SK185199A3 - Zlúčeniny kódujúce ochranný protefn typu M z baktérieStreplococcus equi a vykonané štúdie - Google Patents

Abstract

Opisujú sa molekulárne zlúčeniny, ktoré kódujú ochranný protein typu M z mikroorganizmu Streptococcus equi (SeM), aminokyselinová zlúčenina, ktorá je týmto kódovaná, a sústava látok, ktoré zahŕňajú buď kódované látky alebo bunkové komponenty, ktoré kódujú. Predmetom sú napríklad vakcíny, ktoré využívajú aminokyselinové zlúčeniny alebo vektory a bunkové dráhy potrebné na vytvorenie aminokyselinových zlúčenín. Ďalej sa uvádzajú metódy na stimuláciu S. equišpecifickej imunitnej reakcie koní a spôsob umožňujúci detekciu Streplococcus equi.

Description

Zlúčeniny kódujúce ochranný proteín typu M z baktérie Streptococcus equi a vykonané štúdie.

Táto prihláška prednostne nárokuje právo na pôvodnú;·,, patentovú prihlášku US 60/050.577. evidovanú 24.júna 1997..,,/ • *7

Tento vynález bol vyvinutý s grantovou podporou vládz___

Spojených štátov: USDA-NRICGP, číslo 95-01837, a preto môže mať vláda Spojených štátov určité práva na tento vynález.

OBLASŤ TECHNIKY

Predkladaný vynález uvádza metódy určené na stimuláciu· S. equi - špecifickej, imunitnej reakcie u koní.

DOTERAJŠÍ STAV TECHNIKY

Predkladaný vynález sa všeobecne vzťahuje k molekulárnym zlúčeninám, ktoré kódujú ochranný proteín typu M z baktérie Streptococcus equi (SeM), aminokyselinovú zlúčeninu, ktorá je pritom kódovaná a zloženie látok, ktoré zahŕňajú buď kódované zlúčeniny alebo bunkové komponenty, ktoré sú kódované. Predmetom predkladaného vynálezu sú napríklad tu popísané vakcíny využívajúce zlúčeniny na báze aminokyselín alebo vektorov a bunkovej dráhy vhodné pre tvorbu aminokyselinových zlúčenín.

Streptococcus equi, Lancefieldova skupina C streptokokov spôsobuje dusivé, vysoko nákazlivé, infekčné ochorenie nosohltanu a vysychanie lymfatických uzlín skupiny Equidae. Antifagocytický proteín typu M (SeM) velký 28 kDa je hlavným faktorom nákazlivosti a ochranným antigénom a funkciami limitovanými ukladaním C3b na povrchu baktérie priamo viazaným fibrinogénom. Boschwith a Timoney, 17 Microbiol. Pathogenesis 121 (1994) a Boschowith a Timotey, 62 Infect. Inrnun. 3515 (1994) .

V nedávnej minulosti sa prepuknutiu S. equi na konských farmách zabraňovalo a liečilo sa karanténou podozrivých zvierat, antiseptickou úpravou jedla, podstielkou a ustajnením a antibiotikami v prípade indikácie. Boli popísané vakcíny obsahujúce nenákazlivé S. equi alebo jeho frakcie, ale faktor úspešnosti bol malý. Patent US, č. 5.183.659. popisuje vakcínu, ktorá stimuluje odozvu protilátky nosohltanu u koní, ale vakcína sa obmedzila, rovnako ako mnoho iných takýchto vakcín, rizikom reverzie prudkej nákazy a občasného vývoja zápalu u očkovaných koní.

S. equi je vylučovaný v nosnom výtoku a hnise z lymfatických uzlín postihnutých zvierat. Bežná laboratórna bakteriálna detekcia zahŕňa bakteriologické kultúry nosných výterov, nosných výplachov a hnisu spôsobeného zápalu, a je často obtiažna z dôvodu prítomnosti iných kontaminácií, malého množstva organizmov alebo prítomnosťou S. zooepidemicus a ďalších β-hemolytických streptokokov. Doplnenie kultúr a ich identifikácia obvykle trvá 2 až 3 dni, jedná sa o príliš dlhý interval daný vysoko infekčným dusením a potrebou rýchlo identifikovať nakazené kone, aby mohli byť izolované v ranom štádiu nákazy.

PODSTATA VYNÁLEZU

Účelom predkladaného vynálezu je poskytnutie molekulárnych zlúčenín, ktoré kódujú SeM a zloženie látok, ktoré zahŕňajú buď kódované látky alebo bunkové komponenty, ktoré kódujú.

Cielom je teda predložiť vektory, bunkové dráhy a produkty bunkových membrán za použitia prezentovaných zlúčenín.

Ďalším cielom je predstaviť spôsob umožňujúci detekciu Streptococcus equi.

Ďalšie zámery a znaky predkladaného vynálezu budú zrejmé z nasledujúceho detailného popisu, príkladov a požiadaviek.

Definícia

Nasledujúce termíny by mali mať zodpovedajúci vysvetľujúci význam. Všetky ostatné termíny majú rovnaký význam, aký majú bežne v zodpovedajúcom odbore, v ktorom sa tieto termíny používajú.

„Biologická vzorka’ znamená nosný alebo ústny hlien alebo vzorku krvi.

„Transformácia’ a „transfekcia’ znamená prijať nukleovú kyselinu, vniknúť do bunky, či je alebo nie je začlenená do genómu.

PREHĽAD OBRÁZKOV NA VÝKRESOCH

Vynález bude ďalej popísaný v súvislostiach so sprievodnými výkresmi, v ktorých:

Obrázok 1 je nukleotidová a odvodená aminokyselinová sekvencia SeM. Pozície báz a aminokyselín sú zobrazené na lavej strane obrázku. Predpokladaný promotor a ribozomálne väzbové oblasti (RBS) sú orámované a signálne a membránové kotvové sekvencie sú vyznačené tučným písmom.

Obrázok 2 je prenos proteinov využívajúcich špecifické interakcie antigénu s protilátkou, tzv. „imunobloť, prezentujúce reakcie lyzátu z E. coli BL21, SeM02 a mutanolyzinového extraktu S. equi s antisérom 216 a 963 k SeM a rekombinantnému SeM.

Obrázok 3 je „imunobloť prezentujúci reakcie extraktov mutanolyzínu sérií dočasne a geograficky separovaných izolátov S. equi s antisérom k rekombinantu SeM. Odhadované molekulové hmotnosti sú zobrazené na pravej strane obrázku.

Obrázok 4 je immunoblot prezentujúci lineárne epitopy rozpoznávané IgA v nosných výplachoch uzdravujúcich sa (8 týždňov) koní.

Obrázok 5 je graf ilustrujúci regióny SeM reagujúcich s protilátkami v konských sérach odobratých 8 týždňov po uzdravení z dusenia.

Predkladaný vynález predstavuje zlúčeniny nukleovej kyseliny skladajúci sa zo zlúčenín nasledujúcej sekvencie:

agctttctgtcacctgatggtccttatcaaatactgtaattgataacttcaaacagccct 61. gtagagattttactaacgacatagtatccatgctaagcgtcacccccttcataatcctca 121 cggtatcttattctatcttaaaatttaagaaaagcaaggatatgcacttataatgaaaaa 1.81 ATAGACÄTAAAAAACAATAATATACATTCTTGCTTATTAAATAAAAATGAC AATGTACTG 241 cataaagaagttcctgtcattaaaataaaagtgccatgäggttataatagtatggtaaaa

301 caaaaaagtgtgcccataacgggtagagaggaattgacatatgtttttgagaaataacaa 361 gccaaaatttagcatcagáaaactaagtgccggtgcagcatcagtattagttgcaacaag 421 TGTGTTGGGAGGGACAACTGTAAAAGCGAACTCTGAGGTTAGTCGTACGGCGACTCCAAG 481 ÄJTATCGCGTGATTTAAAAAATAGATTAAGCGATATAGCCATAAGTGGAGATGCCTCATC 541 AGCCCAAAAAGTTCGAAAiyTTCTAAAAGGCGCCTCTGTTGGGGATTTACAGGCATTATT 601 gagaggtcttgattcagcaagggctgcgtatggtagagatgattattacaatttattgat 661 . gcacctttcatcgatgttaaatgataaacctgatggggatagaagacaattaagtttggc 721 TTCATTACTTGTAGATGAAATTGAAAAGCGGATTGCTGATGGAGATAGGTATGCAAAACT 7 81 tcttgaggctaaacttgcagctattaaatctcaacaagaaatgcttagagaaagagattc 841 CCAACTTCGAAATCTAGAGAAGGAGAAAGAACAAGAGCTCäCAAAAGCTAAAGATGAGCG

901 tcaagctcttaccGaatcattcaacaaaactttatcaagatcaacaaaagagtataataa

961 ACTAAAAAfcAGAACTTGCAAAAG AAAAAGAÁAAAGCAGCTAAGATG ACTAAGGÄATTAGC r-· .ľ.

1021 AGATAAGCTAAGCAATGCTGAAGCAAGTCGTGATÁAAGCCTTTGCAGTATCAAAAGATTT t

1081 agcagataaactaagtagtgctgaagcaagtcgtgátaaagcttttgcagtatcaaaaga

1141 tttagcagataaattggcagctaaaacagcagaagctcaaaagttaatggaaaacgttgg 1201 tagtctagaccgcttggtagagtctgcaaaacgtgaaatggctcaaaaattagcagaaat 1261 tgatcaattaactgctgataaggctaaggctgatgcagagcttgcacctgcaaatcacac 1321 CATTGCATCACTTCAAACAGAGCTAGAAAAAGCTAAGACAG AGCTTGCTGTTTCAGAGCG

1381 TTTGATTGAATCAGGCAAACGTGAAATTGCTGAGCTACAAAAACAAAAAGATGCTTCTGA

1441 TAAGGCTTTAGTAGAATCACAAGCTAATGTAGCAGAGCTTCAAAAACAAAAAGCAGCATC 1501 agatgctaaggtagcagagcttgaaaaagaagttgaagctgctaaagctgaggttgcag a 1561 tcttaaagcacaattagctaagaaagaagaagägcttgaagccgttaagaagg aaaaaga 1621 agcgcttgaagctaagattgaagagctcaaaaaagctcatcctgaggaactttcaaaact 1681 taaagaaatgcttgagaagaaagaccatgcaaatgcagatcttcaagcagaaatcaatcg 1741 CTTGAAGCAAGAGCTAGCTGACAGGATTAAGTCATTGTCACAAGGTGGTCGTGCTTCACA 1801 ^acaaacccaggcactacaactgctaaagcaggtcaattgccatctactggtgagtctgc 1861 taacc'cattcttcactattgcagctcttactgtcatcgctggtgctggäatggctgtggt 1921 gtctcctaaacgcaaagaaaactaagctatttcctctttccccaatggacaatagccg aa 1981 ATAATAGAGCGACTATCGTTCTAACAC AAAAGCAACAGTCTCCTGTCTGTTGCTTTTTGT 2041 GATATTAGGGCTCATC AGTCTAGGCTAATGGTTTTCTGCGCTTTATCTGCA [SEQ ID NO.l (M-proteín (SeM) gén S. equi)]. Otvorený čítací rámec začína na pozícii 341 a končí na báze 1934. Jedná sa najskôr o zlúčeninu SEQ ID NO 1. Ďalej sú tiež uvedené zlúčeniny komplementárne k SEQ ID NO 1. Preferovaná časť SEQ ID NO 1 je tá, ktorá je popísaná vyššie ako báza číslo 341 až 1943, vrátane (SEQ ID NO 3). Okrem toho zlúčeniny definované bázami číslo 452 až približne 1331 sú taktiež uprednostňované (SEQ ID NO 4).

Ako môžu oceniť kvalifikovaní pracovníci, príklady zlúčenín DNK uvedených vyššie môžu ľahko odvodiť komplementárne sekvencie RNK. Každá takáto sekvencia RNK je tiež považovaná za predmet v rámci rozsahu predkladaného vynálezu. V uvedenom popise sa tieto zlúčeniny DNK a RNK nazývajú „zlúčeniny nukleových kyselín*.

Okrem toho sú tu prezentované bunky transferktované zlúčeninou nukleovej kyseliny (alebo jej niekoľkonásobné kópie) uvedené v tomto vynáleze. Uprednostňovaná je bunka transfektovaná s SEQ ID NO 1 alebo časť z tejto bunky. Takéto bunky môžu byť prokaryotické alebo eurakryotické. Preferované bunky zahŕňajú: E. coli, S. cerevisiae, a Salmonella spp. Tiež sú predstavené vektory transfektované zlúčeninou nukleovej kyseliny (alebo jej niekoľkonásobnej kópie) uvedené v tomto vynáleze. Preferované vektory zahŕňajú vírusy ovčích kiahní, adenovírusy alebo ďalšie vírusové vektory.

Zlúčeniny nukleovej kyseliny sa môžu získať použitím primárov technikou PCR alebo z génovej banky, prístupové číslo U73162. Vektory bunkovej väzby sa môžu tiež získať na základe skúseností v odbore.

Okrem toho je tu uvedená aminokyselinové zlúčenina:

I

5 1 M F L R N	10 N R P R	1 15 F S I· R R L	20 25 SAGAASVLVAT5	30' V L G
31 G T T V K	A N S E	V S R T A T	PRLSRDLKNRLS	D I A
61 I S G D A	S S A Q	K V R N L· L	KGASVGDLQALL	R G L
91 D S A R A	A Y G R	D D Y Y N L	L M H.L SSMLNDKP	D G D
121 R R Q L S	L A S L	L V D E I E	KRIADGDRYAKL	LEA
151 K L A A I	R S Q Q	E M L R E R	DSQLRNLEREKE	Q E L
181 T K A K D	E R Q A	L T E S F N	RTLSRSTKEYNK	L K T
211 E L A K E	K E K A	A K M T R E	LADKLSNAEASR	D K A
241 F A V S R	D L A D	R L S S A E	A S .Ŕ DRAFAVSKD	LAD
271 K L· A A K	T A E A	E K L M E N	VGSLDRLVESAK	R E M
301 A Q R L A	E I D Q	L T A D R A	RADAELAAANDT	I A S
331 L Q T E L	E R A R	T E L A V S’ «	ERLIESGKREIA	E L Q
361 R Q R D A	S D R A	L V E S Q A	NVAELEKQKAAS	DAR
391 V A E L E	REVE	A A R A E V	ADLXAQLAKKEE	E L E
421 A V R R E	REÁL	E A R I E E	LKRAHAEELSKL	K E M
451 L E R R D	HANA	D L Q A E X	NRLKQELADRIK	S L S
481 Q G G R A	S Q T N	P G T T T A	KAGQLPSTGESA	N P F

511FTIAALTVIAGAGMAVVSPKRKEN čo je SQ ID NO 2. Predkladaný vynález taktiež zahŕňa časti vyššie spomenutej sekvencie. Časťou s najväčšou preferenciou vyššie uvedenej sekvencie sú: reziduá 37 až 33C (SEQ ID NO 5), avšak človek vzdelaný v odbore môže rozpoznať, že každá špeciálna antigénová časť je komerčne významná a je zahrnutá do odboru pôsobnosti tohto vynálezu.

Zlúčeniny aminokyselín sa môžu získať buď niekoľkonásobnou expresiou a čistením v mikroorganizme alebo v niektorých prípadoch konvenčnou peptidovou syntézou. Predmetom tohoto vynálezu je vakcína pre S. equi. Je preferovaná vakcína, ktorá sa podáva nosom alebo orálne. Vakcína prezentovaná v tomto vynáleze môže obsahovať celú SEQ ID NO 2 alebo jej časť.

Vakcíny prezentované v tomto vynáleze môžu byť súčasťou každej farmaceutický akceptovanej formulácie. Napríklad, SEQ ID NO 5 môže byť začlenená do dvojvrstvových dutiniek (lipozómov) vo vodnom prostredí podľa známych postupov ako takého, ktorý je popísaný v publikácii Debs a ďalší, 265 J.Biol.Chem. 10189 (1990). Akýkoľvek dosiahnuteľný nosič alebo lipid tvoriaci lipozómy môže byť použitý v ktoromkoľvek vzorci, ktorý odovzdáva SeM antigén, napríklad poly-DL-Lactide-co-glycolid môže byť použitý v nosnom spreji, ktorý zahŕňa SEQ ID NO 5. Vzorce, ktoré obsahujú zložky zvyšujúce prísun antigénu k mukóze, ako je malé množstvo B-podjednotky toxínu cholery, sú tiež v rámci rozsahu tohoto vynálezu.

Predkladaný vynález tiež poskytuje metódy, ktoré stimulujú S. equi špecifickú imunitnú odozvu u koní, Ktorú zahŕňa predkladaná zlúčenina kódovaná SEQ ID NO 2 alebo jej časti. Preferované je nosné alebo orálne zavedenie aplikácie.

Nakoniec, tento vynález prezentuje metódy, ktoré určujú prítomnosť S. equi u koní prostredníctvom polymerizačnej reťazovej reakcie. Diagnostické skúšky polymerizačnej reťazovej reakcie uvedené v tomto vynáleze môžu byť porovnané so známymi metódami, ak sú priméry pre sekvencie tu uverejnené použité ako niektoré z východzích materiálov. Metódy pre PCR možno nájsť v mnohých časopisoch a knihách, napríklad diagnostické metódy PCR sa môžu vykonávať podía Techniques in PCR, PCR, Current Protocols in Molecular Biology or Maniatis. Ako odborníci vzdelaní v tejto problematike vedia, preferované sú tie priméry, ktoré obsahujú najmenej 50% GC, najlepšie veľkosť 19 až 23 párov báz a nie sú schopné pri kroku nasadávania primérov vytvárať duplikátne úseky cieľovej DNK.

PRÍKLADY VYKONANIA VYNÁLEZU

Príklad 1: Klonovanie, sekventácia a expresia SeM

Chromozonálna DNK prislúchajúca S. equi CF32 sa parciálne štiepila Tsp 5091 (New England Biolabs Inc., Beverly MA) a fragmenty o velkosti 3 až 8 kb sa ligovali do λ ZAPII štiepených EcoRI (Stratagene, LaJolla, CA) . Po zapakovaní (Gaigapack II) (Stratagene, LaJolla, CA) a transfekcii do E. coli XLI-Blue MRF (Stratagene, LaJolla, CA) sa knižnica vysiala, namnožila a uložila pri -70 °C v 7% DMSO. Knižnica sa skúšala na duplikátnych nitrocelulózových diskoch za

ΙΟ použitia králičieho antiséra 216 (zriedeného 1:400) do kyselinového extraktu fragmentu SeM o veľkosti 41 kDa. Niekolko reakčných plakov sa analyzovalo, kým všetky plaky ukazovali pozitívny signál. Proteíny v týchto fágových lyzátoch sa separovali pomocou SDS PAGE a imunoblotovali so sérom 216. Plazmid obsahujúci fragment veľkosti 3,5 kb kódujúci SeM sa odstránil z pozitívneho fágu a výsledný plazmid sa označil pSeMOl. Sekvenovanie nukleotidov sa vykonalo na HindlII, PvuII a HindlII-PvuII fragmentoch S. equi insertov vložených do pSK automatickým cyklickým sekvenovaním. Sekvencie sa usporiadali, porovnali a spojili pomocou DNASIS (Hitachi Software Engineering America, Ltd., San Diego, CA) . SeM bez signálnej sekvencie sa subklonoval do BamHI miesta expresného vektora pET15b (Novagen, Madison, WT) využívajúci metódy amplifikácie nukleotidového reťazca (PCR) s pSeMOl ako templátom a primérmi SeM-F (gcggatcCGAACTCTGAGGTTAGTCGT) (SEQ ID NO 6) a SeM-R (gcggatccATAGCTTAGTTTTCTTTGCG) (SEQ ID NO 7) . Výsledný plazmid sa označil pSeM02 a transformoval sa do E. coli BL21 (DE3). Rekombinantný SeM sa izoloval z lyzátu BL21 pomocou afinitnej chromatografie na His-Bind Resin (Novagen, Madison, WI).

Analýza spojených sekvencií odhalila prítomnosť jedného otvoreného čítacieho rámca skladajúceho sa z 1605 nukleotidov kódujúcich gén seM (obr.l). Preklad seM odhalil základný (CH +4,5) preproteín skladajúci sa z 535 aminokyselín s vypočítanou molekulovou hmotnosťou 58,251 a pi 8,67. N koniec aminokyselinovej sekvencie (rezíduá 37 až 52) bol identický s koncom získaným priamym mikrosekvenovaním fragmentu SeM o veľkosť 41 kDa prečisteným z kyselinového extraktu S. equi. Predpokladané vlastnosti sekvencie aminokyselín ukazujú typické vlastnosti streptokokových povrchových proteinov. Signálaa sekvencia predstavuje 36 rezíduí. N koniec stabilizovaného proteínu má pozitívny náboj. Kotvová membrána preoložene j oblasti a koncové sekvencie sú podobné sekvenciám z ostatných skupín A a C streptokokových sekvencií. Dva priamo opakované úseky (21 rezíduí) sú umiestnené medzi rezíduami 226 s 267. Ďalšie kratšie priamo opakované úseky sa líšia v dĺžke od 3 do 6 rezíduí objavujúcich sa v karboxy koncovej polovici molekuly. Analýza sekundárnej štruktúry translatovaného proteínu ukazuje rozsiahlu oblast alfa helix rozprestierajúci sa od rezídua 120 do 480, Predpovedaná sekundárna štruktúra vykazuje ohyby v blízkosti rezíduí 120 a 480 až 500.

Príklad 2: Určenie sekvencie aminokyselín

Prečistený kyselinový extrakt (2 mg), ako je popísané v príklade 3, sa vložil do 2 cm širokej drážky na akrylamidový gél o hrúbke 1,5 mm pre pripravený SDS PAGE, Gél bol najprv podrobený pred nanesením proteínu 40minútovému zapojeniu pri 100 V s 0,1 mM tioglykolovou kyselinou.. Nasledovala elektroforéza a e. oktroforézny transfer do rmmobilonu P (MjLJipore), hlavné fragmenty SeM o veľkosti 41 a 46 kDa sa identifikovali ootioco, 'arbenia po dobu 1 min. s 0,.025% Coomassie blue v 40% metanole a 5% ľadovej kyseline octovej s následnou 2-mi nútovo·. inkuoacioi. v 30% metanole a 5% ľadovej kyseline octovej. Fragment veľký kDa sa vyrezal a analyzoval mikrosekvenovaním vykonaným na sekvenátore, modele 477A pulse liquid phase sequencer (Applied Bio Systems) v Laboratóriu makromolekulárnej syntézy na Univerzite v Kentucky.

Príklad 3: Extrakcia proteínov

Proteín typu M sa extrahoval z kultúry S. equi kultivovanej cez noc (18 hod.) pomocou horúcej kyselinovej extrakcie (Lancefield and Perlmann. 96 J.Exp.Med. 71 (1952)) a adsorboval sa na stĺpec hydroxyapatitu v 10 mM fosfátovom tlmivom roztoku s pH 7,2. Proteíny typu M sa eluovali do 0,2M Na₂HPO₄, odsolili na Sephadexe G25 a lyofilizovali sa. Peleta sa rozpustila v roztoku 25% acetonitrilu s 0,5% trifluóroctovej kyseliny a vložila sa na fenyl RP kolónu s reverznou fázou (Bio-Rad, San Francisco CA) napojenú na Waters 650 proteínový purifikačný systém (Waters, Marlborough, MA). Proteín sa eluoval pomocou lineárneho gradientu 25 až 65% acetonitrilu s 0,5% TFA. Na analýzu píkov sa použil bodový immunoblot na nitrocelulóze používajúci špecifické králičie antisérum SeM. Pík obsahujúci proteín SeM sa eluoval na 42% koncentráciu v acetonitrile. Pozitívne piky z niekoľkých frakcií sa spojili a ďalej prečistili na rovnakom stĺpci. Prečistený proteín sa lyofilizoval, resuspendoval v PBS a uložil sa po častiach pri -20 °C. Mutanolyzinové extrakty bakteriálnych kmeňov S. equi sa upravili tak, ako bolo opísané predtým (Galán a Timoney, 26 J.Clin. Microbiol. 1142 (1988)).

3

Príklad 4: Antiséra

Antisérum sa zvýšilo oproti prečistenému SeM kombináciou hydroxyapatitu a chromatografíou s reverznou fázou. Biely králik z Nového Zélandu (216) sa injektoval podkožné 50 pg SeM v kompletnom Freundovskom adjuvantc ďalš c? 3 týždne v intervaloch po 2 podobných dávkach emulgovaných s nekompletným Freundovským adjuvantom. Sérum sa odobralo v

8. týždni. Králik 963 sa preimunizovsl podobne s rekombinantnou SeM zo sonikátu E. coli. Králik Ec sa imunizoval lyzátom z E. coli NovaBlue obsahujúcim plazmid pT7 Blue bez insertu. Dospelé myši ICR sa imunizovali 25 pg prečisteným SeM zo sonikátu E. coli pomocou HIS-Tag chromatograf ie. Prečistený SeM (25 pg) sa zmiešal s 5 pg mykolického dipeptidu (MDP) a alhydrogélu (30%) a preniesol sa do podkožnej dávky o objeme 100 ml. Dve podkožné nosné dávky obsahujúce 250 pg SeM, ale nie MDP sa dávkovali o 10 a 20 dní neskôr. Myšiam sa odoberala krv 28 dní. Všetky antiséra sa pred použitím uložili pri -70 °C.

Príklad 5: „Imunoblotovanie

Proteíny streptokokových extraktov alebo prečistených zo sonikátu E. coli sa separovali na SDS-10% polyakrylamidovej elektroforéze (PAGE) a elektród kolovali sa do gélovej membrány nitrocelulózy mkubovali v zoopovedajúcom antisére rozpusteným 1:200 v PBS a potom / perox dáza konjugovanom proteíne G (1:4000). Reaktívne fragmenty sa vizualizovali použitím substrátu 4--chlór 1-na ľtolu (0,5 mg/ml).

Králičie antisérum 963 ku recSeM reagovali s proteínom velkým 58 kDa v mutanolyzínovom extrakte z S. egui a s o niečo väčším proteínom veľkým 60 kDa exprimovaným v E. coli BL21 obsahujúci pSeM02 (obr.2). Rovnaké fragmenty proteínov boli rozoznané králičím antisérom 216 do fragmentu 5eM o veľkosti 41 kDa. Obrázok 3 predstavuje profil „imunoblotu* mutalyzinovaných extraktov sérii izolátov 5. egui odobratých v rôznom čase v Spojených štátoch a v Európe. Antisérum proti rec-seM rozpoznávalo dva fragmenty proteínu o velkostiach 58 a 56 kDa vo všetkých extraktoch.

Príklad 6: ELISA

Fragment SeM (velký 41 kDa) extrahovaný a prečistený preparatívnou elektroforézou na agaróze sa použil k potiahnutiu sond (2,5 mg/sonda) z polystyrénových doštičiek ELISA (Costar, 25880, Corning Glass Company, Corning NY). Po umytí a inkubácii v 0,1 M fosfátovom tlmivom roztoku obsahujúcom soli (PBS) obsahujúci 0,05 Tween 20 a 1% hovädzie sérum albumín (BSA), sa myšie alebo králičie séra zriedili 1:80 a 1:200 v PBS a pridali sa v trojnásobnom množstve do sond (100 ml/sonda). Po trojhodinovej inkubácia pri 37 °C sa detekovala väzba na IgG buď s peroxidázovým konjugovaným proteínom G (1:4000) alebo králičím anti-myším IgG nasledovaným roztokom o-fenyléndiamínu (0,001 mM) Priemerné hodnoty OD z troch meraní sa merali proti sondám obsahujúcim antigén a PBS.

]5

Príklad 7: Opsonická skúška

Konské neutrofily sa separovali z čerstvo odobratej heparinizovanej konskej krvi s diskontinuálnym Percoll gradientom Pycock a kol., 42 Res.Vet,Sci. 411 (1987). Neurofily zo 7 ml krvi sa resuspendovali v RPM1 médiu (Gipco, Grand Island, NY) a 80 ml alikvot (6 x 105 buniek) sa pridalo v trojnásobnom množstve do sond z 24 bunkových zhlukov (Costar, Cambridge, Mass). Každá sonda obsahovala kruhový sklenený prúžok (12 mm v priemere). Zoskupenie buniek sa inkubovalo 2 hod. pri 37 °C v 5% CO? a bunky sa raz umyli PBS, aby sa odstránili neprichytené neurofily.. Skúšobné organizmy (S. equi CF32 a S. zooepidemicus W60) sa pestovali cez noc pri teplote 37 °C v THB s 0,2% kvasným extraktom do OD 0,6. 20 ml kultúry sa pridalo k 25 ml séra a ďalej sa pridalo 450 ml RPMI. Potom, čo sa miska ľahko pretrepala po dobu 30 min. pri 37 °C, sa krycie krúžky opát umyli pomocou PBS (pH 7,2), zafixovali sa v 10% formalíne a zafarbili pomocou Giemsa. Počet neurofilov s pridruženými streptokokmi na 100 buniek sa ďalej rozpočítal pre každé sérum a vyjadril sa v percentách. Všetky pokusy sa vykonali trikrát. Rozdiely v opsonickej aktivite imúnneho a kontrolného séra sa štatisticky vyhodnotili Študentovým t-testom (nepárové skúmanie) založenom na priemerných hodnotách získaných z troch experimentov.

Sérum z myši imunizovanej s prečisteným rekozr.b:nantom SeM vykazovalo 15-krát väčšiu opsonickú aktivitu pro S. equi než neimúnne myšie sérum. Tieto séra vykazovali silné protilátkové reakcie prostredníctvom ELISA ku fragmentu SeM o veľkosti 41 kDa (príklad 6)

Príklad 8: Štúdium viazaného fibrinogénu

I

Konský fibrinogén (0,5 mb/sonda) sa naviazal na sondy z 96 polystyrénových doštičiek ELISA (Costar) . Po umytí a inkubácii sa rekombinantný SeM (0,4 mg/sonda) pridal v trojnásobnej forme do separovaných sond a inxuboval sa 12 hodín pri teplote 37 °C. Po umytí sa králičie antisérum proti fragmentu SeM o velkosti 41 kDa zriedené 1:80 pridalo do príslušných sond a inkubovalo sa pri teplote 37 °C po dobu 2 hodín. Kontrolné sondy sa skladali zo sond, z ktorých sa vynechal fibrinogén a zo sond upravených sérami z rovnakých králikov ako pred imunizáciou. Množstvo špecifických králičích protilátok, ktoré viazali fixovaný SeM na fibrinogén, sa detekovali, ako je popísané v protokole ELISA.

SeM preukázal silnú väzbu na konský fibrinogén -moblizovaný na sondy doštičiek ELISA. Priemerná hodnota ELISA (±SD) pre SeM viazaný na fibrinogén po korekcii pre nešpecifikovaný viazaný proteín k povrchu sondy bol C,9±0.1. Opravená hodnota bola 0,l±0,l, keď sa predimunizované sérum použilo pre štúdium väzby streptokokových proteínov.

Príklad 9: Prístupové čísla nukleotidovej sekvencie

Prístupové číslo genetickej banky pre nuk:eotidové sekvencie SeM je U73162.

Príklad 10: Homológia

S výnimkou signálnej a membránovej kotvove^ sekvencie r.ebola zistená žiadna homológia SeM so skupinou A aleoo GM protein sekvencií v databáze génovej banky. SeM vyká/e niekroré homológie medzi vlastným signálom (39% identita; a kotvovou membránou (66% identita) s tými, ktoré sú uvedené v databáze.

Príklad 11: Prítomnosť protilátok viažúcich sa na SeM u uzdravujúcich sa koní

Na obrázku 3 sú ukázané oblasti SeM reagujúce s nrotilátkair.l· v konských sérach odobratých 8 týždňov po spamätania sa z dusenia. Väčšina koní vykazovala reakcie na epitopy v centrálnej oblasti SeM (rezíduá 170 až 2/0). Reakcie jednotlivých koní k tretine υ N-konca a k oblast . uhlíkového konca SeM boli omnoho rozdielnejšie. Žiadny z koní nereagoval na samotný peptid 151 až 166. Lineárne epitopy rozpoznané pomocou IgA v uzdravujúcich sa (8 týždňov) nosných hlienoch je možné nájsť v rovná<oj oblast: reagujúcej so sérom protilátky (obrázok 4) Násobné epitopy sú normované a, ako v prípade séra protilátky, je tu zjavný značný rozdiel v reakciách jednotlivých koní .

Príklad 12: Imunizácia neexponovaných jednoročný^:. poníkov

Imunizovali sa dve skupiny trojročných walsxých poníkov pomocou mikroenkapsulárneho rekombinantného ťú/'nho pf.otidu

M-proteínu (SeM, aminokyseliny 231 až 330) produkovaného E. coli BL21 a mikroenkapsulárnym extraktom samotného hostiteľa E. coli. Enkapsulárny protein (100 pg) bol prvý deň rozprášený do nozdry konského jedinca použitím nosného rozprašovača. Nosné dávky 150 a 350 pg sa podali Ί. a 42. deň. Sérum a nosné hlieny boli odobraté 1., 7., 21. a 42.deň a analyzovali pre SeM špecifické IgG v sére a IgA v nosných hlienoch.

Špecifická mukosálna IgA odozva na SeM bola rozpoznateľná 21. deň u dvoch z troch poníkov a u všetkých poníkov 49. deň. Žiadny z troch kontrolných poníkov imunizovaných samotným E. coli extraktom neodpovedal SeM. U žiadneho z poníkov sa nezaznamenali žiadne reakcie na sérum protilátky. Tieto štúdie demonštrujú možnosť vykonávat selektívne-indukujúce špecifické mukosálne odpovede na protilátky u koní použitím mikroenkapsulárneho streptokokového peptidu.

Príklad 13: PCR diagnostická skúška

Nosné výtery (Precision Dynamic Corp. San Fernardo, CA, Culturette, Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL) sa odobrali z postihnutých a neizolovaných koní v priebehu prvého až piateho dňa po klinickej diagnóze dusenia na farmách A, B, C a D. Niektoré kone boli prehliadnuté viac než raz behom nasledujúcich troch týždňov. Nosné výtery sa odobrali od koní z fariem UK 15. a 18. deň nasledujúci po zmiešaní a odhalení dvoch koní s klinickým dusením. U oboch týchto koní sa rozvinulo dusenie behom 17 dní po tom, čo boli vystavené zmiešaniu. Nosné výtery sa odobrali nakvapkaním 50 ml fosfátového tlmivého roztoku ,'pH 7,2) cez v priemere 8 mm širokú latexovú trubičku sa vlo/.ii 15 cm do nozdry a odobratím tekutiny vytekajúcej von ľekutina sa odstredila pri 3000 g a kusy paliet sa separovali pre kultiváciu a PCR. Výtery a nosné výplachy sa kultivovali na krvnom agare koní Columbia CNA a inkubovali sa '.8 hodín pri 37 °C. Beta hemolytické kolónie sa kultivoval. osobitne a ich správanie sa testovalo pri fermentácii na pôdach obsahujúcich laktózu, sorbitol a trehalózu Mucoid betaheramolytické kolónie, ktoré nefermentovali žiadny z týchto cukrov, boli identifikované ako S. equi.

DNK pre PCR z nosných výterov a výplachov sa pripravila nasledujúcim spôsobom: cípy tampónu sa umiestni'! do 300 μΐ sterilovanej vody, vortexovali sa, cípy sa vybrali a tekutina sa odstredila pri 14000 g 10 minút. Sedimenty sa resuspendovali v 20 μΐ K-tlmivom roztoku (IX Gen Amp tlmivého roztoku II, Perkin Elmer, 0,5% Tweenu 20, 100 g/ml proteinázy K) . Pelety z nosných výplachov sa resuspendovali v ekvivalentnom objeme K-tlmivého roztoku. Suspenzie sa inkubovali pri 55 °C, varili po dobu 5 minút a potom sa odstreďovali 5 minút pri 14000 g. Reakčná zmes pre PCR v celkovom objeme 30 μΐ sa pripravila v Gen Amp tlmivom roztoku II a obsahovala 2 mM MgCl₂, 0,-2 mM dNTP, 0,5 jednotiek Taq polymerázy, 0,25 μΜ SeM6 a SeM7 primérov a 2 až 5 μΐ vzorky. Sekvencie primérov boli 5' • TGCATAAAGAAGTTCCTGTC (SeM7-dopredu (báza 239-258) SEQ ID NO 8) a 5'-GATTCGGTAAGAGCTTGACG (SeM naspäť (báza 899 až 918) SEQ ID NO 9), Minerálny olej (30 μ) sa pridal z oho dôvodu.

0 aby sa reakcia dobre utesnila. Cyklovanie sa vykonalo nasledovne: -92 °C po dobu 2 minút, 92 °C na dobu 1 minúty; 58 °C na dobu 1 minúty (30-krát); 72 °C na dobu 5 minút; a nakoniec 4°C. PCR produkty sa separovali na elektroforéze v agarózovom géle obsahujúcom etidium bromid. SeM fragment amplifikovaný pomocou primárov SeM6 a 7 mal veľkosť 679 bp.

Pomocou PCR sa detekoval fragment DNK o veľkosti 679 bp v 37 vzorkách zahŕňajúcich 14 z 15, ktoré boli pri kultivácii pozitívne. Citlivosť PCR sa javí omnoho vyššia než citlivosť rastu.

Je nutné poznamenať, že i napriek úplnému popisu predkladaného vynálezu sú možné rôzne zmeny a modifikácie zrejmé tým, ktorí sa touto problematikou zaoberajú. Také zmeny a modifikácie sú chápané v rámci rozsahu platnosti predkladaného vynálezu, ako je definované pripojenými nárokmi.

POPIS SEKVENCIE <110» tJjnoney, John F.

Artiuehln, Sergey

Weivereity of Xentucky Reooarch Foundation <120> Zlúčeniny kódujúce ochranný proteín typu M z baktérie Streptococcus equi a vykonané štúdie <130» P-1045 <140» filed herewlth <141» 1996-05-23 <150» 60/050,577 I <151» 1997-06-24 <160» 9 <170» Patentln Ver. 2,0 <210» 1 <211» 2091 <212» DNA <213» Streptococcus equi <400» 1 . _____ agctttctgt cacctgatgg tccttatcaa atactgtaat tgataacttc aaacagccct 60 gtagagatt tactaacgac atagtatcca tgctaagcgt cacccccttc ataatcctca 120 cggtatctta ttctatctta aaatttaaga aaagcaagga tatgcactta taatgaaaaa 180 atagacataa aaaacaataa tatacattct tgcttattaa ataaaaatga caatgtactg 240 cataaagaag ttcctgtcat taaaataaaa gtgccatgag gttataatag tatggtaaaa 300 caaaaaagtg Igcccataac gggtogagag gaattgacat atgtttttga gaaataacaa 360^: gccaaaattt agcatcagaa aactaagtgc cggtgcagca tcagtattag ttgcaacaag 420' tglSdggga gggacaactg taaaagcgaa ctctgaggtt agtcgtácgg cgaótččä’äg 480 altatcgcgt gatttaaaaa atagattaag cgatatagcc ataagtggag atgcctcatc 540 agcccaaaaa gttcgaaatc ttctaaaagg cgcctctgtt ggggatttac aggcattatt 600 gagaggtctt gattcagcaa gggctgcgta tggtagagat gattattaca atttattgat 660 gcacctttca tcgatgttaa atgataaacc tgatggggat agaagacaat taagtttggc 720 t tcattactt gtagatgaaa ttgaaaagcg gattgctgat ggagataggt atgcaaaact 780 (cttgaggct aaacttgcag ctattaaatc tcaacaagaa atgcttagag aaagagattc 840 ccaacttcga aatctagaga aggagaaaga acaagagctc acaaaagcta aagatgagcg 900 tcaagctctt accgaatcat tcaacaaaac tttatcaaga tcaacaaaag agtataataa 960 actaaaaaca gaacttgcaa aagaaaaaga aaaagcagct aagatgacta aggaattagc 1020 agataagcta agcaatgctg aagcaagtcg tgataaagcc tttgcagtat caaaagattt 1080 agcagataaa ctaagtagtg ctgaagcaag tcgtgataaa gcttttgcag tatcaaaaga 1140 tltagcagat aaattggcag ctaaaacagc agaagctgaa aagttaatgg aaaacgttgg 1200 tagtctagac cgcttggtag agtctgcaaa acgtgaaatg gctcaaaaat tagcagaaat 1260 tgatcaalta actgctgata aggctaaggc tgatgcagag cllgcagctg caaatgacac 1320 cattgcatca cttcaaacag agctagaaaa agctaagaca gagcttgctg ttlcagagcg 1380 tttgattgaa tcaggcaaac gtgaaattgc tgagctacaa aaacaaaaag atgcttctga 1440 laaggctlta gtagaatcac aagctaatgt agcagagctt gaaaaacaaa aagcagcatc 1500 agatgctaag gtagcagagc ttgaaaaaga agttgaagct gctaaagctg aggttgcaga 1560 tcttaaagca caatlagcta agaaagaaga agagcttgaa gccgttaaga aggaaaaaga 1620 agcgcttgaa gctaagattg aagagctcaa aaaagctcat gctgaggaac tttcaaaact 1680 taaagaaatg cttgagaaga aagaccatgc aaatgcagat cttcaagcag aaatcaatcg 1740 cttgaagcaa gagctagctg acaggattaa gtcattgtca caaggtggtc gtgcttcaca 1800 aacaaaccca ggcactacaa ctgctaaagc aggtcaattg ccatctactg gtgagtctgc 1860 taacccaltc tlcactattg cagctcttac tgtcatcgct ggtgctggaa tggctgtggt 1920 gtctcctaaa cgcaaagaaa actaagctat ttcctctttc cccaatggac aatagccgaa 1980 ataatagagc gaclatcgtt ctaacacaaa agcaacagtc tcctgtctgt tgctttttgt 2040 gatattaggg,ctcatcagtc taggctaatg gttttctgcg ctttatctgc a 2091 <2IO>2 | <211> 534 <212> PRT <213> Streptococcus cqui <400> 2

Met Phe Leu Arg Asn Asn Lys Pro Lys Phe Ser Íle Arg Lys Leu Ser 15 10 15

Ala Gly Ala Ala Ser Val Leu Val Ala Thr Ser Val Leu Gly Gly Thr 20 25 30

Thr Val Lys Ala Asn Ser G,u Val Ser Arg Thr Ala Thr Pro Arg Leu 35 40 45

Ser Arg Asp Leu Lys Asn Arg Leu Ser Asp íle Ala íle Ser Gly Asp 50 55 60

Ala Ser Ser Ala Gin Lys Val Arg Asn Leu Leu Lys Gly Ala Ser Val 65 70 75 80

Gly Asp Leu Gin Ala Leu Leu Arg Gly Leu Asp Ser Ala Arg Ala Ala 85 90 95

Tyr Gly Arg Asp Asp Tyr Tyr Asn Leu Leu Met His Leu Ser Ser Met 100 105 110

Leu Asn Asp Lys Pro Asp Gly Asp Arg Arg Gin Leu Ser Leu Ala Ser 115 120 125

Leu Leu Val Asp Glu Íle Glu Lys Arg íle Ala Asp Gly Asp Arg Tyr 130 135 140

Ala Lys Leu Leu Glu Ala Lys Leu Ala Ala Íle Lys Ser Gin Gin Glu 145 150 155 160

Met Leu Arg Glu Arg Asp Ser Gin Leu Arg Asn Leu Glu Lys Glu Lys 165 170 175

Glu Gin Glu Leu Tlir Lys Ala Lys Isp Glu Arg Gin AJa Leu Thr Glu 180 1.85 190

Ser Phe Asn Lys Thr Leu Ser Arg Ser Thr Lys Glu Tyr Asn Lys Leu 195 200 205

Lys Thr Glu Leu Ala Lys Glu Lys Glu Lys Ala Ala Lys Met Thr Lys 210 215 220

Glu Leu Ala Asp Lys Leu Ser Asn Ala Glu Ala Ser Arg Asp Lys Ala 225 230 235 240

Phe Ala Val Ser Lys Asp Leu Ala Asp Lys Leu Ser Ser Ala Glu Ala 245 250 255

Ser Arg Asp Lys Ala Phe Ala Val Ser Lys Asp Leu Ala Asp Lys Leu 260 265 | 270

Ala Ala Lys Thr Ala Glu Ala Glu Lys Leu Met Glu Asn Val Gly Ser 275 280 285

Leu Asp Arg Leu Val Glu Ser Ala Lys Arg Glu Met Ala Gin Lys Leu 290 295 300

Ala Glu íle Asp Gin Leu Thr Ala Asp, Lys Ala Lys Ala Asp Ala Glu 305 310 315 320

Leu Ala Ala Ala Asn Asp Thr íle Ala Ser Leu Gin Thr Glu Leu Glu 325 330 335

Lys Ala Lys Thr Glu Leu Ala Val Ser Glu Arg Leu íle Glu Ser Gly 340 345 350

Lys Arg Glu íle Ala Glu Leu Gin Lys Gin Lys Asp Ala Ser Asp Lys 355 360 365

Ala Leu Val Glu Ser Gin Ala Asn Val Ala Glu Leu Glu Lys Gin Lys 370 375 380|

Ala Ala Ser Asp Ala Lys Val Ala Glu Leu Glu Lys Glu Val Glu Ala 385 390 395 400

Ala Lys Ala Glu Val Ala Asp Leu Lys Ala Gin Leu Ala Lys Lys Glu 405 410 415

Glu Glu Leu Glu Ala Val Lys Lys Glu Lys Glu Ala Leu Glu Ala Lys 420 425 430 íle Glu Glu Leu Lys Lys Ala Hís Ala Glu Glu Leu Ser Lys Leu Lys 435 440 445

Glu Met Leu Glu Lys Lys Asp His Ala Asn Ala Asp Leu Gin Ala Glu 450 455 460 íle Asn Arg Leu Lys Gin Glu Leu Ala Asp Arg íle Lys Ser Leu Ser 465 470 475 480

Gin Gly Gly Arg Ala Ser Gin Thr Asn Pro Gly Thr Thr Thr Ala Lys 485 490 495

Ala Gly Gin Leu Pro Ser Thr Gly Glu Ser Ala Asn Pro Plie Phe Thr 500 505 510 íle AJa Ala Leu Thr Val íle Ala Gly Ala Gly Met Ala Val Val Ser 515 520 525

Pro Lys Arg Lys Glu Asn 530 <2I0>3 <211> 1603 <212>DNA <213> Streptococcus equi <400> 3 algtttttga gaaataacaa gccaaaattt agcatcagaa aactaagtgc cggtgcagca 60 tcagtattag ttgcaacaag tgtgttggga gggacaactg taaaagcgaa ctctgaggtt 120 agtcgtacgg cgactccaag attatcgcgt gatttaaaaa atagattaag cgatatagcc 180 ataagtggag atgcctcatc agcccaaaaa gttcgaaatc ttctaaaagg cgcctctgtt 240 ggggatttac aggcattatt gagaggtctt gatteageaa gggctgcgta tggtagagat 300 gatlattaca atttattgat gcacctttca tcgatgttaa atgataaacc tgatggggat 360 agaagacaat taagtttggc ttcattactt gtagatgaaa ttgaaaagcg gattgctgat 420 ggagataggt atgcaaaact tcttgaggct aaacttgcag ctattaaatc tcaacaagaa 480 atgcttagag aaagagatte ccaacttcga aatetagaga aggagaaaga acaagagctc 540 acaaaagcta aagatgagcg tcaagctctt accgaatcat tcaacaaaac tttatcaaga 600 tcaacaaaag agtataataa actaaaaaca gaacttgcaa aagaaaaaga aaaagcagct 660 aagatgacta aggaattagc agataageta agcaatgctg aagcaagtcg tgataaagcc 720 tttgcagtat caaaagattt agcagalaaa ctaagtagtg ctgaagcaag tcgtgalaaa 780 gcttttgcag tatcaaaaga tttageagat aaatlggcag ctaaaacagc agaagelgaa 840 aagttaatgg aaaacgttgg tagtctagac egeltggtag agtctgcaaa acgtgaaatg 900 gctcaaaaat tagcagaaat tgatcaatta actgctgata aggctaaggc tgatgcagag 960 cttgcagctg caaatgacac cattgcatca cttcaaacag agctagaaaa agctaagaca 1020 gagcttgctg tttcagagcg tttgattgaa tcaggcaaac gtgaaattgc tgagctacaa 1080 aaacaaaaag atgcttctga taaggctlta gtagaatcac aagctaatgt agcagagctt 1140 gaaaaacaaa aagcagcatc agatgctaag gtagcagagc ttgaaaaaga agltgaagct 1200 gctaaagctg aggttgcaga tcttaaagca caattagcta agaaagaaga agagcttgaa 1260 gccgttaaga aggaaaaaga agcgcttgaa gctaagattg aagagctcaa aaaagctcat 1320 gctgaggaac tttcaaaact taaagaaatg cttgagaaga aagaccatgc aaatgcagat 1380 cttcaagcag aaatcaatcg cttgaagcaa gagctagctg acaggattaa gtcattgtca 1440 caaggtggtc gtgcttcaca aacaaaccca ggcactacaa ctgctaaagc aggtcaattg 1500 ccatctactg gtgagtctgc taacccattc ttcactattg cagctcttac tgtcatcgct 1560 ggtgctggaa tggctgtggt gtctcctaaa cgcaaagaaa act 1603 <210> 4 <211> 880 <2I2>DNA <213> Streptococcus equi <400>4 tctgaggtta gtcgtacggc gactccaaga ttatcgcgtg atttaaaaaa tagattaagc 60 gatatagcca taagtggaga tgcctcatca gcccaaaaag ttcgaaatct tctaaaaggc 120 gcctctgttg gggatttaca ggcattattg agaggtcttg attcagcaag ggctgcgtat 180 ggtagagatg attattacaa tttattgatg cacctttcat cgatgttaaa tgataaacct 240 gatggggata gaagacaatt aagtttggct {cattacttg tagatgaaat tgaaaagcgg 300 attgctgatg gagataggta tgcaaaactt cttgaggcta aacttgcagc tattaaatct 360 caacaagaaa tgcttagaga aagagattcc caacttcgaa atctagagaa ggagaaagaa 420 caagagctca caaaagctaa agatgagcgt caagctctta ccgaatcatt caacaaaact 480 (tatcaagat caacaaaaga gtataataaa ctaaaaacag aacttgcaaa agaaaaagaa 540 aaagcagcta agalgactaa ggaattagca gataagctaa gcaatgctga agcaagtcgt 600 gataaagcct tlgcaglatc aaaagattta gcagataaac taagtagtgc tgaagcaagt 660 cgtgataaag ctlttgcagt atcaaaagat ttagcagata aattggcagc taaaacagca 720 gaagctgaaa agttaatgga aaacgttggt agtctagacc gcttggtaga gtctgcaaaa 780. cgtgaaatgg ctcaaaaatt agcagaaatt gatcaattaa ctgctgataa ggctaaggct 840 galgcagagc (tgcagctgc aaatgacacc attgcatcac 880 <2IO> 5 <21l>294 <2I2>PRT <213> Streptococcus equi <400> 5

Asn Ser Glu Val Ser Arg Tlir Ala Thr Pro Arg Leu Ser Arg Asp Leu 15 10 15

Lys Asn Arg Leu Ser Asp íle Ala íle Ser Gly Asp Ala Ser Ser AJa 20 25 30

Gin Lys Val Arg Asn Leu Leu Lys Gly Ala Ser Val Gly Asp Leu Gin

40 45

Ala Leu Leu Arg Gly Leu Asp Ser AJa Arg Ala Ala Tyr Gly Arg Asp 50 55 60

Asp Tyr Tyr Asn Leu Leu Met His Leu Ser Ser Met Leu Asn Asp Lys 65 70 75 80

Pro Asp Gly Asp Arg Arg Gin Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Val Asp 85 90 95

Glu íle Glu Lys Arg Íle Ala Asp Gly Asp Arg Tyr Ala Lys Leu Leu 100 105 110

Glu Ala Lys Leu Ala Ala íle Lys Ser Gin Gin Glu Met Leu Arg Glu 1*15 120 125

Arg Asp Ser Gin Leu Arg Asn Leu Glu Lys Glu Lys Glu Gin Glu Leu 130 135 140

Thr Lys Ala Lys Asp Glu Arg Gin Ala Leu Thr Glu Ser Phe Asn Lys 145 150 155 160

Thr Leu Ser Arg Ser Thr Lys Glu Tyr Asn Lys Leu Lys Thr Glu Leu 165 170 175

Ala Lys Glu Lys Glu Lys Ala Ala Lys Met Thr Lys Glu Leu Ala Asp 180 185 | 190

Lys Leu Ser Asn A,a Glu Ala Ser Arg Asp Lys Ala Phe Ala Val Ser 195 200 205

Lys Asp Leu Ala Asp Lys Leu Ser Ser Ala Glu Ala Ser Arg Asp Lys 210 , 215 220

Ala Phe Ala Val Ser Lys Asp Leu A^la Asp Lys Leu Ala Ala Lys Thr 225 230 235 240

Ala Glu Ala Glu Lys Leu Met Glu Asn Val Gly Ser Leu Asp Arg Leu 245 250 255

Val Glu Ser Ala Lys Arg Glu Met A,a Gin Lys Leu Ala Glu íle Asp 260 265 270

Gin Leu Thr Ala Asp Lys Ala Lys Ala Asp Ala Glu Leu Ala Ala Ala 275 280 285

Asn Asp Thr íle A,a Ser 290 <2IO>6 <21I> 27 <2I2> DNA <213> Streptococcus equi <400> 6 gcggatccga actctgaggt tagtcgt <210> 7 <211> 28 <212>DNA <213> Streptococcus equi <400>7 gcggatccat agcttagttt tctttgcg 28 <2I0> 8 <211> 20 <212>DNA <213> Streptococcus equi <400> 8 tgcataaaga agttcctgtc 20 <2I0> 9 <211>20 <212>DNA <213> Streptococcus equi <400> 9 gattcggtaa gagcttgacg

Claims (14)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Zlúčenina obsahujúca zlúčeninu so vzorcor.· SEQ lD NO 1.
2. 2. Zlúčenina nároku 1, ktorá je SEQ ID NO Ί
3. 3. Prokaryotická bunka obsahujúca zlúčenine podľa nároku 1.
4. 4. Eukaryotická bunka obsahujúca zlúčen?.nt podľa nároku _.
5. 5. Bunka podľa nároku 3, ktorá je E. coli
6. 6. Bunka podľa nároku 3, ktorá je Salmonella spp
7. 7. Zlúčenina so vzorcom SEQ TD NO 2 alebo jej časti.
8. 8. Vakcína obsahujúca zlúčeninu podľa nároku 7.
9. 9. Zlúčenina podľa nároku 7, ktorá je SEQ ID NO 5
10. 10. Zlúčenina podľa nároku 9, ktorá je včlenená do lipozómu.
11. 11. Zlúčenina podľa nároku 10, ktorá ďalej obsahuje Bpodjednotku toxínu cholery.
12. 12. Spôsob indukcie S. equi-špecifickej imunity u koňa vyznačujúci sa tým, že obsahuje zlúčeninu podľa nároku 9.
13. 13. Spôsob identifikácie koňa infikovaného S. equ.' vyznačujúci sa tým, že sa získa biologická vzorka z koňapripraví sa vzorka pre PCR, vykoná sa PCR za použitia zodpovedajúcich primérov pre SEQ ID NO 1, elektroforéza konečného produktu a potvrdí sa prítomnosť alebo neprítomnosť fragmentu zodpovedajúcej veľkost.
14. 14. Spôsob podľa nároku 13 vyznačujúci sa tým, že sú použité priméry SEQ ID NO 8 a SEQ ID NO 9