JP2005504062A - 癌治療剤としての野生型ras - Google Patents
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Abstract
細胞、特に癌細胞の増殖を阻害する方法が提供される。この方法は、細胞内の1つまたは複数の野生型rasタンパク質の細胞内レベルを上昇させることを含む。一局面において、この方法は細胞内の野生型rasタンパク質をコードする核酸分子を導入し、発現させることを含む。別の局面において、1つまたは複数のrasタンパク質の細胞内レベルを、細胞内に1つまたは複数の野生型rasタンパク質を導入することによって増加させる。本発明は、腫瘍または癌の治療における野生型タンパク質あるいは1つまたは複数の野生型rasタンパク質をコードする核酸の治療的使用、または腫瘍または癌の形成の予防的抑制にも関する。ヒトまたは他の哺乳動物における癌を特徴づけまたは評価する方法が提供される。
Description
【技術分野】
【0001】
本出願は、2001年8月24日に出願された米国仮出願出願番号60/314,693から優先権を主張しており、その全体を本明細書に援用する。
【0002】
本発明は、少なくとも一部は国立衛生研究所からの助成金(R01CA58554号およびR01CA78797号)による支援を受けた。連邦政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【0003】
背景
ras遺伝子は、遺伝子の中のrasスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、ヒトおよび齧歯類を含むさまざまな種に存在する。このスーパー遺伝子ファミリーは、多くの多様な細胞内シグナル伝達経路に重要なグアニン三リン酸結合部位を有する構造的に関連するタンパク質をコードする、50以上の遺伝子からなる。このスーパー遺伝子ファミリーのrasサブファミリーは、H−ras、K−ras(Kras2としても知られる)、N−ras、ならびにRAPおよびREL遺伝子からなる(Bredel and Pollack, 1999, Brain Res Rev, 29:232−49; Beaupre and Kuzrock, 1999, J. Clin Oncol, 17:1071−9.)。それぞれのヒトras遺伝子の染色体上の位置は、当該分野において既知である。
【0004】
3つのras遺伝子(H−ras、K−rasおよびN−ras)は、約7〜35キロ塩基対の染色体DNAにわたる6または7つのエキソンを包含する。特定のras遺伝子によっては、タンパク質コード領域を含む4つまたは5つのエキソンが存在する。これらのコードエキソンの初めの3つの中には、GDP/GTP結合およびGTPアーゼ機能のrasタンパク質をコードする領域がある。3つのras遺伝子は、約189アミノ酸長のp21タンパク質をコードし、p21タンパク質は、活性なGTP結合状態にある場合は、細胞膜の内部表面に位置する。特に、チロシンキナーゼレセプターがそのリガンド(例えば、増殖(増殖)因子またはホルモン)の結合によって活性化される場合、p21−rasタンパク質の活性化によって細胞内シグナル伝達が開始する(Bredel and Pollack, 1999, Brain Res Rev, 29:232−49.; McCormick, 1995, Curr Opin Genet Dev, 5:51−5.; McCormick, 1994, Curr Opin Genet Dev, 4:71−6.)。ras/Erk経路におけるその後の下流シグナル伝達は、多数の転写因子を活性化し、これは、細胞型および外部刺激に依存して、細胞増殖または分化を調節する。
【0005】
ras/Erk経路は、幾つかのGTPアーゼ活性タンパク質(GAP)によって負に(negatively)調節される。タンパク質複合体がp21−rasとGAPとの間に形成される場合、p21−rasタンパク質の微弱な固有のGTPアーゼ活性を大きく高める(McCormick, 1995, Curr Opin Genet Dev, 5:51−5.; Ahmadian, et al., 1996, J Biol Chem, 271:16409−15. )。この増加したGTPアーゼ活性は、GTPをGDPに触媒し、活性GTP:p21−rasを、下流のシグナル伝達を停止させる不活性GDP:p21−rasに戻す。内部シグナル伝達経路に関与する非レセプタータンパク質チロシンキナーゼは、p21−rasおよびras/Erk経路も活性化し得る(Rozakis−Adcock, et al., 1992, Nature, 360:689−92., McCormick, 1993, Ciba Found Symp, 176:1−5; Baltensperger, et al., 1993, Science, 260:1950−2.)。p21−rasタンパク質およびras/Erk経路の調節は、上記引用文献に記載の多くのタンパク質の相互作用および酵素活性によって制御される。
【0006】
ras遺伝子の特に重要な局面は、それが腫瘍形成において重要な役割を果たすことである。野生型状態では、ras遺伝子は非腫瘍形成性である。しかしながら、様々なrasの変異(いわゆる「活性化」変異)は、ras遺伝子を腫瘍形成性にし、ras遺伝子の発現が動物において悪性疾患を引き起こしたり、培養細胞の形質転換を引き起こしたりする。野生型の非腫瘍形成性状態では、ras遺伝子はいわゆる原癌遺伝子である。活性化変異を有するras遺伝子は、癌遺伝子であるといわれる。
【0007】
ras遺伝子における活性化点変異は、他のどの原癌遺伝子よりも、より多くのヒト腫瘍型においてより高い頻度(全ヒト腫瘍の25〜30%)で検出されている(Beaupre and Kurzrock, 1999, J Clin Oncol, 17:1071−9.; Anderson, et al., 1992, Environ Health Perspect, 98:13−24., Bos, 1989, Cancer Res, 49:4682−9.; Rodenhuis and Slebos, 1992, Cancer Res, 52:2665s−69s.)。例えば、40〜50%の結腸癌(Bos, et al, 1987, Nature, 327:293−7.; Forrester, et al., 1987, Nature, 327:298−303.; Burmer, et al., 1991, Environ Health Perspect, 93:27−31.);80%の膵臓癌(Burmer, et al., 1991, Environ Health Perspect, 93:27−31.; Mariyama et al., 1989, Jpn J Cancer Res, 80:622−6.; Shibata, et al., 1990, Cancer Res, 50:1279−83.; Pinto, et al., 1997, Acta Cytol, 41:427−34);および30〜50%の肺腺癌(Rodenhuis and Slebos, 1992, Cancer Res, 52:2665s−69s.; Rodenhuis, et al., 1988, Cancer Res, 48:5738−41.; Reynolds, et al., 1991, Proc Natl Acad Sci USA, 88:1085−9.; Suzuki, et al., 1990, Oncogene, 5:1037−43.; Li, et al., 1994, Lung Cancer, 11:19−27.; Mills et al., 1995, Cancer Res, 55:1444−7.)において、変異が検出される。K−ras変異は、この腫瘍型において観察される活性化ras変異のうちの、90%を上回る割合を占める。さらに、活性化ras変異は、骨髄起源、精上皮腫、乳癌、グリア芽細胞腫および神経芽細胞腫の造血性腫瘍(hematopoietic neoplasia)において見られる。ras変異は、胃、膀胱、前立腺、皮膚、甲状腺、頭頸部、子宮内膜、肝臓、卵巣、腎臓、睾丸等の癌においても見られる。活性化されたras原癌遺伝子は、多数の齧歯類において生成された自然発生腫瘍および化学誘導腫瘍においても検出されてきた(Anderson, at al., 1992, Environ Health Perspect, 98:13−24.; Balmain and Brown, 1988, Adv Cancer Res, 51:147−82; Guerrero and Pellicer, 1987, Mutat Res, 185:293−308.)。例えばK−ras原癌遺伝子は、マウスの肺腫瘍において検出される。
【0008】
全ての変異が腫瘍形成性であるras遺伝子をもたらすとは限らないため、ras内の全ての変異が「活性化する」とは限らない。ras原癌遺伝子の変異の活性化は、常にとは限らないが、遺伝子の12番目、13番目および61番目のコドンにおいて優勢に起こる。活性化変異は、コドン59、63、116、117、119、145および146においても見られる。これらの変異の結果は、外部刺激の非存在下において、細胞内のras/Erkシグナル伝達経路を継続的にアップレギュレートすることである。したがって、細胞増殖において重要な役割を果たすシグナル伝達経路は、構造的にオンになる(turned on)(McCormick, 1994, Curr Opin Genet Dev, 4:71−6.; Lowy and Willumsen, 1993, Annu Rev Biochem, 62:851−91)。変異型腫瘍形成性p21と野生型p21との生物学的活性の最初に観察された差異は固有のGTPアーゼ活性であり、バリン−12腫瘍形成性変異と比較して、野生型において10倍高かった。その後、固有のGTPアーゼ活性を、ヒト腫瘍および野生型rasタンパク質において観察されるp21の幾つかの変異形態を区別するのに用いることはできないことがわかった(Trahey and McCormick, 1987, Science, 238:542−5.)。GAPの発見後、コドン12、13または61に変異を有する腫瘍形成性p21と野生型p21との主な生化学的差異は、活性p21:GTP複合体におけるGTP加水分解を誘導するGAPの能力であることが示された。GAP誘導性加水分解は、rasのこの変異形態よりも野生型p21において1000倍であり得る(Vogel, et al., 1988, Nature, 335:90−3.; Gibbs, et al., 1988, Proc Natl Acad Sci USA, 85:5026−30.)。したがって変異形態は、野生型よりも長く活性GTP形態で残存し、変異形態による継続的なシグナル伝達は、少なくとも一部は、腫瘍形成性を招く。
【0009】
活性化されたras癌遺伝子は、遺伝学的に「優性」といわれてきた。優性な遺伝子変異は、たとえその遺伝子の相同な野生型対立遺伝子が同一の細胞にも発現しても、その遺伝子の表現型を産生するものである。変異遺伝子産物によって産生される表現型は、同一の遺伝子の野生型対立遺伝子の発現の結果生じる表現型を支配するといわれる。活性化されたras対立遺伝子は腫瘍形成性であるため、たとえ野生型対立遺伝子も発現したとしても、ras癌遺伝子は優性な変異といわれる(Barbacid, 1987, Annu Rev Biochem, 56:779−827; Marshall, 1991, Pa Med, 94:10.)。
【0010】
しかしながら、ras癌遺伝子が優性であるとの特徴づけは、満足でない場合がある。真の「優性な」変異をコードする遺伝子は、遺伝子発現の通常のレベル(上昇あるいは過剰発現レベルではない)で、および上記のようにその遺伝子の相同な非変異型対立遺伝子の発現の存在下で、その遺伝子の表現型を産生する。幾つかの研究により、形質転換ras癌遺伝子は通常のレベルで発現せず、通常のレベルよりも高いレベルで発現するということが示唆されている。例えば、マウスNIH/3T3細胞の他に変異型ras対立遺伝子でインビトロで形質転換された他の齧歯類細胞においても、変異型ras対立遺伝子は、対照細胞よりも高いレベルで発現する(Hua, et al., 1997, Proc Natl Acad Sci USA, 94:9614−9.; You, et al., 1989, Proc Natl Acad Sci USA, 86:3070−4.; Guerreo et al., 1984, Proc Natl Acad Sci USA, 81:202−5.; Spandidos and Wilkie, 1984, Nature, 310:469−75.)。さらに、ヒト腫瘍細胞株から単離された第一の腫瘍形成性ras対立遺伝子であった変異型EJ H−ras1対立遺伝子は、12番目のコドン変異だけでなく、通常のras対立遺伝子と比較して少なくとも10倍発現を増加させる、最後のイントロンにおける変異も含む(Cohen and Levinson, 1988, Nature, 334:119−24.)。最終的に、Finney およびBishop(Finney and Bishop, 1993, Science, 260:1524−7.)は相同組み換えを用いて、ある野生型H−ras対立遺伝子を形質転換変異型H−ras対立遺伝子に置換した。通常のおよび変異型のH−ras相同遺伝子の双方が同程度に発現したが、異型接合細胞は形質転換されなかった。自然に形質転換された細胞が異型接合細胞の培養から生じ、形質転換された細胞の変異型対立遺伝子は増幅されていた。これらの特定の研究により、ras癌遺伝子の腫瘍形成能は高い発現レベル(優性な変異と矛盾した要件)によって決まるということが示唆された。
【0011】
活性化されたras癌遺伝子の腫瘍形成活性は、優性な変異の活性として適切に特徴づけされていないため、活性化されたras癌遺伝子の形質転換または腫瘍形成活性のより完全な記載を必要とする。このような記載は、癌(特に、活性化されたras癌遺伝子によって引き起こされた癌)のより良い治療を提供すると考えられる。このような記載により、ras癌遺伝子によって引き起こされた癌のより良い診断法および予後判定法も提供される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
既存の抗ras療法は、転写後に生物学的に活性となるように変更されなければならない不活性な前駆体としてrasタンパク質を合成する(Casey, et al., 1989, Proc Natl Acad Sci USA, 86:8323−7.; Hancock, et al., 1989, Cell, 57:1167−77.)、という事実を活用する。このような改変の第一ステップは、炭素数15のイソプレノイド(すなわちファルネソール)を、ファーネシルトランスフェラーゼ(FTase)によりCAAXモチーフのC末端システインに付加することである(Hancock, et al., 1989, Cell, 57:1167−77.)。ゲラニルゲラニル化は、ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ−I(GGTアーゼ−I)によってCAAXモチーフへの炭素数20の部分の付加をもたらす、別の転写後のステップである。既存の抗ras療法は、これらの転写後のステップを選択的に妨げる戦略を利用する(Gibbs et al., 1993, J Biol Chem, 268:7617−20.; Tamanoi, 1993, Trends Biochem Sci, 18:349−53.; Lerner et al., 1995, J Biol Chem, 270:26770−3.)。これらの戦略が有する1つの問題は、これらの転写後のステップの阻害が、活性化されたrasタンパク質の活性のみでなく、腫瘍サプレッサー活性を有する既存の野生型rasタンパク質も阻害することである。別の問題は、rasタンパク質以外のタンパク質が、上記のように転写後に変更されることである。したがって、これらのステップの阻害は、ras以外のタンパク質が影響されると思われるという点で、非特異性である。本明細書に記載された方法(野生型rasの発現)は、これらの欠失の支配下にない。
【課題を解決するための手段】
【0013】
発明の要旨
野生型ras遺伝子は、特に、腫瘍形成性または形質転換表現型が活性化されたras遺伝子または活性化されたrasシグナル伝達経路によって引き起こされる場合、細胞の腫瘍形成性または形質転換表現型を抑制する(すなわち、細胞増殖を阻害する)ことを本発明者らは見出した。したがって、本発明は、細胞、特に癌細胞の増殖を阻害する方法を提供する。この方法は、細胞内における1つまたは複数の野生型rasタンパク質の細胞内レベルを増加させることを含む。一局面においては、この方法は、野生型rasタンパク質をコードする細胞に核酸分子を導入することを含む。導入された核酸はDNAであり得て、この場合、この核酸は野生型rasタンパク質をコードする配列に動作可能に結合する転写プロモーターをさらに含む。導入された核酸は、野生型rasタンパク質または断片をコードし、細胞内のポリペプチドに翻訳されることが可能であるRNAでもあり得る。いずれの場合においても、1つまたは複数の野生型rasタンパク質の細胞内レベルの増加が起こり、細胞増殖が阻害される。増殖細胞がヒトまたは他の動物の腫瘍の範囲内にある場合、細胞増殖の阻害は腫瘍の拡大を停止または減速し、腫瘍の大きさを減少させ、または人体から腫瘍を除去しさえする。
【0014】
別の局面においては、1つまたは複数のrasタンパク質の細胞内レベルは、1つまたは複数の野生型rasタンパク質を細胞内に導入することによって増加する。野生型rasタンパク質の細胞内への導入は、タンパク質形質導入ドメインをタンパク質に加えることによって促進され得る。タンパク質形質導入ドメインは、タンパク質の取り込みを促進する。このよう内在化したrasタンパク質は、タンパク質を取り込んだ細胞の増殖を阻害する。タンパク質形質導入ドメインを含むrasタンパク質は、注射または吸入等の手段によりヒトまたは他の動物に効果的に投与されることが可能である。
【0015】
本発明は、腫瘍または癌の治療において1つまたは複数の野生型rasタンパク質をコードする野生型rasタンパク質または核酸の治療的使用、または腫瘍または癌の形成の予防的抑制にも関する。特定の癌(すなわち、ハイリスク群)と診断される確率が平均以上であり、野生型rasの予防的使用の候補者と思われるヒトの群が存在する。このようなヒトの群は、特定の環境的状況(例えば、ヘビースモーカー)に暴露されるため、特定の癌への家族性感受性のために(例えば、感受性の増加を引き起こす遺伝子の遺伝的継承)、または他の理由のために、ハイリスクであり得る。このような野生型rasの治療的または予防的使用は、治療に有効な量の1つまたは複数の野生型rasタンパク質またはこのようなタンパク質をコードする核酸分子を、個体に投与することを含む。
【0016】
本発明は、細胞内の野生型rasタンパク質、またはその増殖抑制断片の濃度を増加させることによって細胞内のERK MAPキナーゼの活性を減少させる方法も提供する。細胞内の濃度を増加させることは、細胞である野生型rasタンパク質をコードするDNA分子を導入して発現させること、または1つまたは複数の野生型rasタンパク質を細胞に導入することのいずれかによって提供される。
【0017】
本発明は、ヒトまたは他の哺乳動物の癌を特徴づけし、評価する方法も提供する。一実施形態においては、この方法は、被検体から得られた腫瘍細胞のゲノムの1つまたは複数の内因性ras対立遺伝子における機能損失変異をアッセイすることを含む。別の実施形態においては、この方法は、1つまたは複数の内因性ras対立遺伝子における機能損失変異、および被検体から得られた腫瘍細胞の1つまたは複数のras対立遺伝子における活性化変異をアッセイすることを含む。特定の場合においては、機能損失変異は、癌細胞において減少したレベルのrasタンパク質の産生をもたらす。他の場合においては、機能損失変異は、野生型rasタンパク質が有する増殖抑制機能を失ったrasタンパク質の産生をもたらす。活性化されたrasによって引き起こされた最も活動的な癌は、活性化されたras対立遺伝子および野生型rasの増殖抑制活性を欠如する第二のras対立遺伝子の双方を含むため、この方法は、このような癌およびこのような癌を有するヒトまたは動物の予後の診断を提供する。
【0018】
本発明は、異型接合rasノックアウトマウスにおける肺腫瘍形成を誘導する方法にも関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【0019】
発明の詳細な説明
(定義)
本明細書において「野生型」とは、特定の遺伝子を含む生物体または細胞の大部分に見られる配列である遺伝子のヌクレオチド配列またはその遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列をいう。遺伝子またはタンパク質が野生型でない場合、それは変異体である。変異体遺伝子は、野生型遺伝子の配列とは異なるヌクレオチド配列を有する。変異体タンパク質は、野生型タンパク質の配列とは異なるアミノ酸配列を有する。
【0020】
本明細書において、野生型rasタンパク質は「増殖抑制」活性と呼ばれる活性を有する。細胞内における野生型ras活性または付加的野生型ras活性の発現後、増殖抑制活性は、野生型ras活性または付加的野生型ras活性が発現されなかった細胞と比較して、細胞の1つまたは複数の増殖パラメータまたは増殖パラメータの減少または阻害として測定される。これらの細胞に対してなされた多くの異なる測定は、増殖抑制活性を示す。例えば、細胞周期時間の減少、細胞分割時間の減少、およびG1細胞周期フェーズ期間の減少は、野生型rasの増殖抑制活性の指標である。野生型ras活性が発現される細胞が腫瘍、癌または形質転換細胞である場合、軟寒天中におけるコロニーの形成効率の減少または病巣形成の減少等の性質の測定は、対照と比較して野生型rasの増殖抑制活性の指標である。野生型ras活性が発現される細胞がヒトまたは動物の腫瘍の一部を含む、または一部である場合、腫瘍の大きさの減少、腫瘍増殖速度の減少または転移速度の低下は、野生型rasの増殖抑制活性の指標である。
【0021】
本発明で重要なのは、細胞内に発現される野生型ras遺伝子が細胞増殖を阻害または抑制することである。細胞増殖の阻害または抑制とは当業者には周知の用語であり、細胞分割を減速または停止させて細胞数が増加しないようにすることを指す。このような細胞増殖の減速の大きさは変化し得る。本明細書において、腫瘍を含む細胞増殖の変更は、本願の範囲内である。細胞増殖の減速または停止を示す様々な細胞特性の測定は、本願の実施例に記載される。本願の範囲内である腫瘍を含む細胞の野生型rasによる細胞増殖抑制のさらなる局面は、アポトーシス(プログラムされた細胞死)および細胞分化の誘導である。
【0022】
本明細書において「不活化変異」または「機能損失変異」とは、ras遺伝子がコードするrasタンパク質の増殖抑制活性を排除または減少するras遺伝子中のまたは遺伝子周囲の変異を指す。この一例は、遺伝子が発現したrasタンパク質の量の減少をもたらさない遺伝子のコード領域内の1つまたは複数の置換、欠失、挿入または複製であるが、1分子当たりを基準として、変異を含むrasタンパク質は、不活化変異を含まないrasタンパク質よりも小さい増殖抑制活性を定量的に有する。このタイプの不活化変異は、ras遺伝子の1つまたは複数の、初めの3つのコードエキソン内に起こりやすいと考えられる。
【0023】
不活化変異の別の例は、ras遺伝子中の、遺伝子近傍の、または遺伝子に影響する変異であり、その遺伝子からはrasタンパク質は発現されない、または発現量が減少する。このような変異は、例えば、rasプロモーターの転写活性を減少させること、遺伝子からの転写物の異常なスプライシングまたはスプライシングの減少を引き起こすこと、または細胞内のras mRNAまたはタンパク質の半減期を減少させることが可能である。この場合、1分子当たりを基準として、産生されたrasタンパク質は野生型rasタンパク質と同一の増殖抑制活性を定量的に有し得るが、このような変異を含む細胞は野生型rasタンパク質の量が減少するため、ras増殖抑制活性の量が減少する。
【0024】
他の変異は、ras対立遺伝子全体の欠失またはDNA配列からタンパク質が産生されないのに十分なras対立遺伝子の欠失をもたらす。他のタイプの変異はras遺伝子配列内の内部複製を含み、1つのタイプはタンデム複製である。
【0025】
細胞内の野生型ras増殖抑制活性量の減少が、特定のras遺伝子内または遺伝子周辺の、DNAのシトシン残基のメチル化の増加または変化にも起因し得ることも認識すべきである。細胞のDNAのこのような後成的変化は異常メチル化をもたらし、当該分野において周知であり、一般には遺伝子からの翻訳レベルの減少をもたらすと知られている。
【0026】
野生型rasの増殖抑制活性が、細胞中のERK MAPキナーゼ活性の減少と関連があることは認識されるべきである。ERK MAPキナーゼはrasシグナル伝達経路の下流にあり、これは当該分野では周知である。細胞内における野生型rasタンパク質濃度の増加は、ERK MAPキナーゼの活性の減少をもたらす(実施例2参照)。
【0027】
本発明は、細胞内における野生型rasタンパク質濃度の増加によって細胞内のERK MAPキナーゼ活性を減少させる方法も提供する。
【0028】
本明細書において「活性化変異」または「機能獲得変異」とは、一般にras遺伝子のコード配列内の変異を指し、これは形質転換、腫瘍形成性または発癌性活性を有するrasタンパク質の産生をもたらす。生化学的に、活性化変異を含むrasタンパク質(活性化rasタンパク質とも呼ばれる)は、GTPアーゼ活性が減少することもあり、その結果、rasタンパク質が活性なGTP結合状態に固定される。活性化rasタンパク質は、ヌクレオチド結合親和性も減少することがあり、そのため、rasが結合するGDPがより速い速度でGTPと交換される。GAPタンパク質は、GTP結合rasのGDP結合rasへの変換を引き起こす能力が減少することもある。これら全ての場合は、GTP結合rasの蓄積をもたらし、これは、シグナル伝達を引き起こすrasである。活性化変異は、ras遺伝子のコドン12、13、59、61、63、116、117、119、145および146において見られることが知られる。このような変異は、タンパク質のグアニンヌクレオチド結合部位にまたは部位の近傍に起こる。これらコドン内の全ての変異がrasの活性化を同程度引き起こすとは限らない。同様に、これらコドン内の全ての変異が活性化するとは限らない。これらコドンの1つまたは複数内の一部の変異は機能損失変異である可能性がある。活性化変異は多数の技法によって検出され、その幾つかは、Bosらによる米国特許第5,591,582号に記載される(その中の情報は、参考として本明細書により援用される)。
【0029】
本明細書において、DNA分子の細胞への「導入」とは、DNA分子を細胞へ導く当該分野において既知の様々な方法を指す。単離されたDNAを細胞へ導入するこのような方法の1つは、トランスフェクションとして知られる。このようなトランスフェクションは、細胞によるDNAの取り込みを促進する細胞またはDNAの様々な処理を用いて広く行われる。例えば、細胞を化学的処理してDNA透過性にすることができる。例えば、細胞が内在化(internalize)できるリポソームへDNAを組み込むことによってもDNAを処理することができる。
【0030】
核酸(DNAまたはRNA)は、ウイルスを用いて細胞内へ導入されることも可能である。例えば、細胞内へ導入される野生型rasタンパク質をコードするcDNAは、ウイルスゲノム内にクローン化される。このようなウイルスによる細胞の感染は、ウイルスゲノムの細胞への導入をもたらす。クローン化遺伝子はウイルスゲノムの一部であるため、クローン化遺伝子はウイルスゲノムと共に細胞内へ導入される。このようなウイルス「ベクター」は、DNAまたはRNAゲノムを有することが可能である。多数のこのようなウイルスベクターは、当業者には周知である。遺伝子(例えば、野生型ras)を有し、そのゲノムにクローン化されたウイルスベクターは、「組み換え」ウイルスと称され得る。
【0031】
本明細書において「腫瘍形成性」、「形質転換」および「腫瘍性(新形成の)」とは、癌または悪性細胞の特性(すなわち表現型)を有する細胞を指す。様々なこのような特性は、当業者には周知である。例えば、腫瘍形成性細胞が動物に注射される場合は腫瘍を形成するが、非腫瘍形成性細胞は動物への注射後に腫瘍を形成しない。本明細書において、いわゆる「癌遺伝子」は、細胞内への導入および細胞内での発現後に、非癌性細胞を癌性にする遺伝子である。本明細書において、このような癌遺伝子の1つは、活性化変異を含むras遺伝子である。このようなras遺伝子は、「活性化された」ras遺伝子と呼ばれ得る。「抗癌遺伝子」または「腫瘍サプレッサー」遺伝子は、細胞内への導入および細胞内での発現後に、癌性細胞を非癌性にする遺伝子である。本明細書において、このような腫瘍抑制遺伝子の1つは、野生型ras遺伝子である。
【0032】
「新形成」(neoplasia)とは、通常よりも迅速に細胞増殖により増殖し、新たな増殖を開始する刺激が中断した後も増殖を継続させる異常組織の形成および増殖をもたらすプロセスを意味する。
【0033】
(様々なコピー数の野生型rasによるマウスにおける腫瘍発生)
これらの研究は、肺腫瘍形成における野生型K−rasの影響を確定するために計画された。K−ras対立遺伝子欠損マウスは生存できず、胎児性肝臓障害および貧血のために妊娠12〜14日の間に死亡する(Johnson et al., 1997, Genes Dev, 11:2468−81.)ため、そのマウスは試験することができなかった。しかしながら、異型接合K−ras欠損マウスは、マウスの近交系由来の肺腫瘍のほぼ100%が活性化されたK−ras対立遺伝子を示すため、肺腫瘍形成における野生型K−rasの役割を評価するための良好な代替物である(You, et al., 1989, Proc Natl Acad Sci USA, 86:3070−4)。これらの研究は、以下に記載のように行われた。
【0034】
(動物およびF1異型接合体の産生)
6週齢のA/J、129/SvlmJおよびC57BL/6J雌性マウスは、Jackson Laboratories(Bar Harbor, Maine)から入手した。129/Sv−K−ras+/−(K−ras「ノックアウト」)マウスは、以前報告されたように(Johnson et al., 1997, Genes Dev, 11:2468−81.)作成した。ノックアウトマウスは、K−ras遺伝子に新たな遺伝子を含むDNAコンストラクトの挿入変異を含んだ(Johnson et al., 1997, Genes Dev, 11:2468−81.)。動物は、HEPAフィルターをかけた環境制御室(24±1℃、12/12時間の明/暗サイクル)で、堅木の床敷きおよびダストカバーを有するプラスチックケージに収容された。動物は、Rodent Lab Chow(#5001; Purina)であり、水は自由給餌させた。7日間の隔離後、動物をペアにして、(A/J×129/Sv−K−ras+/−)F1、(129/SvlmJ×129/Sv−K−ras+/−)F1および(C57BL/6J×129/Sv−K−ras+/−)F1マウスの産生のための飼育コロニーを作成した。全ての動物の体重を、研究期間の間、月1回モニタリングした。
【0035】
(マウスの遺伝子型の特定)
尾組織切除物(clipping)を、(A/J×129/Sv−K−ras+/−)F1、(129/SvlmJ×129/Sv−K−ras+/−)F1および(C57BL/6J×129/Sv−K−ras+/−)F1マウスからそれぞれ採取し、溶解溶液(プロナーゼ0.4mg/ml、10%ドデシル硫酸ナトリウム(w/v)、10mM Tris、400mM NaClおよび2mM EDTA)中でホモジナイズして37℃で一晩インキュベートした後、フェノール−クロロホルム抽出し、氷冷アルコールで析出させた。各マウスの切除した尾から単離されたDNAは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて、K−ras標的化変異の存在に対して遺伝子型を特定した。すなわち、一対のPCRプライマー(oIMR013:5’−CTTGGGTGGAGAGGCTATTC−3’、oIMR014:5’−AGGTGAGATGACAGGAGATC−3’)を用いて、新たな挿入断片から280bpの産物を増幅した。別の対のPCRプライマー(oIMR015:5’−CAAATGTTGCTTGTCTGGTG−3’ TCR Cd−1、oIMR016:5’−GTCAGTCGAGTGCACAGTTT−3’)を用いて、150bpの産物を内部標準として増幅した。野生型K−ras対立遺伝子の双方(K−ras(+/+))を有するDNAは、たった150bpの断片しか提示しなかったが、野生型K−ras対立遺伝子および標的化変異(+/−)対立遺伝子を有するDNAは、PCR後に150bpおよび280bpバンドを示した。このスクリーニングは、確認のために少なくとも1回は繰り返された。異型接合体雄性129/Sv−K−ras+/−マウスを、A/JおよびC57BL/6J雌と交尾させた。子孫の50%がK−ras標的化変異(tm1)を有しており、残りの50%は野生型K−ras対立遺伝子のみを有していた。
【0036】
(K−ras+/−マウスにおける肺腫瘍形成)
ウレタン誘導性肺腫瘍形成およびMNU誘導性肺腫瘍形成の双方の研究のための実験計画を図1aに示す。6週齢の(A/J×129/Sv−K−ras+/−)F1、(129/SvlmJ×129/Sv−K−ras+/−)F1、および(C57BL/6J×129/Sv−K−ras+/−)F1ハイブリッドマウスを、K−ras遺伝子型および発癌処理のタイプによって12の群に無作為抽出した。ウレタン(カルバミン酸エチル)(純度>99%)およびN−メチルニトロソウレア(MNU)(純度99%)は、Sigma Chemical Co.(St. Louis, Missouri)から入手した。これらの化学的発癌性物質は、バイオアッセイでの使用の直前に調製した。ウレタンおよびMNU双方は、通常の生理食塩水に溶解した。ウレタン処理のために、100匹の雄性マウス((A/J×129/Sv−K−ras+/+)F1マウス17匹、(A/J×129/Sv−K−ras+/−)F1マウス12匹、(129/SvlmJ×129/Sv−K−ras+/+)F1マウス15匹、(129/SvlmJ×129/Sv−K−ras+/−)F1マウス19匹、(C57BL/6J×129/Sv−K−ras+/+)F1マウス19匹、および(C57BL/6J×129/Sv−K−ras+/−)F1マウス18匹を含む)をバイオアッセイに用いた。全ての動物に、0.2mlのリン酸緩衝生理食塩水中のウレタン(1mg/g(体重))を、単回腹腔内(i.p.)注射した。
【0037】
MNU処理群に対して、83匹の雄性マウス((A/J×129/Sv−K−ras+/+)F1マウス14匹、(A/J×129/Sv−K−ras+/−)F1マウス13匹、(129/SvlmJ×129/Sv−K−ras+/+)F1マウス14匹、(129/SvlmJ×129/Sv−K−ras+/−)F1マウス15匹、(C57BL/6J×129/Sv−K−ras+/+)F1マウス13匹、および(C57BL/6J×129/Sv−K−ras+/−)F1マウス14匹を含む)をバイオアッセイに用いた。全ての動物に、0.2mlのリン酸緩衝生理食塩水中のMNU(50mg/g(体重))を、単回i.p.注射した。
【0038】
マウスにおける肺腫瘍発生は異なる遺伝的背景に大きく依存するため、3匹の異なるF1マウスを、起こり得る株特異性効果を回避するために用いた。ウレタン処理18週後、およびMNU処理12週後に、全12群からの動物をCO2窒息により安楽死させた。肺腫瘍組織および正常組織の一部を摘出し、液体窒素中で瞬間凍結させた。各腫瘍の代表的な部分を、組織病理学検査のためにTellyesniczky溶液に固定化した。それぞれの肺を、解剖顕微鏡で検査し、腫瘍の数および大きさを得た。腫瘍の体積は、各腫瘍の三次元的大きさを測定することによって、および直径として3回測定の平均値を用いることにより確定された。半径(直径/2)を確定し、「体積=(4/3)πr3(r−半径)」によって全腫瘍体積を算出した。一元配置の分散分析を用いて、対照群と処理群とのマウスあたりの肺腫瘍数の差異を確定した。二元配置の分散分析を用いて、対照群と処理群との肺腫瘍の数および大きさの双方の差異を確定した。
【0039】
図1aに示すように、6週齢の(A/J×129/Sv−K−ras+/−)F1、(129/SvlmJ×129/Sv−K−ras+/−)F1または(C57BL/6J×129/Sv−K−ras+/−)F1マウス(野生型または異型接合K−rasノックアウトのいずれか)に、ウレタンを1mg/g(体重)の投与量で単回腹腔内注射した。ウレタンによる処理の18週後、全3群の異型接合K−ras欠損マウスには、同型接合野生型対応物よりも有意に多くかつ大きな肺腫瘍が発生した。図1に示すように、(A/J×129/Sv−K−ras+/−)F1異型接合K−ras欠損マウスのウレタンによる処理により、野生型(A/J×129/Sv−K−ras+/+)F1マウスの同一の発癌性物質による処理よりも、肺ごとに4倍多い腫瘍が産生された。同様に、(129/SvlmJ×129/Sv−K−ras+/−)F1および(C57BL/6J×129/Sv−K−ras+/−)F1異型接合K−ras欠損マウスのウレタン処理により、それぞれの野生型同腹仔の処理よりも、肺ごとに4〜5倍多くの腫瘍をもたらした(図1b)。全肺腫瘍体積へのさらなる著しい効果、すなわち、A/J×129/SvJ背景、129/SvlmJ×129/Sv背景およびC57BL/6J×129/Svマウス背景を有する異型接合K−ras欠損マウスにおける、それぞれ30倍、19倍および8倍を超える体積増加があった(図1c)。
【0040】
異型接合K−ras欠損マウスからの大きな肺腫瘍の大部分(>60%)は、腺癌であった(図2b、図2dおよび図2f)。一方、ウレタンまたはN−メチル−N−ニトロソウレア(MNU)のいずれかで処理された野生型マウスからの腫瘍は、いずれも小さな肺腺腫であった(図2a、図2c、および図2e)。図2cおよび図2eに示されるように、腺腫は単一型増殖パターンによって特徴づけされ、一般に十分に分化した細胞から成っていた。異型接合K−ras欠損マウスからの肺腫瘍の約60%は腺癌であった(図2dおよび図2f)。マウスの肺腺癌は、分化の程度が異なる細胞から構成されていた(図2f)。これらの腫瘍は、正常な肺胞構造の完全な損失、細胞核/細胞質比、細胞核集中(crowding)および細胞学的異型の増加、増殖パターンの不均一性、および近接した細気管支または血管への侵入を示した。これらの結果は、野生型K−rasの損失が未分化悪性肺腫瘍の発生に有意に寄与することを示唆する。
【0041】
これらの観察は予想外であり、肺の発癌を化学的に誘導する間、K−rasの野生型対立遺伝子が腫瘍サプレッサーとして作用することを示唆した。発癌性物質としてMNUを用いた第2の肺腫瘍バイオアッセイを行った。MNUは代謝活性化を必要としない直接作用アルキル化剤であるが、一方ウレタンは代謝活性化を必要とする前発癌性物質である。(A/J×129/Sv−K−ras+/−)F1、(129/SvlmJ×129/Sv−K−ras+/−)F1または(C57BL/6J×129/Sv−K−ras+/−)F1マウスは、ウレタンについて記載されたプロトコルと類似のものを用いて、MNUで処理された。図1dおよび図1eに見られるように、MNUによるK−ras欠損マウスの処理により、腫瘍多様性が4〜6倍増加し、3つのマウス背景の全てにおいて腫瘍体積が32〜50倍増加した。
【0042】
(肺腫瘍におけるK−ras活性化変異)
上記のマウスにおける肺腫瘍を、K−ras活性化変異に関して分析した。TRIzol試薬(Gibco BRL)を用いて肺腫瘍からDNAを単離し、PCR反応のテンプレートとして用い、次いでPCA産物のDNAの配列決定を行った。K−rasエキソン1および2のためのPCRプライマーの配列は、以前記載された(You, et al., 1989, Proc Natl Acad Sci USA, 86:3070−4.)。また、PCR反応を行い、以前記載されたように(You, et al., 1989, Proc Natl Acad Sci USA, 86:3070−4.)PCR産物を直接配列決定した。
【0043】
表1に示されるように、K−rasの第1のエキソンおよび第2のエキソンにおいて行われた配列分析により、K−ras野生型マウスから分析された全てのウレタン誘導性腫瘍は、コドン61の2番目の位置においてATからTAへの塩基転換を含むことが明らかになった。類似の頻度およびタイプのK−ras変異は、ウレタンで処理された異型接合K−ras欠損マウスからの肺腫瘍において観察された。同様に、野生型マウスまたは異型接合K−ras欠損マウスのいずれかからのMNU誘導性肺腫瘍全ては、K−rasにおけるコドン12の2番目の位置においてGCからATへの塩基転換を含んでいた(表1)。
【0044】
(表1:肺腫瘍において検出されたK−ras遺伝子における活性化変異)
【0045】
【表1】
(マウス肺腫瘍における末端染色体6のLOH)
この研究においては、出願人らはK−ras活性化変異とK−ras領域におけるマーカーの損失(異型接合性またはLOHの損失)との関係をさらに調べた。この関係は、腫瘍におけるK−rasの他の野生型対立遺伝子の損失を示唆する。
【0046】
国立毒性学プログラム(NTP)は、K−ras変異およびLOH分析のためにB6C3F1マウスから2組のマウス肺腫瘍を提供した。第1の組は、吸引により0、1、2または4mg/m3のV2PO5に2年間暴露されたマウス由来であった。第2の組は、クロロプレンで処理されたマウス由来であった。肺腫瘍の多様性データおよびクロロプレン誘導性腫瘍のK−ras変異分析が報告された(Sills, et al., 1999, Carcinogenesis, 20:657−62.; 1996, NTP Technical Report 467, NIH Publication no. 96−3957, NIEHS, NIH, Research Triangle Park, NC)。対立遺伝子型(allelotypic)分析を、V2PO5研究において42個のマウス肺腫瘍(2個は無処理マウス由来、40個はV2PO5暴露マウス由来である)を用いて、マーカーD6MIT14で行った。D6MIT14は、Research Genetics, Inc.(Hunstsville, Alabama)から入手された。標準的なPCR反応を行い、目に見える差異を観察することができた場合に対立遺伝子の損失を記録した。クロロプレン誘導性肺腫瘍をホルマリン固定し、パラフィン包埋した。したがって、D6MIT14マーカーを用いては満足なPCR結果を得ることができなかった。K−ras近傍のLOHを評価するために、C57BL/6マウスとC3Hマウスとの間で多様であり、一本鎖コンホメーション多形性分析技法である、マーカーD6MCO12(プライマー配列:D6MCO12−1F 5’GATGTCAAACGTGAGAGTGTC3’(配列番号_)およびD6MCO12−1R 5’GCGCTGACTCGCTTCTTCCAT3’(配列番号_))を用いた。マーカーとしてK−rasのコドン61の変異(CAA→CTA)を用いて、結果をさらに確認した。
【0047】
表2にまとめられたように、40個の五酸化バナジウム(V2PO5)誘導性肺腺癌をK−ras活性に関して調べ、29個(73%)は変異を有していた。また、これらの腫瘍を、マーカーD6MIT14でのK−rasの領域におけるLOHに関して類別し、これらのうち18個が対立遺伝子欠損を示した(表2)。V2PO5誘導性腫瘍に見られる最も頻繁なK−ras変異は、コドン12の2番目の塩基におけるGAのATへの塩基転位またはGAのTAへの塩基転換のいずれかであった(データは示さず)。D6MIT14は、K−rasの0.5−cM内にマッピングされる(Manenti, et al., 1999, Genome Res, 9:639−46.)。D6MIT14における対立遺伝子の損失は、腫瘍におけるK−ras変異と密接に相関しており、対立遺伝子損失を有する18個の腫瘍うち16個(89%)がK−ras変異も有していた。K−rasコドン61変異(CAA→CTA)およびD6MCO12(K−rasに約5cM近接)を用いて、出願人らはこれらのサンプル中におけるLOHの程度を調べた。図3bおよび図3cおよび表2に示されるように、対立遺伝子損失を有する19個の腫瘍のうち16個(84%)はK−ras変異も有しており、このことは、これらのマーカーにおける対立遺伝子損失とK−ras活性化との密接な相関を示唆する。これらの結果は、K−ras野生型マウスにおける肺腫瘍の発生の低下や大きさの縮小は、野生型K−ras対立遺伝子の維持の結果であることも示唆する。PCR−RFLP分析を18個のウレタン処理肺腫瘍で行い、このうち6個は(A/J×129/Sv−K−ras+/+)F1、6個は(129/SvlmJ×129/Sv−K−ras+/+)F1、6個は(C57BL/6J×129/Sv−K−ras+/+)F1マウス由来であった。wt/wtマウス由来の18個の肺腫瘍は、対立遺伝子損失を含まなかった。(C57BL/6J×129/Sv−K−ras+/+)F1マウス由来の肺腫瘍におけるLOH状態を分析した代表的な結果を図3aに示す。
【0048】
(表2 マウス肺腫瘍においてK−ras活性化と関係する遠位染色体6におけるLOH)
【0049】
【表2】
a:LOHおよびK−rasの変異データは、Hegi et al.からのものである(Hegi,et al.、1994,Cancer Res,54:6257−64)。
b:K−ras変異データは、Sills et al.からのものである(Sills,et al.,1999,Carcinogenesis,20:657−662)。
【0050】
(診断および予後アッセイ)
本発明は、ヒトまたは動物における腫瘍または癌を特徴付けする方法を提供する。一局面においては、この方法は、ras遺伝子中のまたは遺伝子近傍の変異を検出するために、腫瘍または癌由来のサンプル中の1つまたは複数のras遺伝子の1つまたは複数の対立遺伝子の分析を含む。一実施形態においては、特異的H−ras、K−rasおよびN−rasに対する対立遺伝子を分析する。他の実施形態においては、多様なH−ras遺伝子、K−ras遺伝子またはN−ras遺伝子に対する対立遺伝子を分析する。この分析は通常、腫瘍または癌細胞のゲノムからのDNAのある形態の遺伝子型特定を含み、様々な方法でなされ得る。好ましくは、この分析はras遺伝子のあるタイプのDNA配列決定を含む。配列分析を含まない遺伝子型特定は、遺伝子中の1つの塩基対が変更されているタイプの変異を検出することはできない可能性がある。
【0051】
あるタイプの分析においては、腫瘍または癌から単離されたDNAは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって分析される。ras遺伝子の領域、あるいは周辺の領域を選択し、その領域におけるゲノムDNAとハイブリダイズするPCRプライマーを作製する。このようなプライマーは、ras遺伝子内の任意の公知の配列に向けて、またはゲノム配列が知られているras遺伝子周辺の領域に向けて作製され得る。用いられることか可能なras遺伝子周辺の領域のこのような組の1つは、多様なミクロサテライトマーカーであり、この配列およびヒト全体の位置ならびに幾つかの動物ゲノムは、当該分野において知られている。PCR反応にプライマーを用いて、目的のras遺伝子を含むゲノム領域を増幅させる。ras遺伝子を含むゲノム領域全体を増幅させるために1回のPCR反応を用いもよい。あるいは、目的のras遺伝子の異なる領域をそれぞれ増幅させる、複数回のPCR反応を用いてもよい。好ましくは、目的のras遺伝子のコード領域全体を増幅させるようにPCR反応を用いる。さらに、イントロン内および目的のras遺伝子周辺のゲノム領域を増幅してもよい。
【0052】
その後、PCR産物の分析を行う。PCR産物の分析は、様々なタイプであり得る。行う分析のタイプは通常、分析を行っている人が検出しようとしている変異のタイプに依存する。例えば、対照細胞(すなわち、野生型ras遺伝子を有することが知られる細胞)由来のDNAを用いた同一のPCR産物の大きさと比較して、腫瘍または癌細胞ゲノム由来の特定のPCR産物の大きさを分析することは、ゲノム領域におけるDNAの挿入または欠失を検出することができる。当該分野では知られているが、ゲノムを増幅するために2つのPCRプライマーを用いる領域の間のゲノム領域においてDNAの挿入がある場合、得られるPCR産物は、挿入が起こらなかったゲノム由来のDNAを用いて得られた同一のPCR産物の大きさと比較してより大きい。同様に、2つのPCRプライマーの間のゲノムにおけるDNAの欠失は、欠失を含まないゲノム由来のDNAを用いて得られた対照PCR産物と比較してより小さいPCR産物をもたらす。このような分析は、野生型ゲノム由来の産物と比較して、PCR産物の大きさに比較的大きな変化(例えば、最小でも10%の変化)を検出する。通常、PCR産物の大きさは、2つ以上のPCR産物の相対的な大きさを比較することによって確定される。例えば、ras変異が疑われるゲノム由来のPCR産物の大きさは、ras変異が存在しないことが知られるゲノム由来の同一のPCR産物の大きさと比較される。相対的な大きさは、ゲル電気泳動において起こる電場中のPCR産物の移動を用いて容易に比較される。アガロースゲル電気泳動は、この目的のためにしばしば用いられる。
【0053】
PCR産物を分析する別の方法は、PCR産物の全てまたは一部のヌクレオチド配列を確定することによる。この分析方法は、10%未満のPCR産物の相対的な大きさの変化を検出する。この方法は、相対的な大きさの変化をもたらさないDNA配列の変化も検出する。例えば、2つの異なる細胞由来のDNAの増幅から得られた同一のPCR産物の配列決定および配列比較は、単一または複数のヌクレオチド塩基の変化やDNA領域の置換等を検出することができる。DNAの配列決定方法またはPCR産物のDNA配列決定方法は、分子生物学の技術分野において既知である。配列決定の連鎖停止方法がしばしば用いられる。DNAの配列決定は、自動配列決定機によってしばしば行われる。
【0054】
別のタイプの分析においては、RNA、好ましくは腫瘍または癌細胞から単離されたmRNAをテンプレートとして用いて、逆転写反応においてDNAを作製する。その後、逆転写されたDNAは、試験中のras遺伝子のmRNA内にあることが知られる配列を有するPCRプライマーを用いるPCR反応におけるテンプレートとして用いられる。特定のras遺伝子のmRNA配列の全長を増幅するために、上記のように様々なmRNAプライマーを選択することができる。これは、上記のような1回のPCR反応または複数回のPCR反応を用いて行うことができる。その後、すでに記載されたのとほぼ同様にPCR産物の分析を行う。あるタイプの分析においては、PCR産物の有無または対照と比較したその大きさの変化は、rasゲノム領域内の大きな挿入または欠失等の大きな変化を示す。さらに、このような分析はPCR産物のゲル電気泳動を用いて広く行われる。別のタイプの分析においては、PCR産物のDNA配列は、当該分野において周知の方法を用いて決定される。
【0055】
当該分野で周知の他の方法も、ras遺伝子、転写物、またはいずれかの野生型と比較しての変更の存在をアッセイするために使用することができる。これらの方法のいくつかに、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、RNアーゼ保護アッセイ、S1ヌクレアーゼアッセイ等がある。
【0056】
rasDNAおよびRNAを変異に関して分析する方法に加えて、rasタンパク質自身を、もしあれば、変化に関してアッセイすることも可能である。例えば、当該分野において、特定のrasタンパク質をコードする遺伝子内の特異的変異の存在に依存して、様々なrasタンパク質(H−ras、K−rasおよびN−ras)に特異的に結合する様々な抗体が周知である。例えば、タンパク質をコードする遺伝子の特異的コドンにおける活性化変異がある場合に限り、rasタンパク質に結合する抗体が利用できる。他の抗体は、タンパク質が変異を含まないかまたは少なくとも十分特徴づけされた活性化変異を含まない場合に限り、rasタンパク質に結合する。このような区別して結合する抗体の機能の基礎は通常、特定のrasタンパク質のコンホメーションである。例えば変異は、特異的抗体が結合するまたはしないようにrasタンパク質のコンホメーションの変化を引き起こす。このタイプの抗体の多くは、市販されている(例えば、Oncogenic Science)。したがって、抗体の利用によって、特異的変異rasタンパク質が腫瘍または癌細胞に存在するかどうかを確定することができる。特異的変異が存在するかどうか確定することもできる。
【0057】
このような抗体は、当該分野において既知の様々なアッセイを用いてrasタンパク質を分析するために用いられる。例えば、免疫沈降、ウェスタンブロッティングおよび免疫組織化学は、一般に用いられる方法である。抗体を用いる他のアッセイは、当該分野において既知であり、用いられることが可能である。ある抗体は、1つまたは複数のこのようなアッセイにおいて良好な結果をもたらし得る。
【0058】
記載されるように、ras遺伝子の異常メチル化は、細胞内の野生型ras活性発現の減少をもたらす。細胞中の特定の遺伝子の異常メチル化を検出するための、当該分野において既知である様々な方法がある。ある方法においては、DNA中の同一のヌクレオチド配列を認識するが配列内の特定のヌクレオチドがメチル化されるかどうかによって配列を区別して切断する、一組の制限エンドヌクレアーゼを用いる。その後、切断されたDNAは、1つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼ部位にわたるプローブを用いて、サザンブロッティングによって分析される。対照細胞と比較して腫瘍または癌細胞由来のゲノムDNAにおける部位のメチル化の変化は、サザンブロットにおけるDNA断片のバンドパターンの差異によって検出される。異常メチル化を検出するための他の方法には、メチル化シトシンを異なるヌクレオチド塩基に変化させるゲノムDNAの亜硫酸水素処理が含まれる。その後、変化した塩基は様々な技法(メチル化感受性PCRはこの技法の1つである)を用いて検出される。他の方法には、様々なDNA配列決定技法が含まれる。このような技法の1つは、ゲノム配列決定である。他の方法は知られており、用いられることが可能である。
【0059】
腫瘍または癌細胞のras遺伝子、RNAまたはタンパク質を特徴付けするためのこのようなアッセイの結果を、診断または予後に用いることができる。野生型rasは増殖抑制活性を有するため、この活性の存在は上記のアッセイが用いられる患者にとって望ましい。一般に、患者にとって最も望ましくない状況は、野生型ras増殖抑制活性が腫瘍または癌由来の細胞に存在しない状況である。より望ましい状況、およびより良い予後を伴う状況は、一般に腫瘍または癌細胞における野生型ras増殖抑制活性がある状況である。
【0060】
(治療剤または予防剤としての野生型ras遺伝子)
本発明は、増殖抑制活性を有する野生型rasタンパク質の細胞において発現の増加を引き起こすことにより、細胞増殖を阻害または抑制する方法も提供する。この活性の発現の増加を、様々な方法により引き起こすことができる。通常、このような方法は、野生型rasタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の細胞へ導入することを含む。DNAまたはRNAは、このような細胞に導入され得る。rasタンパク質を細胞に導入することも可能である。ある場合には、既に細胞内にある遺伝子由来の野生型ras活性の発現の増加を引き起こす薬剤を投与することも可能である。
【0061】
当然のことながら、被検体が野生型rasで処理されることが可能な腫瘍または癌を有する場合、これらの方法は治療に用いられる。この方法を、腫瘍または癌を形成しそうな個体においてその形成を抑制するのに用いることもできる。腫瘍または癌を有する個体の、腫瘍または癌細胞における野生型活性が減少しているかまたは活性がない場合、rasの発現の増加を引き起こす方法を用いることが好ましい。しかしながら、野生型ras活性がある場合に本発明の方法を用いることもできるが、既知のrasシグナル伝達経路は、腫瘍または癌の形成および増殖に寄与するようにさらに活性化される。ras以外の遺伝子またはrasシグナル伝達経路以外の経路が個体の腫瘍または癌に寄与する場合も、本発明の方法を用いることができる。
【0062】
これらの方法において、「野生型rasタンパク質」とは、上述したrasスーパー遺伝子ファミリーのメンバーによりコードされる任意の野生型タンパク質をまとめて指す。より好ましくは、用いられる野生型rasタンパク質は、スーパー遺伝子ファミリーのrasサブファミリーのメンバー(すなわち、H−ras、K−ras、N−ras)によりコードされる。最も好ましくは、野生型rasタンパク質はK−rasタンパク質である。本発明の方法において用いられる遺伝子およびタンパク質は、齧歯類由来のものであることもあるが、ヒト由来のものであることが好ましい。これらのタンパク質およびそれらをコードする配列は、当該分野において既知である。このような遺伝子およびタンパク質の配列は、National Center for Biotechnology Informationによって提供されるデータベースまたは他の類似のデータベースにおいて、インターネット上で見ることができる。
【0063】
rasタンパク質、またはrasをコードするDNAやRNAの増殖抑制活性の存在は、1つまたは複数の様々なアッセイにより確定される。このようなアッセイのある群には、培養物中のまたは動物中の細胞に遺伝子またはタンパク質を導入すること、およびその後、その遺伝子またはタンパク質の細胞増殖への効果を測定することが含まれる。増殖抑制活性は、増殖の阻害を引き起こす。別の方法は、遺伝子またはタンパク質を細胞へ導入すること、およびその後、ERK MAPキナーゼの活性を測定することである。この測定は、当該分野において既知の生化学的アッセイを使用することによって行うことができる。
【0064】
この方法は、ヒトまたは動物体内のタンパク質投与後の安定化または半減期の増加をもたらすras遺伝子またはそれがコードされたタンパク質への修飾のためにも提供される。修飾された、短縮または部分タンパク質が、抗増殖性、増殖抑制性、抗腫瘍発生性、抗腫瘍形成性、抗悪性等であると言うことができるある活性を保つ限り、野生型ras遺伝子またはタンパク質に対する任意の修飾が本発明の範囲内であることに留意することは重要である。
【0065】
野生型ras遺伝子は、様々な手段を用いて導入されることが可能である。これらの手段の多くは、遺伝子療法の技術分野において周知である。野生型ras活性をコードするまたは野生型ras活性の刺激を引き起こすウイルスベクターを用いる、腫瘍または癌細胞のトランスフェクションまたは感染等の様々な方法を用いて、遺伝子を導入することができる。
【0066】
本発明は、例えばヒトまたは動物の腫瘍を含む細胞等のヒトまたは動物に存在する細胞に、野生型ras遺伝子を導入するために提供される。ヒトまたは動物中にある細胞に遺伝子を導入するための様々な方法がある。ある好ましい方法は、腫瘍を含む細胞にウイルスが感染するように、クローン化された野生型ras遺伝子を含む組み換えウイルスを、ヒトまたは動物へ投与することを用いる。ヒトまたは動物中にある細胞に遺伝子を導入する別の方法は、野生型rasをコードする精製されたDNAを、ヒトまたは動物に直接投与することを含む。このような投与は、DNAの注射によって行うことができる。このような手段は、一般にワクチン分野で、特にいわゆる「DNAワクチン」の投与のために用いられる。
【0067】
野生型ras活性をコードするポリヌクレオチド配列を細胞内に導入するために、ポリヌクレオチド配列のタンパク質コード領域は通常、mRNAへの転写に加えてmRNAの野生型rasへの翻訳も促進する配列に結合する。これを行うための当該分野において一般的なストラテジーは、クローン化されたタンパク質コード配列の発現を促進する配列を含むベクターに、rasタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をクローン化することである。
【0068】
発現ベクターは通常、遺伝子発現を促進する配列を含む。発現媒体は、タンパク質コード配列のアセンブリを含む転写ユニットおよび転写および翻訳を調節するエレメントを含むことが可能である。転写調節エレメントは一般に、転写を開始するエレメントを含む。このようなエレメントのタイプとしては、プロモーターおよびエンハンサーが挙げられる。プロモーターは、構成的、誘導的または組織特異的であり得る。転写調節エレメントは、転写を停止させる、またはRNAの3’末端処理のためのシグナル(ポリアデニル化のためのシグナル)を提供するものも含む。翻訳調節配列は通常、配列をコードするタンパク質の一部であり、翻訳開始コドンおよび翻訳停止コドンを含む。タンパク質コード領域の一部である付加的配列(例えば、細胞膜にタンパク質を導く配列、シグナル配列等)があってもよい。
【0069】
細胞内に導入されるras配列は、細胞内に導入された後、高レベルで発現する(すなわち、導入されたポリヌクレオチド配列が細胞内でrasタンパク質を大量に産生する)ことが好ましい。細胞内に導入されたポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を引き起こす技法は、当該分野において既知である。このような技法は、配列を細胞内に導入させるとすぐにポリヌクレオチド配列の転写が増加することを含むことが多いが、これらに限定されない。このような技法は導入されたポリヌクレオチド配列を高レベルで(at a high rate)開始させる転写プロモーターの使用を含むことが多い。このような様々なプロモーターが存在し、当該分野で既知である。このようなプロモーターは、ウイルス由来であることが多い。このようなプロモーターは、様々な細胞のタイプにおけるポリヌクレオチド配列の、効率的な転写をもたらすことができる。このようなプロモーターは、構成的(例えばヒトサイトメガロウイルス由来のCMVエンハンサー/プロモーター)または誘導的(例えば、マウス乳腺腫瘍ウイルス由来のMMTVエンハンサー/プロモーター)であり得る。様々な構成的および誘導的プロモーターおよびエンハンサーが当該分野において知られている。特異的な細胞型におけるポリヌクレオチド配列の転写をもたらす、他のプロモーター(いわゆる「腫瘍特異的プロモーター」)も用いることができる。特異的組織において発現する様々なプロモーターが存在し、当該分野において知られている。例えば、発現が神経、肝臓、上皮細胞および他の細胞に特異的であるプロモーターが存在し、当該分野において知られている。このようなDNA分子を作製する方法(すなわち、組み換えDNA法)は、当業者には周知である。
【0070】
当該分野において、ベクターとは、細胞で結合した別の核酸またはポリヌクレオチド配列の導入を媒介することが可能な核酸分子を指す。好ましいベクターの1つのタイプはエピソーム(すなわち、染色体外複製が可能な核酸)である。他のタイプのベクターは、ベクターが導入される細胞のゲノムの一部になる。挿入されたDNA配列の発現を導くことができるベクターは、「発現ベクター」と称され、プラスミド、ウイルスまたは他のタイプの当該分野において知られている分子を含み得る。
【0071】
代表的には、ベクターは、rasポリヌクレオチド配列の挿入を可能にする、1つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む。ベクターは、非形質転換細胞から形質転換細胞を同定し、分離する働きをする化合物をコードするマーカー遺伝子(例えば、優性抗生物質抵抗性遺伝子)をさらに含み得る。
【0072】
本発明において用いられるベクターのタイプの1つは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターは、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、パルボウイルスおよびレトロウイルスを含む様々なウイルスファミリーに一般に準じる、組み換えウイルスである。このような組み換えウイルスは一般に、ベクター感染した宿主細胞における外因性ポリヌクレオチド配列の発現を引き起こすことができるプロモーターの制御下において、外因性ポリヌクレオチド配列(本明細書においてはras遺伝子)を含む。
【0073】
ウイルスベクターのタイプの1つは、ゲノムに挿入された外因性ポリヌクレオチド配列を有する、欠損アデノウイルスである。「欠損アデノウイルス」という用語は、標的細胞において自己複製できないアデノウイルスを指す。一般に、欠損アデノウイルスのゲノムは、感染細胞におけるウイルスの複製に必要な配列を欠如している。このような配列は、部分的に、または好ましくは、完全にゲノムから除去される。標的細胞に感染できるようにするために、欠損ウイルスは、コンストラクトをインビボで調製する間にウイルス粒子の封入を可能にするのに十分な本来のゲノム由来の配列を含む。ウイルスが含む他の配列は、遺伝学的に必要な「シスにある(in cis)」であると言われる任意の配列である。
【0074】
別のタイプのウイルスベクターは、ゲノムに挿入された外因性ポリヌクレオチド配列を有する欠損レトロウイルスである。このような組み換えレトロウイルスは、当該分野において既知である。本発明における使用のための組み換えレトロウイルスは、ヘルパーウイルスの汚染がないことが好ましい。ヘルパーウイルスとは、複製欠損でない、組み換えレトロウイルスのパッケージングの間に生じることがあるウイルスである。
【0075】
非欠損または複製型ウイルスベクターを用いることもできる。このようなベクターは、ウイルスの複製に必要な配列を保持する。
【0076】
他のタイプのベクターは、プラスミドベクターである。
【0077】
一局面においては、本発明の方法は、細胞において野生型rasのレベルが増加するように、rasポリヌクレオチド配列(好ましくはベクターに含まれる)を特異的な細胞に導入することを含む。本明細書において、このようなDNA分子(複数可)(具体的には、1つまたは複数のrasポリヌクレオチド配列をコードするDNA分子)の、細胞への導入または伝達は、DNA分子を細胞へ導くための当該分野において知られている様々な方法のいずれかを指す。単離されたDNAを細胞へ導入するこのような方法の1つは、トランスフェクションとして知られている。このようなトランスフェクションは一般に、細胞によるDNAの取り込みを促進する細胞またはDNAの様々な処理を用いて行われる。例えば、細胞を化学的に処理して、DNA透過性にすることができる。例えば、細胞が内在化できるリポソームにDNAを含むことによって、DNAを処理することもできる。好ましくは、トランスフェクションを用いて、プラスミドDNAを細胞へ導入する。
【0078】
上記のように、ウイルスを用いて、rasポリヌクレオチド配列を細胞内に導入することもできる。例えば、細胞に導入されるポリヌクレオチド配列は、ウイルスゲノムにクローン化される。このようなウイルスによる細胞の感染は、ウイルスゲノムの細胞への導入をもたらす。このようなクローン化されたポリヌクレオチド配列はウイルスゲノムの一部であるため、ウイルスゲノムと共に細胞に導入される。このようなウイルス「ベクター」は、DNAまたはRNAゲノムを有することができる。多数のこのようなウイルスベクターは、当業者には周知である。ゲノムにクローン化された、例えばrasタンパク質をコードするクローン化ポリヌクレオチド配列を有するウイルスベクターは、「組み換え」ウイルスと称される。ウイルスを用いてのDNA分子の伝達は、ポリヌクレオチド配列を、動物の特定の細胞または腫瘍に伝達させるのに特に有用である。このような技法は、遺伝子療法として当該分野において広く知られている。
【0079】
ヒトまたは動物の患者中にある細胞に、ポリヌクレオチド配列を導入する別の方法は、rasタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む精製されたDNAを、ヒトまたは動物に直接投与することを含む。このような投与は、DNAの注射によって、またはDNAのトランスフェクションによってさえも行うことができる。このような手段は、ワクチン分野において、具体的にはいわゆる「DNAワクチン」を投与するために、広く用いられる。
【0080】
ヒトまたは動物に野生型ras遺伝子を投与するためにどんな手段を用いても、このような手段は、腫瘍細胞に優先的に導入され、非腫瘍細胞にはあまり優先的に導入されない野生型ras遺伝子をもたらす。例えば、ヒトまたは動物のある細胞型(例えば、腫瘍細胞型)を特異的に感染させる組み換えウイルスをもたらす技法が、当該分野において知られている。ウイルスに対しては、このような「ターゲッティング」は、組み換えウイルスに対する細胞レセプターの処置(manipulation)および/またはウイルスに対する細胞レセプターを認識してそれに結合するウイルスリガンドの処置によって達成されることが可能である。このような手段は、野生型ras遺伝子を動物またはヒトの腫瘍細胞に導入するために用いられる場合、本願の範囲内である。
【0081】
外因性ポリヌクレオチド配列を、他の細胞ではなく特異的細胞に導入するための遺伝子伝達および遺伝子療法の技術分野において知られている方法がある。例えば、ヒトまたは動物にある細胞型(例えば、腫瘍細胞型)を特異的に感染させる組み換えウイルスをもたらす技法が、当該分野において知られている。ウイルスに対しては、このような「ターゲッティング」は、組み換えウイルスに対する細胞レセプターの処置および/またはウイルスに対する細胞レセプターを認識してそれに結合するウイルスリガンドの処置によって達成されることが可能である。このような手段は、rasポリヌクレオチド配列を動物またはヒトの腫瘍細胞に導入するために用いられる場合、本願の範囲内である。
【0082】
rasポリヌクレオチド配列が細胞内に導入された後、具体的には、ポリヌクレオチド配列が導入された細胞および/または導入されたポリヌクレオチド配列を発現している特異的細胞を確定するための技法が用いられる。ポリヌクレオチド配列の存在および/またはポリヌクレオチド配列の発現を調べるための様々な技法が存在し、当該分野において既知である。このような技法の幾つかは、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ウェスタンブロッティング、RNアーゼ保護、放射性ヨウ素摂取アッセイ等を含む。
【0083】
(治療剤としての野生型rasタンパク質)
本発明の別の局面は、rasタンパク質を細胞に導入することによって細胞増殖を阻害または抑制する方法を提供する。タンパク質を細胞に導入するための様々な方法が存在する。タンパク質を細胞に導入するための当該分野において知られている様々な方法がある。ある方法においては、タンパク質を結合または融合させて、細胞へ入ることを導く短いペプチドにする。あるペプチドのこのような群は、タンパク質形質導入ドメインと呼ばれる。タンパク質を細胞へ導入する別の方法は、脂質担体を用いる。例えば、リポソームに関与するタンパク質は、リポソームが細胞に入るまたは細胞と融合する場合、細胞に入ることができる。タンパク質を細胞に導入する他の方法が知られている。マイクロインジェクションおよびエレクトロポレーションが、その方法の2つである。他の方法も知られている。
【0084】
このような方法としては、Nagaharaらによる出版物(Nagahara et al., 1998, Nat Med, 4:1449−52)に、およびDowdyの研究室からの出版物(Nagahara et al., 1998, Nat Med, 4:1449−52.; Schwarze, et al., 1999, Science, 285:1569−72.; Vocero−Akbani, et al., 2000, Methods Enzymol, 322:508−21; Ho, et al., 2001, Cancer Res, 61:474−7., Vocero−Akbani, et al., 2001, Methods Enzymol, 332:36−49; Snyder and Dowdy, 2001, Curr Opin Mol Ther, 3:147−52.; Becker−Hapak, et al., 2001, Methods, 24:247−56.)に記載されるような、「タンパク質形質導入」または「タンパク質療法」が挙げられるがこれらに限定されない。これらの出版物は参考として本明細書において援用される。
【0085】
一実施形態においては、ヒト免疫欠損ウイルスTATタンパク質(Green and Loewenstein, 1988, Cell, 55:1179−88.; Frankel and Pabo, 1988, Cell, 55:1189−93.)由来の「タンパク質形質導入ドメイン」(PTD)である、11アミノ酸配列を、野生型rasタンパク質に融合させる。その後、精製されたタンパク質を細胞表面と接触させ、その細胞の増殖を阻害または抑制するように機能する野生型rasタンパク質をその細胞に取り込む。融合したPTDを含む野生型rasタンパク質を、ヒトまたは動物の腫瘍を含む細胞に導入することが望ましい場合は、そのタンパク質を様々な方法によってヒトに投与する。好ましくは、そのタンパク質は、注射(例えば静脈に)によって、またはエーロゾル中の吸入によって投与される。
【0086】
融合したPTDを含む野生型rasタンパク質は、PTDをコードするDNA配列を有する野生型ras遺伝子をコードするDNA配列を融合することによって生成されることが好ましい。大量の融合タンパク質が生成されるように、融合遺伝子の生物体への導入、および生物体における高レベルでの遺伝子発現を促進するベクター(例えば、プラスミドまたはウイルスベクター)に、得られるras−PTD融合遺伝子を組み込むことが好ましい。融合遺伝子を含むベクターを発現することができるこのような生物体の1つは細菌、好ましくは大腸菌である。他の生物体も当業者に広く用いられる。融合タンパク質をこれらの生物体のいずれかにおいて高レベルで発現させた後、当業者に既知のタンパク質精製技法を用いて、融合タンパク質を生物体から精製する。
【0087】
野生型rasタンパク質は、ヒトまたは他の動物に、好ましくは薬学的組成物中で投与される。送達に適した剤形は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th ed.(Mack Publishing Co., Philadelphoa, Pa., 1985)に見られる。これらの薬学的組成物は、様々な薬物送達システムにおける使用に適している(Langer, Science 249:1527−1533, 1990)。
【0088】
組成物中の野生型rasタンパク質は、単一の投与または一連の接種に適している。この薬学的組成物は、非経口投与、局所投与または経口投与を対象としている。非経口投与は、静脈内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与または筋内投与によることが好ましい。非経口投与は、肝臓の動脈または胆管へのカテーテル挿入等による患者の肝臓に対して優先的に行われ得る。非経口投与のために、組成物にはrasタンパク質および適切な無菌担体(水、水性緩衝液、0.4%生理食塩水溶液、0.3%グリシン、ヒアルロン酸または当該分野において既知の無毒性非イオン性界面活性剤のエマルジョン等)が含まれる。組成物は、NaCl、KCl、CaCl2、酢酸ナトリウムおよび乳酸ナトリウム等の緩衝剤や湿潤剤等の、生理的状態に近づけるための物質をさらに含んでもよい。なお、薬学的に許容可能な組成物中のrasタンパク質の投与に加えて、rasタンパク質をコードするDNAまたはRNAを、このような組成物の一部として投与してもよい。
【0089】
従来の無毒性な固体担体中のrasタンパク質を含む固体組成物としては、例えば、グルコース、スクロース、マンイトール、ソルビトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、セルロースまたはセルロース誘導体、炭酸ナトリウムおよび炭酸マグネシウム等が挙げられる。固体組成物の経口投与のために、HCV様粒子は、組成物を10%〜95%、より好ましくは25%〜75%含むことが好ましい。
【0090】
治療または予防に有効な投与量のrasタンパク質組成物を、個体に投与する。組成物は単回投与として投与されてもよいが、それよりも、何日、何週、さらには何ヶ月にもわたる一連の投薬としてもよい。本明細書における有効な治療投与量とは、腫瘍の増殖を阻害する、または腫瘍の退縮さえ引き起こす投与量である。このような投与量により、腫瘍の転移も阻害または抑制される。本明細書における有効な予防投与量とは、腫瘍の形成を抑制する投与量である。
【0091】
(ERK MAPキナーゼに対する野生型rasの発現)
本発明の別の局面は、ERK MAPキナーゼの活性を阻害する方法を提供する。ERK MAPキナーゼ活性の阻害は、上記のように、野生型rasタンパク質をコードする遺伝子または野生型rasタンパク質の、細胞への導入後に起こる。
【実施例】
【0092】
本発明のさらなる詳細は以下の実施例において見出すことができ、これらの実施例は本発明の範囲をさらに定義する。本明細書に引用した全ての参照は、その全てが参照により本明細書において明示的に援用される。
【0093】
(実施例1. 野生型K−ras遺伝子による腫瘍細胞株の増殖阻害)
野生型K−rasが、R16という名の形質転換NIH/3T3細胞株(You et al., 1989, Proc Natl Acad Sci USA, 86:3070−4.)およびLM2という名のマウス肺腫瘍細胞株(McDoniels−Silvers, et al., 2001, Exp Lung Res, 27:297−318.)の増殖を阻害する、トランスフェクション研究を行った。いずれの細胞株も、変異型K−ras対立遺伝子を含んでいた。R16は、K−ras中のコドン12の2番目の位置におけるGCからATへの塩基転位を含むマウス肺腫瘍DNAにより形質転換されたNIH/3T3由来である。R16細胞は、変異型K−rasの高レベルの発現(野生型K−ras対立遺伝子よりも約10倍高い)を示した。LM2は、A/Jマウス株におけるウレタン誘導性肺腫瘍から確立された、転移性腫瘍細胞株である。LM2は、K−rasのコドン61の2番目の位置におけるATからGCへの塩基転位を含んでいた。
【0094】
野生型K−rasを含む発現ベクターは、A/Jマウスの正常な肺から単離された全mRNAの、マウスcDNA配列由来のプライマーを用いたRT−PCRにより単離された、野生型K−ras4Bに対する全長マウスcDNAから作製された(George et al., 1985, Embo J, 4:1199−203.)。野生型K−ras4B発現コンストラクトは、cDNAのpCR3.1哺乳動物発現プラスミド(Invitrogen, Carlsbad, California)へのライゲーションによって作製される。その後、発現コンストラクトは、Maxi−tip 500カラム(QIAGEN, Santa Clarita, California)を用いて精製され、トランスフェクション実験に使用する前に、確認のために配列決定された。
【0095】
同一の継代のR16およびLM3細胞を、クローン(すなわち、pCR3.1ベクターのみ、およびリポフェクタミン(Life Technologies, Gaithersburg, Maryland)を用いる野生型K−ras4B)の1.5〜2μgの精製プラスミドDNAを用いて、同一の条件下でトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞は、G418における選択により選択された。G418耐性R16細胞を直接アッセイし、G418耐性LM2細胞を安定なクローンにサブクローン化した。これらの細胞は、増殖速度およびコロニー形成効率の分析のために用いられた。増殖速度は、各ウェルに2000個の細胞を播種した12ウェルシャーレを用いて、これらの細胞から確定された。10%のFBSおよび50μg/mlのG418を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で、二連式ウェルにおいてR16細胞をインキュベートした。10%のFBSおよび50μg/mlのG418を添加したCMRL1066中で、LM2細胞を培養した。プレーティング後1、2、4、6および8日目に細胞を計数した(図4および5参照)。コロニー形成アッセイのために、トランスフェクト細胞の各サブクローン用に4つのシャーレ(各直径10cm)を用いた。各シャーレに1000個の細胞を播種し、10%のFBSおよび50μg/mlのG418を添加したDMEM中で12日間インキュベートした。その後、細胞を10%緩衝ホルマリンで固定化し、クリスタルバイオレットで染色し、目に見えるコロニー(直径1.5mmを超える)を計数した。トランスフェクト野生型K−ras4Bの発現は、トランスフェクトクローンによって運ばれる独自の配列を利用するRT−PCRによって、これらのサブクローンにおいて、およびコロニー形成アッセイから選択されたコロニーにおいてモニタリングされた。具体的には、cDNAは、野生型K−ras4Bを用いてトランスフェクトされたG418耐性細胞から単離されるRNAから生成される。その後、これらのcDNAに関して、転写開始位置の後ろに位置するベクター配列(5’TAATACGACTCACTATAGGG3’)およびK−ras4Bイントラジェニックコード配列(5’CTCTATCGTAGGGTCGTAC3’)に特異的なプライマーを用いてPCRを行った。
【0096】
図4aに示されるように、野生型K−rasのR16細胞へのトランスフェクションは、細胞増殖を有意に阻害した(6日目までに80%阻害)。空のベクター対照細胞において65個を超えるコロニーが増殖したが、野生型K−rasトランスフェクトNIH/3T3細胞から生じたコロニーは非常に少数(10個未満)しか観察されなかった(図4bおよび図4c)。野生型K−ras遺伝子のLM2へのトランスフェクションは、G418耐性細胞(LM2−K−ras4B H)の選択されたクローンの1つにおいて、細胞増殖を有意に阻害した(4日目までに90%阻害)(図5a)。LM2−K−ras4B Hは、比較的高レベルのトランスフェクト野生型K−rasを発現した(図5d)。200個を超えるコロニーが空のベクター対照細胞において増殖したが、LM2−K−ras4B H細胞においては非常に少数のコロニー(10個未満)しか見られなかった(図5bおよび図5c)。LM2細胞由来の平均30個のコロニーは、約3倍低いレベルのトランスフェクト野生型K−ras(LM2−K−ras4B Lと表す)を発現したが(図5d)、このことは、野生型K−rasの抑制効果は投与量依存性であることを示唆する(図5b〜図5d)。
【0097】
トランスフェクト野生型K−Rasの阻害効果を、腫瘍形成性K−Rasのタンパク質発現の減少によって説明することができるかどうか試験した。LM2細胞は、K−rasのコドン61におけるCAAからCGAへの変異を含む。この変異型K−Rasを認識するのに利用可能な抗体は存在しないため、代替的方法を用いた。GDP結合でなくGTP結合Rasは、c−RafのRas結合ドメイン(RBD)と、特に関連し得る。細菌によって発現したGST−RBDを、LM2細胞株のK−RasのGTP結合性腫瘍形成性形態を単離するためのアフィニティマトリクスとして用いた。
【0098】
LM2細胞を、マイルドな溶解緩衝液(10mM Tris−HCl(pH7.5)、100mM NaCl、1% NP−40、5mM MgCl2、0.2mM PMSF、2μg/ml ロイペプチン、5μg/ml アプロチニン、1mM ベンズアミジン)に溶解し、遠心分離により清浄にした。Bradford Assay(BioRad)によりタンパク質濃度を確定し、インキュベーション前に、サンプルを予めグルタチオンアガロースに結合させたRafのGST−RBD(40μg)(Hermann et al., 1995, J Biol Chem, 270:2901−5.)、またはグルタチオンアガロースのみのいずれかで同等化した。混合の2時間後、ビーズを洗浄し、結合したタンパク質をSDSサンプル処理緩衝液で溶出した。結合したK−rasタンパク質は、α−K−ras F234抗体(Santa Cruz Biotechnology)を用いたウェスタンブロットにより可視化した。
【0099】
図6aに示されるように、様々な程度のトランスフェクト野生型タンパク質発現を有する全ての試験細胞株において、等量の腫瘍形成性K−Rasが単離された。LM2−4S−11およびLM2−K−ras4B Hは、比較的高レベルのトランスフェクト野生型K−Rasを発現したが、一方、LM2−4S−3、LM−2−K−ras4B LおよびLM2−4S−M1は比較的低レベルのトランスフェクト野生型K−Rasを有していた。陽性対照として、293細胞をK−RasV12(pCDNA3−K−RasV12;GTP結合)またはK−RasN17(pCDNA3−K−RasN17;GDP結合)のいずれかでトランスフェクトし、K−RasV12のみがGST−RBDと関連していた(図6a)。データは、腫瘍形成性K−Rasの発現が野生型形態の過剰発現に影響されないことを示す。
【0100】
(実施例2. 野生型K−RasによるERK活性阻害)
これらの研究は、野生型K−Rasの発現がERK活性に影響を与えることを確定した。MAPキナーゼの活性は、細胞の形質転換において重要な役割を果たすことが知られている。ERK活性を、抗リン酸ERK抗体を用いたイムノブロッティングによって確定した。ERK活性は、活性化ループのリン酸化によって直接調節され、これは抗リン酸ERKによって認識される。ERKキナーゼ活性は、抗リン酸ERKイムノブロットを用いて検出されるシグナルと直接相関する。
【0101】
実施例1に記載したように、LM2−K−ras4B HおよびLM2−4S−11細胞株を、これらの研究に用いた。HEK293細胞も、対照として用いた。ERK活性を分析するために、HEK293およびLM2細胞を、それぞれ10%FBSを添加したDMEMおよびCMLR1066培地中で培養した。50ng/mlのEGFを用いて、ERK活性を10分間刺激した。EGFによる刺激を受けなかったHEK細胞を陰性対照とし、EGFにより刺激されたHEK293細胞を陽性対照として用いた。上記実施例1に記載したように、細胞をSDSサンプル処理緩衝液中で直接溶解し、抗ERK抗体または抗リン酸ERK抗体(Sigma Chemical Co. St. Louis, Missouri)を用いたウェスタンブロッティングによって分析した。
【0102】
図6bに示すように、野生型K−Rasの発現レベルとERK活性との間の逆相関が観察された。LM2−K−ras4B HおよびLM2−4S−11細胞株は、比較的高レベルのK−Ras発現を有しており(図5d)、ベクター対照細胞よりも有意に低いERK活性を示した(図6b)。一方、LM2−K−ras4B L、LM2−4S−3およびLM2−4S−M1細胞は、比較的低レベルのK−Ras発現を有しており(図5d)、比較的標準的なERK活性を示した(図6b)。
【0103】
(実施例3. トランスフェクト野生型K−rasは、トランスフェクト細胞株のインビボ腫瘍増殖を阻害した)
この研究は、ヌードマウスのR16およびLM2細胞により、野生型K−rasが腫瘍の発達を阻害することを示した。上記実施例1に記載されたように、野生型K−ras4Bまたは空のベクターをR16およびLM2細胞にトランスフェクトした。胸腺欠損マウス(4〜6週齢)は、Jackson Laboratory(Bar Harbor, Maine)から入手された。対数増殖期の約100万個の細胞を、各ヌードマウスの脇腹に皮下注射し、サブクローンあたり5匹の動物を用いた。動物の健康をモニタリングし、腫瘍の大きさを毎日チェックし、腫瘍の潜伏時間(出現の時間)および大きさ(mm3)を記録した。細胞注射の2〜4週間後、マウスを安楽死させて腫瘍重量を測定した。全てのヌードマウス腫瘍における野生型K−rasクローンの発現をRT−PCRによって確認した。
【0104】
図7a〜図7dに示すように、ベクター対照細胞を注射した5匹のマウス全てにおいては大きな腫瘍が発生していたが、一方、野生型K−rasを運ぶR16細胞およびLM2細胞を注射した5匹のマウスにおいては小さな腫瘍しか観察されなかった。野生型K−rasトランスフェクト群における腫瘍は、ベクター対照マウスの腫瘍(約1.9gおよび約0.6g)と比較して、有意に小さかった(約0.3gおよび約0.05g)(P<0.0001)(図7d)。これらの結果は、野生型K−rasがR16およびLM2細胞の腫瘍形成能を阻害することを示唆した。
【0105】
(実施例4. ウイルスベクターを用いての野生型K−ras遺伝子のヒトへの投与)
野生型K−ras遺伝子をアデノウイルスゲノムに組み換えることによって、組み換え型アデノウイルスを構築する。標準的な方法を用いてウイルスを増殖させ、精製する。組み換え型K−rasアデノウイルスがK−ras遺伝子を発現する能力を試験するために、培養細胞を感染させ、タンパク質抽出物を感染細胞から作製し、この抽出物はK−rasタンパク質に特異的する。K−rasを発現する組み換え型アデノウイルスは、腫瘍を有するヒトに投与する。その後、組み換え型アデノウイルスを投与されたヒトの腫瘍増殖をモニタリングする。
【0106】
(実施例5. タンパク質形質導入を用いた野生型K−rasタンパク質のヒトへの投与)
野生型K−ras遺伝子の5’末端と融合したヒト免疫欠損ウイルスTAT遺伝子由来の、11アミノ酸タンパク質形質導入ドメイン(PTD)をコードするヌクレオチド配列を有する野生型K−ras遺伝子を含む、細菌プラスミド発現ベクターを構築する。プラスミドは、タンパク質(K−ras:PTD融合タンパク質)のアミノ末端と融合した11アミノ酸PTDを有する野生型K−rasタンパク質を産生する大腸菌に形質転換される。K−ras:PTD融合タンパク質は、形質転換された大腸菌から、標準的なタンパク質精製手段を用いて精製する。精製したK−ras:PTD融合タンパク質は、腫瘍を有するヒトに投与する。投与は、静脈内注射またはエーロゾルの吸入のいずれかにより行う。ヒトに投与するK−ras:PTD融合タンパク質は、特定の投与経路に許容可能な薬学的調製物に含まれる。
【0107】
(実施例6. 活性化rasおよび野生型rasの損失によって引き起こされる癌診断)
ヒトの腫瘍由来の組織サンプルを生検から得る。組織サンプルに含まれる細胞を溶解し、標準的な方法を用いて細胞からDNAを単離する。単離したDNAは、K−rasタンパク質をコードするK−rasゲノム配列の領域を増幅するプライマーを用いたPCRに付す。その後、増幅したPCR産物の配列決定を行う。得られたDNA配列を分析して、既知の活性化変異が存在するかどうか確定し、野生型K−rasタンパク質の増殖抑制活性の排除をもたらすK−rasのさらなる変異が存在するかどうかも確定する。
【0108】
(実施例7. 野生型rasの損失に関連する癌の特徴づけ)
合計22個の腺癌および8個の大細胞癌腫の遺伝子型を、染色体12における異型接合性の損失に関して特定した。これらの腫瘍と対になった正常組織とは、Cooperative Human Tissue Network of The Ohio State University Department of Pathology(Columbus, OH)およびUniversity of Cincinnati(Cincinnati, OH)から得た。全ての腫瘍は、病理学者によって病理組織学的に分類された。高分子量のDNAが腫瘍組織および正常組織の双方から、それぞれ出版されたプロトコル(Blin, N. & Stafford, D.W. (1976). Nucleic Acids Res, 3, 2303−8.)に従って単離された。対立遺伝子損失は、染色体12p上の8個の多様なマイクロサテライトマーカー(D12S89、D12S358、D12S310、D12S1606、D12S1596、G60541、D12S1617およびD12S1592(Research Genetics, Inc.))を用いたPCRによってアッセイされた。全てのマーカーは、8%変性ポリアクリルアミドゲル上で記録された。ゲルを乾燥し、X線フィルムに一晩暴露し、LOHを可視的に記録した。40%以上の差異が見られたサンプルのみを対立遺伝子損失として記録した。PCR直接配列決定分析を用いて、Kras2遺伝子のコドン12の変異を、全ての肺腺癌および大細胞癌腫のDNAにおいて確定した。肺腫瘍由来のKras2エキソン1のPCR増幅を、M., Wang, Y., Stoner, G., You, L., Maronpot, R., Reynolds, S.H. & Anderson, M. (1992). Proc Natl Acad Sci USA, 89, 5804−8に記載のように行った。Kras2エキソン1に対するPCRプライマー配列は、以下の通りであった:Kras2−1F:5’−TTTTTATTATAAGGCCTGCT−3’(配列番号_)およびKras2−1R:5’−GTCCACAAAATGATTCTGAA−3’(配列番号_)。114bpのPCR産物は、QIAquickゲル抽出キット(Qiagen, Valencia, CA)を用いて溶出した。コドン12の変異は、ABI PRISM 3700 DNAアナライザー(Perkin−Elmer/Applied Biosystems)を用いて検出された。
【0109】
Kras2領域に注目して、合計8個のマイクロサテライトマーカーを分析した。それぞれのマーカーに対する対立遺伝子型データを表3にまとめる。22個の腺癌のうちの11個(50.0%)および8個の大細胞癌腫のうちの4個(50.0%)は、用いたマーカーの少なくとも1つにおいて対立遺伝子の損失を有することがわかった。図8aは、8個のマイクロサテライトマーカーにおける染色体12pの対立遺伝子型分析の代表的な結果を示す。Kras2変異分析に関して、本発明者らのデータは、22個の腺癌のうちの9個(40.9%)および8個の大細胞癌腫のうちの3個(37.5%)は、コドン12においけるKras2の変異(GGT→TGT、CGT、GAT、GCTおよびGTT塩基転位;図8b、表3)を含むことを示した。LOH分析およびKras2変異データを組み合わせると、腺癌および大細胞癌腫において観察される染色体12p上の対立遺伝子損失の大部分は、活性化されたKras2変異と一致した。約82%(11個のうちの9個)の腺癌および75%(4個のうちの3個)の大細胞癌腫は、それぞれ活性化されたKras対立遺伝子を保持していたが、染色体12pの対立遺伝子の損失を示した。12p上の1つまたは複数の遺伝子座においてKras2変異およびLOHを有する12個の腫瘍を図9に示す。中でも、腫瘍HCG0688L、5796A、HCG1595A、HCG1610LおよびHCG1618Aは、分析した参考マーカーの完全な損失を示し、一方、腫瘍363Aは、最も近い参考マーカー(D12S310およびD12S1592)において異型接合性を保持していたが、D12S1596マーカーのみを損失した。腫瘍167Aおよび5471Aもまた、最も近い参考マーカー(D12S1592)において異型接合性を保持していたが、Kras2が位置するマーカーD12S1617/G60541に関して末端欠失を示した(図9)。LOHデータは、最小領域のLOHをマーカー(D12S1606およびD12S1617/G60541)に局在化させた。フィジカルゲノムマップ(physical genomic map)は、約800kb領域のこれら2つのマーカーに挟まれた位置にKras2遺伝子を配置している。この結果は、野生型Kras2対立遺伝子が、ヒト肺腺癌および大細胞癌腫において欠如することを示唆する。
【0110】
(表3:非小細胞肺癌における染色体12におけるLOH)
【0111】
【表3】
1a:マーカーについて情報性がある腫瘍の数を検査した。
【図面の簡単な説明】
【0112】
【図1】異型接合K−ras欠損マウスを用いた肺腫瘍バイオアッセイ。a:実験計画、bおよびd:それぞれ、ウレタン処理マウスおよびMNU処理マウスにおける肺腫瘍多様性、cおよびe:それぞれ、ウレタン処理マウスおよびMNU処理マウスにおける肺腫瘍負荷。白いバーはK−ras+/+マウスを、黒いバーはK−ras+/−マウスをそれぞれ表す。A/J:(A/J×129/Sv−K−ras)F1、129/SvlmJ:(129/SvlmJ×129/Sv−K−ras)F1、C57BL/6J:(C57BL/6J×129/Sv−K−ras)F1。星印はP<0.0001(野生型動物と比較)を示す。
【図2】異型接合K−ras欠損マウス由来の肺腫瘍。aおよびb:それぞれ、(A/J×129/Sv−K−ras+/+)F1および(A/J×129/Sv−K−ras+/−)F1マウス由来肺の全体的な顕微鏡写真。K−ras欠損マウスにおける腫瘍多様性が、野生型マウスと比較して著しく増加していることに注目、cおよびd:それぞれ、(A/J×129/Sv−K−ras+/+)F1および(A/J×129/Sv−K−ras+/−)F1マウス由来の、4倍での肺腫瘍(腺腫対癌腫)の淡い顕微鏡写真、eおよびf:それぞれ、(A/J×129/Sv−K−ras+/+)F1および(A/J×129/Sv−K−ras+/−)F1マウス由来の、40倍での肺腫瘍。肺胞細気管支腺腫(e)における腫瘍細胞は単形性であり、一方、肺胞細気管支癌腫(f)における腫瘍細胞は多形性である。核は大きさや形が異なっており、目立った複数の核小体を含む。
【図3】マウス肺腫瘍における染色体6上のLOH。a.(C57BL/6J×129/Sv−K−ras+/+)F1野生型マウス由来の肺腫瘍におけるLOH状態に関する、K−rasイントロン2多形性領域のPCR−RFLP分析の代表的な図。レーン1:A/Jマウス対照DNA、レーン2:C57BL/6Jマウス対照DNA、レーン3〜7:(C57BL/6J×129/Sv−K−ras+/+)F1野生型腺腫由来の肺腫瘍。b.K−rasコドン61変異(CAA→CTA)をマーカーとして用いた、クロロプレン誘導性B6C3F1マウス肺腺癌のLOH分析の代表的な図。パネル7:B6C3F1マウス対照DNA、パネル3:クロロプレン誘導性LOH非含有B6C3F1マウス肺腺癌、パネル1、2、4〜6:クロロプレン誘導性LOH含有B6C3F1マウス肺腺癌。c.マーカーD6MCO12の代表的な図を示す。レーン1:c3H/HeJマウス対照DNA、レーン2:C57BL/6Jマウス対照DNA、レーン3:B6C3マウス対照DNA、レーン4〜18:クロロプレン誘導性B6C3F1マウス肺腺癌。
【図4】形質転換NIH/3T3細胞株(R16)における野生型K−rasによる増殖抑制。a.ベクター対照対K−ras4BトランスフェクトR16細胞の増殖曲線。同一継代レベルにおけるR16細胞を、pCR3.1ベクターのみまたは野生型K−ras4Bのいずれかの精製プラスミドDNA1.5〜2μgを用いた同一の条件下でトランスフェクトした。1〜6日目に、G418耐性R16細胞を計数した。各データポイントは2回の実験の平均である。bおよびc:トランスフェクト野生型K−ras4Bによるコロニー形成の阻害。1000個のG418耐性R16細胞を4つのシャーレ(10cm)にそれぞれ播種し、10%のFBSおよび50μg/mlのG418を添加したDMEM中で12日間インキュベートした。その後、細胞を10%緩衝ホルマリンで固定化してクリスタルバイオレットで染色し、目に見えるコロニー(>直径1.5mm)を計数した。星印はP<0.05(ベクタートランスフェクト細胞と比較)を示す。
【図5】マウス肺腫瘍細胞株(LM2)の野生型K−rasによる増殖抑制。a.ベクター対照対K−ras4BトランスフェクトLM2細胞の増殖曲線。同一継代のLM2細胞を、pCR3.1ベクターのみまたは野生型K−ras4Bのいずれかの精製プラスミドDNA1.5〜2μgを用いた同一の条件下でトランスフェクトした。G418耐性LM2細胞を、安定なクローンにサブクローン化した。このクローンの1つをLM2−4S−7と命名し、これは比較的高レベルのトランスフェクト野生型K−rasを発現し、LM2−K−ras4B Hと表した。LM2−4S−4と命名された別のクローンは、約3倍低いレベルのトランスフェクト野生型K−rasを発現し、LM2−K−ras4B Lと表した。G418耐性ベクター対照、LM2−K−ras4B HおよびLM2−K−ras4B L細胞を、1〜4日目に計数した。各データポイントは2回の実験の平均である。星印はP<0.05(ベクタートランスフェクト細胞と比較)を示す。bおよびc:トランスフェクト野生型K−ras4Bによるコロニー形成の阻害。1000個のG418耐性ベクター対照、LM2−K−ras4B HおよびLM2−K−ras4B L細胞を、4つのシャーレ(10cm)にそれぞれ播種し、10%のFBSおよび50μg/mlのG418を添加したCMRL1066中で12日間インキュベートした。その後、細胞を10%緩衝ホルマリンで固定化してクリスタルバイオレットで染色し、目に見えるコロニー(>直径1.5mm)を計数した。星印はP<0.05(ベクタートランスフェクト細胞と比較)を示す。d.トランスフェクトK−ras4Bクローンにより運ばれた独自の配列のRT−PCR。レーン1〜14:LM2−4S−1、LM2−4S−2、LM2−4S−3、LM2−K−ras4B L、LM2−K−ras4B H、LM2−4S−8、LM2−4S−9、LM2−4S−10、LM2−4S−11、LM2−4S−L1、LM2−4S−L3、LM2−4S−L4、LM2−4S−Mおよびベクター対照。
【図6】野生型K−Rasを発現するLM2細胞のK−RasおよびERKの活性化状態。a.Ras活性化。LM2細胞株から得られた溶解物を、グルタチオンアガロースと結合したGST−RBDまたはグルタチオンアガロースのみとインキュベートした(パネル左)。結合したK−Rasは、α−KRas F234抗体(Santa Cruz Biotechnology)を用いたウェスタンブロットにより検出した。HEK293細胞を、K−RasV12およびK−RasN17に対する発現ベクターを用いてトランスフェクトして溶解し、上記のような同一の結合アッセイに付した(パネル右)。b.ERK活性。全細胞溶解物は、抗ERK(パネル上)および抗リン酸ERK(パネル下)抗体によりプローブした。EGFにより刺激されなかったHEK293細胞を陰性対照として用い、EGFにより刺激されたHEK293細胞を陽性対照とした。イムノブロットにおける二重線は、ERK1(44KD)およびERK2(42KD)に相当する。
【図7】野生型K−rasトランスフェクト腫瘍細胞の、ヌードマウス腫瘍発生アッセイ。aおよびb:ヌードマウス腫瘍発達の阻害(左側−ベクター対照、右側−K−ras4Bトランスフェクト細胞)、c:腫瘍の大きさ測定、d:最終的なヌードマウス腫瘍重量の測定。星印はP<0.05(ベクタートランスフェクト細胞と比較)を示す。
【図8】A:非小細胞肺癌におけるLOHを示す代表的なオートラジオグラフ。上記各オートラジオグラフ:マイクロサテライトマーカー、矢印:対立遺伝子損失、N:正常DNA、T:腫瘍DNA。各サンプルに対して、パネル左:LOH非含有肺腫瘍、パネル右:LOH含有肺腫瘍。B:Kras2遺伝子コドン12の変異の代表的な例。左側:Kras2変異非含有肺腫瘍、右側:Kras2遺伝子第12コドン変異(GGT→TGT塩基転位)含有肺腫瘍。
【図9】非小細胞肺癌における染色体12のLOHマップ。1つまたは複数の病巣においてLOHを示した14個のサンプルを示す。左側:12個のサンプルも、活性化されたKras2対立遺伝子を保持していた。右側:2個のサンプルはKras2変異を含まなかった。染色体12の遺伝子マップは、NCBI Human Genome Resources由来である。L:大細胞癌腫、A:腺癌。
【0001】
本出願は、2001年8月24日に出願された米国仮出願出願番号60/314,693から優先権を主張しており、その全体を本明細書に援用する。
【0002】
本発明は、少なくとも一部は国立衛生研究所からの助成金(R01CA58554号およびR01CA78797号)による支援を受けた。連邦政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【0003】
背景
ras遺伝子は、遺伝子の中のrasスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、ヒトおよび齧歯類を含むさまざまな種に存在する。このスーパー遺伝子ファミリーは、多くの多様な細胞内シグナル伝達経路に重要なグアニン三リン酸結合部位を有する構造的に関連するタンパク質をコードする、50以上の遺伝子からなる。このスーパー遺伝子ファミリーのrasサブファミリーは、H−ras、K−ras(Kras2としても知られる)、N−ras、ならびにRAPおよびREL遺伝子からなる(Bredel and Pollack, 1999, Brain Res Rev, 29:232−49; Beaupre and Kuzrock, 1999, J. Clin Oncol, 17:1071−9.)。それぞれのヒトras遺伝子の染色体上の位置は、当該分野において既知である。
【0004】
3つのras遺伝子(H−ras、K−rasおよびN−ras)は、約7〜35キロ塩基対の染色体DNAにわたる6または7つのエキソンを包含する。特定のras遺伝子によっては、タンパク質コード領域を含む4つまたは5つのエキソンが存在する。これらのコードエキソンの初めの3つの中には、GDP/GTP結合およびGTPアーゼ機能のrasタンパク質をコードする領域がある。3つのras遺伝子は、約189アミノ酸長のp21タンパク質をコードし、p21タンパク質は、活性なGTP結合状態にある場合は、細胞膜の内部表面に位置する。特に、チロシンキナーゼレセプターがそのリガンド(例えば、増殖(増殖)因子またはホルモン)の結合によって活性化される場合、p21−rasタンパク質の活性化によって細胞内シグナル伝達が開始する(Bredel and Pollack, 1999, Brain Res Rev, 29:232−49.; McCormick, 1995, Curr Opin Genet Dev, 5:51−5.; McCormick, 1994, Curr Opin Genet Dev, 4:71−6.)。ras/Erk経路におけるその後の下流シグナル伝達は、多数の転写因子を活性化し、これは、細胞型および外部刺激に依存して、細胞増殖または分化を調節する。
【0005】
ras/Erk経路は、幾つかのGTPアーゼ活性タンパク質(GAP)によって負に(negatively)調節される。タンパク質複合体がp21−rasとGAPとの間に形成される場合、p21−rasタンパク質の微弱な固有のGTPアーゼ活性を大きく高める(McCormick, 1995, Curr Opin Genet Dev, 5:51−5.; Ahmadian, et al., 1996, J Biol Chem, 271:16409−15. )。この増加したGTPアーゼ活性は、GTPをGDPに触媒し、活性GTP:p21−rasを、下流のシグナル伝達を停止させる不活性GDP:p21−rasに戻す。内部シグナル伝達経路に関与する非レセプタータンパク質チロシンキナーゼは、p21−rasおよびras/Erk経路も活性化し得る(Rozakis−Adcock, et al., 1992, Nature, 360:689−92., McCormick, 1993, Ciba Found Symp, 176:1−5; Baltensperger, et al., 1993, Science, 260:1950−2.)。p21−rasタンパク質およびras/Erk経路の調節は、上記引用文献に記載の多くのタンパク質の相互作用および酵素活性によって制御される。
【0006】
ras遺伝子の特に重要な局面は、それが腫瘍形成において重要な役割を果たすことである。野生型状態では、ras遺伝子は非腫瘍形成性である。しかしながら、様々なrasの変異(いわゆる「活性化」変異)は、ras遺伝子を腫瘍形成性にし、ras遺伝子の発現が動物において悪性疾患を引き起こしたり、培養細胞の形質転換を引き起こしたりする。野生型の非腫瘍形成性状態では、ras遺伝子はいわゆる原癌遺伝子である。活性化変異を有するras遺伝子は、癌遺伝子であるといわれる。
【0007】
ras遺伝子における活性化点変異は、他のどの原癌遺伝子よりも、より多くのヒト腫瘍型においてより高い頻度(全ヒト腫瘍の25〜30%)で検出されている(Beaupre and Kurzrock, 1999, J Clin Oncol, 17:1071−9.; Anderson, et al., 1992, Environ Health Perspect, 98:13−24., Bos, 1989, Cancer Res, 49:4682−9.; Rodenhuis and Slebos, 1992, Cancer Res, 52:2665s−69s.)。例えば、40〜50%の結腸癌(Bos, et al, 1987, Nature, 327:293−7.; Forrester, et al., 1987, Nature, 327:298−303.; Burmer, et al., 1991, Environ Health Perspect, 93:27−31.);80%の膵臓癌(Burmer, et al., 1991, Environ Health Perspect, 93:27−31.; Mariyama et al., 1989, Jpn J Cancer Res, 80:622−6.; Shibata, et al., 1990, Cancer Res, 50:1279−83.; Pinto, et al., 1997, Acta Cytol, 41:427−34);および30〜50%の肺腺癌(Rodenhuis and Slebos, 1992, Cancer Res, 52:2665s−69s.; Rodenhuis, et al., 1988, Cancer Res, 48:5738−41.; Reynolds, et al., 1991, Proc Natl Acad Sci USA, 88:1085−9.; Suzuki, et al., 1990, Oncogene, 5:1037−43.; Li, et al., 1994, Lung Cancer, 11:19−27.; Mills et al., 1995, Cancer Res, 55:1444−7.)において、変異が検出される。K−ras変異は、この腫瘍型において観察される活性化ras変異のうちの、90%を上回る割合を占める。さらに、活性化ras変異は、骨髄起源、精上皮腫、乳癌、グリア芽細胞腫および神経芽細胞腫の造血性腫瘍(hematopoietic neoplasia)において見られる。ras変異は、胃、膀胱、前立腺、皮膚、甲状腺、頭頸部、子宮内膜、肝臓、卵巣、腎臓、睾丸等の癌においても見られる。活性化されたras原癌遺伝子は、多数の齧歯類において生成された自然発生腫瘍および化学誘導腫瘍においても検出されてきた(Anderson, at al., 1992, Environ Health Perspect, 98:13−24.; Balmain and Brown, 1988, Adv Cancer Res, 51:147−82; Guerrero and Pellicer, 1987, Mutat Res, 185:293−308.)。例えばK−ras原癌遺伝子は、マウスの肺腫瘍において検出される。
【0008】
全ての変異が腫瘍形成性であるras遺伝子をもたらすとは限らないため、ras内の全ての変異が「活性化する」とは限らない。ras原癌遺伝子の変異の活性化は、常にとは限らないが、遺伝子の12番目、13番目および61番目のコドンにおいて優勢に起こる。活性化変異は、コドン59、63、116、117、119、145および146においても見られる。これらの変異の結果は、外部刺激の非存在下において、細胞内のras/Erkシグナル伝達経路を継続的にアップレギュレートすることである。したがって、細胞増殖において重要な役割を果たすシグナル伝達経路は、構造的にオンになる(turned on)(McCormick, 1994, Curr Opin Genet Dev, 4:71−6.; Lowy and Willumsen, 1993, Annu Rev Biochem, 62:851−91)。変異型腫瘍形成性p21と野生型p21との生物学的活性の最初に観察された差異は固有のGTPアーゼ活性であり、バリン−12腫瘍形成性変異と比較して、野生型において10倍高かった。その後、固有のGTPアーゼ活性を、ヒト腫瘍および野生型rasタンパク質において観察されるp21の幾つかの変異形態を区別するのに用いることはできないことがわかった(Trahey and McCormick, 1987, Science, 238:542−5.)。GAPの発見後、コドン12、13または61に変異を有する腫瘍形成性p21と野生型p21との主な生化学的差異は、活性p21:GTP複合体におけるGTP加水分解を誘導するGAPの能力であることが示された。GAP誘導性加水分解は、rasのこの変異形態よりも野生型p21において1000倍であり得る(Vogel, et al., 1988, Nature, 335:90−3.; Gibbs, et al., 1988, Proc Natl Acad Sci USA, 85:5026−30.)。したがって変異形態は、野生型よりも長く活性GTP形態で残存し、変異形態による継続的なシグナル伝達は、少なくとも一部は、腫瘍形成性を招く。
【0009】
活性化されたras癌遺伝子は、遺伝学的に「優性」といわれてきた。優性な遺伝子変異は、たとえその遺伝子の相同な野生型対立遺伝子が同一の細胞にも発現しても、その遺伝子の表現型を産生するものである。変異遺伝子産物によって産生される表現型は、同一の遺伝子の野生型対立遺伝子の発現の結果生じる表現型を支配するといわれる。活性化されたras対立遺伝子は腫瘍形成性であるため、たとえ野生型対立遺伝子も発現したとしても、ras癌遺伝子は優性な変異といわれる(Barbacid, 1987, Annu Rev Biochem, 56:779−827; Marshall, 1991, Pa Med, 94:10.)。
【0010】
しかしながら、ras癌遺伝子が優性であるとの特徴づけは、満足でない場合がある。真の「優性な」変異をコードする遺伝子は、遺伝子発現の通常のレベル(上昇あるいは過剰発現レベルではない)で、および上記のようにその遺伝子の相同な非変異型対立遺伝子の発現の存在下で、その遺伝子の表現型を産生する。幾つかの研究により、形質転換ras癌遺伝子は通常のレベルで発現せず、通常のレベルよりも高いレベルで発現するということが示唆されている。例えば、マウスNIH/3T3細胞の他に変異型ras対立遺伝子でインビトロで形質転換された他の齧歯類細胞においても、変異型ras対立遺伝子は、対照細胞よりも高いレベルで発現する(Hua, et al., 1997, Proc Natl Acad Sci USA, 94:9614−9.; You, et al., 1989, Proc Natl Acad Sci USA, 86:3070−4.; Guerreo et al., 1984, Proc Natl Acad Sci USA, 81:202−5.; Spandidos and Wilkie, 1984, Nature, 310:469−75.)。さらに、ヒト腫瘍細胞株から単離された第一の腫瘍形成性ras対立遺伝子であった変異型EJ H−ras1対立遺伝子は、12番目のコドン変異だけでなく、通常のras対立遺伝子と比較して少なくとも10倍発現を増加させる、最後のイントロンにおける変異も含む(Cohen and Levinson, 1988, Nature, 334:119−24.)。最終的に、Finney およびBishop(Finney and Bishop, 1993, Science, 260:1524−7.)は相同組み換えを用いて、ある野生型H−ras対立遺伝子を形質転換変異型H−ras対立遺伝子に置換した。通常のおよび変異型のH−ras相同遺伝子の双方が同程度に発現したが、異型接合細胞は形質転換されなかった。自然に形質転換された細胞が異型接合細胞の培養から生じ、形質転換された細胞の変異型対立遺伝子は増幅されていた。これらの特定の研究により、ras癌遺伝子の腫瘍形成能は高い発現レベル(優性な変異と矛盾した要件)によって決まるということが示唆された。
【0011】
活性化されたras癌遺伝子の腫瘍形成活性は、優性な変異の活性として適切に特徴づけされていないため、活性化されたras癌遺伝子の形質転換または腫瘍形成活性のより完全な記載を必要とする。このような記載は、癌(特に、活性化されたras癌遺伝子によって引き起こされた癌)のより良い治療を提供すると考えられる。このような記載により、ras癌遺伝子によって引き起こされた癌のより良い診断法および予後判定法も提供される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
既存の抗ras療法は、転写後に生物学的に活性となるように変更されなければならない不活性な前駆体としてrasタンパク質を合成する(Casey, et al., 1989, Proc Natl Acad Sci USA, 86:8323−7.; Hancock, et al., 1989, Cell, 57:1167−77.)、という事実を活用する。このような改変の第一ステップは、炭素数15のイソプレノイド(すなわちファルネソール)を、ファーネシルトランスフェラーゼ(FTase)によりCAAXモチーフのC末端システインに付加することである(Hancock, et al., 1989, Cell, 57:1167−77.)。ゲラニルゲラニル化は、ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ−I(GGTアーゼ−I)によってCAAXモチーフへの炭素数20の部分の付加をもたらす、別の転写後のステップである。既存の抗ras療法は、これらの転写後のステップを選択的に妨げる戦略を利用する(Gibbs et al., 1993, J Biol Chem, 268:7617−20.; Tamanoi, 1993, Trends Biochem Sci, 18:349−53.; Lerner et al., 1995, J Biol Chem, 270:26770−3.)。これらの戦略が有する1つの問題は、これらの転写後のステップの阻害が、活性化されたrasタンパク質の活性のみでなく、腫瘍サプレッサー活性を有する既存の野生型rasタンパク質も阻害することである。別の問題は、rasタンパク質以外のタンパク質が、上記のように転写後に変更されることである。したがって、これらのステップの阻害は、ras以外のタンパク質が影響されると思われるという点で、非特異性である。本明細書に記載された方法(野生型rasの発現)は、これらの欠失の支配下にない。
【課題を解決するための手段】
【0013】
発明の要旨
野生型ras遺伝子は、特に、腫瘍形成性または形質転換表現型が活性化されたras遺伝子または活性化されたrasシグナル伝達経路によって引き起こされる場合、細胞の腫瘍形成性または形質転換表現型を抑制する(すなわち、細胞増殖を阻害する)ことを本発明者らは見出した。したがって、本発明は、細胞、特に癌細胞の増殖を阻害する方法を提供する。この方法は、細胞内における1つまたは複数の野生型rasタンパク質の細胞内レベルを増加させることを含む。一局面においては、この方法は、野生型rasタンパク質をコードする細胞に核酸分子を導入することを含む。導入された核酸はDNAであり得て、この場合、この核酸は野生型rasタンパク質をコードする配列に動作可能に結合する転写プロモーターをさらに含む。導入された核酸は、野生型rasタンパク質または断片をコードし、細胞内のポリペプチドに翻訳されることが可能であるRNAでもあり得る。いずれの場合においても、1つまたは複数の野生型rasタンパク質の細胞内レベルの増加が起こり、細胞増殖が阻害される。増殖細胞がヒトまたは他の動物の腫瘍の範囲内にある場合、細胞増殖の阻害は腫瘍の拡大を停止または減速し、腫瘍の大きさを減少させ、または人体から腫瘍を除去しさえする。
【0014】
別の局面においては、1つまたは複数のrasタンパク質の細胞内レベルは、1つまたは複数の野生型rasタンパク質を細胞内に導入することによって増加する。野生型rasタンパク質の細胞内への導入は、タンパク質形質導入ドメインをタンパク質に加えることによって促進され得る。タンパク質形質導入ドメインは、タンパク質の取り込みを促進する。このよう内在化したrasタンパク質は、タンパク質を取り込んだ細胞の増殖を阻害する。タンパク質形質導入ドメインを含むrasタンパク質は、注射または吸入等の手段によりヒトまたは他の動物に効果的に投与されることが可能である。
【0015】
本発明は、腫瘍または癌の治療において1つまたは複数の野生型rasタンパク質をコードする野生型rasタンパク質または核酸の治療的使用、または腫瘍または癌の形成の予防的抑制にも関する。特定の癌(すなわち、ハイリスク群)と診断される確率が平均以上であり、野生型rasの予防的使用の候補者と思われるヒトの群が存在する。このようなヒトの群は、特定の環境的状況(例えば、ヘビースモーカー)に暴露されるため、特定の癌への家族性感受性のために(例えば、感受性の増加を引き起こす遺伝子の遺伝的継承)、または他の理由のために、ハイリスクであり得る。このような野生型rasの治療的または予防的使用は、治療に有効な量の1つまたは複数の野生型rasタンパク質またはこのようなタンパク質をコードする核酸分子を、個体に投与することを含む。
【0016】
本発明は、細胞内の野生型rasタンパク質、またはその増殖抑制断片の濃度を増加させることによって細胞内のERK MAPキナーゼの活性を減少させる方法も提供する。細胞内の濃度を増加させることは、細胞である野生型rasタンパク質をコードするDNA分子を導入して発現させること、または1つまたは複数の野生型rasタンパク質を細胞に導入することのいずれかによって提供される。
【0017】
本発明は、ヒトまたは他の哺乳動物の癌を特徴づけし、評価する方法も提供する。一実施形態においては、この方法は、被検体から得られた腫瘍細胞のゲノムの1つまたは複数の内因性ras対立遺伝子における機能損失変異をアッセイすることを含む。別の実施形態においては、この方法は、1つまたは複数の内因性ras対立遺伝子における機能損失変異、および被検体から得られた腫瘍細胞の1つまたは複数のras対立遺伝子における活性化変異をアッセイすることを含む。特定の場合においては、機能損失変異は、癌細胞において減少したレベルのrasタンパク質の産生をもたらす。他の場合においては、機能損失変異は、野生型rasタンパク質が有する増殖抑制機能を失ったrasタンパク質の産生をもたらす。活性化されたrasによって引き起こされた最も活動的な癌は、活性化されたras対立遺伝子および野生型rasの増殖抑制活性を欠如する第二のras対立遺伝子の双方を含むため、この方法は、このような癌およびこのような癌を有するヒトまたは動物の予後の診断を提供する。
【0018】
本発明は、異型接合rasノックアウトマウスにおける肺腫瘍形成を誘導する方法にも関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【0019】
発明の詳細な説明
(定義)
本明細書において「野生型」とは、特定の遺伝子を含む生物体または細胞の大部分に見られる配列である遺伝子のヌクレオチド配列またはその遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列をいう。遺伝子またはタンパク質が野生型でない場合、それは変異体である。変異体遺伝子は、野生型遺伝子の配列とは異なるヌクレオチド配列を有する。変異体タンパク質は、野生型タンパク質の配列とは異なるアミノ酸配列を有する。
【0020】
本明細書において、野生型rasタンパク質は「増殖抑制」活性と呼ばれる活性を有する。細胞内における野生型ras活性または付加的野生型ras活性の発現後、増殖抑制活性は、野生型ras活性または付加的野生型ras活性が発現されなかった細胞と比較して、細胞の1つまたは複数の増殖パラメータまたは増殖パラメータの減少または阻害として測定される。これらの細胞に対してなされた多くの異なる測定は、増殖抑制活性を示す。例えば、細胞周期時間の減少、細胞分割時間の減少、およびG1細胞周期フェーズ期間の減少は、野生型rasの増殖抑制活性の指標である。野生型ras活性が発現される細胞が腫瘍、癌または形質転換細胞である場合、軟寒天中におけるコロニーの形成効率の減少または病巣形成の減少等の性質の測定は、対照と比較して野生型rasの増殖抑制活性の指標である。野生型ras活性が発現される細胞がヒトまたは動物の腫瘍の一部を含む、または一部である場合、腫瘍の大きさの減少、腫瘍増殖速度の減少または転移速度の低下は、野生型rasの増殖抑制活性の指標である。
【0021】
本発明で重要なのは、細胞内に発現される野生型ras遺伝子が細胞増殖を阻害または抑制することである。細胞増殖の阻害または抑制とは当業者には周知の用語であり、細胞分割を減速または停止させて細胞数が増加しないようにすることを指す。このような細胞増殖の減速の大きさは変化し得る。本明細書において、腫瘍を含む細胞増殖の変更は、本願の範囲内である。細胞増殖の減速または停止を示す様々な細胞特性の測定は、本願の実施例に記載される。本願の範囲内である腫瘍を含む細胞の野生型rasによる細胞増殖抑制のさらなる局面は、アポトーシス(プログラムされた細胞死)および細胞分化の誘導である。
【0022】
本明細書において「不活化変異」または「機能損失変異」とは、ras遺伝子がコードするrasタンパク質の増殖抑制活性を排除または減少するras遺伝子中のまたは遺伝子周囲の変異を指す。この一例は、遺伝子が発現したrasタンパク質の量の減少をもたらさない遺伝子のコード領域内の1つまたは複数の置換、欠失、挿入または複製であるが、1分子当たりを基準として、変異を含むrasタンパク質は、不活化変異を含まないrasタンパク質よりも小さい増殖抑制活性を定量的に有する。このタイプの不活化変異は、ras遺伝子の1つまたは複数の、初めの3つのコードエキソン内に起こりやすいと考えられる。
【0023】
不活化変異の別の例は、ras遺伝子中の、遺伝子近傍の、または遺伝子に影響する変異であり、その遺伝子からはrasタンパク質は発現されない、または発現量が減少する。このような変異は、例えば、rasプロモーターの転写活性を減少させること、遺伝子からの転写物の異常なスプライシングまたはスプライシングの減少を引き起こすこと、または細胞内のras mRNAまたはタンパク質の半減期を減少させることが可能である。この場合、1分子当たりを基準として、産生されたrasタンパク質は野生型rasタンパク質と同一の増殖抑制活性を定量的に有し得るが、このような変異を含む細胞は野生型rasタンパク質の量が減少するため、ras増殖抑制活性の量が減少する。
【0024】
他の変異は、ras対立遺伝子全体の欠失またはDNA配列からタンパク質が産生されないのに十分なras対立遺伝子の欠失をもたらす。他のタイプの変異はras遺伝子配列内の内部複製を含み、1つのタイプはタンデム複製である。
【0025】
細胞内の野生型ras増殖抑制活性量の減少が、特定のras遺伝子内または遺伝子周辺の、DNAのシトシン残基のメチル化の増加または変化にも起因し得ることも認識すべきである。細胞のDNAのこのような後成的変化は異常メチル化をもたらし、当該分野において周知であり、一般には遺伝子からの翻訳レベルの減少をもたらすと知られている。
【0026】
野生型rasの増殖抑制活性が、細胞中のERK MAPキナーゼ活性の減少と関連があることは認識されるべきである。ERK MAPキナーゼはrasシグナル伝達経路の下流にあり、これは当該分野では周知である。細胞内における野生型rasタンパク質濃度の増加は、ERK MAPキナーゼの活性の減少をもたらす(実施例2参照)。
【0027】
本発明は、細胞内における野生型rasタンパク質濃度の増加によって細胞内のERK MAPキナーゼ活性を減少させる方法も提供する。
【0028】
本明細書において「活性化変異」または「機能獲得変異」とは、一般にras遺伝子のコード配列内の変異を指し、これは形質転換、腫瘍形成性または発癌性活性を有するrasタンパク質の産生をもたらす。生化学的に、活性化変異を含むrasタンパク質(活性化rasタンパク質とも呼ばれる)は、GTPアーゼ活性が減少することもあり、その結果、rasタンパク質が活性なGTP結合状態に固定される。活性化rasタンパク質は、ヌクレオチド結合親和性も減少することがあり、そのため、rasが結合するGDPがより速い速度でGTPと交換される。GAPタンパク質は、GTP結合rasのGDP結合rasへの変換を引き起こす能力が減少することもある。これら全ての場合は、GTP結合rasの蓄積をもたらし、これは、シグナル伝達を引き起こすrasである。活性化変異は、ras遺伝子のコドン12、13、59、61、63、116、117、119、145および146において見られることが知られる。このような変異は、タンパク質のグアニンヌクレオチド結合部位にまたは部位の近傍に起こる。これらコドン内の全ての変異がrasの活性化を同程度引き起こすとは限らない。同様に、これらコドン内の全ての変異が活性化するとは限らない。これらコドンの1つまたは複数内の一部の変異は機能損失変異である可能性がある。活性化変異は多数の技法によって検出され、その幾つかは、Bosらによる米国特許第5,591,582号に記載される(その中の情報は、参考として本明細書により援用される)。
【0029】
本明細書において、DNA分子の細胞への「導入」とは、DNA分子を細胞へ導く当該分野において既知の様々な方法を指す。単離されたDNAを細胞へ導入するこのような方法の1つは、トランスフェクションとして知られる。このようなトランスフェクションは、細胞によるDNAの取り込みを促進する細胞またはDNAの様々な処理を用いて広く行われる。例えば、細胞を化学的処理してDNA透過性にすることができる。例えば、細胞が内在化(internalize)できるリポソームへDNAを組み込むことによってもDNAを処理することができる。
【0030】
核酸(DNAまたはRNA)は、ウイルスを用いて細胞内へ導入されることも可能である。例えば、細胞内へ導入される野生型rasタンパク質をコードするcDNAは、ウイルスゲノム内にクローン化される。このようなウイルスによる細胞の感染は、ウイルスゲノムの細胞への導入をもたらす。クローン化遺伝子はウイルスゲノムの一部であるため、クローン化遺伝子はウイルスゲノムと共に細胞内へ導入される。このようなウイルス「ベクター」は、DNAまたはRNAゲノムを有することが可能である。多数のこのようなウイルスベクターは、当業者には周知である。遺伝子(例えば、野生型ras)を有し、そのゲノムにクローン化されたウイルスベクターは、「組み換え」ウイルスと称され得る。
【0031】
本明細書において「腫瘍形成性」、「形質転換」および「腫瘍性(新形成の)」とは、癌または悪性細胞の特性(すなわち表現型)を有する細胞を指す。様々なこのような特性は、当業者には周知である。例えば、腫瘍形成性細胞が動物に注射される場合は腫瘍を形成するが、非腫瘍形成性細胞は動物への注射後に腫瘍を形成しない。本明細書において、いわゆる「癌遺伝子」は、細胞内への導入および細胞内での発現後に、非癌性細胞を癌性にする遺伝子である。本明細書において、このような癌遺伝子の1つは、活性化変異を含むras遺伝子である。このようなras遺伝子は、「活性化された」ras遺伝子と呼ばれ得る。「抗癌遺伝子」または「腫瘍サプレッサー」遺伝子は、細胞内への導入および細胞内での発現後に、癌性細胞を非癌性にする遺伝子である。本明細書において、このような腫瘍抑制遺伝子の1つは、野生型ras遺伝子である。
【0032】
「新形成」(neoplasia)とは、通常よりも迅速に細胞増殖により増殖し、新たな増殖を開始する刺激が中断した後も増殖を継続させる異常組織の形成および増殖をもたらすプロセスを意味する。
【0033】
(様々なコピー数の野生型rasによるマウスにおける腫瘍発生)
これらの研究は、肺腫瘍形成における野生型K−rasの影響を確定するために計画された。K−ras対立遺伝子欠損マウスは生存できず、胎児性肝臓障害および貧血のために妊娠12〜14日の間に死亡する(Johnson et al., 1997, Genes Dev, 11:2468−81.)ため、そのマウスは試験することができなかった。しかしながら、異型接合K−ras欠損マウスは、マウスの近交系由来の肺腫瘍のほぼ100%が活性化されたK−ras対立遺伝子を示すため、肺腫瘍形成における野生型K−rasの役割を評価するための良好な代替物である(You, et al., 1989, Proc Natl Acad Sci USA, 86:3070−4)。これらの研究は、以下に記載のように行われた。
【0034】
(動物およびF1異型接合体の産生)
6週齢のA/J、129/SvlmJおよびC57BL/6J雌性マウスは、Jackson Laboratories(Bar Harbor, Maine)から入手した。129/Sv−K−ras+/−(K−ras「ノックアウト」)マウスは、以前報告されたように(Johnson et al., 1997, Genes Dev, 11:2468−81.)作成した。ノックアウトマウスは、K−ras遺伝子に新たな遺伝子を含むDNAコンストラクトの挿入変異を含んだ(Johnson et al., 1997, Genes Dev, 11:2468−81.)。動物は、HEPAフィルターをかけた環境制御室(24±1℃、12/12時間の明/暗サイクル)で、堅木の床敷きおよびダストカバーを有するプラスチックケージに収容された。動物は、Rodent Lab Chow(#5001; Purina)であり、水は自由給餌させた。7日間の隔離後、動物をペアにして、(A/J×129/Sv−K−ras+/−)F1、(129/SvlmJ×129/Sv−K−ras+/−)F1および(C57BL/6J×129/Sv−K−ras+/−)F1マウスの産生のための飼育コロニーを作成した。全ての動物の体重を、研究期間の間、月1回モニタリングした。
【0035】
(マウスの遺伝子型の特定)
尾組織切除物(clipping)を、(A/J×129/Sv−K−ras+/−)F1、(129/SvlmJ×129/Sv−K−ras+/−)F1および(C57BL/6J×129/Sv−K−ras+/−)F1マウスからそれぞれ採取し、溶解溶液(プロナーゼ0.4mg/ml、10%ドデシル硫酸ナトリウム(w/v)、10mM Tris、400mM NaClおよび2mM EDTA)中でホモジナイズして37℃で一晩インキュベートした後、フェノール−クロロホルム抽出し、氷冷アルコールで析出させた。各マウスの切除した尾から単離されたDNAは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて、K−ras標的化変異の存在に対して遺伝子型を特定した。すなわち、一対のPCRプライマー(oIMR013:5’−CTTGGGTGGAGAGGCTATTC−3’、oIMR014:5’−AGGTGAGATGACAGGAGATC−3’)を用いて、新たな挿入断片から280bpの産物を増幅した。別の対のPCRプライマー(oIMR015:5’−CAAATGTTGCTTGTCTGGTG−3’ TCR Cd−1、oIMR016:5’−GTCAGTCGAGTGCACAGTTT−3’)を用いて、150bpの産物を内部標準として増幅した。野生型K−ras対立遺伝子の双方(K−ras(+/+))を有するDNAは、たった150bpの断片しか提示しなかったが、野生型K−ras対立遺伝子および標的化変異(+/−)対立遺伝子を有するDNAは、PCR後に150bpおよび280bpバンドを示した。このスクリーニングは、確認のために少なくとも1回は繰り返された。異型接合体雄性129/Sv−K−ras+/−マウスを、A/JおよびC57BL/6J雌と交尾させた。子孫の50%がK−ras標的化変異(tm1)を有しており、残りの50%は野生型K−ras対立遺伝子のみを有していた。
【0036】
(K−ras+/−マウスにおける肺腫瘍形成)
ウレタン誘導性肺腫瘍形成およびMNU誘導性肺腫瘍形成の双方の研究のための実験計画を図1aに示す。6週齢の(A/J×129/Sv−K−ras+/−)F1、(129/SvlmJ×129/Sv−K−ras+/−)F1、および(C57BL/6J×129/Sv−K−ras+/−)F1ハイブリッドマウスを、K−ras遺伝子型および発癌処理のタイプによって12の群に無作為抽出した。ウレタン(カルバミン酸エチル)(純度>99%)およびN−メチルニトロソウレア(MNU)(純度99%)は、Sigma Chemical Co.(St. Louis, Missouri)から入手した。これらの化学的発癌性物質は、バイオアッセイでの使用の直前に調製した。ウレタンおよびMNU双方は、通常の生理食塩水に溶解した。ウレタン処理のために、100匹の雄性マウス((A/J×129/Sv−K−ras+/+)F1マウス17匹、(A/J×129/Sv−K−ras+/−)F1マウス12匹、(129/SvlmJ×129/Sv−K−ras+/+)F1マウス15匹、(129/SvlmJ×129/Sv−K−ras+/−)F1マウス19匹、(C57BL/6J×129/Sv−K−ras+/+)F1マウス19匹、および(C57BL/6J×129/Sv−K−ras+/−)F1マウス18匹を含む)をバイオアッセイに用いた。全ての動物に、0.2mlのリン酸緩衝生理食塩水中のウレタン(1mg/g(体重))を、単回腹腔内(i.p.)注射した。
【0037】
MNU処理群に対して、83匹の雄性マウス((A/J×129/Sv−K−ras+/+)F1マウス14匹、(A/J×129/Sv−K−ras+/−)F1マウス13匹、(129/SvlmJ×129/Sv−K−ras+/+)F1マウス14匹、(129/SvlmJ×129/Sv−K−ras+/−)F1マウス15匹、(C57BL/6J×129/Sv−K−ras+/+)F1マウス13匹、および(C57BL/6J×129/Sv−K−ras+/−)F1マウス14匹を含む)をバイオアッセイに用いた。全ての動物に、0.2mlのリン酸緩衝生理食塩水中のMNU(50mg/g(体重))を、単回i.p.注射した。
【0038】
マウスにおける肺腫瘍発生は異なる遺伝的背景に大きく依存するため、3匹の異なるF1マウスを、起こり得る株特異性効果を回避するために用いた。ウレタン処理18週後、およびMNU処理12週後に、全12群からの動物をCO2窒息により安楽死させた。肺腫瘍組織および正常組織の一部を摘出し、液体窒素中で瞬間凍結させた。各腫瘍の代表的な部分を、組織病理学検査のためにTellyesniczky溶液に固定化した。それぞれの肺を、解剖顕微鏡で検査し、腫瘍の数および大きさを得た。腫瘍の体積は、各腫瘍の三次元的大きさを測定することによって、および直径として3回測定の平均値を用いることにより確定された。半径(直径/2)を確定し、「体積=(4/3)πr3(r−半径)」によって全腫瘍体積を算出した。一元配置の分散分析を用いて、対照群と処理群とのマウスあたりの肺腫瘍数の差異を確定した。二元配置の分散分析を用いて、対照群と処理群との肺腫瘍の数および大きさの双方の差異を確定した。
【0039】
図1aに示すように、6週齢の(A/J×129/Sv−K−ras+/−)F1、(129/SvlmJ×129/Sv−K−ras+/−)F1または(C57BL/6J×129/Sv−K−ras+/−)F1マウス(野生型または異型接合K−rasノックアウトのいずれか)に、ウレタンを1mg/g(体重)の投与量で単回腹腔内注射した。ウレタンによる処理の18週後、全3群の異型接合K−ras欠損マウスには、同型接合野生型対応物よりも有意に多くかつ大きな肺腫瘍が発生した。図1に示すように、(A/J×129/Sv−K−ras+/−)F1異型接合K−ras欠損マウスのウレタンによる処理により、野生型(A/J×129/Sv−K−ras+/+)F1マウスの同一の発癌性物質による処理よりも、肺ごとに4倍多い腫瘍が産生された。同様に、(129/SvlmJ×129/Sv−K−ras+/−)F1および(C57BL/6J×129/Sv−K−ras+/−)F1異型接合K−ras欠損マウスのウレタン処理により、それぞれの野生型同腹仔の処理よりも、肺ごとに4〜5倍多くの腫瘍をもたらした(図1b)。全肺腫瘍体積へのさらなる著しい効果、すなわち、A/J×129/SvJ背景、129/SvlmJ×129/Sv背景およびC57BL/6J×129/Svマウス背景を有する異型接合K−ras欠損マウスにおける、それぞれ30倍、19倍および8倍を超える体積増加があった(図1c)。
【0040】
異型接合K−ras欠損マウスからの大きな肺腫瘍の大部分(>60%)は、腺癌であった(図2b、図2dおよび図2f)。一方、ウレタンまたはN−メチル−N−ニトロソウレア(MNU)のいずれかで処理された野生型マウスからの腫瘍は、いずれも小さな肺腺腫であった(図2a、図2c、および図2e)。図2cおよび図2eに示されるように、腺腫は単一型増殖パターンによって特徴づけされ、一般に十分に分化した細胞から成っていた。異型接合K−ras欠損マウスからの肺腫瘍の約60%は腺癌であった(図2dおよび図2f)。マウスの肺腺癌は、分化の程度が異なる細胞から構成されていた(図2f)。これらの腫瘍は、正常な肺胞構造の完全な損失、細胞核/細胞質比、細胞核集中(crowding)および細胞学的異型の増加、増殖パターンの不均一性、および近接した細気管支または血管への侵入を示した。これらの結果は、野生型K−rasの損失が未分化悪性肺腫瘍の発生に有意に寄与することを示唆する。
【0041】
これらの観察は予想外であり、肺の発癌を化学的に誘導する間、K−rasの野生型対立遺伝子が腫瘍サプレッサーとして作用することを示唆した。発癌性物質としてMNUを用いた第2の肺腫瘍バイオアッセイを行った。MNUは代謝活性化を必要としない直接作用アルキル化剤であるが、一方ウレタンは代謝活性化を必要とする前発癌性物質である。(A/J×129/Sv−K−ras+/−)F1、(129/SvlmJ×129/Sv−K−ras+/−)F1または(C57BL/6J×129/Sv−K−ras+/−)F1マウスは、ウレタンについて記載されたプロトコルと類似のものを用いて、MNUで処理された。図1dおよび図1eに見られるように、MNUによるK−ras欠損マウスの処理により、腫瘍多様性が4〜6倍増加し、3つのマウス背景の全てにおいて腫瘍体積が32〜50倍増加した。
【0042】
(肺腫瘍におけるK−ras活性化変異)
上記のマウスにおける肺腫瘍を、K−ras活性化変異に関して分析した。TRIzol試薬(Gibco BRL)を用いて肺腫瘍からDNAを単離し、PCR反応のテンプレートとして用い、次いでPCA産物のDNAの配列決定を行った。K−rasエキソン1および2のためのPCRプライマーの配列は、以前記載された(You, et al., 1989, Proc Natl Acad Sci USA, 86:3070−4.)。また、PCR反応を行い、以前記載されたように(You, et al., 1989, Proc Natl Acad Sci USA, 86:3070−4.)PCR産物を直接配列決定した。
【0043】
表1に示されるように、K−rasの第1のエキソンおよび第2のエキソンにおいて行われた配列分析により、K−ras野生型マウスから分析された全てのウレタン誘導性腫瘍は、コドン61の2番目の位置においてATからTAへの塩基転換を含むことが明らかになった。類似の頻度およびタイプのK−ras変異は、ウレタンで処理された異型接合K−ras欠損マウスからの肺腫瘍において観察された。同様に、野生型マウスまたは異型接合K−ras欠損マウスのいずれかからのMNU誘導性肺腫瘍全ては、K−rasにおけるコドン12の2番目の位置においてGCからATへの塩基転換を含んでいた(表1)。
【0044】
(表1:肺腫瘍において検出されたK−ras遺伝子における活性化変異)
【0045】
【表1】
(マウス肺腫瘍における末端染色体6のLOH)
この研究においては、出願人らはK−ras活性化変異とK−ras領域におけるマーカーの損失(異型接合性またはLOHの損失)との関係をさらに調べた。この関係は、腫瘍におけるK−rasの他の野生型対立遺伝子の損失を示唆する。
【0046】
国立毒性学プログラム(NTP)は、K−ras変異およびLOH分析のためにB6C3F1マウスから2組のマウス肺腫瘍を提供した。第1の組は、吸引により0、1、2または4mg/m3のV2PO5に2年間暴露されたマウス由来であった。第2の組は、クロロプレンで処理されたマウス由来であった。肺腫瘍の多様性データおよびクロロプレン誘導性腫瘍のK−ras変異分析が報告された(Sills, et al., 1999, Carcinogenesis, 20:657−62.; 1996, NTP Technical Report 467, NIH Publication no. 96−3957, NIEHS, NIH, Research Triangle Park, NC)。対立遺伝子型(allelotypic)分析を、V2PO5研究において42個のマウス肺腫瘍(2個は無処理マウス由来、40個はV2PO5暴露マウス由来である)を用いて、マーカーD6MIT14で行った。D6MIT14は、Research Genetics, Inc.(Hunstsville, Alabama)から入手された。標準的なPCR反応を行い、目に見える差異を観察することができた場合に対立遺伝子の損失を記録した。クロロプレン誘導性肺腫瘍をホルマリン固定し、パラフィン包埋した。したがって、D6MIT14マーカーを用いては満足なPCR結果を得ることができなかった。K−ras近傍のLOHを評価するために、C57BL/6マウスとC3Hマウスとの間で多様であり、一本鎖コンホメーション多形性分析技法である、マーカーD6MCO12(プライマー配列:D6MCO12−1F 5’GATGTCAAACGTGAGAGTGTC3’(配列番号_)およびD6MCO12−1R 5’GCGCTGACTCGCTTCTTCCAT3’(配列番号_))を用いた。マーカーとしてK−rasのコドン61の変異(CAA→CTA)を用いて、結果をさらに確認した。
【0047】
表2にまとめられたように、40個の五酸化バナジウム(V2PO5)誘導性肺腺癌をK−ras活性に関して調べ、29個(73%)は変異を有していた。また、これらの腫瘍を、マーカーD6MIT14でのK−rasの領域におけるLOHに関して類別し、これらのうち18個が対立遺伝子欠損を示した(表2)。V2PO5誘導性腫瘍に見られる最も頻繁なK−ras変異は、コドン12の2番目の塩基におけるGAのATへの塩基転位またはGAのTAへの塩基転換のいずれかであった(データは示さず)。D6MIT14は、K−rasの0.5−cM内にマッピングされる(Manenti, et al., 1999, Genome Res, 9:639−46.)。D6MIT14における対立遺伝子の損失は、腫瘍におけるK−ras変異と密接に相関しており、対立遺伝子損失を有する18個の腫瘍うち16個(89%)がK−ras変異も有していた。K−rasコドン61変異(CAA→CTA)およびD6MCO12(K−rasに約5cM近接)を用いて、出願人らはこれらのサンプル中におけるLOHの程度を調べた。図3bおよび図3cおよび表2に示されるように、対立遺伝子損失を有する19個の腫瘍のうち16個(84%)はK−ras変異も有しており、このことは、これらのマーカーにおける対立遺伝子損失とK−ras活性化との密接な相関を示唆する。これらの結果は、K−ras野生型マウスにおける肺腫瘍の発生の低下や大きさの縮小は、野生型K−ras対立遺伝子の維持の結果であることも示唆する。PCR−RFLP分析を18個のウレタン処理肺腫瘍で行い、このうち6個は(A/J×129/Sv−K−ras+/+)F1、6個は(129/SvlmJ×129/Sv−K−ras+/+)F1、6個は(C57BL/6J×129/Sv−K−ras+/+)F1マウス由来であった。wt/wtマウス由来の18個の肺腫瘍は、対立遺伝子損失を含まなかった。(C57BL/6J×129/Sv−K−ras+/+)F1マウス由来の肺腫瘍におけるLOH状態を分析した代表的な結果を図3aに示す。
【0048】
(表2 マウス肺腫瘍においてK−ras活性化と関係する遠位染色体6におけるLOH)
【0049】
【表2】
a:LOHおよびK−rasの変異データは、Hegi et al.からのものである(Hegi,et al.、1994,Cancer Res,54:6257−64)。
b:K−ras変異データは、Sills et al.からのものである(Sills,et al.,1999,Carcinogenesis,20:657−662)。
【0050】
(診断および予後アッセイ)
本発明は、ヒトまたは動物における腫瘍または癌を特徴付けする方法を提供する。一局面においては、この方法は、ras遺伝子中のまたは遺伝子近傍の変異を検出するために、腫瘍または癌由来のサンプル中の1つまたは複数のras遺伝子の1つまたは複数の対立遺伝子の分析を含む。一実施形態においては、特異的H−ras、K−rasおよびN−rasに対する対立遺伝子を分析する。他の実施形態においては、多様なH−ras遺伝子、K−ras遺伝子またはN−ras遺伝子に対する対立遺伝子を分析する。この分析は通常、腫瘍または癌細胞のゲノムからのDNAのある形態の遺伝子型特定を含み、様々な方法でなされ得る。好ましくは、この分析はras遺伝子のあるタイプのDNA配列決定を含む。配列分析を含まない遺伝子型特定は、遺伝子中の1つの塩基対が変更されているタイプの変異を検出することはできない可能性がある。
【0051】
あるタイプの分析においては、腫瘍または癌から単離されたDNAは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって分析される。ras遺伝子の領域、あるいは周辺の領域を選択し、その領域におけるゲノムDNAとハイブリダイズするPCRプライマーを作製する。このようなプライマーは、ras遺伝子内の任意の公知の配列に向けて、またはゲノム配列が知られているras遺伝子周辺の領域に向けて作製され得る。用いられることか可能なras遺伝子周辺の領域のこのような組の1つは、多様なミクロサテライトマーカーであり、この配列およびヒト全体の位置ならびに幾つかの動物ゲノムは、当該分野において知られている。PCR反応にプライマーを用いて、目的のras遺伝子を含むゲノム領域を増幅させる。ras遺伝子を含むゲノム領域全体を増幅させるために1回のPCR反応を用いもよい。あるいは、目的のras遺伝子の異なる領域をそれぞれ増幅させる、複数回のPCR反応を用いてもよい。好ましくは、目的のras遺伝子のコード領域全体を増幅させるようにPCR反応を用いる。さらに、イントロン内および目的のras遺伝子周辺のゲノム領域を増幅してもよい。
【0052】
その後、PCR産物の分析を行う。PCR産物の分析は、様々なタイプであり得る。行う分析のタイプは通常、分析を行っている人が検出しようとしている変異のタイプに依存する。例えば、対照細胞(すなわち、野生型ras遺伝子を有することが知られる細胞)由来のDNAを用いた同一のPCR産物の大きさと比較して、腫瘍または癌細胞ゲノム由来の特定のPCR産物の大きさを分析することは、ゲノム領域におけるDNAの挿入または欠失を検出することができる。当該分野では知られているが、ゲノムを増幅するために2つのPCRプライマーを用いる領域の間のゲノム領域においてDNAの挿入がある場合、得られるPCR産物は、挿入が起こらなかったゲノム由来のDNAを用いて得られた同一のPCR産物の大きさと比較してより大きい。同様に、2つのPCRプライマーの間のゲノムにおけるDNAの欠失は、欠失を含まないゲノム由来のDNAを用いて得られた対照PCR産物と比較してより小さいPCR産物をもたらす。このような分析は、野生型ゲノム由来の産物と比較して、PCR産物の大きさに比較的大きな変化(例えば、最小でも10%の変化)を検出する。通常、PCR産物の大きさは、2つ以上のPCR産物の相対的な大きさを比較することによって確定される。例えば、ras変異が疑われるゲノム由来のPCR産物の大きさは、ras変異が存在しないことが知られるゲノム由来の同一のPCR産物の大きさと比較される。相対的な大きさは、ゲル電気泳動において起こる電場中のPCR産物の移動を用いて容易に比較される。アガロースゲル電気泳動は、この目的のためにしばしば用いられる。
【0053】
PCR産物を分析する別の方法は、PCR産物の全てまたは一部のヌクレオチド配列を確定することによる。この分析方法は、10%未満のPCR産物の相対的な大きさの変化を検出する。この方法は、相対的な大きさの変化をもたらさないDNA配列の変化も検出する。例えば、2つの異なる細胞由来のDNAの増幅から得られた同一のPCR産物の配列決定および配列比較は、単一または複数のヌクレオチド塩基の変化やDNA領域の置換等を検出することができる。DNAの配列決定方法またはPCR産物のDNA配列決定方法は、分子生物学の技術分野において既知である。配列決定の連鎖停止方法がしばしば用いられる。DNAの配列決定は、自動配列決定機によってしばしば行われる。
【0054】
別のタイプの分析においては、RNA、好ましくは腫瘍または癌細胞から単離されたmRNAをテンプレートとして用いて、逆転写反応においてDNAを作製する。その後、逆転写されたDNAは、試験中のras遺伝子のmRNA内にあることが知られる配列を有するPCRプライマーを用いるPCR反応におけるテンプレートとして用いられる。特定のras遺伝子のmRNA配列の全長を増幅するために、上記のように様々なmRNAプライマーを選択することができる。これは、上記のような1回のPCR反応または複数回のPCR反応を用いて行うことができる。その後、すでに記載されたのとほぼ同様にPCR産物の分析を行う。あるタイプの分析においては、PCR産物の有無または対照と比較したその大きさの変化は、rasゲノム領域内の大きな挿入または欠失等の大きな変化を示す。さらに、このような分析はPCR産物のゲル電気泳動を用いて広く行われる。別のタイプの分析においては、PCR産物のDNA配列は、当該分野において周知の方法を用いて決定される。
【0055】
当該分野で周知の他の方法も、ras遺伝子、転写物、またはいずれかの野生型と比較しての変更の存在をアッセイするために使用することができる。これらの方法のいくつかに、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、RNアーゼ保護アッセイ、S1ヌクレアーゼアッセイ等がある。
【0056】
rasDNAおよびRNAを変異に関して分析する方法に加えて、rasタンパク質自身を、もしあれば、変化に関してアッセイすることも可能である。例えば、当該分野において、特定のrasタンパク質をコードする遺伝子内の特異的変異の存在に依存して、様々なrasタンパク質(H−ras、K−rasおよびN−ras)に特異的に結合する様々な抗体が周知である。例えば、タンパク質をコードする遺伝子の特異的コドンにおける活性化変異がある場合に限り、rasタンパク質に結合する抗体が利用できる。他の抗体は、タンパク質が変異を含まないかまたは少なくとも十分特徴づけされた活性化変異を含まない場合に限り、rasタンパク質に結合する。このような区別して結合する抗体の機能の基礎は通常、特定のrasタンパク質のコンホメーションである。例えば変異は、特異的抗体が結合するまたはしないようにrasタンパク質のコンホメーションの変化を引き起こす。このタイプの抗体の多くは、市販されている(例えば、Oncogenic Science)。したがって、抗体の利用によって、特異的変異rasタンパク質が腫瘍または癌細胞に存在するかどうかを確定することができる。特異的変異が存在するかどうか確定することもできる。
【0057】
このような抗体は、当該分野において既知の様々なアッセイを用いてrasタンパク質を分析するために用いられる。例えば、免疫沈降、ウェスタンブロッティングおよび免疫組織化学は、一般に用いられる方法である。抗体を用いる他のアッセイは、当該分野において既知であり、用いられることが可能である。ある抗体は、1つまたは複数のこのようなアッセイにおいて良好な結果をもたらし得る。
【0058】
記載されるように、ras遺伝子の異常メチル化は、細胞内の野生型ras活性発現の減少をもたらす。細胞中の特定の遺伝子の異常メチル化を検出するための、当該分野において既知である様々な方法がある。ある方法においては、DNA中の同一のヌクレオチド配列を認識するが配列内の特定のヌクレオチドがメチル化されるかどうかによって配列を区別して切断する、一組の制限エンドヌクレアーゼを用いる。その後、切断されたDNAは、1つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼ部位にわたるプローブを用いて、サザンブロッティングによって分析される。対照細胞と比較して腫瘍または癌細胞由来のゲノムDNAにおける部位のメチル化の変化は、サザンブロットにおけるDNA断片のバンドパターンの差異によって検出される。異常メチル化を検出するための他の方法には、メチル化シトシンを異なるヌクレオチド塩基に変化させるゲノムDNAの亜硫酸水素処理が含まれる。その後、変化した塩基は様々な技法(メチル化感受性PCRはこの技法の1つである)を用いて検出される。他の方法には、様々なDNA配列決定技法が含まれる。このような技法の1つは、ゲノム配列決定である。他の方法は知られており、用いられることが可能である。
【0059】
腫瘍または癌細胞のras遺伝子、RNAまたはタンパク質を特徴付けするためのこのようなアッセイの結果を、診断または予後に用いることができる。野生型rasは増殖抑制活性を有するため、この活性の存在は上記のアッセイが用いられる患者にとって望ましい。一般に、患者にとって最も望ましくない状況は、野生型ras増殖抑制活性が腫瘍または癌由来の細胞に存在しない状況である。より望ましい状況、およびより良い予後を伴う状況は、一般に腫瘍または癌細胞における野生型ras増殖抑制活性がある状況である。
【0060】
(治療剤または予防剤としての野生型ras遺伝子)
本発明は、増殖抑制活性を有する野生型rasタンパク質の細胞において発現の増加を引き起こすことにより、細胞増殖を阻害または抑制する方法も提供する。この活性の発現の増加を、様々な方法により引き起こすことができる。通常、このような方法は、野生型rasタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の細胞へ導入することを含む。DNAまたはRNAは、このような細胞に導入され得る。rasタンパク質を細胞に導入することも可能である。ある場合には、既に細胞内にある遺伝子由来の野生型ras活性の発現の増加を引き起こす薬剤を投与することも可能である。
【0061】
当然のことながら、被検体が野生型rasで処理されることが可能な腫瘍または癌を有する場合、これらの方法は治療に用いられる。この方法を、腫瘍または癌を形成しそうな個体においてその形成を抑制するのに用いることもできる。腫瘍または癌を有する個体の、腫瘍または癌細胞における野生型活性が減少しているかまたは活性がない場合、rasの発現の増加を引き起こす方法を用いることが好ましい。しかしながら、野生型ras活性がある場合に本発明の方法を用いることもできるが、既知のrasシグナル伝達経路は、腫瘍または癌の形成および増殖に寄与するようにさらに活性化される。ras以外の遺伝子またはrasシグナル伝達経路以外の経路が個体の腫瘍または癌に寄与する場合も、本発明の方法を用いることができる。
【0062】
これらの方法において、「野生型rasタンパク質」とは、上述したrasスーパー遺伝子ファミリーのメンバーによりコードされる任意の野生型タンパク質をまとめて指す。より好ましくは、用いられる野生型rasタンパク質は、スーパー遺伝子ファミリーのrasサブファミリーのメンバー(すなわち、H−ras、K−ras、N−ras)によりコードされる。最も好ましくは、野生型rasタンパク質はK−rasタンパク質である。本発明の方法において用いられる遺伝子およびタンパク質は、齧歯類由来のものであることもあるが、ヒト由来のものであることが好ましい。これらのタンパク質およびそれらをコードする配列は、当該分野において既知である。このような遺伝子およびタンパク質の配列は、National Center for Biotechnology Informationによって提供されるデータベースまたは他の類似のデータベースにおいて、インターネット上で見ることができる。
【0063】
rasタンパク質、またはrasをコードするDNAやRNAの増殖抑制活性の存在は、1つまたは複数の様々なアッセイにより確定される。このようなアッセイのある群には、培養物中のまたは動物中の細胞に遺伝子またはタンパク質を導入すること、およびその後、その遺伝子またはタンパク質の細胞増殖への効果を測定することが含まれる。増殖抑制活性は、増殖の阻害を引き起こす。別の方法は、遺伝子またはタンパク質を細胞へ導入すること、およびその後、ERK MAPキナーゼの活性を測定することである。この測定は、当該分野において既知の生化学的アッセイを使用することによって行うことができる。
【0064】
この方法は、ヒトまたは動物体内のタンパク質投与後の安定化または半減期の増加をもたらすras遺伝子またはそれがコードされたタンパク質への修飾のためにも提供される。修飾された、短縮または部分タンパク質が、抗増殖性、増殖抑制性、抗腫瘍発生性、抗腫瘍形成性、抗悪性等であると言うことができるある活性を保つ限り、野生型ras遺伝子またはタンパク質に対する任意の修飾が本発明の範囲内であることに留意することは重要である。
【0065】
野生型ras遺伝子は、様々な手段を用いて導入されることが可能である。これらの手段の多くは、遺伝子療法の技術分野において周知である。野生型ras活性をコードするまたは野生型ras活性の刺激を引き起こすウイルスベクターを用いる、腫瘍または癌細胞のトランスフェクションまたは感染等の様々な方法を用いて、遺伝子を導入することができる。
【0066】
本発明は、例えばヒトまたは動物の腫瘍を含む細胞等のヒトまたは動物に存在する細胞に、野生型ras遺伝子を導入するために提供される。ヒトまたは動物中にある細胞に遺伝子を導入するための様々な方法がある。ある好ましい方法は、腫瘍を含む細胞にウイルスが感染するように、クローン化された野生型ras遺伝子を含む組み換えウイルスを、ヒトまたは動物へ投与することを用いる。ヒトまたは動物中にある細胞に遺伝子を導入する別の方法は、野生型rasをコードする精製されたDNAを、ヒトまたは動物に直接投与することを含む。このような投与は、DNAの注射によって行うことができる。このような手段は、一般にワクチン分野で、特にいわゆる「DNAワクチン」の投与のために用いられる。
【0067】
野生型ras活性をコードするポリヌクレオチド配列を細胞内に導入するために、ポリヌクレオチド配列のタンパク質コード領域は通常、mRNAへの転写に加えてmRNAの野生型rasへの翻訳も促進する配列に結合する。これを行うための当該分野において一般的なストラテジーは、クローン化されたタンパク質コード配列の発現を促進する配列を含むベクターに、rasタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をクローン化することである。
【0068】
発現ベクターは通常、遺伝子発現を促進する配列を含む。発現媒体は、タンパク質コード配列のアセンブリを含む転写ユニットおよび転写および翻訳を調節するエレメントを含むことが可能である。転写調節エレメントは一般に、転写を開始するエレメントを含む。このようなエレメントのタイプとしては、プロモーターおよびエンハンサーが挙げられる。プロモーターは、構成的、誘導的または組織特異的であり得る。転写調節エレメントは、転写を停止させる、またはRNAの3’末端処理のためのシグナル(ポリアデニル化のためのシグナル)を提供するものも含む。翻訳調節配列は通常、配列をコードするタンパク質の一部であり、翻訳開始コドンおよび翻訳停止コドンを含む。タンパク質コード領域の一部である付加的配列(例えば、細胞膜にタンパク質を導く配列、シグナル配列等)があってもよい。
【0069】
細胞内に導入されるras配列は、細胞内に導入された後、高レベルで発現する(すなわち、導入されたポリヌクレオチド配列が細胞内でrasタンパク質を大量に産生する)ことが好ましい。細胞内に導入されたポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を引き起こす技法は、当該分野において既知である。このような技法は、配列を細胞内に導入させるとすぐにポリヌクレオチド配列の転写が増加することを含むことが多いが、これらに限定されない。このような技法は導入されたポリヌクレオチド配列を高レベルで(at a high rate)開始させる転写プロモーターの使用を含むことが多い。このような様々なプロモーターが存在し、当該分野で既知である。このようなプロモーターは、ウイルス由来であることが多い。このようなプロモーターは、様々な細胞のタイプにおけるポリヌクレオチド配列の、効率的な転写をもたらすことができる。このようなプロモーターは、構成的(例えばヒトサイトメガロウイルス由来のCMVエンハンサー/プロモーター)または誘導的(例えば、マウス乳腺腫瘍ウイルス由来のMMTVエンハンサー/プロモーター)であり得る。様々な構成的および誘導的プロモーターおよびエンハンサーが当該分野において知られている。特異的な細胞型におけるポリヌクレオチド配列の転写をもたらす、他のプロモーター(いわゆる「腫瘍特異的プロモーター」)も用いることができる。特異的組織において発現する様々なプロモーターが存在し、当該分野において知られている。例えば、発現が神経、肝臓、上皮細胞および他の細胞に特異的であるプロモーターが存在し、当該分野において知られている。このようなDNA分子を作製する方法(すなわち、組み換えDNA法)は、当業者には周知である。
【0070】
当該分野において、ベクターとは、細胞で結合した別の核酸またはポリヌクレオチド配列の導入を媒介することが可能な核酸分子を指す。好ましいベクターの1つのタイプはエピソーム(すなわち、染色体外複製が可能な核酸)である。他のタイプのベクターは、ベクターが導入される細胞のゲノムの一部になる。挿入されたDNA配列の発現を導くことができるベクターは、「発現ベクター」と称され、プラスミド、ウイルスまたは他のタイプの当該分野において知られている分子を含み得る。
【0071】
代表的には、ベクターは、rasポリヌクレオチド配列の挿入を可能にする、1つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む。ベクターは、非形質転換細胞から形質転換細胞を同定し、分離する働きをする化合物をコードするマーカー遺伝子(例えば、優性抗生物質抵抗性遺伝子)をさらに含み得る。
【0072】
本発明において用いられるベクターのタイプの1つは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターは、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、パルボウイルスおよびレトロウイルスを含む様々なウイルスファミリーに一般に準じる、組み換えウイルスである。このような組み換えウイルスは一般に、ベクター感染した宿主細胞における外因性ポリヌクレオチド配列の発現を引き起こすことができるプロモーターの制御下において、外因性ポリヌクレオチド配列(本明細書においてはras遺伝子)を含む。
【0073】
ウイルスベクターのタイプの1つは、ゲノムに挿入された外因性ポリヌクレオチド配列を有する、欠損アデノウイルスである。「欠損アデノウイルス」という用語は、標的細胞において自己複製できないアデノウイルスを指す。一般に、欠損アデノウイルスのゲノムは、感染細胞におけるウイルスの複製に必要な配列を欠如している。このような配列は、部分的に、または好ましくは、完全にゲノムから除去される。標的細胞に感染できるようにするために、欠損ウイルスは、コンストラクトをインビボで調製する間にウイルス粒子の封入を可能にするのに十分な本来のゲノム由来の配列を含む。ウイルスが含む他の配列は、遺伝学的に必要な「シスにある(in cis)」であると言われる任意の配列である。
【0074】
別のタイプのウイルスベクターは、ゲノムに挿入された外因性ポリヌクレオチド配列を有する欠損レトロウイルスである。このような組み換えレトロウイルスは、当該分野において既知である。本発明における使用のための組み換えレトロウイルスは、ヘルパーウイルスの汚染がないことが好ましい。ヘルパーウイルスとは、複製欠損でない、組み換えレトロウイルスのパッケージングの間に生じることがあるウイルスである。
【0075】
非欠損または複製型ウイルスベクターを用いることもできる。このようなベクターは、ウイルスの複製に必要な配列を保持する。
【0076】
他のタイプのベクターは、プラスミドベクターである。
【0077】
一局面においては、本発明の方法は、細胞において野生型rasのレベルが増加するように、rasポリヌクレオチド配列(好ましくはベクターに含まれる)を特異的な細胞に導入することを含む。本明細書において、このようなDNA分子(複数可)(具体的には、1つまたは複数のrasポリヌクレオチド配列をコードするDNA分子)の、細胞への導入または伝達は、DNA分子を細胞へ導くための当該分野において知られている様々な方法のいずれかを指す。単離されたDNAを細胞へ導入するこのような方法の1つは、トランスフェクションとして知られている。このようなトランスフェクションは一般に、細胞によるDNAの取り込みを促進する細胞またはDNAの様々な処理を用いて行われる。例えば、細胞を化学的に処理して、DNA透過性にすることができる。例えば、細胞が内在化できるリポソームにDNAを含むことによって、DNAを処理することもできる。好ましくは、トランスフェクションを用いて、プラスミドDNAを細胞へ導入する。
【0078】
上記のように、ウイルスを用いて、rasポリヌクレオチド配列を細胞内に導入することもできる。例えば、細胞に導入されるポリヌクレオチド配列は、ウイルスゲノムにクローン化される。このようなウイルスによる細胞の感染は、ウイルスゲノムの細胞への導入をもたらす。このようなクローン化されたポリヌクレオチド配列はウイルスゲノムの一部であるため、ウイルスゲノムと共に細胞に導入される。このようなウイルス「ベクター」は、DNAまたはRNAゲノムを有することができる。多数のこのようなウイルスベクターは、当業者には周知である。ゲノムにクローン化された、例えばrasタンパク質をコードするクローン化ポリヌクレオチド配列を有するウイルスベクターは、「組み換え」ウイルスと称される。ウイルスを用いてのDNA分子の伝達は、ポリヌクレオチド配列を、動物の特定の細胞または腫瘍に伝達させるのに特に有用である。このような技法は、遺伝子療法として当該分野において広く知られている。
【0079】
ヒトまたは動物の患者中にある細胞に、ポリヌクレオチド配列を導入する別の方法は、rasタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む精製されたDNAを、ヒトまたは動物に直接投与することを含む。このような投与は、DNAの注射によって、またはDNAのトランスフェクションによってさえも行うことができる。このような手段は、ワクチン分野において、具体的にはいわゆる「DNAワクチン」を投与するために、広く用いられる。
【0080】
ヒトまたは動物に野生型ras遺伝子を投与するためにどんな手段を用いても、このような手段は、腫瘍細胞に優先的に導入され、非腫瘍細胞にはあまり優先的に導入されない野生型ras遺伝子をもたらす。例えば、ヒトまたは動物のある細胞型(例えば、腫瘍細胞型)を特異的に感染させる組み換えウイルスをもたらす技法が、当該分野において知られている。ウイルスに対しては、このような「ターゲッティング」は、組み換えウイルスに対する細胞レセプターの処置(manipulation)および/またはウイルスに対する細胞レセプターを認識してそれに結合するウイルスリガンドの処置によって達成されることが可能である。このような手段は、野生型ras遺伝子を動物またはヒトの腫瘍細胞に導入するために用いられる場合、本願の範囲内である。
【0081】
外因性ポリヌクレオチド配列を、他の細胞ではなく特異的細胞に導入するための遺伝子伝達および遺伝子療法の技術分野において知られている方法がある。例えば、ヒトまたは動物にある細胞型(例えば、腫瘍細胞型)を特異的に感染させる組み換えウイルスをもたらす技法が、当該分野において知られている。ウイルスに対しては、このような「ターゲッティング」は、組み換えウイルスに対する細胞レセプターの処置および/またはウイルスに対する細胞レセプターを認識してそれに結合するウイルスリガンドの処置によって達成されることが可能である。このような手段は、rasポリヌクレオチド配列を動物またはヒトの腫瘍細胞に導入するために用いられる場合、本願の範囲内である。
【0082】
rasポリヌクレオチド配列が細胞内に導入された後、具体的には、ポリヌクレオチド配列が導入された細胞および/または導入されたポリヌクレオチド配列を発現している特異的細胞を確定するための技法が用いられる。ポリヌクレオチド配列の存在および/またはポリヌクレオチド配列の発現を調べるための様々な技法が存在し、当該分野において既知である。このような技法の幾つかは、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ウェスタンブロッティング、RNアーゼ保護、放射性ヨウ素摂取アッセイ等を含む。
【0083】
(治療剤としての野生型rasタンパク質)
本発明の別の局面は、rasタンパク質を細胞に導入することによって細胞増殖を阻害または抑制する方法を提供する。タンパク質を細胞に導入するための様々な方法が存在する。タンパク質を細胞に導入するための当該分野において知られている様々な方法がある。ある方法においては、タンパク質を結合または融合させて、細胞へ入ることを導く短いペプチドにする。あるペプチドのこのような群は、タンパク質形質導入ドメインと呼ばれる。タンパク質を細胞へ導入する別の方法は、脂質担体を用いる。例えば、リポソームに関与するタンパク質は、リポソームが細胞に入るまたは細胞と融合する場合、細胞に入ることができる。タンパク質を細胞に導入する他の方法が知られている。マイクロインジェクションおよびエレクトロポレーションが、その方法の2つである。他の方法も知られている。
【0084】
このような方法としては、Nagaharaらによる出版物(Nagahara et al., 1998, Nat Med, 4:1449−52)に、およびDowdyの研究室からの出版物(Nagahara et al., 1998, Nat Med, 4:1449−52.; Schwarze, et al., 1999, Science, 285:1569−72.; Vocero−Akbani, et al., 2000, Methods Enzymol, 322:508−21; Ho, et al., 2001, Cancer Res, 61:474−7., Vocero−Akbani, et al., 2001, Methods Enzymol, 332:36−49; Snyder and Dowdy, 2001, Curr Opin Mol Ther, 3:147−52.; Becker−Hapak, et al., 2001, Methods, 24:247−56.)に記載されるような、「タンパク質形質導入」または「タンパク質療法」が挙げられるがこれらに限定されない。これらの出版物は参考として本明細書において援用される。
【0085】
一実施形態においては、ヒト免疫欠損ウイルスTATタンパク質(Green and Loewenstein, 1988, Cell, 55:1179−88.; Frankel and Pabo, 1988, Cell, 55:1189−93.)由来の「タンパク質形質導入ドメイン」(PTD)である、11アミノ酸配列を、野生型rasタンパク質に融合させる。その後、精製されたタンパク質を細胞表面と接触させ、その細胞の増殖を阻害または抑制するように機能する野生型rasタンパク質をその細胞に取り込む。融合したPTDを含む野生型rasタンパク質を、ヒトまたは動物の腫瘍を含む細胞に導入することが望ましい場合は、そのタンパク質を様々な方法によってヒトに投与する。好ましくは、そのタンパク質は、注射(例えば静脈に)によって、またはエーロゾル中の吸入によって投与される。
【0086】
融合したPTDを含む野生型rasタンパク質は、PTDをコードするDNA配列を有する野生型ras遺伝子をコードするDNA配列を融合することによって生成されることが好ましい。大量の融合タンパク質が生成されるように、融合遺伝子の生物体への導入、および生物体における高レベルでの遺伝子発現を促進するベクター(例えば、プラスミドまたはウイルスベクター)に、得られるras−PTD融合遺伝子を組み込むことが好ましい。融合遺伝子を含むベクターを発現することができるこのような生物体の1つは細菌、好ましくは大腸菌である。他の生物体も当業者に広く用いられる。融合タンパク質をこれらの生物体のいずれかにおいて高レベルで発現させた後、当業者に既知のタンパク質精製技法を用いて、融合タンパク質を生物体から精製する。
【0087】
野生型rasタンパク質は、ヒトまたは他の動物に、好ましくは薬学的組成物中で投与される。送達に適した剤形は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th ed.(Mack Publishing Co., Philadelphoa, Pa., 1985)に見られる。これらの薬学的組成物は、様々な薬物送達システムにおける使用に適している(Langer, Science 249:1527−1533, 1990)。
【0088】
組成物中の野生型rasタンパク質は、単一の投与または一連の接種に適している。この薬学的組成物は、非経口投与、局所投与または経口投与を対象としている。非経口投与は、静脈内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与または筋内投与によることが好ましい。非経口投与は、肝臓の動脈または胆管へのカテーテル挿入等による患者の肝臓に対して優先的に行われ得る。非経口投与のために、組成物にはrasタンパク質および適切な無菌担体(水、水性緩衝液、0.4%生理食塩水溶液、0.3%グリシン、ヒアルロン酸または当該分野において既知の無毒性非イオン性界面活性剤のエマルジョン等)が含まれる。組成物は、NaCl、KCl、CaCl2、酢酸ナトリウムおよび乳酸ナトリウム等の緩衝剤や湿潤剤等の、生理的状態に近づけるための物質をさらに含んでもよい。なお、薬学的に許容可能な組成物中のrasタンパク質の投与に加えて、rasタンパク質をコードするDNAまたはRNAを、このような組成物の一部として投与してもよい。
【0089】
従来の無毒性な固体担体中のrasタンパク質を含む固体組成物としては、例えば、グルコース、スクロース、マンイトール、ソルビトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、セルロースまたはセルロース誘導体、炭酸ナトリウムおよび炭酸マグネシウム等が挙げられる。固体組成物の経口投与のために、HCV様粒子は、組成物を10%〜95%、より好ましくは25%〜75%含むことが好ましい。
【0090】
治療または予防に有効な投与量のrasタンパク質組成物を、個体に投与する。組成物は単回投与として投与されてもよいが、それよりも、何日、何週、さらには何ヶ月にもわたる一連の投薬としてもよい。本明細書における有効な治療投与量とは、腫瘍の増殖を阻害する、または腫瘍の退縮さえ引き起こす投与量である。このような投与量により、腫瘍の転移も阻害または抑制される。本明細書における有効な予防投与量とは、腫瘍の形成を抑制する投与量である。
【0091】
(ERK MAPキナーゼに対する野生型rasの発現)
本発明の別の局面は、ERK MAPキナーゼの活性を阻害する方法を提供する。ERK MAPキナーゼ活性の阻害は、上記のように、野生型rasタンパク質をコードする遺伝子または野生型rasタンパク質の、細胞への導入後に起こる。
【実施例】
【0092】
本発明のさらなる詳細は以下の実施例において見出すことができ、これらの実施例は本発明の範囲をさらに定義する。本明細書に引用した全ての参照は、その全てが参照により本明細書において明示的に援用される。
【0093】
(実施例1. 野生型K−ras遺伝子による腫瘍細胞株の増殖阻害)
野生型K−rasが、R16という名の形質転換NIH/3T3細胞株(You et al., 1989, Proc Natl Acad Sci USA, 86:3070−4.)およびLM2という名のマウス肺腫瘍細胞株(McDoniels−Silvers, et al., 2001, Exp Lung Res, 27:297−318.)の増殖を阻害する、トランスフェクション研究を行った。いずれの細胞株も、変異型K−ras対立遺伝子を含んでいた。R16は、K−ras中のコドン12の2番目の位置におけるGCからATへの塩基転位を含むマウス肺腫瘍DNAにより形質転換されたNIH/3T3由来である。R16細胞は、変異型K−rasの高レベルの発現(野生型K−ras対立遺伝子よりも約10倍高い)を示した。LM2は、A/Jマウス株におけるウレタン誘導性肺腫瘍から確立された、転移性腫瘍細胞株である。LM2は、K−rasのコドン61の2番目の位置におけるATからGCへの塩基転位を含んでいた。
【0094】
野生型K−rasを含む発現ベクターは、A/Jマウスの正常な肺から単離された全mRNAの、マウスcDNA配列由来のプライマーを用いたRT−PCRにより単離された、野生型K−ras4Bに対する全長マウスcDNAから作製された(George et al., 1985, Embo J, 4:1199−203.)。野生型K−ras4B発現コンストラクトは、cDNAのpCR3.1哺乳動物発現プラスミド(Invitrogen, Carlsbad, California)へのライゲーションによって作製される。その後、発現コンストラクトは、Maxi−tip 500カラム(QIAGEN, Santa Clarita, California)を用いて精製され、トランスフェクション実験に使用する前に、確認のために配列決定された。
【0095】
同一の継代のR16およびLM3細胞を、クローン(すなわち、pCR3.1ベクターのみ、およびリポフェクタミン(Life Technologies, Gaithersburg, Maryland)を用いる野生型K−ras4B)の1.5〜2μgの精製プラスミドDNAを用いて、同一の条件下でトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞は、G418における選択により選択された。G418耐性R16細胞を直接アッセイし、G418耐性LM2細胞を安定なクローンにサブクローン化した。これらの細胞は、増殖速度およびコロニー形成効率の分析のために用いられた。増殖速度は、各ウェルに2000個の細胞を播種した12ウェルシャーレを用いて、これらの細胞から確定された。10%のFBSおよび50μg/mlのG418を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で、二連式ウェルにおいてR16細胞をインキュベートした。10%のFBSおよび50μg/mlのG418を添加したCMRL1066中で、LM2細胞を培養した。プレーティング後1、2、4、6および8日目に細胞を計数した(図4および5参照)。コロニー形成アッセイのために、トランスフェクト細胞の各サブクローン用に4つのシャーレ(各直径10cm)を用いた。各シャーレに1000個の細胞を播種し、10%のFBSおよび50μg/mlのG418を添加したDMEM中で12日間インキュベートした。その後、細胞を10%緩衝ホルマリンで固定化し、クリスタルバイオレットで染色し、目に見えるコロニー(直径1.5mmを超える)を計数した。トランスフェクト野生型K−ras4Bの発現は、トランスフェクトクローンによって運ばれる独自の配列を利用するRT−PCRによって、これらのサブクローンにおいて、およびコロニー形成アッセイから選択されたコロニーにおいてモニタリングされた。具体的には、cDNAは、野生型K−ras4Bを用いてトランスフェクトされたG418耐性細胞から単離されるRNAから生成される。その後、これらのcDNAに関して、転写開始位置の後ろに位置するベクター配列(5’TAATACGACTCACTATAGGG3’)およびK−ras4Bイントラジェニックコード配列(5’CTCTATCGTAGGGTCGTAC3’)に特異的なプライマーを用いてPCRを行った。
【0096】
図4aに示されるように、野生型K−rasのR16細胞へのトランスフェクションは、細胞増殖を有意に阻害した(6日目までに80%阻害)。空のベクター対照細胞において65個を超えるコロニーが増殖したが、野生型K−rasトランスフェクトNIH/3T3細胞から生じたコロニーは非常に少数(10個未満)しか観察されなかった(図4bおよび図4c)。野生型K−ras遺伝子のLM2へのトランスフェクションは、G418耐性細胞(LM2−K−ras4B H)の選択されたクローンの1つにおいて、細胞増殖を有意に阻害した(4日目までに90%阻害)(図5a)。LM2−K−ras4B Hは、比較的高レベルのトランスフェクト野生型K−rasを発現した(図5d)。200個を超えるコロニーが空のベクター対照細胞において増殖したが、LM2−K−ras4B H細胞においては非常に少数のコロニー(10個未満)しか見られなかった(図5bおよび図5c)。LM2細胞由来の平均30個のコロニーは、約3倍低いレベルのトランスフェクト野生型K−ras(LM2−K−ras4B Lと表す)を発現したが(図5d)、このことは、野生型K−rasの抑制効果は投与量依存性であることを示唆する(図5b〜図5d)。
【0097】
トランスフェクト野生型K−Rasの阻害効果を、腫瘍形成性K−Rasのタンパク質発現の減少によって説明することができるかどうか試験した。LM2細胞は、K−rasのコドン61におけるCAAからCGAへの変異を含む。この変異型K−Rasを認識するのに利用可能な抗体は存在しないため、代替的方法を用いた。GDP結合でなくGTP結合Rasは、c−RafのRas結合ドメイン(RBD)と、特に関連し得る。細菌によって発現したGST−RBDを、LM2細胞株のK−RasのGTP結合性腫瘍形成性形態を単離するためのアフィニティマトリクスとして用いた。
【0098】
LM2細胞を、マイルドな溶解緩衝液(10mM Tris−HCl(pH7.5)、100mM NaCl、1% NP−40、5mM MgCl2、0.2mM PMSF、2μg/ml ロイペプチン、5μg/ml アプロチニン、1mM ベンズアミジン)に溶解し、遠心分離により清浄にした。Bradford Assay(BioRad)によりタンパク質濃度を確定し、インキュベーション前に、サンプルを予めグルタチオンアガロースに結合させたRafのGST−RBD(40μg)(Hermann et al., 1995, J Biol Chem, 270:2901−5.)、またはグルタチオンアガロースのみのいずれかで同等化した。混合の2時間後、ビーズを洗浄し、結合したタンパク質をSDSサンプル処理緩衝液で溶出した。結合したK−rasタンパク質は、α−K−ras F234抗体(Santa Cruz Biotechnology)を用いたウェスタンブロットにより可視化した。
【0099】
図6aに示されるように、様々な程度のトランスフェクト野生型タンパク質発現を有する全ての試験細胞株において、等量の腫瘍形成性K−Rasが単離された。LM2−4S−11およびLM2−K−ras4B Hは、比較的高レベルのトランスフェクト野生型K−Rasを発現したが、一方、LM2−4S−3、LM−2−K−ras4B LおよびLM2−4S−M1は比較的低レベルのトランスフェクト野生型K−Rasを有していた。陽性対照として、293細胞をK−RasV12(pCDNA3−K−RasV12;GTP結合)またはK−RasN17(pCDNA3−K−RasN17;GDP結合)のいずれかでトランスフェクトし、K−RasV12のみがGST−RBDと関連していた(図6a)。データは、腫瘍形成性K−Rasの発現が野生型形態の過剰発現に影響されないことを示す。
【0100】
(実施例2. 野生型K−RasによるERK活性阻害)
これらの研究は、野生型K−Rasの発現がERK活性に影響を与えることを確定した。MAPキナーゼの活性は、細胞の形質転換において重要な役割を果たすことが知られている。ERK活性を、抗リン酸ERK抗体を用いたイムノブロッティングによって確定した。ERK活性は、活性化ループのリン酸化によって直接調節され、これは抗リン酸ERKによって認識される。ERKキナーゼ活性は、抗リン酸ERKイムノブロットを用いて検出されるシグナルと直接相関する。
【0101】
実施例1に記載したように、LM2−K−ras4B HおよびLM2−4S−11細胞株を、これらの研究に用いた。HEK293細胞も、対照として用いた。ERK活性を分析するために、HEK293およびLM2細胞を、それぞれ10%FBSを添加したDMEMおよびCMLR1066培地中で培養した。50ng/mlのEGFを用いて、ERK活性を10分間刺激した。EGFによる刺激を受けなかったHEK細胞を陰性対照とし、EGFにより刺激されたHEK293細胞を陽性対照として用いた。上記実施例1に記載したように、細胞をSDSサンプル処理緩衝液中で直接溶解し、抗ERK抗体または抗リン酸ERK抗体(Sigma Chemical Co. St. Louis, Missouri)を用いたウェスタンブロッティングによって分析した。
【0102】
図6bに示すように、野生型K−Rasの発現レベルとERK活性との間の逆相関が観察された。LM2−K−ras4B HおよびLM2−4S−11細胞株は、比較的高レベルのK−Ras発現を有しており(図5d)、ベクター対照細胞よりも有意に低いERK活性を示した(図6b)。一方、LM2−K−ras4B L、LM2−4S−3およびLM2−4S−M1細胞は、比較的低レベルのK−Ras発現を有しており(図5d)、比較的標準的なERK活性を示した(図6b)。
【0103】
(実施例3. トランスフェクト野生型K−rasは、トランスフェクト細胞株のインビボ腫瘍増殖を阻害した)
この研究は、ヌードマウスのR16およびLM2細胞により、野生型K−rasが腫瘍の発達を阻害することを示した。上記実施例1に記載されたように、野生型K−ras4Bまたは空のベクターをR16およびLM2細胞にトランスフェクトした。胸腺欠損マウス(4〜6週齢)は、Jackson Laboratory(Bar Harbor, Maine)から入手された。対数増殖期の約100万個の細胞を、各ヌードマウスの脇腹に皮下注射し、サブクローンあたり5匹の動物を用いた。動物の健康をモニタリングし、腫瘍の大きさを毎日チェックし、腫瘍の潜伏時間(出現の時間)および大きさ(mm3)を記録した。細胞注射の2〜4週間後、マウスを安楽死させて腫瘍重量を測定した。全てのヌードマウス腫瘍における野生型K−rasクローンの発現をRT−PCRによって確認した。
【0104】
図7a〜図7dに示すように、ベクター対照細胞を注射した5匹のマウス全てにおいては大きな腫瘍が発生していたが、一方、野生型K−rasを運ぶR16細胞およびLM2細胞を注射した5匹のマウスにおいては小さな腫瘍しか観察されなかった。野生型K−rasトランスフェクト群における腫瘍は、ベクター対照マウスの腫瘍(約1.9gおよび約0.6g)と比較して、有意に小さかった(約0.3gおよび約0.05g)(P<0.0001)(図7d)。これらの結果は、野生型K−rasがR16およびLM2細胞の腫瘍形成能を阻害することを示唆した。
【0105】
(実施例4. ウイルスベクターを用いての野生型K−ras遺伝子のヒトへの投与)
野生型K−ras遺伝子をアデノウイルスゲノムに組み換えることによって、組み換え型アデノウイルスを構築する。標準的な方法を用いてウイルスを増殖させ、精製する。組み換え型K−rasアデノウイルスがK−ras遺伝子を発現する能力を試験するために、培養細胞を感染させ、タンパク質抽出物を感染細胞から作製し、この抽出物はK−rasタンパク質に特異的する。K−rasを発現する組み換え型アデノウイルスは、腫瘍を有するヒトに投与する。その後、組み換え型アデノウイルスを投与されたヒトの腫瘍増殖をモニタリングする。
【0106】
(実施例5. タンパク質形質導入を用いた野生型K−rasタンパク質のヒトへの投与)
野生型K−ras遺伝子の5’末端と融合したヒト免疫欠損ウイルスTAT遺伝子由来の、11アミノ酸タンパク質形質導入ドメイン(PTD)をコードするヌクレオチド配列を有する野生型K−ras遺伝子を含む、細菌プラスミド発現ベクターを構築する。プラスミドは、タンパク質(K−ras:PTD融合タンパク質)のアミノ末端と融合した11アミノ酸PTDを有する野生型K−rasタンパク質を産生する大腸菌に形質転換される。K−ras:PTD融合タンパク質は、形質転換された大腸菌から、標準的なタンパク質精製手段を用いて精製する。精製したK−ras:PTD融合タンパク質は、腫瘍を有するヒトに投与する。投与は、静脈内注射またはエーロゾルの吸入のいずれかにより行う。ヒトに投与するK−ras:PTD融合タンパク質は、特定の投与経路に許容可能な薬学的調製物に含まれる。
【0107】
(実施例6. 活性化rasおよび野生型rasの損失によって引き起こされる癌診断)
ヒトの腫瘍由来の組織サンプルを生検から得る。組織サンプルに含まれる細胞を溶解し、標準的な方法を用いて細胞からDNAを単離する。単離したDNAは、K−rasタンパク質をコードするK−rasゲノム配列の領域を増幅するプライマーを用いたPCRに付す。その後、増幅したPCR産物の配列決定を行う。得られたDNA配列を分析して、既知の活性化変異が存在するかどうか確定し、野生型K−rasタンパク質の増殖抑制活性の排除をもたらすK−rasのさらなる変異が存在するかどうかも確定する。
【0108】
(実施例7. 野生型rasの損失に関連する癌の特徴づけ)
合計22個の腺癌および8個の大細胞癌腫の遺伝子型を、染色体12における異型接合性の損失に関して特定した。これらの腫瘍と対になった正常組織とは、Cooperative Human Tissue Network of The Ohio State University Department of Pathology(Columbus, OH)およびUniversity of Cincinnati(Cincinnati, OH)から得た。全ての腫瘍は、病理学者によって病理組織学的に分類された。高分子量のDNAが腫瘍組織および正常組織の双方から、それぞれ出版されたプロトコル(Blin, N. & Stafford, D.W. (1976). Nucleic Acids Res, 3, 2303−8.)に従って単離された。対立遺伝子損失は、染色体12p上の8個の多様なマイクロサテライトマーカー(D12S89、D12S358、D12S310、D12S1606、D12S1596、G60541、D12S1617およびD12S1592(Research Genetics, Inc.))を用いたPCRによってアッセイされた。全てのマーカーは、8%変性ポリアクリルアミドゲル上で記録された。ゲルを乾燥し、X線フィルムに一晩暴露し、LOHを可視的に記録した。40%以上の差異が見られたサンプルのみを対立遺伝子損失として記録した。PCR直接配列決定分析を用いて、Kras2遺伝子のコドン12の変異を、全ての肺腺癌および大細胞癌腫のDNAにおいて確定した。肺腫瘍由来のKras2エキソン1のPCR増幅を、M., Wang, Y., Stoner, G., You, L., Maronpot, R., Reynolds, S.H. & Anderson, M. (1992). Proc Natl Acad Sci USA, 89, 5804−8に記載のように行った。Kras2エキソン1に対するPCRプライマー配列は、以下の通りであった:Kras2−1F:5’−TTTTTATTATAAGGCCTGCT−3’(配列番号_)およびKras2−1R:5’−GTCCACAAAATGATTCTGAA−3’(配列番号_)。114bpのPCR産物は、QIAquickゲル抽出キット(Qiagen, Valencia, CA)を用いて溶出した。コドン12の変異は、ABI PRISM 3700 DNAアナライザー(Perkin−Elmer/Applied Biosystems)を用いて検出された。
【0109】
Kras2領域に注目して、合計8個のマイクロサテライトマーカーを分析した。それぞれのマーカーに対する対立遺伝子型データを表3にまとめる。22個の腺癌のうちの11個(50.0%)および8個の大細胞癌腫のうちの4個(50.0%)は、用いたマーカーの少なくとも1つにおいて対立遺伝子の損失を有することがわかった。図8aは、8個のマイクロサテライトマーカーにおける染色体12pの対立遺伝子型分析の代表的な結果を示す。Kras2変異分析に関して、本発明者らのデータは、22個の腺癌のうちの9個(40.9%)および8個の大細胞癌腫のうちの3個(37.5%)は、コドン12においけるKras2の変異(GGT→TGT、CGT、GAT、GCTおよびGTT塩基転位;図8b、表3)を含むことを示した。LOH分析およびKras2変異データを組み合わせると、腺癌および大細胞癌腫において観察される染色体12p上の対立遺伝子損失の大部分は、活性化されたKras2変異と一致した。約82%(11個のうちの9個)の腺癌および75%(4個のうちの3個)の大細胞癌腫は、それぞれ活性化されたKras対立遺伝子を保持していたが、染色体12pの対立遺伝子の損失を示した。12p上の1つまたは複数の遺伝子座においてKras2変異およびLOHを有する12個の腫瘍を図9に示す。中でも、腫瘍HCG0688L、5796A、HCG1595A、HCG1610LおよびHCG1618Aは、分析した参考マーカーの完全な損失を示し、一方、腫瘍363Aは、最も近い参考マーカー(D12S310およびD12S1592)において異型接合性を保持していたが、D12S1596マーカーのみを損失した。腫瘍167Aおよび5471Aもまた、最も近い参考マーカー(D12S1592)において異型接合性を保持していたが、Kras2が位置するマーカーD12S1617/G60541に関して末端欠失を示した(図9)。LOHデータは、最小領域のLOHをマーカー(D12S1606およびD12S1617/G60541)に局在化させた。フィジカルゲノムマップ(physical genomic map)は、約800kb領域のこれら2つのマーカーに挟まれた位置にKras2遺伝子を配置している。この結果は、野生型Kras2対立遺伝子が、ヒト肺腺癌および大細胞癌腫において欠如することを示唆する。
【0110】
(表3:非小細胞肺癌における染色体12におけるLOH)
【0111】
【表3】
1a:マーカーについて情報性がある腫瘍の数を検査した。
【図面の簡単な説明】
【0112】
【図1】異型接合K−ras欠損マウスを用いた肺腫瘍バイオアッセイ。a:実験計画、bおよびd:それぞれ、ウレタン処理マウスおよびMNU処理マウスにおける肺腫瘍多様性、cおよびe:それぞれ、ウレタン処理マウスおよびMNU処理マウスにおける肺腫瘍負荷。白いバーはK−ras+/+マウスを、黒いバーはK−ras+/−マウスをそれぞれ表す。A/J:(A/J×129/Sv−K−ras)F1、129/SvlmJ:(129/SvlmJ×129/Sv−K−ras)F1、C57BL/6J:(C57BL/6J×129/Sv−K−ras)F1。星印はP<0.0001(野生型動物と比較)を示す。
【図2】異型接合K−ras欠損マウス由来の肺腫瘍。aおよびb:それぞれ、(A/J×129/Sv−K−ras+/+)F1および(A/J×129/Sv−K−ras+/−)F1マウス由来肺の全体的な顕微鏡写真。K−ras欠損マウスにおける腫瘍多様性が、野生型マウスと比較して著しく増加していることに注目、cおよびd:それぞれ、(A/J×129/Sv−K−ras+/+)F1および(A/J×129/Sv−K−ras+/−)F1マウス由来の、4倍での肺腫瘍(腺腫対癌腫)の淡い顕微鏡写真、eおよびf:それぞれ、(A/J×129/Sv−K−ras+/+)F1および(A/J×129/Sv−K−ras+/−)F1マウス由来の、40倍での肺腫瘍。肺胞細気管支腺腫(e)における腫瘍細胞は単形性であり、一方、肺胞細気管支癌腫(f)における腫瘍細胞は多形性である。核は大きさや形が異なっており、目立った複数の核小体を含む。
【図3】マウス肺腫瘍における染色体6上のLOH。a.(C57BL/6J×129/Sv−K−ras+/+)F1野生型マウス由来の肺腫瘍におけるLOH状態に関する、K−rasイントロン2多形性領域のPCR−RFLP分析の代表的な図。レーン1:A/Jマウス対照DNA、レーン2:C57BL/6Jマウス対照DNA、レーン3〜7:(C57BL/6J×129/Sv−K−ras+/+)F1野生型腺腫由来の肺腫瘍。b.K−rasコドン61変異(CAA→CTA)をマーカーとして用いた、クロロプレン誘導性B6C3F1マウス肺腺癌のLOH分析の代表的な図。パネル7:B6C3F1マウス対照DNA、パネル3:クロロプレン誘導性LOH非含有B6C3F1マウス肺腺癌、パネル1、2、4〜6:クロロプレン誘導性LOH含有B6C3F1マウス肺腺癌。c.マーカーD6MCO12の代表的な図を示す。レーン1:c3H/HeJマウス対照DNA、レーン2:C57BL/6Jマウス対照DNA、レーン3:B6C3マウス対照DNA、レーン4〜18:クロロプレン誘導性B6C3F1マウス肺腺癌。
【図4】形質転換NIH/3T3細胞株(R16)における野生型K−rasによる増殖抑制。a.ベクター対照対K−ras4BトランスフェクトR16細胞の増殖曲線。同一継代レベルにおけるR16細胞を、pCR3.1ベクターのみまたは野生型K−ras4Bのいずれかの精製プラスミドDNA1.5〜2μgを用いた同一の条件下でトランスフェクトした。1〜6日目に、G418耐性R16細胞を計数した。各データポイントは2回の実験の平均である。bおよびc:トランスフェクト野生型K−ras4Bによるコロニー形成の阻害。1000個のG418耐性R16細胞を4つのシャーレ(10cm)にそれぞれ播種し、10%のFBSおよび50μg/mlのG418を添加したDMEM中で12日間インキュベートした。その後、細胞を10%緩衝ホルマリンで固定化してクリスタルバイオレットで染色し、目に見えるコロニー(>直径1.5mm)を計数した。星印はP<0.05(ベクタートランスフェクト細胞と比較)を示す。
【図5】マウス肺腫瘍細胞株(LM2)の野生型K−rasによる増殖抑制。a.ベクター対照対K−ras4BトランスフェクトLM2細胞の増殖曲線。同一継代のLM2細胞を、pCR3.1ベクターのみまたは野生型K−ras4Bのいずれかの精製プラスミドDNA1.5〜2μgを用いた同一の条件下でトランスフェクトした。G418耐性LM2細胞を、安定なクローンにサブクローン化した。このクローンの1つをLM2−4S−7と命名し、これは比較的高レベルのトランスフェクト野生型K−rasを発現し、LM2−K−ras4B Hと表した。LM2−4S−4と命名された別のクローンは、約3倍低いレベルのトランスフェクト野生型K−rasを発現し、LM2−K−ras4B Lと表した。G418耐性ベクター対照、LM2−K−ras4B HおよびLM2−K−ras4B L細胞を、1〜4日目に計数した。各データポイントは2回の実験の平均である。星印はP<0.05(ベクタートランスフェクト細胞と比較)を示す。bおよびc:トランスフェクト野生型K−ras4Bによるコロニー形成の阻害。1000個のG418耐性ベクター対照、LM2−K−ras4B HおよびLM2−K−ras4B L細胞を、4つのシャーレ(10cm)にそれぞれ播種し、10%のFBSおよび50μg/mlのG418を添加したCMRL1066中で12日間インキュベートした。その後、細胞を10%緩衝ホルマリンで固定化してクリスタルバイオレットで染色し、目に見えるコロニー(>直径1.5mm)を計数した。星印はP<0.05(ベクタートランスフェクト細胞と比較)を示す。d.トランスフェクトK−ras4Bクローンにより運ばれた独自の配列のRT−PCR。レーン1〜14:LM2−4S−1、LM2−4S−2、LM2−4S−3、LM2−K−ras4B L、LM2−K−ras4B H、LM2−4S−8、LM2−4S−9、LM2−4S−10、LM2−4S−11、LM2−4S−L1、LM2−4S−L3、LM2−4S−L4、LM2−4S−Mおよびベクター対照。
【図6】野生型K−Rasを発現するLM2細胞のK−RasおよびERKの活性化状態。a.Ras活性化。LM2細胞株から得られた溶解物を、グルタチオンアガロースと結合したGST−RBDまたはグルタチオンアガロースのみとインキュベートした(パネル左)。結合したK−Rasは、α−KRas F234抗体(Santa Cruz Biotechnology)を用いたウェスタンブロットにより検出した。HEK293細胞を、K−RasV12およびK−RasN17に対する発現ベクターを用いてトランスフェクトして溶解し、上記のような同一の結合アッセイに付した(パネル右)。b.ERK活性。全細胞溶解物は、抗ERK(パネル上)および抗リン酸ERK(パネル下)抗体によりプローブした。EGFにより刺激されなかったHEK293細胞を陰性対照として用い、EGFにより刺激されたHEK293細胞を陽性対照とした。イムノブロットにおける二重線は、ERK1(44KD)およびERK2(42KD)に相当する。
【図7】野生型K−rasトランスフェクト腫瘍細胞の、ヌードマウス腫瘍発生アッセイ。aおよびb:ヌードマウス腫瘍発達の阻害(左側−ベクター対照、右側−K−ras4Bトランスフェクト細胞)、c:腫瘍の大きさ測定、d:最終的なヌードマウス腫瘍重量の測定。星印はP<0.05(ベクタートランスフェクト細胞と比較)を示す。
【図8】A:非小細胞肺癌におけるLOHを示す代表的なオートラジオグラフ。上記各オートラジオグラフ:マイクロサテライトマーカー、矢印:対立遺伝子損失、N:正常DNA、T:腫瘍DNA。各サンプルに対して、パネル左:LOH非含有肺腫瘍、パネル右:LOH含有肺腫瘍。B:Kras2遺伝子コドン12の変異の代表的な例。左側:Kras2変異非含有肺腫瘍、右側:Kras2遺伝子第12コドン変異(GGT→TGT塩基転位)含有肺腫瘍。
【図9】非小細胞肺癌における染色体12のLOHマップ。1つまたは複数の病巣においてLOHを示した14個のサンプルを示す。左側:12個のサンプルも、活性化されたKras2対立遺伝子を保持していた。右側:2個のサンプルはKras2変異を含まなかった。染色体12の遺伝子マップは、NCBI Human Genome Resources由来である。L:大細胞癌腫、A:腺癌。
Claims (27)
- 細胞増殖を阻害する方法であって、該細胞内における1つまたは複数の野生型rasタンパク質の細胞内レベルを増加させる工程を含む、方法。
- 前記細胞内における野生型rasタンパク質の細胞内レベルを、
a)野生型rasタンパク質に対するコード領域を含む核酸を該細胞内に導入すること、および
b)該野生型rasタンパク質を該細胞内において発現させること
によって増加させる、請求項1に記載の方法。 - 前記細胞は、ヒトまたは他の哺乳動物の腫瘍細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸は、高レベルの野生型rasタンパク質コード領域の転写を引き起こすプロモーター配列を含むDNAである、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸は、ウイルスゲノムの一部である、請求項1に記載の方法。
- 前記野生型rasタンパク質は、野生型K−rasタンパク質、野生型N−rasタンパク質および野生型H−rasタンパク質、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 野生型rasタンパク質の細胞内レベルを、1つまたは複数の野生型rasタンパク質を前記細胞内に導入することによって前記細胞内で増加させる、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞は、ヒトまたは他の動物における腫瘍細胞である、請求項7に記載の方法。
- 前記野生型rasタンパク質は、タンパク質形質導入ドメインをさらに含む、請求項7に記載の方法。
- 前記タンパク質形質導入ドメインは、ヒト免疫欠損ウイルスTATタンパク質由来の11アミノ酸配列を含む、請求項9に記載の方法。
- 細胞内における野生型rasタンパク質のレベルを増加させる工程を含む、細胞内におけるERK MAPキナーゼの活性を減少させる方法。
- 哺乳動物の被検体における腫瘍を評価する方法であって、
該腫瘍から細胞を提供する工程、および
該細胞のゲノムにおける少なくとも1つの内因性ras対立遺伝子において機能損失変異をアッセイする工程
を含む方法。 - 前記細胞のゲノムにおける前記内因性ras対立遺伝子のうちの一方における活性化変異についてアッセイする工程をさらに含む、請求項12に記載の方法。
- 前記機能損失変異は、減少した細胞増殖活性を有する変異rasタンパク質の産生をもたらす、請求項12に記載の方法。
- 前記機能損失変異は、健常細胞におけるrasタンパク質レベルと比較して、前記腫瘍細胞におけるrasタンパク質レベルの減少をもたらす、請求項12に記載の方法。
- 前記機能損失変異は、野生型ras対立遺伝子の全てまたは一部の損失をもたらす、請求項12に記載の方法。
- 1つのras対立遺伝子における機能損失変異および別のras対立遺伝子における活性化変異の存在は予後不良を示唆する、請求項13に記載の方法。
- 前記機能損失変異は、前記ras対立遺伝子の第1、第2または第3のエキソンにある、請求項12に記載の方法。
- 前記機能損失変異は、前記細胞内における1つまたは複数の野生型rasタンパク質の細胞内レベルを確定することによりアッセイされる、請求項12に記載の方法。
- 前記機能損失変異は、1つまたは複数の野生型rasタンパク質をコードするmRNAの細胞内レベルを確定することによりアッセイされる、請求項12に記載の方法。
- 前記機能損失変異は、前記細胞のゲノムにおける1つまたは複数の野生型ras対立遺伝子の有無を検出することによってアッセイされる、請求項12に記載の方法。
- 前記機能損失変異は、前記細胞内の1つまたは複数の野生型rasタンパク質の細胞増殖活性を確定することによってアッセイされる、請求項12に記載の方法。
- 哺乳動物の被検体における腫瘍または癌を予防または処置する方法であって、野生型rasタンパク質をコードし、発現する野生型rasタンパク質または核酸を、該被検体に投与する工程を包含する、方法。
- 野生型rasタンパク質は前記被検体における腫瘍に注射される、請求項23に記載の方法。
- 野生型タンパク質をコードする核酸は前記被検体に注射される、請求項23に記載の方法。
- ヒト被検体から得られる癌細胞における1つまたは複数のras対立遺伝子における機能損失変異をアッセイする工程を包含する、該被検体における癌の予後のための方法。
- 化学的発癌物質を異型接合rasノックアウトマウスに注射する工程を包含する、該マウスにおける肺腫瘍形成を誘導する方法。
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