CZ469199A3 - Sloučeniny kódující ochranný protein typu M z bakterie Streptococcus equi - Google Patents

Abstract

Molekulární sloučeniny, které kódují ochranný protein typu M z mikroorganismu Streptococcus equi (SeM), aminokyselinová sloučenina, kteráje tímto kódována a soustava látek, které zahrnují buď kódované látky nebo buněčné komponenty, které kódují. Předmětemřešeníjsou například vakcíny, které využívají aminokyselinové sloučeniny nebo vektory a buněčné dráhy potřebné k vytvoření aminokyselinových sloučenin. Rovněž se uvádí metody pro stimulaci S.equi-specifické imunitní odezvy u koní, diagnostická studie na detekci Streptococcus equi.

Description

Předkládaný vynález uvádí metody určené ke stimulaci Y e^wz-specifické, imunitní reakce u koní.

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY

Předkládaný vynález se obecně vztahuje k molekulárním sloučeninám, které kódují ochranný protein typu M z bakterie Streptococcus equi (SeM), aminokyselinovou sloučeninu, která je přitom kódována a složení látek, které zahrnují buď kódované sloučeniny nebo buněčné komponenty, které jsou kódovány. Předmětem předkládaného vynálezu jsou například zde popsané vakcíny využívající sloučeniny na bázi aminokyselin nebo vektorů a buněčné dráhy vhodné pro tvorbu aminokyselinových sloučenin.

Streptococcus equi, Lancefieldova skupina C streptokoků způsobuje dusivé, vysoce nakažlivé, infekční onemocnění nosohltanu a vysychání lymfatických uzlin skupiny Equidae. Antifagocytický protein typu M (SeM) o velikosti 58 kDa je hlavním faktorem nakažlivosti a ochranným antigenem a funkcemi limitovanými ukládáním C3b na povrchu bakterie přímo vázaným fibrinogenem. Boschwith a Timoney, 17 Microbiol. Pathogenesis 121 (1994) a Boschowith a Timoney, 62 Infect. Immun. 3515 (1994).

V nedávné minulosti bylo propuknutí S. equi na koňských farmách zabraňováno a léčeno karanténou podezřelých zvířat, antiseptickou úpravou jídla, podestýláním a ustájením a antibiotiky v případě indikace. Byly popsány vakcíny obsahující nenakažlivé Y. equi nebo jeho frakce, ale faktor úspěšnosti byl malý. Patent US, č. 5,183,659, popisuje vakcínu, která • · · · • · • · stimuluje odezvu protilátky nosohltanu u koní, ale vakcína byla omezena, jako mnoho takovýchto vakcín, rizikem reverze prudké nákazy a občasného vývoje zánětu u očkovaných koních.

5. equi je vylučován v nosním výtoku a hnisu z lymfatických uzlin zasažených zvířat. Běžná laboratorní bakteriální detekce zahrnuje bakteriologické kultury nosních výtěrů, nosních výplachů a hnisu způsobeného záněty, a je často obtížná z důvodu přítomnosti jiných kontaminací, malého množství organizmů nebo přítomností S. zooepidemicus a dalších βhemolytických streptokoků. Doplnění kultur a jejich identifikace obvykle trvá 2 až 3 dny, jedná se o příliš dlouhý interval daný vysoce infekčním dušením a potřebou rychle identifikovat nakažené koně, aby mohli být izolováni v raném stadiu nákazy.

PODSTATA VYNÁLEZU

Účelem předkládaného vynálezu je poskytnutí molekulárních sloučenin, které kódují SeM a složení látek, které zahrnují buď kódované látky nebo buněčné komponenty, které kódují.

Cílem je tedy předložit vektory, buněčné dráhy a produkty buněčných membrán za použití prezentovaných sloučenin.

Dalším cílem je představit způsob umožňující detekci Streptococcus equi.

Další záměry a znaky předkládaného vynálezu budou zřejmé z následujícího detailního popisu, příkladů a požadavků.

• 9

Definice

Následující termíny by měly mít odpovídající vysvětlující význam. Všechny ostatní termíny mají stejný význam, jaký mají běžně v odpovídajícím oboru, ve kterém jsou tyto termíny používány.

„Biologický vzorek“ znamená nosní nebo ústní hlen nebo krevní vzorek.

„Transformace“ a „transfekce“ znamená přimět nukleovou kyselinu vniknout do buňky, ať je nebo není začleněna do genomu.

PŘEHLED OBRÁZKŮ NA VÝKRESECH

Vynález bude dále popsán v souvislosti s doprovodnými výkresy, ve kterých:

Obrázek 1 je nukleotidová a odvozená aminokyselinová sekvence SeM. Pozice bází a aminokyselin jsou zobrazeny na levé straně obrázku. Předpokládaný promotor a ribosomální vazební oblasti (RBS) jsou orámovány a signální a membránové kotevní sekvence jsou vyznačeny tučným písmem.

Obrázek 2 je přenos proteinů využívající specifické interakce antigenu s protilátkou, tzv. „imunoblot“, prezentující reakce lyzátu zE. coli BL21, SeM02 a mutanolysinového extraktu S. equi s antisérem 216 a 963 k SeM a rekombinantnímu SeM.

• · · • · • · • ·

Obrázek 3 je „imunoblot“ prezentující reakce extraktů mutanolysinu sérií dočasně a geograficky separovaných izolátů £ equi s antisérem k rekombinantu SeM. Odhadované molekulární hmotnosti jsou zobrazeny na pravé straně obrázku.

Obrázek 4 je immunoblot prezentující lineární epitopy rozpoznané IgA v nosních výplaších • uzdravujících se (8 týdnů) koní.

Obrázek 5 je graf ilustrující regiony SeM reagujících s protilátkami v koňských sérech odebraných 8 týdnů po uzdravení z dušení.

Předkládaný vynález představuje sloučeniny nukleové kyseliny skládající se ze sloučenin následující sekvence;

AGCTTTCTGTCACCTGATGGTCCTTATCAAATACTGTAATTGATAACTTCAAACAGCCCT 61. GTAGAGATTTTACTAACGACATAGTATCCATGCTAAGCGTCACCCCCTTCATAATCCTCA

121 cggtatcttattctatcttaaaatttaagaaaagcaaggatatgcacttataatgaaaaa

181 ATAGACATAAAAAACAATAATATACATTCTTGCTTATTAAATAAAAATGAC AATGTACTG 241 cataaagaagttcctgtcattaaaataaaagtgccatgaggttataatagtatggtaaaa 301 caaaaaagtgtgcccataacgggtagagaggaattgacatatgtttttgagaaataac aa 361 gccaaaatttagcatcagaaaactaagtgccggtgcagcatcagtattagttgcaacaag 421 tgtgttgggagggacaactgtaaaagcgaactctgaggttagtcgtacggcgactccaag 481 attatcgcgtgatttaaaaaatagattaagcgatatagccataagtggagatgcctcatc 541 agcccaaaaagttcgaaatcttctaaaaggcgcctctgttggggatttacaggc attatt 601 gagaggtcttgattcagcaagggctgcgtatggtagagatgattattacaatttattgat

661 gcacctttcatggatgttaaatgataaacctgatggggatagaagacaattaagtttggc 721 TTCATTACTTGTAGATG AAATTGAAAAGCGGATTGCTGAŤGGAGATAGGTATGCAAAACT 7 81 tcttgaggctaaacttgcagctattaaatctcaacaagaaatgcttagagaaagagattc

841 ccaacttcgaaatctagagaaggagaaagaacaagagctcacaaaagctaaagatgagcg 901 tcaagctcttaccgaatcattcaacaaaactttatcaagatcaacaaaagagtataataa 961 ACTAAAAAtAGAACTTGCAAAAGAAAAAGAAAAAGCAGCTAAGATGACTAAGGAATTAGC 1021 AGATAAGCTAAGCAATGCTGAAGCAAGTCGTGATÁAAGCCTTTGCAGTATCAAAAG attt 1081 AGC AG ATAAACTAAGTAGTGCTGAAGCAAGTCGTGATAAAGCTTTTGCAGTATCAAAAGA

1141 TTTAGCAGATAAATTGGCAGCTAAAACAGCAGAAGCTGAAAAGTTAATGGAAAACGTTGG

1201 TAGTCTAGACCGCTTGGTAGAGTCTGCAAAACGTGAAATGGCTCAAAAATTAGCAGAAAT

61 TGATCAATTAACTGCTGATAAGGCTAAGGCTGATGCAGAGCTTGCAGCTGCAAATGACAC

1321 CATTGCATCACTTCAAACAGAGCTAGAAAAAGCTAAGACAGAGCTTGCTGTTTCAGAGCG 1381 tttgattgaatcaggcaaacgtgaaattgctgagctacaaaaacaaaaagatgcttctga

1441 TAAGGCTTTAGTAGAATCACAAGCTAAŤGTAGCAGAGCTTGAAAAACAAAAAGCAGCATC 1501 AGATGCTAAGGTAGCAGAGCTTGAAAAAGAAGTTGAAGCTGCTAAAGCTGAGGTTGCAGA 1561 TCTTAAAGC ACAATTAGCTAAG AAAGAAGAAGAGCTTGAAGCCGTTAAGAAGGAAAAAGA 1621 AGCGCTTGAAGCTAAGATTGAAGAGCTCAAAAAAGCTCATGCTGAGGAACTTTCAAAACT 1681 TAAAGAAATGCTTGAGAAGAAAGACCATGCAAATGC agatcttcaagcagaaatc aatcg

1741 cttgaagcaagagctagctgacaggattaagtcattgtcacaaggtggtcgtgcttcaca 1801 aac aaacccaggcactacaactgctaaagcaggtcaattgccatctactggtgagťctgc 1861 taacccattcttcactattgcagctcttactgtcatcgctggtgctggaatggctgtggt 1921 gtctcctaaacgcaaagaaaactaagctatttcctctttccccaatggacaatagccgaa 1981 ATÁATAG AGCGACTATCGTTCTAACACAAAAGCAACAGTCTCCTGTCTGTTGCTTTTTGT 2 041 GATATTAGGGCTCATCAGTCTAGGCTAATGGTTTTCTGCGCTTTATCTGCA [SEQ ID NO.l (M-protein (SeM) gen S.eqw)]. Otevřený čtecí rámec začíná na pozici 341 a končí bází 1934. Nejspíše se jedná o sloučeninu SEQ ID NO 1. Dále jsou také uvedeny sloučeniny komplementární k SEQ ID NO 1 nebo komplementární k částem SEQ ID NO 1.

• · ·

Preferovaná část SEQ ID NO 1 je ta, která je popsána výše jako báze číslo 341 až 1943, včetně (SEQ ID NO 3). Kromě toho sloučeniny definované bázemi číslo 452 až přibližně 1331 jsou taktéž upřednostňovány (SEQ ID NO 4).

Jak mohou ocenit kvalifikovaní pracovníci, příklady sloučenin DNA uvedených výše mohou snadno odvodit komplementární sekvence RNA. Každá taková sekvence RNA je také považována za předmět v rámci rozsahu předkládaného vynálezu. V uvedeném popisu se tyto skupiny sloučenin DNA a RNA nazývají „sloučeniny nukleových kyselin“.

Kromě toho jsou zde prezentovány buňky transfektované sloučeninou nukleové kyseliny (nebo její několikanásobné kopie) uvedené v tomto vynálezu. Upřednostňována je buňka transfektovaná sSEQ ID NO 1 nebo část z této buňky. Takové buňky mohou být prokaiyotícké nebo eukaiyotické. Preferované buňky zahrnují: E.coli, S. cerevisiae, a Salmonella spp. Také jsou představeny vektory transfektované sloučeninou nukleové kyseliny (nebo její několikanásobné kopie) uvedené v tomto vynálezu. Preferované vektory zahrnují viry neštovic, adenoviry nebo další virové vektory.

Sloučeniny nukleové kyseliny mohou být získány použitím primerů technikou PCR nebo z genové banky, přístupové číslo U73162. Vektory buněčné vazby mohou být také získány na základě zkušeností v oboru.

Kromě toho je zde uvedena aminokyselinová sloučenina:

₅ 10 15 20 25 30 imflrnnkpkfsirklsagaasvlvatsvlg

31GTTVKANSEVSRTATPRLSRDLKNRLSDIA

61ISGDASSAQKVRNLLKGASVGDLQALLRGL , ·« ·· ♦·

91

D

S

A

R

A

A

Y

G

R

D

D

Y

Y

N

L

121

R

R

Q

L

S

L

A

S

L

L

V

D

E

I

E

151

K

L

A

A

I

K

S

Q

Q

E

M

L

R

E

R

181

T

K

A

K

D

E

R

Q

A

L

T

E

S

F

N

211

E

L

A

K

E

K

E

K

A

A

K

M

T

K

E

241

F

A

V

S

K

D

L

A

D

K

L

S

S

A

E

271

K

L

A

A

K

T

A

E

A

E

K

L

M

E

N

301

A

Q

K

L

A

E

I

D

Q

L

T

A

D

K

A

331

L

Q

T

E

L

E

K

A

K

T

E

L

A

V

S

361

K

Q

K

D

A

S

D

K

A

L

V

E

S

Q

A

391

V

A

E

I»

E

K

E

V

E

A

A

K

A

E

V

421

A

v

K

K

E

K

E

A

L

E

A

K

I

E

E

451

L

E

K

K

D

H

A

N

A

D

L

Q

A

E

I

481

Q

G

G

R

A

S

Q

T

N

P

G

T

T

T

A

511

F

T

I

A

A

L

T

V

I

A

G

A

G

M

A

LMHLSSMLNDKPDGD

KRIADGDRYAKLLEA

DSQLRNLEKEKEQEL

KTLSRSTKEYNKLKT

LADKLSNAEASRDKA

A SR DKAFAVSKDLAD

VGSLDRLVESAKREM

KADABLAAANDTIAS

ERLIESGKREIAELQ

NVAELEKQKAASDAK

ADLKAQLAKKEEELE

LKKAHAEELSKLKEM

NRLKQELADRIKSLS

KAGQLPSTGESANPF

VVSPKRKEN což je SEQ ID NO 2. Předkládaný vynález taktéž zahrnuje části výše zmíněné sekvence. Částí s největší preferencí výše zmíněné sekvence jsou: rezidua 37 až 330 (SEQ ID NO 5), nicméně člověk zběhlý v oboru může rozpoznat, že každá speciální antigenová část je komerčně významná a je zahrnuta do oboru působnosti tohoto vynálezu.

Sloučeniny aminokyselin mohou být získány buď několikanásobnou expresí a čištěním v mikroorganismu nebo v některých případech konveční peptidovou syntézou.

0

00« 0 0

Nicméně, vakcína pro S. equi je předmětem tohoto vynálezu. Je preferována vakcína, která je podána nosem nebo orálně. Vakcína prezentovaná v tomto vynálezu může obsahovat celou

SEQ ID NO 2 nebo její část.

Vakcíny prezentované v tomto vynálezu mohou být součástí každé farmaceuticky akceptované formulace. Například, SEQ ID NO 5 může být začleněna do dvouvrstvých dutinek (lipozómů) ve vodním prostředí podle známých postupů jako je ten popsaný v publikaci Debs a další, 265 J. Biol. Chem. 10189 (1990). Jakýkoliv dosažitelný nosič nebo lipid tvořící liposomy může být použit v jakémkoliv vzorci, který předává SeM antigen, například poly-DL-Lactide-co-glycolid může být využit v nosním spreji, který zahrnuje SEQ ID NO 5. Vzorce, které obsahují složky zvyšující přísun antigenu k mucose, jako je malé množství B-podjednotky toxinu cholery, jsou také v rámci rozsahu tohoto vynálezu.

Předkládaný vynález také poskytuje metody, které stimulují S. equi specifickou imunitní odezvu u koní, kterou zahrnuje předkládaná sloučenina kódovaná SEQ ID NO 2 nebo její části. Je preferováno nosní nebo orální zavedení aplikace.

Konečně, tento vynález prezentuje metody, které určují přítomnost S. equi u koní prostřednictvím polymerační řetězcové reakce. Diagnostické zkoušky polymerační řetězcové reakce uvedené v tomto vynálezu mohou být porovnávány se známými metodami, pokud jsou primery pro sekvence zde uveřejněné použity jako některé z výchozích materiálů. Metody pro PCR lze nalézt v mnoha časopisech a knihách, například diagnostické metody PCR mohou být prováděny podle s Techniques in PCR, PCR, Current Protocols in Molecular Biology or Maniatis. Jak jsou si odborníci znalí problematiky vědomi, preferované primery jsou ty, které obsahují přinejmenším 50 % GC, nejlépe velikost 19 až 23 párů bází a nejsou schopné při kroku nasedání primerů vytvářet duplikátní úseky cílové DNA.

• · • · « • · ····

PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU

Příklad 1: Klonování, sekvenování a exprese SeM

Chromozomální DNA příslušející S. equi CF32 byla parciálně štěpena Tsp 5091 (New England Biolabs lne., Beverly MA) a fragmenty o velikosti 3 až 8 kb byly ligovány do λ ZAPII štěpených EcoRI (Stratagene, LaJolla, CA). Po zapakování (Gigapack II) (Stratagene, LaJolla, CA) a transfekci do E. coli XLLBlue MRF (Stratagene, LaJolla, CA) byla knihovna vyseta, namnožena a uložena při -70 °C v 7% DMSO. Knihovna byla zkoušena na duplikátních nitrocelulózových discích za použití králičího antiséra 216 (zředěného 1:4000) do kyselinového extraktu fragmentu SeM o velikosti 41 kDa. Několik reakčních plaků bylo analyzováno, dokud všechny plaky ukazovaly pozitivní signál. Proteiny v těchto fágových lyzátech byly separovány pomocí SDS PAGE a imunoblotovány se sérem 216. Plazmid obsahující fragment o velikosti 3,5 kb kódující SeM byl odstraněn z pozitivního fágu a výsledný plazmid byl označen pSeMOl. Sekvenování nukleotidů bylo provedeno na HindlII, PvuII a HindlII-PvuII fragmentech z S. equi inzertů vložených do pSK automatickým cyklickým sekvenováním. Sekvence byly uspořádány, porovnány a spojeny pomocí DNASIS (Hitachi Software Engineering America, Ltd., San Diego, CA). SeM bez signální sekvence byl subklonován do BamHI místa expresního vektoru pET15b (Novagen, Madison, WT) využívající metody amplifikace nukleotidového řetězce (PCR) s pSeMOl jako templátem a primery SeM-F (gcggatcCGAACTCTGAGGTTAGTCGT) (SEQ ID NO 6) a SeM-R (gcggatccATAGCTTAGTTTTCTTTGCG) (SEQ ID NO 7). Výsledný plazmid byl označen pSeM02 a transformován do E. coli BL21 (DE3). Rekombinantní SeM byl izolován z lyzátů BL21 pomocí afinitní chromatografie na His-Bind Resin (Novagen, Madison, WI).

Analýza spojených sekvencí odhalila přítomnost jednoho otevřeného čtecího rámce skládajícího se ze 1605 nukleotidů kódujících gen seM (obr. 1). Překlad seM odhalil základní (CH +4.5) preprotein skládající se z 535 aminokyselin o vypočtené molekulární hmotnosti 58.251 a pí 8,67. N konec aminokyselinové sekvence (rezidua 37až 52) byl identický s koncem získaným přímým mikrosekvenováním fragmentu SeM o velikosti 41 kDa přečištěným z kyselinového extraktu S. equi. Předpověděné vlastnosti sekvence aminokyselin ukazují typické vlastnosti streptokokových povrchových proteinů. Signální sekvence ·· »· •9 ···· • · • · • ··· • · :

• · · • ··

I ♦ · ¹ ♦ · ♦♦ • · :

• ♦ ;

» · · « .· ·· představuje 36 reziduí. N konec stabilizovaného proteinu má pozitivní náboj. Kotevní membrána předložené oblasti a koncové sekvence jsou podobné těm z ostatních skupin A a C streptokokových sekvencí. Dva přímo opakované úseky (21 reziduí) jsou umístěny mezi rezidui 226 a 267. Další kratší přímo opakované úseky se liší v dálce od 3 do 6 rezidua objevujících se v karboxy koncové polovině molekuly. Analýza sekundární struktury translatovaného proteinu ukazuje rozsáhlou oblast alfa helix rozprostírající se od rezidua 120 do 480. Předpověděná sekundární struktura vykazuje ohyby v blízkosti reziduí 120 a 480 až 500.

Příklad 2: Určení sekvence aminokyselin

Přečištěný kyselinový extrakt (2 mg), jak je popsáno v příkladu 3, byl vložen do 2 cm široké drážky na akrylamidový gel o tloušťce 1,5 mm pro připravený SDS PAGE. Gel byl nejdříve podroben před nanesením proteinu Čtyřicetiminutovému zapojení při 100 V s 0,1 mM thioglykolovou kyselinou. Následovala elektroforéza a elektroforézní transfer do Immobilonu P (Millipore), hlavní fragmenty SeM o velikosti 41 a 46 kDa byly identifikovány pomocí barvení po dobu 1 min. s 0,025% Coomassie blue v 40% methanolu a 5% ledové kyseliny octové následované dvou minutovou inkubací v 30% methanolu a 5% ledové kyseliny octové. Fragment o velikosti 41 kDa byl vyříznut a analyzován mikrosekvenováním provedeném na sekvenátoru, modelu 477A pulse liquid phase sequencer (Applied Bio Systems) v Laboratoři makromolekulární syntézy na University of Kentucky.

Příklad 3: Extrakce proteinů

Protein typu M byl extrahován z kultury S. equi kultivované přes noc (18 h) pomocí horké kyselinové extrakce (Lancefíeld and Perlmann. 96 J. Exp. Med. 71 (1952) a adsorbován na sloupec hydroxyapatitu v 10 mM fosfátovém pufru o pH 7,2. Proteiny typu M byly eluovány do 0,2 M Na2HPO4, odsoleny na Sephadexu G25 a lyofilizovány. Peleta byla rozpuštěna v roztoku 25% acetonitrilu s 0,5% trifluorooctové kyseliny a vložena na fenyl RP kolonu s reverzní fází (Bio-Rad, San Francisco CA) napojenou na Waters 650 proteinový purifíkační systém (Waters, Marlborough, MA). Protein byl eluován pomocí lineárního gradientu 25 až 65% acetonitrilu s 0.5% TFA. Na analýzu píku byl použit bodový immunoblot na ·· ► · · • · ··· • · · 2 • · 9 · *· ·» ···· • · · · 9· ♦ · ** • · * 2 • · · 2 • · · ί ♦ » ♦ · ·· nitrátcelulose používající specifické králičí antisérum SeM. Pík obsahující protein SeM byl eluován na 42% koncentraci v acetonitrilu. Pozitivní píky z několika frakcí spojeny a dále přečištěny na stejném sloupci. Přečištěný protein byl lyopfilizován, resuspendován v PBS a uložen v alikvotách při -20°C. Mutanolysinové extrakty bakteriálních kmenů S. equi byly upraveny tak, jak bylo popsáno dříve (Galán a Timoney, 26 J. Clin. Microbiol. 1142 (1988).

Příklad 4: Antiséra

Antisérum bylo zvýšeno proti přečištěnému SeM kombinací hydroxyapatitu a chromatografií s reverzní fázi. Bílý králík z Nového Zélandu (216) byl injektován podkožně 50 pg SeM v kompletním Freundovském adjuvantu následující 3 týdny v intervalech po 2 podobných dávkách emulgovaných s nekompletním Freundovským adjuvantem. sérum bylo odebráno v 8. týdnu. Králík 963 byl přeimunizován podobně s rekombinantním SeM ze sonikátu E. coli. Králík Ec byl imunizován lyzátem zE. coli NovaBlue obsahující plazmid pT7 Blue bez inzertu. Dospělé myši ICR byly imunizovány 25 pg přečištěným SeM ze sonikátu E. coli pomocí HIS-Tag chromatografie. Přečištěný SeM (25 pg) byl smíchán s 5 pg mycolického dipeptidu (MDP) a alhydrogelu (30%) a přendán do podkožní dávky o objemu 100 ml. Dvě podkožní nosné dávky obsahující 25 pg SeM, ale ne MDP, byly dávkovány o 10 a 20 dní později. Myším byla odebírána krev 28 dní. Všechna antiséra byla uložena při 70 °C, než byla použita.

Příklad 5: „Imunoblotování“

Proteiny streptokokových extraktů nebo přečištěných ze sonikátu E. coli byly separovány na SDS-10% polyakrylamidové gelové elektroforéze (PAGE) a elektroblotovány do memrány nítrocelulozy a inkubovány v odpovídajícím antisérem rozpuštěným 1:200 v PBS, a poté v peroxidasa-kojugátovém proteinu G (1:4000). Reaktivní fragmenty byly vizualizovány za použití substrátu 4-chlor-l-naftolu (0,5 mg/ml).

Králičí antisérum 963 ku recSeM reagovalo s proteinem o velikosti 58 kDa v mutanolysinovém extraktu z S. equi a s poněkud větším proteinem o velikosti 60 kDa exprimovaným v E. coli BL21 obsahující pSeM02 (obr. 2). Stejné fragmenty proteinů byly • · · · .· ·· « · · • · ···.

«« ···· • · .

• · .

rozeznány králičím antisérem 216 do fragmentu SeM o velikosti 41 kDa. Obrázek 3 představuje profil „imunoblotu“ mutanolysinových extraktů sérií izolátů S. equi odebrané v různém čase ve Spojených státech a v Evropě. Antisérum proti rec-seM rozpoznávalo dva fragmenty proteinu o velikostech 58 a 56 kDa ve všech extraktech.

Příklad 6: ELISA

Fragment SeM (o velikosti 41 kDa) extrahovaný kyselinou a přečištěný preparativní elektroforézou na agarose byl použit k potažení sond (2,5 mg/sonda) z polystyrénových destiček ELISA (Costar, 25880, Corning Glass Company, Corning NY). Po umytí a inkubaci v 0,1 M fosfátovém pufru obsahujícím soli (PBS) obsahující 0,05 Tween 20 a 1% hovězí sérum albumin (BSA), byla myší nebo králičí séra zředěná 1:80 a 1:200 v PBS a přidána v trojnásobném množství do sond (100 ml/sondu). Po tříhodinové inkubaci při 37 °C byla detekována vazba na IgG buď s peroxidasovým konjugovaným proteinem G (1:4000) nebo králičím anti-myším IgG následovaného roztokem O-phenylene diaminu (0.0001 mM). Průměrné hodnoty OD ze třech měření byly měřeny proti sondám obsahujících antigen a PBS.

Příklad 7: Opsonická zkouška

Koňské neutrophily byly separovány z čerstvě sebrané heparinizované koňské krve s diskontinuálním Percoll gradientem Pycock a kol., 42 Res. Vet. Sci. 411 (1987). Neutrophily ze 7 ml krve byly resuspendovány v RPMI mediu (Gipco, Grand Island, NY) a 80 ml aliquot (6 x 105 buněk) přidány v trojnásobném množství do sond z 24 buněčných shluků (Costar, Cambridge, Mass). Každá sonda obsahovala kruhový skleněný proužek (12 mm v průměru). Seskupení buněk bylo inkubováno 2 h při 37 °C v 5% CO2 a buňky byly jednou omyty PBS, aby byly odstraněny nepřichycené neutrophily. Zkušební organismy (S. equi CF32 a S. zooepidemicus W60) byly pěstovány přes noc při teplotě 37 °C vTHB s 0.2% kvasným extraktem do OD 0,6, Dvacet ml kultury bylo přidáno k 25 ml séra, a dále bylo přidáno 450 ml RPMI. Poté, co byla miska lehce protřepána po dobu 30 min. při 37 °C, krycí kroužky byly opět omyty pomocí PBS (pH 7,2), zafixovány v 10% formalínu a obarveny pomocí Giemsa. Počet neutrophilů s přidruženými streptokoky na 100 buněk byly následně rozpočítány pro každé sérum a vyjádřeny v procentech. Všechny pokusy byly provedeny • · • · třikrát. Rozdíly v opsonické aktivitě imunního a kontrolního séra byly statisticky vyhodnoceny Studentovým t-testem (nepárovým zkoumáním) založeném na průměrných hodnotách získaných ze tří experimentů.

Sérum z myši imunizované s přečištěným rekombinantem SeM vykázalo 15 krát větší opsonickou aktivitu pro S. equi než neimunní myší sérum. Tato séra také prokázala silné protilátkové reakce prostřednictvím ELISA ke fragmentu SeM o velikosti 41 kDa (přiklad 6).

Příklad 8: Studie vázaného fibrinogenu

Koňský fibrinogen (0,5 mb/sondu) byl navázán na sondy z 96 polystyrénových destiček ELISA (Costar). Po omytí a inkubaci byl rekombinantní SeM (0,4 mg/sondu) přidán v trojnásobné formě do separovaných sond a inkubován 12 hodin při teplotě 37 °C. Po omytí bylo králičí antisérum proti fragmentu SeM o velikosti 41 kDa zředěné 1:80 přidáno do příslušných sond a inkubováno při teplotě 37 °C po dobu 2 hodin. Kontrolní sondy se skládaly ze sond, ze kterých byl vynechán fibrinogen a ze sond upravených séry ze stejných králíků jako před imunizací. Množství specifických králičích protilátek, které vázaly fixovaný SeM na fibrinogen, byly detekovány, jak je popsáno v protokolu ELISA.

SeM vykázal silnou vazbu na koňský fibrinogen imobilizovaný na sondy destiček ELISA. Průměrná hodnota ELISA (±SD) pro SeM vázaný na fibrinogen po korekci pro nespecifikovaný vázaný protein ku povrchu sondy byl 0,9 ±0,1. Opravená hodnota byla 0,1 ± 0,1, když bylo předimunizované sérum použito pro studii vazby streptokokových proteinů.

Příklad 9: Přístupová čísla nukleotidové sekvence

Přístupové číslo genetické banky pro nukleotidové sekvence SeM je U73162.

Příklad 10: Homologie

S výjimkou signální a membránové kotevní sekvence nebyla zjištěna žádná homologie SeM se skupinou A nebo GM protein sekvencí v databázi genové banky. SeM vykazuje některé • · • · • · · · · · · • · · · · · · homologie mezi vlastním signálem (39% identita) a kotevní membránou (66% identita) s těmi, které jsou uvedeny v databázi.

Příklad 11: Přítomnost protilátek vázající se na SeM u uzdravujících se koních

Na obrázku 3 jsou ukázány oblasti SeM reagující s protilátkami v koňských sérech odebraných 8 týdnů po vzpamatování se z dušení. Většina koní vykazovala reakce na epitopy v centrální oblasti SeM (rezidua 170 až 270). Reakce jednotlivých koní ke třetině u N-konce a k oblasti uhlíkového konce SeM byly rozdílné mnohem více. Žádný z koní nereagoval na samotný peptid 151 až 166. Lineární epitopy rozpoznané pomocí IgA v uzdravujících se (8 týdnů) nosních hlenech je možné nalézt ve stejné oblasti reagující s sérem protilátky (obrázek 4). Násobné epitopy jsou normovány a, jako v případě séra protilátky, je zde patrný značný rozdíl v reakcích jednotlivých koní.

Příklad 12: Imunizace neexponovaných jednoročních poníků

Byly imunizovány dvě skupiny tříletých velšských poníků pomocí mikroenkapsulárního rekombinantního fuzního peptidu M-proteinu (SeM, aminokyseliny 231 až 330) produkovaného E. coli BL21 a mikroenkapsulámím extraktem samotného hostitele E. coli. Enkapsulární protein (100 pg) byl první den rozprášen do nozdry každého jedince použitím nosního rozprašovače. Nosné dávky 150 a 350 pg byly podány 7. a 42. den. Sérum a nosní hleny byly odebrány 1., 7., 21. a 42. den a analyzovány pro SeM specifické IgG v séru a IgA v nosních hlenech.

Specifická mucosalní IgA odezva na SeM byla znatelná 21. den u dvou ze tří poníků a u všech poníků 49. den. Žádný ze tří kontrolích poníků imunizovaných samotným E. coli extraktem neodpovídal SeM. U žádného z poníků nebyly zaznamenány žádné reakce na sérum protilátky. Tyto studie demonstrují možnost provádět selektivně-indukujících specifických mucosalních odpovědí na protilátky u koní použitím mikroenkapsulárního streptokokového peptidu.

Příklad 13: PCR diagnostická zkouška

Nosní výtěry (Precision Dynamic Corp. San Fernardo, CA, Culturette, Baxter Healthcare Corp., Deerfíeld, IL) byly odebrány z postižených a neizolovaných koní v průběhu prvního až pátého dne po klinické diagnóze dušení na farmách A, B, C a D. Někteří koně byli prohlédnuti více než jednou během následujících tří týdnů. Nosní výtěry byly odebrány od koní z farem UK patnáctý a osmdesátý pátý den následující po smíšení a odhalení dvou koní s klinickým dušením. U obou těchto koní se rozvinulo dušení během 17 dnů po tom, co byli vystaveni smíšení. Nosní výtěry byly odebrány nakapáním 50 ml fosfátového pufru (pH 7,2) přes v průměru 8 mm latexovou trubičku vloženou 15 cm do nozdry a odebráním tekutiny vytékající ven. Tekutina byla odstředěna při 3000 g a kusy pelet separovány pro kultivace a PCR. Výtěry a nosní výplachy byly kultivovány na krevním agaru koní Columbia CNA a inkubovány 18 hodin při 37 °C. Beta hemolytické kolonie byly kultivovány zvlášť a jejich chování bylo testováno při fermentaci na půdách obsahujících laktózu, sorbitol a trehalosu Mucoid beta-hermolytické kolonie, které nefermentovaly žádny z těchto cukrů, byly identifikovány jako S. equi.

DNA pro PCR z nosních výtěrů a výplachů byla připravena následujícím způsobem: cípy tampónu byly umístěny do 300 μΐ sterilované vody, vortexovány, cípy byly vyjmuty a tekutina odstředěna při 14000 g 10 minut. Sedimenty byly resuspendovány v 20 μΐ K-pufru (IX Gen Amp pufru II, Perkin Elmer, 0.5% Tweenu 20, 100 g/ml proteinasy K). Pelety z nosních výplachů byly resuspendovány v ekvivalentním objemu do K-pufru. Suspenze byly inkubovány při 55 °C, vařeny po dobu 5 minut, a poté odstřeďovány 5 minut při 14000g. Reakční mix pro PCR v celkovém objemu 30 μΐ byly připraveny v Gen Amp pufru II a obsahoval 2 mM MgCl₂, 0,2 mM dNTP, 0,5 jednotek Taq polymerasy, 0,25 μΜ SeM6 a SeM7 primerů a 2 až 5 μΐ vzorku. Sekvence prímerů byly 5' TGCATAAAGAAGTTCCTGTC (SeM7-dopředu (báze 239-258) SEQ ID NO 8) a 5' GATTCGGTAAGAGCTTGACG (SeM zpět (báze 899 až 918) SEQ ID NO 9). Minerální olej (30 μΐ) byl přidán z toho důvodu, aby byla reakce dobře utěsněna. Cyklování bylo provedeno následovně: -92 °C na dobu 2 minut; 92 °C na dobu 1 minuty; 58 °C na dobu 1 minuty (30 krát); 72 °C na dobu 5 minut; a konečně 4 °C. PCR produkty byly separovány na * · · 9 · 9 9999

9999 9 9 9 9 99 9

99 999 9 999 99 9

99 9 9 99 9 9 99 9

99 99 99 99 99 elektroforéze v agarozovém gelu obsahující ethidium bromid. SeM fragment amplifikovaný pomocí primerů SeM6 a 7 měl velikost 679 bp.

Pomocí PCR byl detekován fragment DNA o velikosti 679 bp v 37 vzorcích zahrnujících 14 z 15, které byly pozitivní při kultivaci. Citlivost PCR se jeví jako mnohem vyšší než citlivost růstu.

Je nutno poznamenat, že i pře úplný popis předkládaného vynálezu jsou možné různé změny a modifikace zřejmé těm, kteří se touto problematikou zabývají. Takové změny a modifikace jsou chápany v rámci rozsahu platnosti předkládaného vynálezu, jak je definováno připojenými nároky.

• · · · · · · · · · *···· ·· · ♦ · · · • · · ··· · · · · ·· · • · · · ···· ···· ·· ·· ·· · · · · ··

POPIS SEKVENCE <110» timoney, John F.

Artiushin, Sergey

University of Kentucky Research Foundation <120> Sloučeniny kódující ochranný protein typu M z bakterie Streptococcus equi a provedená studie <130» P-1045 <140» filed herewith <141» 1530-06-23 <150» 60/050,577 «151» 1537-06-24 <160> 3 <170» Patentln Ver. 2,0 <210» l <211» 2031 <212» DNA <213» Streptococcus equi <400» 1 agctttctgt cacctgatgg tccttatcaa atactgtaat tgataacttc aaacagccct 60 gtagagatt tactaacgac atagtatcca tgctaagcgt cacccccttc ataatcctca 120 cggtatctta ttctatctta aaatttaaga aaagcaagga tatgcactta taatgaaaaa 180 atagacataa aaaacaataa tatacattct tgcttattaa ataaaaatga caatgtactg 240 cataaagaag ttcctgtcat taaaataaaa gtgccatgag gttataatag tatggtaaaa 300 caaaaaagtg tgcccataac gggtagagag gaattgacat atgtttttga gaaataacaa 360 gccaaaattt agcatcagaa aactaagtgc cggtgcagca tcagtattag ttgcaacaag 420 tgtgttggga gggacaactg taaaagcgaa ctctgaggtt agtčgtacgg cgactčcaag 480 attatcgcgt gatttaaaaa atagattaag cgatatagcc ataagtggag atgcctcatc 540 agcccaaaaa gttcgaaatc ttctaaaagg cgcctctgtt ggggatttac aggcattatt 600 gagaggtctt gattcagcaa gggctgcgta tggtagagat gattattaca atttattgat 660 gcacctttca tcgatgttaa atgataaacc tgatggggat agaagacaat taagtttggc 720 ttcattactt gtagatgaaa ttgaaaagcg gattgctgat ggagataggt atgcaaaact 780 tcttgaggct aaacttgcag ctattaaatc tcaacaagaa atgcttagag aaagagattc 840 ccaacttcga aatctagaga aggagaaaga acaagagctc acaaaagcta aagatgagcg 900 tcaagctctt accgaatcat tcaacaaaac tttatcaaga tcaacaaaag agtataataa 960 actaaaaaca gaacttgcaa aagaaaaaga aaaagcagct aagatgacta aggaattagc 1020 agataagcta agcaatgctg aagcaagtcg tgataaagcc tttgcagtat caaaagattt 1080 agcagataaa ctaagtagtg ctgaagcaag tcgtgataaa gcttttgcag tatcaaaaga 1140 tttagcagat aaattggcag ctaaaacagc agaagctgaa aagttaatgg aaaacgttgg 1200 tagtctagac cgcttggtag agtctgcaaa acgtgaaatg gctcaaaaat tagcagaaat 1260 «ΦΦΦ • · · · · · · · φ φφ · φ φφ φφφ · φφφ φ · φ φφφφ φφφφ φφφφ φφφφ φφφφ φφφφ tgatcaatta actgctgata aggctaaggc tgatgcagag cttgcagctg caaatgacac 1320 cattgcatca cttcaaacag agctagaaaa agctaagaca gagcttgctg tttcagagcg 1380 tttgattgaa tcaggcaaac gtgaaattgc tgagctacaa aaacaaaaag atgcttctga 1440 taaggcttta gtagaatcac aagctaatgt agcagagctt gaaaaacaaa aagcagcatc 1500 agatgctaag gtagcagagc ttgaaaaaga agttgaagct gctaaagctg aggttgcaga 1560 tcttaaagca caattagcta agaaagaaga agagcttgaa gccgttaaga aggaaaaaga 1620 agcgcttgaa gctaagattg aagagctcaa aaaagctcat gctgaggaac tttcaaaact 1680 taaagaaatg cttgagaaga aagaccatgc aaatgcagat cttcaagcag aaatcaatcg 1740 cttgaagcaa gagctagctg acaggattaa gtcattgtca caaggtggtc gtgcttcaca 1800 aacaaaccca ggcactacaa ctgctaaagc aggtcaattg ccatctactg gtgagtctgc 1860 taacccattc ttcactattg cagctcttac tgtcatcgct ggtgctggaa tggctgtggt 1920 gtctcctaaa cgcaaagaaa actaagctat ttcctctttc cccaatggac aatagccgaa 1980 ataatagagc gactatcgtt ctaacacaaa agcaacagtc tcctgtctgt tgctttttgt 2040 gatattaggg ctcatcagtc taggctaatg gttttctgcg ctttatctgc a 2091 <210>2 <211> 534 <212> PRT <213> Streptococcus equi <400> 2

Met Phe Leu Arg Asn Asn Lys Pro Lys Phe Ser Ile Arg Lys Leu Ser 15 10 15

Ala Gly Ala Ala Ser Val Leu Val Ala Thr Ser Val Leu Gly Gly Thr 20 25 30

Thr Val Lys Ala Asn Ser Glu Val Ser Arg Thr Ala Thr Pro Arg Leu 35 40 45

Ser Arg Asp Leu Lys Asn Arg Leu Ser Asp Ile Ala Ile Ser Gly Asp 50 55 60

Ala Ser Ser Ala Gin Lys Val Arg Asn Leu Leu Lys Gly Ala Ser Val

70 75 80

Gly Asp Leu Gin Ala Leu Leu Arg Gly Leu Asp Ser Ala Arg Ala Ala 85 90 95 ··· · · · · · · · • ···« · · · t ·· · • · · · · · · · · · · · · • · · · ···· · · · · ·· · · ·· · · ·· tt

Tyr Gly Arg Asp Asp Tyr Tyr Asn Leu Leu Met His Leu Ser Ser Met 100 105 110

Leu Asn Asp Lys Pro Asp Gly Asp Arg Arg Gin Leu Ser Leu Ala Ser 115 120 125

Leu Leu Val Asp Glu Ile Glu Lys Arg Ile Ala Asp Gly Asp Arg Tyr 130 135 140

Ala Lys Leu Leu Glu Ala Lys Leu Ala Ala Ile Lys Ser Gin Gin Glu 145 150 155 160

Met Leu Arg Glu Arg Asp Ser Gin Leu Arg Asn Leu Glu Lys Glu Lys 165 170 175

Glu Gin Glu Leu Thr Lys Ala Lys Asp Glu Arg Gin Ala Leu Thr Glu 180 185 190

Ser Phe Asn Lys Thr Leu Ser Arg Ser Thr Lys Glu Tyr Asn Lys Leu 195 200 205

Lys Thr Glu Leu Ala Lys Glu Lys Glu Lys Ala AJa Lys Met Thr Lys 210 215 220

Glu Leu AJa Asp Lys Leu Ser Asn Ala Glu Ala Ser Arg Asp Lys Ala

225 230 235 240

Phe Ala Val Ser Lys Asp Leu Ala Asp Lys Leu Ser Ser Ala Glu Ala 245 250 255

Ser Arg Asp Lys Ala Phe Ala Val Ser Lys Asp Leu Ala Asp Lys Leu 260 265 270

Ala Ala Lys Thr Ala Glu Ala Glu Lys Leu Met Glu Asn Val Gly Ser 275 280 285

Leu Asp Arg Leu Val Glu Ser Ala Lys Arg Glu Met Ala Gin Lys Leu 290 295 300

Ala Glu Ile Asp Gin Leu Thr Ala Asp Lys Ala Lys Ala Asp Ala Glu

305 310 315 320

Leu Ala Ala Ala Asn Asp Thr Ile Ala Ser Leu Gin Thr Glu Leu Glu 325 330 335

Lys Ala Lys Thr Glu Leu Ala Val Ser Glu Arg Leu Ile Glu Ser Gly 340 345 350

Lys Arg Glu Ile Ala Glu Leu Gin Lys Gin Lys Asp Ala Ser Asp Lys 355 360 365

Ala Leu Val Glu Ser Gin Ala Asn Val Ala Glu Leu Glu Lys Gin Lys 370 375 380 • 9 9 9 9

9 ··· ♦ ·

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

99 99 •9 9999

9 9 9

9 9 9

9 9 9

9 9 9

9 99

Ala Ala Ser Asp Ala Lys Val Ala Glu Leu Glu Lys Glu Val Glu Ala 385 390 395 400

Ala Lys Ala Glu Val Ala Asp Leu Lys Ala Gin Leu Ala Lys Lys Glu 405 410 415

Glu Glu Leu Glu Ala Val Lys Lys Glu Lys Glu Ala Leu Glu Ala Lys 420 425 430

Ile Glu Glu Leu Lys Lys Ala His Ala Glu Glu Leu Ser Lys Leu Lys 435 440 445

Glu Met Leu Glu Lys Lys Asp His Ala Asn Ala Asp Leu Gin Ala Glu 450 455 460

Ile Asn Arg Leu Lys Gin Glu Leu Ala Asp Arg Ile Lys Ser Leu Ser 465 470 475 480

Gin Gly Gly Arg Ala Ser Gin Thr Asn Pro Gly Thr Thr Thr Ala Lys 485 490 495

Ala Gly Gin Leu Pro Ser Thr Gly Glu Ser Ala Asn Pro Phe Phe Thr 500 505 510

Ile Ala Ala Leu Thr Val Ile Ala Gly Ala Gly Met Ala Val Val Ser 515 520 525

Pro Lys Arg Lys Glu Asn 530 <210>3 <211> 1603 <212> DNA <213> Streptococcus equi <400> 3 atgtttttga gaaataacaa gccaaaattt agcatcagaa aactaagtgc cggtgcagca 60 tcagtattag ttgcaacaag tgtgttggga gggacaactg taaaagcgaa ctctgaggtt 120 agtcgtacgg cgactccaag attatcgcgt gatttaaaaa atagattaag cgatatagcc 180 ataagtggag atgcctcatc agcccaaaaa gttcgaaatc ttctaaaagg cgcctctgtt 240 ggggatttac aggcattatt gagaggtctt gattcagcaa gggctgcgta tggtagagat 300 gattattaca atttattgat gcacctttca tcgatgttaa atgataaacc tgatggggat 360 agaagacaat taagtttggc ttcattactt gtagatgaaa ttgaaaagcg gattgctgat 420 ggagataggt atgcaaaact tcttgaggct aaacttgcag ctattaaatc tcaacaagaa 480 atgcttagag aaagagattc ccaacttcga aatctagaga aggagaaaga acaagagctc 540 acaaaagcta aagatgagcg tcaagctctt accgaatcat tcaacaaaac tttatcaaga 600 tcaacaaaag agtataataa actaaaaaca gaacttgcaa aagaaaaaga aaaagcagct 660 aagatgacta aggaattagc agataagcta agcaatgctg aagcaagtcg tgataaagcc 720 tttgcagtat caaaagattt agcagataaa ctaagtagtg ctgaagcaag tcgtgataaa 780 gcttttgcag tatcaaaaga tttagcagat aaattggcag ctaaaacagc agaagctgaa 840 aagttaatgg aaaacgttgg tagtctagac cgcttggtag agtctgcaaa acgtgaaatg 900

ΦΦ φφφφ φφφ · · φ φφφφ φφφφφ φ φ φ φφφφ φ φφ φφφ φ φφφ φφ φ φφφφ φφφφ φφφφ φφ φφ φφφφ φφ φφ gctcaaaaat tagcagaaat tgatcaatta actgctgata aggctaaggc tgatgcagag 960 cttgcagctg caaatgacac cattgcatca cttcaaacag agctagaaaa agctaagaca 1020 gagcttgctg tttcagagcg tttgattgaa tcaggcaaac gtgaaattgc tgagctacaa 1080 aaacaaaaag atgcttctga taaggcttta gtagaatcac aagctaatgt agcagagctt 1140 gaaaaacaaa aagcagcatc agatgctaag gtagcagagc ttgaaaaaga agttgaagct 1200 gctaaagctg aggttgcaga tcttaaagca caattagcta agaaagaaga agagcttgaa 1260 gccgttaaga aggaaaaaga agcgcttgaa gctaagattg aagagctcaa aaaagctcat 1320 gctgaggaac tttcaaaact taaagaaatg cttgagaaga aagaccatgc aaatgcagat 1380 cttcaagcag aaatcaatcg cttgaagcaa gagctagctg acaggattaa gtcattgtca 1440 caaggtggtc gtgcttcaca aacaaaccca ggcactacaa ctgctaaagc aggtcaattg 1500 ccatctactg gtgagtctgc taacccattc ttcactattg cagctcttac tgtcaícgct 1560 ggtgctggaa tggctgtggt gtctcctaaa cgcaaagaaa act 1603 <210>4 <211> 880 <212> DNA <213> Streptococcus equi <400>4 tctgaggtta gtcgtacggc gactccaaga ttatcgcgtg atttaaaaaa tagattaagc 60 gatatagcca taagtggaga tgcctcatca gcccaaaaag ttcgaaatct tctaaaaggc 120 gcctctgttg gggatttaca ggcattattg agaggtcttg attcagcaag ggctgcgtat 180 ggtagagatg attattacaa tttattgatg cacctttcat cgatgttaaa tgataaacct 240 gatggggata gaagacaatt aagtttggct tcattacttg tagatgaaat tgaaaagcgg 300 attgctgatg gagataggta tgcaaaactt cttgaggcta aacttgcagc tattaaatct 360 caacaagaaa tgcttagaga aagagattcc caacttcgaa atctagagaa ggagaaagaa 420 caagagctca caaaagctaa agatgagcgt caagctctta ccgaatcatt caacaaaact 480 ttatcaagat caacaaaaga gtataataaa ctaaaaacag aacttgcaaa agaaaaagaa 540 aaagcagcta agatgactaa ggaattagca gataagctaa gcaatgctga agcaagtcgt 600 gataaagcct ttgcagtatc aaaagattta gcagataaac taagtagtgc tgaagcaagt 660 cgtgataaag cttttgcagt atcaaaagat ttagcagata aattggcagc taaaacagca 720 gaagctgaaa agttaatgga aaacgttggt agtctagacc gcttggtaga gtctgcaaaa 780 cgtgaaatgg ctcaaaaatt agcagaaatt gatcaattaa ctgctgataa ggcíaaggct 840 gatgcagagc ttgcagctgc aaatgacacc attgcatcac 880 <210> 5 <211>294 <212>PRT <213> Streptococcus equi <400> 5

Asn Ser Glu Val Ser Arg Thr Ala Thr Pro Arg Leu Ser Arg Asp Leu 15 10 15

Lys Asn Arg Leu Ser Asp Ile Ala Ile Ser Gly Asp Ala Ser Ser Ala 20 25 30

Gin Lys Val Arg Asn Leu Leu Lys Gly Ala Ser Val Gly Asp Leu Gin 35 40 45

Ala Leu Leu Arg Gly Leu Asp Ser Ala Arg Ala Ala Tyr Gly Arg Asp 50 55 60

Φ Φ φ

Φ ΦΦΦΦ

Φ Φ Φ Φ

Φ * Φ Φ

ΦΦ ΦΦ

ΦΦΦΦ

Φ Φ

ΦΦΦ Φ Φ

Φ Φ Φ

Φ» · ·

ΦΦ ΦΦ

Φ Φ Φ Φ

Φ · ♦ ·

Φ Φ Φ Φ

Φ Φ Φ Φ

ΦΦ ··

Asp Tyr Tyr Asn Leu Leu Met His Leu Ser Ser Met Leu Asn Asp Lys 65 70 75 80

Pro Asp Gly Asp Arg Arg Gin Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Val Asp 85 90 95

Glu Ile Glu Lys Arg lle Ala Asp Gly Asp Arg Tyr Ala Lys Leu Leu 100 105 110

Glu Ala Lys Leu Ala Ala Ile Lys Ser Gin Gin Glu Met Leu Arg Glu 115 120 125

Arg Asp Ser Gin Leu Arg Asn Leu Glu Lys Glu Lys Glu Gin Glu Leu 130 135 140

Thr Lys Ala Lys Asp Glu Arg Gin Ala Leu Thr Glu Ser Phe Asn Lys 145 150 155 160

Thr Leu Ser Arg Ser Thr Lys Glu Tyr Asn Lys Leu Lys Thr Glu Leu 165 170 175

Ala Lys Glu Lys Glu Lys Ala Ala Lys Met Thr Lys Glu Leu Ala Asp 180 185 190

Lys Leu Ser Asn Ala Glu Ala Ser Arg Asp Lys Ala Phe Ala Val Ser 195 200 205

Lys Asp Leu Ala Asp Lys Leu Ser Ser Ala Glu Ala Ser Arg Asp Lys 210 215 220

Ala Phe Ala Val Ser Lys Asp Leu Ala Asp Lys Leu Ala Ala Lys Thr 225 230 235 240

Ala Glu Ala Glu Lys Leu Met Glu Asn Val Gly Ser Leu Asp Arg Leu 245 250 255

Val Glu Ser Ala Lys Arg Glu Met Ala Gin Lys Leu Ala Glu Ile Asp 260 265 270

Gin Leu Thr Ala Asp Lys Ala Lys Ala Asp Ala Glu Leu Ala Ala Ala 275 280 285

Asn Asp Thr Ile Ala Ser 290 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Streptococcus equi <400> 6 gcggatccga actctgaggt tagtcgt ť» ···· « · 9 9 9 9 · »·· · r ·

9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9· 90 94 90 • · · ·

9 9 ·

9 9 9 9

9 9 9

99 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Streptococcus equi <400> 7 gcggatccat agcttagttt tctttgcg 28 <210>8 <211> 20 <212> DNA <213> Streptococcus equi <400> 8 tgcataaaga agttcctgtc 20 <2I0> 9 <211>20 <212>DNA <213> Streptococcus equi <400> 9 gattcggtaa gagcttgacg

Claims (14)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Sloučenina obsahující sloučeninu se vzorcem: SEQ ID NO 1.
2. 2. Sloučenina nároku 1, která je SEQ ID NO 1.
3. 3. Prokaryotická buňka obsahující sloučeninu podle nároku 1.
4. 4. Eukaryotická buňka obsahující sloučeninu podle nároku 1.
5. 5. Buňka podle nároku 3, která je E. coli.
6. 6. Buňka podle nároku 3, která je Salmonella spp.
7. 7. Sloučenina sevzorcem SEQ ID NO 2 nebo její části.
8. 8. Vakcína obsahující sloučeninu podle nároku 7.
9. 9. Sloučenina podle nároku 7, která je SEQ ID NO 5.
10. 10. Sloučenina podle nároku 9, která je včleněna do liposomu.
11. 11. Sloučenina podle nároku 10, která dále obsahuje B-podjednotku toxinu cholery.
12. 12. Způsob indukce S- e^wz-specifické imunity u koně se vyznačuje tím, že obsahuje sloučeninu podle nároku 9.
13. 13. Způsob identifikace koně infikovaného S. equi vyznačující se tím, že se získá biologický vzorek z koně, připraví se vzorek pro PCR, provede se PCR za použití odpovídajících primerů pro SEQ ID NO 1, elektroforéza konečného produktu a potvrdí se přítomnost nebo nepřítomnost fragmentu o odpovídající velikosti.
14. 14. Způsob podle nároku 13 se vyznačuje tím, že jsou použity primery SEQ ID NO 8 a SEQ

    ID NO 9.