými metastázami (17,18). V niektorých štúdiách sa ukázalo, že nadmerná expresia len niektorých variantov CD44 sa spája s rakovinou. Napr. expresia variantov obsahujúcich sekvencie exónu v6 sa objavuje v pokročilom štádiu vývoja niektorých nádorov, ale niektoré varianty CD44 bez sekvencie exónu v6 sa objavujú v skorých štádiách tumorigenézy a pri časných adenómoch. Skúmanie gastrického adenokarcinómu ukázalo expresiu CD44v pri všetkých testovaných vzorkách, pričom adenokarcinómy intestinálneho typu exprimovali exóny v5 a v6, zatial čo pri adenokarcinómoch difúzneho typu prevládala expresia samotného v5. Normálna žalúdočná sliznica preukazuje expresiu exónu v5 vo foveolárnej proliferačnej zóne a v epiteli s mukoidným povrchom (19). Rovnaký spôsob expresie sa potvrdil pre exón vil, ktorý sa vyskytuje v nadmernom množstve v dobre diferencovaných intestinálnych nádoroch, na rozdiel od nádorového tkaniva difúzneho typu. Normálna žalúdočná sliznica ukazuje významne nižšiu expresiu spojených foriem s exónom vil. Prítomnosť CD44 sa spojila s novým výskytom nádorov a zvýšenou mortalitou počas nasledujúceho obdobia dlhého priemerne 14 mesiacov.

Údaje z odbornej literatúry ukazujú, že nadmerná expresia má dlhodobý klinický význam. Pri jednej skupine pacientov s pozitívnou expresiou exónu v6 v 87 % primárneho nádoru prsníka a 100 % výskytom metastáz v podpazuchových uzlinách, celkovo nízka miera prežívania súvisela s prítomnosťou epitopov CD44v (20, 21). Iná skupina získala podobné výsledky, ale predpokladala, že efekt sa časom vytráca. V štúdii zaoberajúcej sa gliómami sa zistilo, že invazívnosť sa výrazne inhibovala pri dvoch bunkových líniách a plne potlačila pri piatich ďalších špecifickým protismerným („antisense) oligonuleotidom, ktorý inhiboval expresiu CD44 (15).

Pokial je nám známe, terapia využívajúca „antisense oligonukleotidy, sa doposiaľ nepoužila pri pľúcnej rakovine, melanóme alebo leukémii a nikdy sa tiež nezistilo, že jedna lebo viac variant CD44 sú spojené s niektorým z týchto novotvarov. Problém je obzvlášť výrazný v spojení s plúcnou rakovinou, alebo existu j ú prinajmenšom dva typy, malobunkový plúcny karcinóm (SCLC) a pľúcny karcinóm nemalobunkový (NSCLC). SCLC predstavuje asi jednu štvrtinu prípadov, sú pri ňom exprimované neuroendokrinné peptidy a čiastočne metastázuje do lymfatických uzlín, mozgu, kostí, pľúc a čriev. NSCLC predstavuje väčšinu prípadov pľúcnej rakoviny a zahŕňa adenokarcinóm, epidermoidný karcinóm a veľkobunkový karcinóm. NSCLC sa charakterizuje rastovými faktormi podobnými epitelovým rastovým faktorom a receptorom a je lokálne invazivny. Penno a kol. zistili v r. 1944 (2), že transkripcia a translácia štandardnej formy CD44 je vysoká pri pľúcnych nemalobunkových nádoroch a epidermoidnej metaplázie, ale je zriedkavá v malobunkových nádoroch a kludových pneumocytoch typu II.

Melanocyty a melanómové bunky sa často skúmajú ako model na zistenie zmien prebiehajúcich pri malignej transformácii, vrátane hľadania génov, ktoré sa exprimujú v malignych, ale nie v normálnych, melanocytoch. Melanómové bunky, sa na rozdiel od normálnych melanocytov, môžu deliť aj v neprítomnosti exogénnych rastových faktorov. Táto nezávislosť je odrazom vlastnej produkcie rastových faktorov a cytokínov pre autokrinnú stimuláciu rastu (22).

Melanómové bunky vylučujú rôzne rastové faktory vrátane TGFa, TGF-β, reťazca A a B rastového faktora pochádzajúceho z doštičiek, základný fibroblastový rastový faktor, IL-6, IL-1, faktor stimulujúci kolónie granulocytových makrofágov a MGSA. Tieto rastové faktory, exprimované buď konštitutívne alebo do odpovede na indukciu rôznymi cytokinmi, prispievajú k vývoju fenotypu transformovaného melanómu tým, že pôsobia ako autokrinné rastové faktory alebo modulujú hostiteľovu odpoveď na nádorové bunky (23, 24) .

Aby mohli vytvoriť metastázy, musia sa melanómové bunky oddeliť od priameho nádoru, preniknúť väzivovým tkanivom hostiteľa a vstúpiť do obehu, prostredníctvom krvného produktu sa rozšíriť a prežiť, pokial nedosiahnu vzdialené kapilárne riečište, kde prisadnú, preniknú do parenchýmu príslušného orgánu a začnú proliferovať sekundárnym rastom. Rast buniek vo vzdialených mies tach prebieha, keď nádorové bunky odpovedajú na parakrinné rastové faktory produkované bunkami hostiteľa (22).

Približne 95 % familiárnych malignych melanómov a 40 % sporadických melanómov pochádza z prekurzorových lézii. Existujú tri typy melanocytových lézii: kongenitálne, získané a dysplastické névy. Kongenitálne a všeobecne získané névy predstavujú ohniskovú proliferáciu normálnych melanocytov. Oproti tomu dysplastické névy sú tvorené heterogénnou populáciou normálnych melanocytov a melanocytov zo zvýšenou pigmentáciou, jadrovým pleomorfizmom a mitotickou atypiou. Z tohto dôvodu sa melanocyty dysplastických név považujú za prekurzorové lézie ľudských malígnych melanómov. Ľudské melanómy sa roztriedili do 3 štádií: i) melanóm vo fáze radiálneho rastu, ii) melanóm vo fáze vertikálneho rastu a iii) metastázujúci melanóm. Primárny melanóm, či už vo fáze radiálneho alebo vertikálneho rastu alebo metastáz, má významné biologické, biochemické a karyotypové odlišnosti v porovnaní s normálnymi melanocytmi a melanocytovými prekurzorovými léziami (23) .

Ľudský melanóm je vhodný modelový systém, lebo bunky izolované z rôznych štádií progresie nádoru môžu byť kultivované a skúmané v laboratóriu. Ľudský melanóm Hs294T (ATCC) použitý v pokusoch ďalej opisovaných, sa získal z metastatickej lymfatickej uzliny a predstavuje vysoko metastázujúcu melanómovú bunkovú líniu (25). Tieto pokusy, spoločne s pokusmi s NSCLC, sa môžu považovať za predzvesť všeobecnej účinnosti terapie novotvarov exprimujúcich CD44, na ktorú sa vzťahujú nároky v tejto prihláške.

Claims

Vytvorili sa oligonukleotidy rôznych sekvencií, a skúšala sa ich účinnosť proti pľúcnym a melanómovým rakovinovým bunkám. Ako „sense (orientované súhlasne zo smerom translácie) tak aj „antisense (orientované proti smeru translácie, protismerné) oligonukleotidy sa navrhli podľa sekvencie, ktorú publikovali

Stamenkovic a kol. (26). Celkom sa syntetizovalo a skúšalo 22 oligonukleotidov, z ktorých boli tie, ktoré uvádza nasledujúci prehľad, vybrané a ďalej skúšané.

označenie 5'-sekvencia-3' poloha v géne CD44 identifikačné číslo „antisense oligonukleotid ICN - 240 5'ATTCGAAATG AAACAA 1620 i. č. 1 ICN - 248 5'TTTATCTTCT TCCAAGGCGA AGC 991 i . č. 2 ICN - 237 5'TTTATCTTCT TCCAAG 991 i . č. 3 ICN - 308 5'TTCCTCCCAG GAC 2038 i. č. 4 ICN - 310 5'AAATTTCCTC CCAG 2038 i. č. 5 ICN - 314 5'GGCAGGTTAT ATTCA 250 i . č. 6 „sense oligonukleotid ICN - 236 5'ATTTGAATAT AACCTGGCGA AGC 246 i.č. 7 náhodný oligonukleotid ICN - 88 5'TGCCAGACTA TTGTCCCA n/a i .č. 8

Všetky skúšané oligonukleotidy sa syntetizovali na automatickom syntetizátore DNA (Model 394, Applied Biosystems) ako fosfodiestery použitím štandardného fosforoamiditového postupu. Výsledné oligonukleotidy sa prečistili na HPLC pomocou polopreparačnej kolóny C8 s reverznou fázou (ABI) a 5 % lineárnym gradientom acetonitrilu v 0,1 M acetáte trietylamónnom a acetonitrile. Čistota výsledných produktov sa kontrolovala na HPLC s analytickou kolónou C18 (Beckman).

Testovanie všetkých oligonukleotidov prebiehalo na líniách NCI-H460 a NCI-H661 velkobunkového pľúcneho karcinómu a línii Hs294T melanómových rakovinových buniek z Americkej zbierky typových kultúr (ATCC). Bunky sa pestovali štandardným rutinným spôsobom v zvlhčenom inkubátore pri 37 °C v atmosfére 5 % CO2 /

95 % vzduch pri normálnom atmosférickom tlaku. Obe bunkové línie sa pestovali ako adherentné kultúry v 90% médiu RPMI 164 0 doplnenom 10% fetálnym hovädzím sérom. Bunky sa vysiali na mikrotitračnú doštičku s 96 jamkami s počtom 2 000 buniek na jamku, a potom sa podrobili pôsobeniu „sense aj „antisense oligonukleotidov, (ktoré sú podrobne charakterizované nižšie) v koncentráciách

0,1, 0,25, 0,5 a 1,0 μΜ. Po 72 hodinách kultivácie sa bunky označili pulzom (³H)tymidínu s aktivitou 1 pC/ml a kultivovali ďalšie dve hodiny, potom sa analyzovali automatickým zberačom Harvester

96 (Tomtec) a inkorporácia (³H)tymidínu sa zmerala β-počítačom. Všetky kultúry sa pestovali v troch opakovaniach a všetky pokusy sa opakovali trikrát, aby sa zaistila presnosť výsledkov.

V predbežnom sledovaní plúcneho karcinómu sa vzorky bunkových línií NCI-H460 a NCI-H661 inkubovali v prítomnosti každého z oligonukleotidov v koncentrácii 0,5 μΜ 72 hodín, a potom sa testovali na inhibíciu DNA. Obr. 1 ukazuje výsledky testov. Šesť „antisense oligonukleotidov ICN - 240 (sekvencia i.č. 1), ICN 248 (sekvencia i.č. 2), ICN - 237 (sekvencia i.č. 3), ICN - 308 (sekvencia i.č. 4), ICN - 310 (sekvencia i.č. 5) a ICN - 314 (sekvencia i.č. 6) takmer úplne obmedzilo bunkový rast plúcneho karcinómu, zatiaľ čo ostatné oligonukleotidy mali len minimálny vplyv na bunkový rast.

Obr. 2 ukazuje výsledky testovania šiestich vybraných oligonukleotidov na cytotoxicitu pomocou príjmu neutrálnej červene (Clonetics, San Diego) pri oboch líniách plúcneho karcinómu. Výsledky na bunkách v prítomnosti ktoréhokoľvek z oligonukleotidov sú zhodné s výsledkami bez neho, čo dokazuje, že oligonukleotidy nie sú pri svojom pôsobení cytotoxické.

Obr. 3A a 3B ukazujú výsledky testu 3, „antisense oligonukleotidov ICN - 240, (sekvencia i.č. 1), ICN - 237 (sekvencia i.č. 3) a ICN - 308 (sekvencia i.č. 4) a jedného „sense oligonukleotidu ICN - 236 (sekvencia i.č. 7) závislosti účinku na dávke. V pokuse boli bunky oboch karcinómových línií ošetrené 'oztokom oligonukleotidov v koncentráciách 0,1, 0,25, 0,5 a 1,0 ;.iM 72 hodín. Všetky „antisense oiigonukleotidy ukazovali zvyšujúci sa inhibičný účinok na bunkový rast s rastúcou koncentráciou, pričom bunkový rast sa inhiboval z 55 až 95 % pri koncentráciách 0,25 a 0,5 μΜ. Rastúca koncentrácia „sense oligonukleotidu (ICN - 236, sekvenciu i.č. 7) neovplyvňovala bunkový rast.

Obr. 4A a 4B ukazujú výsledky skúšania oligonukleotidov ICN - 237 (sekvencia i.č. 3), ICN - 240 (sekvencia i.č. 1) a ICN (sekvencia i.č. 4) na oboch líniách buniek pľúcneho karcinómu počas 6 dní. Ako je vidieť, najvyššia inhibícia (20 až 45 %) sa dosiahla medzi 24 a 48 hodinami pôsobenia pri všetkých 3 vybraných „antisense oligonukleotidoch a po 72 až 120 hodinách bol už účinok v podstate nepoznateľný.

Sekvenčná špecifickosť niekoľkých oligonukleotidov, ICN - 88

(sekvencia i.č. 8), ICN - 236 (sekvencia i. č. 7), ICN - 237 (sekvencia i .č. 3), ICN - 240 (sekvencia i. č. 1), ICN - 248 (sekvencia i .č. 2) a ICN - 308 (sekvencia i .č. 4) sa overila po- mocou reverznej transkripcie a PCR (RT - PCR) . RNA pre RT - PCR

z oboch karcinómových línií a melanómu sa izolovala spôsobom, ktorý používa guanidinizotiokyanát (mikroizolačný systém RNA s centrifugačnými kolónkami GlassMax, Gibco BLR). Syntéza prvého reťazca cDNA sa vykonala s 0,5 g celkovej RNA, primerom oligo(T) a reverznou transkriptázou M-MLV podľa pokynov výrobcu (Perkin Elmer Cetus). Potom sa vybrali také primery, ktoré špecificky nasadajú na určité oblasti génu CD44, a tak amplifikujú úseky génu kódujúce špecifické proteiny CD44. Primery a sonda DNA na test s ľudskou CD44 cDNA vychádzali zo sekvencie, ktorú publikoval Stamenkovic a kol. (1989) a sú uvedené v nasledujúcom prehľade .

primer sekvencia 5'- 3' poloha i.č. sek- (bp) venčia P - 1 GACACATATT GCTTCAATGC TTCAGC 520 9 P - 2 GATGCCAAGA TGATCAGCCA TTCTGGAAT 920 10 P - 3 AGCAGAGTAA TTCTCAGAG 947 11 P - 4 CTGATAAGGA ACGATTGACA 1221 12 P - 5 GAGACCAAGA CACATTCCAC CCCAG 1241 13 P - 6 ACTCCTTGTT CACCAAATGC A 1561 14 P - 7 ACACCTTGTT CACCAAATGC A 182 15

Printery P - 1 (sekvencie i.č. 9) a P - 2 (sekvencie i.č. 10) sú zhodné s printermi, ktoré publikoval Matsamura a Tarin (27) a sú navrhnuté tak, aby amplifikovali štandardnú časť CD44. PCR s primermi P - 1 a P - 2 vedú k syntéze fragmentu s veľkosťou 480 bp pri vzorkách, ktoré exprimujú štandardné CD44, zatiaľ čo výsledný fragment vzoriek exprimujúcich epitelovú formu CD44 má veľkosť 878 bp a vzorky s inak zostrihanými transkriptami spôsobujú vznik niekoľkých rôzne dlhých fragmentov. cDNA každej vzorky (10 % celkového množstva) sa použilo ako templát pre PCR v reakčnej zmesi obsahujúcej lx Taq pufor, MgCl₂ (1,5 mM), dNTP (500 μΜ), vhodné 5' a 3' primery a Taq polymerázu (50 U/ml). Parametre cyklovania PCR boli 55 °C po 8 min., 94 °C po 1 min., 55 °C po 1 min. a 72 °C po 2 min., celkom 35 cyklov, a na záver ešte 72 °C po 8 min.

Aby sa zistilo, ako každý z vybraných oligonukleotidov inhibuje expresiu mRNA pre CD44, sa expresia mRNA CD44 skúmala pomocou kombinácie RT-PCR a Southernovho prenosu. Primery P - 1 (sekvencia i.č. 9) a P - 2 (sekvencia i.č. 10) použité v PCR sú odvodené zo sekvencie exónov (1 až 5 a 16 až 20) kódujúcich sekvencie štandardnej izoformy, susediacej s vloženými sekvenciami variantnej izoformy. Ako sa dalo očakávať podľa publikovaných údajov (29) a podlá predchádzajúcich výsledkov uvedených na Obr.

5, PCR s printermi P - 1 (sekvencia i.č. 9) a P - 2 (sekvencia

i.č. 10) viedli len ku vzniku štandardnej izoformy CD44. RNA sa pripravila z buniek oboch línií pľúcneho karcinómu, z ktorých niektoré sa ošetrili „antisense oligonukleotidmi (0,5 μΜ po 2 hod.) a iné neošetrili. Skúšalo sa vybraných 6 oligonukleotidov a jeden „sense oligonukleotid a jeden náhodný oligonukleotid ako kontroly (Obr. 6) . Po RT - PCR a analýze Southernovým prenosom sa zistilo, že 3 vybrané „antisense oligonukleotidy opakovane silne inhibujú expresiu CD44 mRNA pri bunkovej línii NCIH4 60 (Obr. 6., dráha 1, ICN - 237, sekvencia i.č. 3, dráha 3: ICN - 240, sekvencia i.č. 1 a dráha 5: ICN - 308, sekvencia i.č. 4) . Podobne to bolo aj pri línii NCI - H661 (Obr. 8, dráha 2: ICN - 237, sekvencia i.č. 3, dráha 3: ICN - 240, sekvencia i.č. 1 a dráha 5: ICN - 308, sekvencia i.č. 4) . Oproti tomu expresia CD44 bola pozitívna pri neošetrených bunkách (Obr. 8, dráha 1) alebo pri bunkách ošetrených „sense oligonukleotidom alebo náhodným oligonukleotidom (Obr. 8, dráha 4: ICN - 236, sekvencia i.č. 7, dráha 6: ICN - 88, sekvencia i.č. 8).

Podávanie oligonukleotidov je odborníkom dobre známe pre vela druhov zvierat vrátane cicavcov a tiež vrátane človeka. Je možné sa úplne odvolať na publikáciu „Delivery Strategies for Antisense Oligonuleotide Therapeutics (Saghir Akhtar, ed., CRC Press, 1995), v ktorej sa detailne opisujú mnohé spôsoby a stratégie podávania. Ako príklad sa v kapitole 5 (str. 71 až 83) uvádza (pričom sa tým neobmedzuje použiteľnosť celej knihy na tento vynález) podávanie tradičným intravenóznym, intraperitoneálnym a subkutánnym spôsobom, a tiež neinvazivnym spôsobom podávania, ako je napr. podávanie intranazálne, okulárne, transdermálne a ionoforetické. Všetky vyššie opísané spôsoby sú použiteľné v predkladanom vynáleze. Šiesta kapitola vyššie citovanej knihy sa zaoberá modifikáciami oligonukleotidov, ktoré robia terapeutické nukleotidy rezistentnými voči nukleázam a termíny nukleotid, nukleotidy, oligonukleotid, oligonukleotidy a bázy nukleovej kyseliny, ktoré sa používajú, zahŕňajú aj tieto opísané modifikácie, a tiež všetky ďalšie konzervatívne modifikácie prirodzených foriem týchto zlúčenín (str. 85 až 104). Oligonukleotidy podľa vynálezu sa môžu naviazať na lipidy alebo iné zlúčeniny, ktoré sú aktívne transportované cez bunkovú membránu, či už so spojovacím článkom alebo bez neho, a potom podávané perorálne, ako opisuje patent U.S. 5 411 947, na ktorý sa týmto odkazuje. Oligonukleotidy podľa predkladaného vynálezu sa môžu podávať tiež v „nahej forme, kapsulované v tobolkách, alebo konjugované vo vezikuloch, lipozómoch, perličkách alebo mikroguličkách, alebo ako aerosól podávané priamo do pľúc použitím napr. výrobku SPAG 2, ICN Biomedicals. Oligonukleotidy podľa vynálezu sa môžu podávať v podstate všetkými spôsobmi doposiaľ opísanými pre oligonukleotidy, vrátane všetkých prijateľných modifikácii, vytvárajúcich analógy a predlieky, a vrátane všetkých vhodných spojív a excipientov, dávkových foriem a liečebných režimov.

V súčasnosti je najvýhodnejšou formou podávanie oligonukleotidov podľa predkladaného vynálezu intravenózne podávanie v množstve od 0,1 mg do 10 mg oligonukleotidu na 1 kg telesnej hmotnosti pacienta, a to 1 až 2x denne počas 40 dní. Takýto liečebný režim vychádza z pozorovania, že polčas účinku podobných oligonukleotidov in vivo je za niekoľko hodín a ovplyvnenie syntézy proteínov pretrváva 48 až 72 hodín. Špecifický liečebný režim jednotlivých pacientov bude samozrejme závisieť na skúsenosti klinického lekára a na jeho posúdení ochorenia pacienta, jeho vnímavosti, vedľajších účinkov a mnohých ďalších faktoroch, ktoré sú lekárom dobre známe. Napr. väčšia alebo menšia dávka, alebo dlhšia či kratšia doba podávania budú závisieť na úsudku ošetrujúceho lekára a navyše sa môže do liečebného režimu zaradiť aj obdobie, v ktorom je podávanie oligonukleotidu dočasne zastavené. Liečenie sa tiež môže komplikovať s ďalšou protirakovinovou alebo paliatívnou liečbou, pokiaľ je to vhodné. Progresia alebo remisia liečenej choroby sa môže sledovať určovaním veľkosti nádoru, rozsahu metastáz a sledovaním ďalších faktorov rádiologickou analýzou alebo inými spôsobmi známymi odborníkom, pričom výskyt a rozsah vedľajších účinkov sa môže určiť sledova ním funkcie čriev a/alebo ľadvín, sledovaním napr. krvného obehu pomocou EKG, a to všetko je odborníkom tiež dobre známe.

Predmetom vynálezu sú oligonukleotidy účinne kontrolujúce expresiu CD44 v nádorových bunkách, ktoré CD44 nadmerne exprimujú, obzvlášť v bunkách nemalobunkových pľúcnych karcinómov a v melanómových bunkách. Spôsoby použitia oligonukleotidov v klinickej praxi sú vo vynáleze tiež opísané. Zatiaľ čo vo vynáleze sú ukázané a opísané špecifické uskutočnenia vynálezu, odborníkom je zrejmé, že ďalšie modifikácie sú možné, pričom nedochádza k odchýleniu od vynálezcovskej myšlienky. Vynález teda nie je obmedzený inak ako patentovými nárokmi.

Citovaná literatúra:

1. Haynes F.B., Telen, J.M., Hale, P.L. Denning M.S. CD44 - A molecule involved in leukocyte adherence and T-cell activation. Immunology Today, 1989, 10 : 423 - 4282.

2. Penno MB, August JT, Baylin SB, Marbry M, Linnoila RI, Lee VS, Croteau D, Yang XL and Rosada C: Expression of CD44 in Human Lung Tumors. Cancer Res., 1994, 54, 1381 - 1387.

3. Lesley J, Hyman R and Kincade PW: CD44 and its Interaction with Extracellular Matrix. Adv. Immunol. 1994, 54 : 271 - 335.

4. Sherman L, Sleeman J., Herrlich P., Ponta H., Hyaluronate receptors: Key Players in Growth, Differentiation, Migration and Tumor Progression. Current Opinion in Celí Biology, 1994, 6 : 726 - 733.

5. Guntehrt U.CD44 : A Multitude of Isoforms with Diverse Functions. Current Topics in Microbiology and Immunology, 1993, 184: 47 - 55.

6. Herrlich P., Zoller M., Pals T., Ponta H., CD44 Splice Variants: Metastases Meet Lymphocytes. Immunol. Today, 1993, 14: 395 - 399.

7. Salles G, Zain M, Wei-meng J, Boussiotis VA and Shipp A: Alternatively Spliced CD44 Transcripts in Diffuse Large-Cell Lymphomas: Characterisation and Comparison with Normál Activated B Cells and Epithelial Malignancies. Blood, 1993, 82: 3539 - 3547.

8. Koopman G, Heider KH, Horst E, Adolf GR, van der Berg F, Ponta H, Herrlich P and Pals ST: Activated Human Lymphocytes and Aggressive Non-Hodgkin's Lymphomas Express a Homologue of the Rat Metastasis-associated Variant of CD44. J.Exp.Med., 1993, 177: 897 - 904.

9. Bartolazzi A, Peach R, Aruffo A, Stamenkovic I: Interaction Between CD44 and Hyaluronate is Directly Implicated in the Regulation of Tumor Development., J.Exp.Med., 1994, 180: 53 - 56.

10. Goodfellow PN, Banting G, Wiles MV, Tunnacliffe A, Parkar M, Solomon E, Dalchau R, Fabre JW: The Gene, MIC4, which Controls Expression of the Antigén Defined by Monoclonal Antibody F10.44.2, is on Human Chromosome 11. Eur.J.Immunol., 1982,¹ 12: 659 - 663.

11. Screaton GR, Beli MV, Jackson DG, Cornelis FB, Gerth U and Beli JI, Genomic Structure of DNA Encoding the Lymphocyte Homing Receptors CD44 Reveals at Least 12 Alternatively Spliced Exons.Proc.Natl.Acad.Sci, USA, 1992, 89: 12160 - 12164.

12. Aruffo A, Stamenkovic I, Melnick M, Underhill CB and Seed B: CD44 is the Principál Celí Surface Receptor for Hyaluronate. Celí, 1990, 61: 1303 - 1313.

13. Seiter S, Árch R, Reber S, Komitowski D, Hofmann M, Ponta H, Herrlich P, Matzku S and Zoller M: Prevention of Tumor Metastasis Formation by Anti-Variant CD44 J.Exp.Med., 1993, 1977: 443 455.

14. Li H, Hamou MF, Tribolet N, Jaufeerally R, Hofmann M, Diserens AC and Meir EG: Variant CD44 Adhesion Molecules are Express in Human Brain Metastases but not in Glioblastomas. Cancer Res.,

1993, 53: 5345 - 5349.

15. Merzak A, Koocheckpour S and Pilkington GJ: CD44 Mediates Human Glioma Celí Adhesion and Invasion in vitro. Cancer Res.,

1994, 54: 3988 - 3992.

16. Dali P, Heider KH, Hekele A, von Minckwitz G, Kaufmann M, Ponta H and Herrlich P: Surface Protein Expression and Messenger RNA-splicing Analysis of CD44 in Uterine Cervical Epithelium. Cancer Res., 1994, 54: 3337 - 3341.

17. Wielenga VJM, Heider KH, Offerhaus JA, Gunther RA, van der Berg EM, Ponta H, Herrlich P and Pals ST: Expression of CD44 Variant Proteins in Human Colorectal Cancer in related to Tumor Progression. Cancer Res., 1993, 53: 4754 - 4756.

18. Finn L, Dougherty G, Finley G, Meisler A, Becich M and Cooper DL: Alternatíve Splicing of CD44 pre-mRNA in Human Colorectal Tumors. Biochem.Biophy.Res.Commun., 1994, 200: 1015 - 1022.

19. Heider KH, Dammrich J, Skroch-Angel P, Muller-Hermelink HK, Vollmers HP, Herrlich P and Ponta H: Differential Expression of CD44 Splice Variants in Intestinal- and Diffuse- Type Human Gastric Carcinomas and Normál Gastric Mucosa. Cancer Res., 1993, 53: 4197 - 4203.

20. Joensuu H, Klemi PJ, Toikkanen S and Jalkanen S: Glycoprotein CD44 Expression and is Association with Survival in Breast Cancer. Amer. J. Pathol., 1993, 143: 867 - 874.

21. Kaufmann M, Heider KH, Sinn HP, von Minckwitz G, Ponta H, Herrlich P: CD44 Variant Exon Epitopes in Primary Breast Cancer and Length of Survival. Lancet, 1995, 345: 615 - 619.

22. Guo Y, Ma J, Wang J, Che X, Narula J, Bigby M, Wu M and Sy M, Inhibition of Human melanoma Growth and Metastasis in Vivo by

Anti-CD44 Monoclonal Antibody. Cancer Res., 1994, 54: 1561 1565.

23. Aaronson SA, Growth factor and cancer. Science, 254: 1146 1153, 1991.

24. Rodeck U, Growth Factor Idenpendence and Growth Factor Regulátory Pathways in Human Melanoma Development. Cancer and Metastasis Rev., 12: 219 - 226, 1993.

25. Birch M, Mitchell S and Hart IR: Isolation and Characterisation of Human Melanoma Celí Variants Expressing High and Low Levels of CD44. Cancer Res., 1991, 51, 6660 - 6667.

26. Stamenkovic I, Aruffo A, Amiot M, Seed B, : The Hematopoietic and Epithelial Forms of CD44 are Distinct Polypeptides with Different Adhesion Potentials for Hyaluronate-bearing Cells. The EMBO Journal, 1991: 343 - 348.

I

27. Matsuma Y, Tarin, Significance of CĎ44 Gene Products for Cancer Diagnostic and Evaluation. The Lancet, 1992, 340: 1053 1058.

28. Kao HT and Nevins JR, _________________________________, Mol. Cell.Biol. 1983, 2058 -206.

29. Iuima SN, Hamada H, Reddy P and Kakunaga T, Molecular Structure of the Human Cytoplasmic β-actin Gene: Inerspecies Homology of Sequences in the Introns. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82: 6133 - 6137.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr.l Stĺpcový graf ukazuje vplyv 22 rôznych oligonukleotidov na bunkový rast dvoch línií buniek pľúcneho karcinómu (NCI-H460 a NCI-H661). Oligonukleotidy zaujímavé pre túto aplikáciu sú:

1 - ICN - 240 (sekvencia identifikačného čísla 1)

3 - ICN - 248 (sekvencia i. č. 2) 6 - ICN - 237 (sekvencia i.č. 3) 11 - ICN - 308 (sekvencia i.č. 4) 13 - ICN - 310 (sekvencia i. č. 5) 17 - ICN - 314 (sekvencia i.č. 6)

Obr.2 Stĺpcový graf ukazujúci cytotoxicitu vybraných oligonukleotidov pre rakovinové bunky.

0br.3A a 3B Vplyv koncentrácie vybraných oligonukleotidov na bunkový rast dvoch línií buniek plúcneho karcinómu.

0br.4A a 4B. Časová závislosť vplyvu vybraných oligonukleotidov na bunkový rast dvoch línií buniek plúcneho karcinómu.

Obr.5 Fotografie produktov RT-PCR na agarózovom géli, znázorňujúce expresiu génu CD44, amplifikované s rôznymi pármi primerov pri neošetrených bunkách plúcneho karcinómu (NCI - 4 60) .

1 - PI (sekvencia i .č. 9) + P2 (sekvencia i .č. 10) 2 - P3 (sekvencia i.č. 11) + P4 (sekvencia i.č. 12) 3 - P5 (sekvencia i .č. 13) + P6 (sekvencia i.č. 14) 4 - P6 (sekvencia i .č. 14) + P7 (sekvencia i.č. 15)

5 - pHE7

6 - PCNA (jadrový antigén deliacich buniek)

7 - 100 bp štandard DNA

Obr.6 Autorádiogram analýzy produktu RT-PCR Southernovým prenosom po ošetrení ludských karcinómových buniek (NCI-H460) oligonukleotidmi s „antisense, „sense a náhodnou sekvenciou.

unt - neošetrené bunky

1 - ICN - 237 (sekvencia i.č. 3) 2 - ICN - 236 (sekvencia i. č. 7) 3 - ICN - 240 (sekvencia i .č. D 4 - ICN - 248 (sekvencia i.č. 2) 5 - ICN - 308 (sekvencia i.č. 4) 6 - ICN - 310 (sekvencia i.č. 5) 7 - ICN - 314 (sekvencia i.č. 6)

8 - ICN - 88 (sekvencia i.č. 8)

Obr.7 Fluororádiogram produktov RT-PCR s rádioaktívne označeným nukleotidfosfátom po ošetrení buniek pľúcneho karcinómu oligonukleotidmi s „antisense, „sense, a náhodnou sekvenciou, pričom pHE7 je vnútorná kontrola.

1 - ICN - 308 (sekvencia i.č. 4) 2 - ICN - 248 (sekvencia i .č. 2) 3 - ICN - 236 (sekvencia i.č. 7) 4 - ICN - 240 (sekvencia i. č. D 5 - ICN - 310 (sekvencia i. č. 5) 6 - ICN - 88 (sekvencia i .. č. 8)

Obr.8 Autorádiogram analýzy produktov RT-PCR Southernovým prenosom po ošetrení ľudských karcinómových buniek (NCI-H661) oligonukleotidmi s „antisense, „sense a náhodnou sekvenciou, pričom sa použil β-aktín ako vnútorná kontrola.

1 - neošetrené bunky

2 - ICN - 237 (sekvencia i.č. 3) 3 - ICN - 240 (sekvencia i .č. 1) 4 - ICN - 236 (sekvencia i .č. 7) 5 - ICN - 308 (sekvencia i.č. 4) 6 - ICN - 88 (sekvencia i w .c. 8)

Obr.9 Autorádiogram analýzy produktov RT-PCR Southernovým prenosom po ošetrení malanómových buniek (Hs294T) oligonukleotidmi s „antisense, „sense a náhodná sekvencia, pričom sa použil β-aktín ako vnútorná kontrola.

1 - neošetrené bunky

2 - ICN - 237 (sekvencia i.č. 3) 3 - ICN - 240 (sekvencia i. č. D 4 - ICN - 236 (sekvencia i. č. 7) 5 - ICN - 308 (sekvencia i.č. 4) 6 - ICN - 248 (sekvencia i .č. 2) 7 - ICN - 88 (sekvencia i .č. 8)

Obr.10 Stĺpcový graf ukazujúci inhibiciu ludských leukemických buniek (NB4) pri nahých myšiach po podaní oligonukleotidu ICN 240 (sekvencia identifikačného čísla 1).

Obr. 11A a 11B Stĺpcové grafy ukazujúce zastavenie rastu leukemických buniek NB4 a buniek ľudskej leukemickej línie Daudi po ošetrení nukleotidom ICN - 240 (sekvencia i.č. 1) a ICN - 967 (sekvencia i.č. 1) , čo je oligonukleotid ICN - 240 modifikovaný naviazaním na cukor. V oboch prípadoch bola koncentrácia oligonukleotidu 10 gg/ml.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Kvantitatívne stanovenie poklesu množstva molekúl mRNA CD44 po pôsobení „antisense oligonukleotidu bolo vykonané pomocou PCR s rádioaktívnou značkou. PCR prebiehalo v podstate rovnako s protokolom opísaným vyššie, okrem toho, že jeden deoxynukleoí tid sa rádioaktívne označil, a to viedlo k rádioaktívnemu označeniu výsledného produktu PCR. Výsledok ukázal, že pri použití koncentrácie „antisense oligonukleotidu 0,5 μΜ expresie mRNA CD44 sa znížila o 79 až 94 % po 2 hodinách pôsobenia, ako sa zmeralo denzitometrom (Obr.7., dráha 1: ICN - 308, sekvencia

i.č. 4, dráha 4: ICN - 240, sekvencia i.č. 1). Nič podobné sa nepozorovalo po ošetrení „sense oligonukleotidom alebo náhodným oligonukleotidom (Obr.7., dráha 3: ICN - 236, sekvencia i.č. 7), dráha 6: ICN - 88, sekvencia i. č. 8) ani po ošetrení inými „antisense oligonukleotidmi (Obr.7., dráha 2: ICN - 248, sekvencia i.č. 2, dráha 5: ICN - 310, sekvencia i.č. 5). Okrem toho žiadny testovaný oligonukleotid neovplyvnil úroveň expresie ribozomálnej RNA (pHE7), čo preukazuje selektivitu cielenú na mRNA CD44.

Príklad 2

Vzorky melanómových buniek (Hs294T) sa inkubovali za 4 „antisense oligonukleotidmi (Obr.9), ICN - 237 (sekvencia i.č.

3), ICN - 240 (sekvencia i.č. 1), ICN - 310 (sekvencia i.č. 5) a ICN - 248 (sekvencia i.č. 2), jedným „sense oligonukleotidom ICN - 236 (sekvencia i.č. 7) a jedným náhodným oligonukleotidom ICN - 88 (sekvencia i.č. 8). Po RT-PCR a Southernovej analýze sa zistilo, že dva „antisense oligonukleotidy inhibovali výrazne expresiu CD44 mRNA, ICN - 240 (sekvencia i.č. 1) s 91 % účinnosťou (Obr.9, dráha 3) a ICN - 248 (sekvencia i.č. 6) s 84 % účinnosťou (Obr. 9, dráha 5), a ďalší oligonukleotid ICN - 308 (sekvencia i.č. 4) inhiboval expresiu s 54 % účinnosťou (Obr. 9, dráha 5). Oligonukleotid ICN - 236 (sekvencia i.č. 4, Obr. 9, dráha 4) a náhodný oligonukleotid ICN - 88 (sekvencia i.č. 8, Obr. 9, dráha 7) a tiež neošetrené bunky (Obr.9, dráha 1) neukázali žiadny vplyv, β-aktín sa použil v tomto pokuse ako vnútorná kontrola.

Príklad 3

Inhibícia rastu buniek ľudskej leukémie (NB4) pri nahých myšiach (Obr. 10) po podaní oligonukleotidu ICN - 240 (sekvencia i. č. 1). Ukázalo sa, že oligonukleotid inhiboval in vi vo rast z 80 % počas obdobia 2 týždňov, a navyše sa neprejavil takmer žiadny okrajový rast leukemických buniek medzi 5 a 15 dňom.

Príklad 4

Zastavenie rastu leukemických buniek NB4 a buniek ľudskej leukémie Daudi (Obr. 11A a 11B) po ošetrení nukleotidom ICN-240 (sekvencie i.č. 1) a ICN - 967 (sekvencie i.č. 1), čo je ICN 240 modifikovaný naviazaním na cukor. Grafy ukazujú významné zvýšenie percenta leukemických buniek vo fáze G1.

Priemyselná využiteľnosť

Predkladaný vynález sa týka použitia protismerných („antisense) oligonukleotidov na kontrolu expresie CD44 v pľúcnych rakovinových bunkách, melanómových a leukemických bunkách. Niektoré z výhodných oligonukleotidov v tomto vynáleze ukazujú 95 % účinnosť, pričom je účinok sekvenčne špecifický a nie je toxický pre ostatné bunky. Predmetom vynálezu sú oligonukleotidy účinne kontrolujúce expresiu CD44 v nádorových bunkách, ktoré CD44 nadmerne exprimujú, obzvlášť bunky nemalobunkových pľúcnych karcinómov a melanómové bunky. Spôsoby použitia oligonukleotidov v klinickej praxi sú vo vynáleze tiež opísané.

/(/ /<frPATENTOVÉ NÁROKY

1. Oligonukleotid obsahujúci sekvenciu 5'TTT ATC TTC TTC CAA G (sekvenciu identifikačného čísla 3).

2. Oligonukleotid obsahujúci sekvenciu 5ΆΤΤ CGA AAT GAA ACA A (sekvenciu identifikačného čísla 1).

3. Oligonukleotid obsahujúci sekvenciu 5'AAA TTT CCT CCC AG (sekvenciu identifikačného čísla 5).

4. Oligonukleotid obsahujúci sekvenciu 5'TTT ATC TTC TTC CAA GGC GAA GC (sekvenciu identifikačného čísla 2).

5. Oligonukleotid podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, ktorý je schopný hybridizovať s génom CD44.

6. Oligonukleotid schopný znížiť expresiu génu CD44 v bunkách pľúcnej rakoviny o viac ako 50 %.

7. Oligonukleotid schopný znížiť expresiu génu CD44 v bunkách nemalobunkového pľúcneho karcinómu o viac ako 50 %.

8 . Oligonukleotid schopný znížiť expresiu génu CD44 v melanómových bunkách o viac ako 50 %. • 9 Oligonukleotid schopný znížiť expresiu génu CD44 v leukemických bunkách o viac ako 50 %.

10. Oligonukleotid, ktorý má veľkosť 13 až 24 bázových párov a je komplementárny k niektorej časti kódujúcej sekvenciu génu CD44 v úseku vymedzenom polohami 250 až 2038.

11. Oligonukleotid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 6 až 10, ktorý obsahuje 13 až 24 (vrátane) bází nukleovej kyseliny.

12. Oligonukleotid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 6 až 10, ktorý obsahuje molekulu DNA.

13. Spôsob liečenia pacientov s novotvarmi, ktoré sú spôsobené aspoň čiastočne CD44, vyznačujúci sa tým, že obsahuje krok podania pacientovi účinného množstva oligonukleotidu schopného znížiť expresiu génu CD44.

14. Spôsob podlá nároku 13, vyznačujúci sa tým, že novotvar je nemalobunkový pľúcny karcinóm.

15. Spôsob podlá nároku 13, vyznačujúci sa tým, že použitý oligonukleotid obsahuje aspoň jednu zo sekvencií 5ΆΤΤ CGA AAT GAA ACA A (sekvencia identifikačného čísla 1), 5'TTT ATC TTC TTC CAA G (sekvencia i.č. 3) a 5'AAA TTT CCT CCC AG (sekvencia i.č. 5).

16. Spôsob podlá nároku 13, vyznačujúci sa tým, že novotvar je melanóm.

17. Spôsob podlá ktoréhokoľvek z nárokov 13 až 16, vyznač sahuje aspoň jednu sa t ý m, že použitý oligonukleotid obzo sekvencií 5ΆΤΤ CGA AAT GAA ACA A

5'TTT ATC TTC TTC CAA GGC

GAA

GC (sekvencia i.č.

2) a 5'AAA TTT

CCT CCC AG (sekvencia i.č.

18.

Spôsob podlá ktoréhokoľvek z nárokov 13 až 16, jeden neho, načuj úci sa t ý m, že spôsob podávania je aspoň zo spôsobu intravenózneho, intraperitoneálneho, intranazálneho, okulárneho, intrabronchiálneho, subkutánintrapulmonálneho, transdermálneho a ionoforetického.

19. Spôsob podlá ktoréhokoľvek z nárokov 13 až 16, vyznačujúci sa tým, že sa podáva oligonukleotid v aspoň jednej z foriem ako je forma odolná nukleázam, naviazaný k lipidu alebo inej zlúčenine, ktorá sa aktívne prenáša cez bunkovú membránu, alebo je v „nahej forme, kapsulovaný, spojený s vezikulmi, lipozómami, adherovaný na perličky alebo mikrosféry, ako je konjugát alebo aerosól.