SK16497A3 - Macrophage derived chemokine and chemokine analogs - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa všeobecne týka chemokinov. Konkrétnejšie sa vynález týka purifikovaných a izolovaných polynukleotidov kódujúcich nový ľudský chemokin C-C, purifikovaného a izolovaného chemokinového proteínu kódovaného týmito polynukleotidmi a látok a spôsobov vhodných pre rekombinantnú produkciu tohto nového chemokinového proteínu,,

Doterajší stav techniky

Chemokiny, ktoré sú tiež známe pod označením interkriny a cytokiny SIS predstavujú triedu malých sekretovaných proteínov (skladajúcich sa napríklad zo 70 až 100 aminokyselín a majúcich molekulu s veľkosťou 8 až 10 kDa), ktoré priťahujú a aktivujú leukocyty a tým napomáhajú stimulácii a regulácii imunitného systému. Označenie chemokin je odvodené od združeného pomenovania chemotaktický cytokin a vyjadruje schopnosť týchto proteínov stimulovať chemotaxiu leukocytov. Chemokiny môžu opravdu zahŕňať hlavné atraktanty pre zápalové bunky do patologických tkanív [všeobecný súhrn viď Baggiolini et al., Advances in Immunology, 55: 97 až 179 (1994)]. Bohatým zdrojom chemokinov sú leukocyty ale niekoľko chemokinov je exprimovaných vo veľkom množstve tkanív (pozri hore uvedenú citáciu, tabuľka II).

Už skôr identifikované chemokiny všeobecne vykazujú 20 až 70% vzájomnú aminokyselinovú zhodu (identitu) a obsahujú 4 vysoko konzervované cysteínové zvyšky. Na základe relatívnej polohy prvých dvoch z týchto cysteínových zvyškov sú chemokiny ďalej roztriedené do dvoch podtried. V pod2 triede C-X-C, teda podtriede a, ktorá je kódovaná génmi umiestnenými v ľudskom chromozómu 4, sú prvé dvaja cysteíny od seba oddelené jednou aminokyselinou. V podtriede C-C, teda aj podtriede β, ktorá je kódovaná génmi umiestnenými v ľudskom chromozómu 17, spolu prvé dvaja cysteíny susedia. Róntgenová kryštalografia a štúdie NMR niekoľkých chemokinov ukázali, že v každej triede vytvára prvý a tretí cysteín prvý disulfidový mostík a druhý a štvrtý cysteín druhý disulfidový mostík. Tieto štruktúry silne ovplyvňujú natívnu konformáciu týchto proteínov. U samotného človeka bolo v každej podtriede chemokinov opísaných takmer 10 rozdielnych sekvencií. Chemokiny z obidvoch podtried obsahujú charakteristické vedúce sekvencie s dĺžkou 22 až 25 aminokyselín.

Chemokiny C-X-C, ktoré zahŕňajú 11-8, Gro alfa/beta/gama, základný proteín krvných doštičiek, faktor 4 krvných doštičiek (PF4), IP-10 a iné, vykazujú približne 25% až 60% zhodu pri porovnaní ktorýchkoľvek dvoch aminokyselinových sekvencií, s výnimkou členov Gro alfa/beta/gama, ktoré vzájomne vykazujú zhodu 84 až 88%. Väčšina chemokinov C-X-C (s výnimkou IP-10 a faktoru 4 krvných doštičiek) má spoločný tripeptidový motív E-L-R pred (vzhľadom k smeru expresie) prvými dvoma cysteínovými zvyškami a tieto chemokiny sú silné stimulátory neutrofilov, ktoré vyvolávajú rýchlu zmenu tvaru, chemotaxiu, respiračné ruptúry a degranuláciu. Tieto účinky sú sprostredkované receptormi spojenými s proteínom G, ktoré sa podobajú rodopsinu a vykazujú sedemtransmembránovú doménu (seven-transmembrane-domain rhodopsin-like G proteín-coupled receptors). Receptory špecifické pre 11-8 boli klonované Holmesom et al. (Science 253: 1278 až 1280, 1991), pričom podobný receptor (77% zhoda), ktorý rozpoznáva 11-8, Gro a NAP2 bol tiež klonovaný (Murphy a Tiffany, Science, 253: 1280 až 1283, 1991). Postupné skracovanie N-terminálnej aminokyselinovej sekvencie určitých chemokinov C-X-C, vrátane 11-8 je spojené s významným zvýšením ich účinnosti.

Chemokiny C-C, ktoré zahŕňajú makrofágové zápalové proteíny (Macrophage Inflammatory Proteins) ΜΙΡ-Ια a ΜΙΡ-1β, monocytové chemoatraktantové proteíny 1, 2 a 3 (MCP-1/2/3), RAŇTES, 1-309 a iné, vykazujú 25% až 75% vzájomnú aminokyselinovú zhodu. Všetky zo skôr identifikovaných chemokinov C-C aktivujú monocyty, vyvolávajú vápnikový tok a chemotaxiu. Selektívnejšie účinky sú pozorované v prípade lymfocytov, napríklad T-lymfocytov, ktoré najlepšie zodpovedajú na RANTES. Receptory spojené s proteínom G, ktoré vykazujú sedemtransmembránovú doménu (seven-transmembranedomain G proteín-coupled receptors) pre chemokiny C-C už boli klonované, vrátane C-C chemokinového receptoru-1 (CCR1), ktorý rozpoznáva ΜΙΡ-Ια a RANTES (Neote et al.,

Celí, 72: 415 až 425, 1993) a receptoru CCR2, ktorý rozpoznáva MCP-1 (Charo et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 91: 2752 až 2756, 1994), CCR3, ktorý rozpoznáva eotaxin (Combadiere,

J. Biol. Chem., 270: 16491, 1995), CCR4, ktorý rozpoznáva ΜΙΡ-Ια, RANTES a MCP-1 (Power et al., J. Biol. Chem. 270: 19495, 1995) a CCR5, ktorý rozpoznáva ΜΙΡ-Ια, MIP-Ιβ a RANTES (Samson et al., Biochemistry, 35: 3362, 1996).

Úloha radu chemokinov, najmä 11-8, pri rôznych patologických stavoch už bola dobre dokumentovaná (všeobecný prehlad je možné nájsť v hore citovanej publikácii Baggiolini et al., pozri najmä tabuľku VII). S nadprodukciou 11-8 je napríklad spojovaná psoriáza a podľa niekoľkých štúdií bola pozorovaná vysoká hladina 11-8 v synoviálnej tekutine zapálených kĺbov pacientov postihnutých reumatickými chorobami, osteoartritídou a dnou.

Tiež úloha chemokinov C-C pri patologických stavoch je dobre dokumentovaná, aj keď menej podrobne ako úloha 11-8.

Tak napríklad koncentrácia MCP-1 v synoviálnej tekutine je u pacientov postihnutých reumatoidnou artritídou vyššia ako u pacientov postihnutých inými artritickými chorobami. MCP-1dependentný influx jednojadrových fagocytov môže byt dôležitý pri vývoji idiopatickej pľúcnej fibrózy. Úloha chemokinov C-C pri verbovaní monocytov do aterosklerotických oblastí je v súčasnosti predmetom intenzívneho záujmu; expresia MCP-1 bola detegovaná v arteriálnych stenách bohatých na makrofágy, ale nie ne v normálnom arteriálnom tkanivu. Bolo ukázané, že expresia MCP-1 v maligných bunkách potlačuje schopnosť týchto buniek vytvárať nádory in vivo (viď US patent č. 5 179 078; táto citácia je tu uvádzaná náhradou za prenesenie jej celého obsahu do opisu tohto vynálezu). Existuje preto potreba identifikovať a charakterizovať ďalšie chemokiny C-C, aby sa ďalej objasnila úloha tejto dôležitej triedy molekúl pri patologických stavoch a aby bolo možné vyvinúť zlepšené spôsoby liečenia takých stavov pri použití produktov odvodených od chemokinov.

Bolo tiež ukázané, že chemokiny z podtriedy C-C sú použiteľné pri zobrazovaní v odbore lekárstva, napríklad pri zobrazovaní miest infekcie, zápalu a iných miest, v ktorých sa vyskytujú receptorové molekuly pre chemokiny C-C (viď napríklad Kulkel et al., US patent č. 5 413 778; táto citácia je tu uvádzaná náhradou za prenesenie jej celého obsahu do opisu tohto vynálezu). Pri týchto metódach sa chemicky pripojí značiace činidlo (napríklad rádioaktívny izotop) k chemokinu C-C pri použití techník známych v tomto odbore (pozri napríklad US patenty č. 4 965 392 a 5 037 630; tieto citácie sú tu uvádzané náhradou za prenesenie ich celého obsahu do opisu tohto vynálezu), značený chemokin vo farmaceutický vhodnom nosiči sa podá subjektu, potom sa nechá značený chemokin akumulovať v cieľovom mieste a nakoniec sa v cieľovom mieste značený chemokin in vivo zobrazí. V tomto odbore existuje potreba vyvinúť ďalšie nové chemokiny C-C pre rozšírenie arzenálu zobrazovacích prostriedkov v lekárstve.

Bolo už tiež ukázané, že chemokiny z podtriedy C-C, RANTES, MIP-a a MIP-Ιβ sú hlavnými mediátormi potlačovacieho účinku ľudských T-buniek proti vírusu imunitnej nedostatočnosti HIV, čo je činidlo zodpovedné za vyvolanie syndrómu získanej imunitnej nedostatočnosti (AIDS). Tieto chemokiny vykazujú schopnosť inhibovať, v rozsahu, ktorý je závislý od dávky, schopnosť špecifických kmeňov HIV infikovať kultivované línie T-buniek (Cocchi et al., Science, 270: 1811, 1995). Všetky skúšané kmene tohto vírusu však nie sú rovnako susceptibilné voči tejto inhibícii a existuje preto potreba nájsť ďalšie chemokiny C-C pre použitie ako inhibítory kmeňov HIV.

S ohľadom na dôležitosť chemokinov ako mediátorov chemotaxie a zápalu existuje tiež potreba identifikovať a izolovať nové členy triedy chemokinov, aby bolo možné uľahčovať moduláciu zápalových a imunitných odpovedí.

Tak napríklad látky, ktoré povzbudzujú zápal môžu povzbudzovať hojenie rán alebo rýchlosť zotavovaní z takých chorôb ako je zápal pľúc, kde je zápal dôležitý pre vykorenenie infekcie. Modulácia zápalu je podobne dôležitá pri patologických stavoch, ktoré sa prejavujú zápalom. Jedným takým patologickým stavom je Crohnova choroba, ktorá sa prejavuje chronickým zápalom všetkých vrstiev čreva, bolesťou a diarheou. Stupeň zlyhania terapie pri použití liečiv je pri Crohnovej chorobe pomerne vysoký a choroba sa často vraciava i u pacientov podrobených chirurgickému zásahu. Identifikácia, izolácia a charakterizácia nových chemokinov uľahčuje moduláciu zápalu.

Podobne tiež látky, ktoré indukujú imunitnú odpoveď, môžu mat značný vplyv na dosiahnutie úľavy alebo hojenie radu patologických stavov, vďaka dôležitej roli leukocytov (napríklad neutrofilov a monocytov) pri imunitných odpovediach sprostredkovaných bunkami a vďaka zavedenej roli chemokinov pri chemotaxii leukocytov existuje potreba identifikovať a izolovať nové chemokiny pre uľahčenie modulácie imunitných odpovedí.

Okrem toho, zistená korelácia medzi expresiou chemoki nu a zápalovými stavmi a chorobami predstavuje potenciál pre diagnostické a prognostické indikácie použitia chemokinov, ako tiež protilátok, ktoré sú s chemokinmi špecificky imunoreaktívne. I preto existuje potreba identifikovať a izolovať nové chemokiny pre uľahčenie takých diagnostických a prognostických indikácií.

Niektoré chemokiny, ako napríklad 11-8, okrem svojej schopnosti priťahovať a aktivovať leukocyty, sú tiež schopné ovplyvňovať proliferáciu iných buniek ako leukocytov (viď Tuschil, J. Invest. Dermatol. 99, 294 až 298, 1992). Existuje pre to potreba identifikovať a izolovať nové chemokiny pre uľahčenie modulácie takej proliferácie buniek.

Z všetkých hore uvedených dôvodov existuje preto potreba vyvinúť rekombinantné spôsoby produkcie novo objavených chemokinov. Tieto rekombinantné spôsoby potom ďalej uľahčia klinické aplikácie chemokinov a ich inhibítorov.

Podstata vynálezu

Vynález je zameraný na nové purifikované a izolované polynukleotidy a polypeptidy, ktoré splňujú jednu alebo viacej hore uvedených potrieb.

Jedným aspektom tohto vynálezu sú purifikované a izolované polynukleotidy (tzn. DNA a RNA, a to ako kódujúce, tak nekódujúce retazce), ktoré kódujú nový ludský chemokin z podtriedy C-C, ktorý je v tomto texte označovaný názvom chemokin pochádzajúci z makrofágov (Macrophage Derived Chemokine), skrátene MDC. Prednostné sekvencie DNA podlá vynálezu zahŕňajú sekvencie genómovej DNA a cDNA a chemicky syntetizované sekvencie DNA.

Nukleotidová sekvencia cDNA označená názvom MDC cDNA, ktorá kóduje tento chemokin, je znázornená v SEQ ID NO: 1. Táto sekvencia zahŕňa 5' a 3' nekódujúce sekvencie. Prednostná DNA podlá vynálezu zahŕňa nukleotidy 20 až 298 zo SEQ ID NO: la tieto nukleotidy zahŕňajú kódujúcu sekvenciu MDC.

Proteín MDC obsahuje putatívnu 24-aminokyselinovú signálnu sekvenciu pri svojom aminokonci. Prednostná DNA podlá vynálezu obsahuje nukleotidy 92 až 298 zo sekvencie SEQ ID NO: la tieto nukleotidy zahŕňajú putatívnu kódujúcu sekvenciu maturovaného (sekretovaného) proteínu MDC bez signálnej sekvencie.

Aminokyselinová sekvencia chemokinu MDC je uvedená na SEQ ID NO: 2. Prednostné polynukleotidy podlá tohto vynálezu zahŕňajú okrem polynukleotidov opísaných hore tiež polynukleotidy, ktoré kódujú aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 2a ktoré sa líšia od polynukleotidov opísaných v predchádzajúcich odsekoch len dobre známou degeneráciou svojho genetického kódu.

Podobne, pretože 24 aminokyselín (polohy -24 až -1) SEQ ID NO: 2 zahŕňa putatívny signálny peptid, ktorý sa odštepuje za vzniku maturovaného chemokinu MDC, zahŕňajú prednostné polynukleotidy podlá vynálezu tiež polynukleo8 tidy, ktoré kódujú aminokyseliny 1 až 69 zo SEQ ID NO: 2. Prednostným polynukleotidom je teda purifikovaný polynukleotid kódujúci polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu, ktorá zahŕňa aminokyseliny 1 až 69 zo sekvencie SEQ ID NO: 2.

Z použití polynukleotidov podľa tohto vynálezu je možné uviesť použitie ako hybridizačnej próby pre identifikáciu a izoláciu genómovej DNA kódujúcej humánny MDC. Taký gén bude mat pravdepodobne štruktúru zahŕňajúcu tri exony a dva introny, táto štruktúra je charakteristická pre gény chemokinov C-C (vid Baggiolini et al., hore uvedená citácia); identifikáciu a izoláciu DNA majúcich sekvencie kódujúce iné ako ľudské proteíny homologické vzhľadom k MDC; a identifikáciu buniek, ktoré exprimujú MDC, ako tiež vymedzenie podmienok, za akých je tento proteín exprimovaný.

Hybridizačné próby podľa vynálezu je tiež možné použiť v diagnostike, napríklad pri hľadaní zápalov v ľudskom tkanivu, napríklad v tkanivu tlstého čreva. Hybridizačné štúdie pri použití MDC polynukleotidovej hybridizačnej próby sú schopné odlíšiť tkanivo tlstého čreva pacientov s Crohnovou chorobou (v tom prípade je MDC hybridizácia detegovaná v epitheliu, lamina propria, Payerových ložiskách a hladkom svalstve) od tkaniva tlstého čreva normálneho človeka (v tomto prípade nie je hybridizácia vyššia ako pozadí).

Všeobecne je možné povedať, že ako hybridizačná próba podľa vynálezu je užitočná súvislá časť MDC cDNA podľa vynálezu obsahujúca aspoň asi 14 nukleotidov a prednostne asi 18 nukleotidov. Jedným aspektom tohto vynálezu je teda DNA zahŕňajúca súvislú časť nukleotidovej sekvencie SEQ ID NO: 1 alebo nekódujúceho reťazca, ktorý je k tejto sekvencii komplementárny a táto súvislá časť obsahuje aspoň 18 nukleotidov, pričom táto DNA je schopná hybridizovat za strin9 gentných podmienok ku kódujúcemu alebo nekódujúcemi reťazcu ludského MDC génu. Pokiaľ sa majú hybridizačné próby podlá vynálezu použiť pre diagnostické účely, vykazujú prednostne hybridizačnú špecificitu voči sekvenciám génu MDC. V prednostnom rozpracovaní teda DNA podlá vynálezu, ktoré tvoria hybridizačné próby, nehybridizujú za stringentných podmienok k iným génom chemokinov človeka, napríklad génom MCP-1, génom MCP-2, génom RANTES, génom ΜΙΡ-Ια, génom ΜΙΡ-Ιβ, génom 1-309 apod.

Podlá ďalšieho aspektu je predmetom vynálezu purifikovaný polynukleotid, ktorý za stringentných podmienok hybridizuje k nekódujúcemu reťazcu DNA so sekvenciou SEQ ID NO: 1. Podobne je predmetom vynálezu tiež purifikovaný polynukleotid, ktorý by, keby nebolo redundancie genetického kódu hybridizoval za stringentných podmienok k nekódujúcemu reťazcu DNA so sekvenciou SEQ ID NO: 1. Ako príklad stringentných hybridizačných podmienok je možné uviesť tieto podmienky: hybridizácia pri 42’C v 5X SSC, 20mM fosforečnane sodnom s pH 6,8, 50% formamidu a premývanie pri 42°C pri použití 0,2X SSC. Odborníkom v tomto odbore je zrejmé, že je žiadúce meniť tieto podmienky empiricky s ohladom na dĺžku a obsah nukleotidovej bázy GC v sekvenciách, ktoré majú byť hybridizované a že existujú vzorce pre určenie takých variácií (pozri napríklad Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Mannual, 2. vydanie, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

Ďalším aspektom tohto vynálezu sú plazmidové a vírusové DNA vektory obsahujúce DNA podlá vynálezu, ktoré boli opísané hore, vrátane akýchkoľvek DNA uvedených kdekolvek v tomto opise. Prednostné vektory zahŕňajú expresné vektory, v ktorých je zavedená cDNA, ktorá kóduje MDC operatívne pripojená k endogénnej alebo heterolognej sekvencii riadiacej expresiu. Také expresné vektory môžu ďalej zahŕňať sekvencie DNA kódujúce polypeptid, ktoré sú operabilne pripojené k sekvenciám DNA kódujúcim MDC. Tieto vektory je možné exprimovať a získa sa pritom fúzovaný proteín obsahujúci MDC polypeptid, ktorý je predmetom záujmu.

Ďalším aspektom tohto vynálezu sú prokaryontné alebo eukaryontné hostitelské bunky, ktoré sú stabilne transfekované alebo transformované DNA alebo vektorom podlá tohto vynálezu. V prednostných hostitelských bunkách sa exprimuje matúrovaný MDC polypeptid kódovaný DNA alebo vektorom podlá tohto vynálezu. DNA, vektory a hostitelské bunky podlá tohto vynálezu sú užitočné napríklad pri spôsoboch rekombinantnej produkcie velkých množstiev polypeptidov MDC podlá tohto vynálezu. I samotné tieto spôsoby spadajú do rozsahu tohto vynálezu. Predmetom vynálezu je teda napríklad tiež spôsob produkcie MDC, pri ktorom sa hostitelská bunka podlá vynálezu pestuje vo vhodnom živnom médiu a z buniek alebo z média sa izoluje MDC proteín.

Ešte ďalším aspektom tohto vynálezu sú purifikované a izolované MDC polypeptidy. Prednostným peptidom je purifikovaný chemokinový polypeptid majúci aminokyselinovú sekvenciu zahŕňajúcu aminokyseliny 1 až 69 zo sekvencie SEQ ID NO: 2. Polypeptidy podlá vynálezu je možné purifikovat z prírodných zdrojov, ale prednostne sa produkujú rekombinantnými postupmi pri použití rôznych DNA, vektorov a/alebo hostitelských buniek podlá vynálezu. Pripraviť je možné ich aj chemickou syntézou. Purifikované polypeptidy podlá vynálezu môžu byt glykozylované alebo neglykozylované, môžu byť vo vode rozpustné alebo nerozpustné, môžu byt oxidované alebo redukované apod. v závislosti od zvolenej hostitelskéj bunky, metódy rekombinantnej produkcie, izolačnej metódy, spracovania, tlmivého roztoku zvoleného pre uskladnenie apod.

Predmetom vynálezu sú tiež polypeptidové analógy MDC, v ktorých sú pri MDC polypeptide podlá tohto vynálezu jeden alebo viaceré aminokyselinové zvyšky pridané, vypustené alebo nahradené, za predpokladu, že si také analógy zachovávajú jednu alebo viaceré biologické účinnosti, ktoré sú charakteristické pre chemokiny C-C. Malá velkost MDC umožňuje chemickú syntézu takých polypeptidových analógov. Pripravené analógy je možné podrobiť screeningu na biologické aktivity MDC (napríklad schopnosť indukovať makrofágovú chemotaxiu alebo inhibovat monocytovú chemotaxiu) pri použití celého radu stanovení aktivity, ktorá je charakterizovaná v tomto opise. Alternatívne je možné také polypeptidové analógy produkovať rekombinantnou cestou pri použití dobre známych postupov, ako je miestne orientovaná mutagenéza DNA kódujúcej MDC podlá tohto vynálezu.

Podobným aspektom tohto vynálezu sú polypeptidové analógy, v ktorých sú jeden alebo viaceré aminokyselinové zvyšky pridané, vypustené alebo nahradené vzhladom k MDC polypeptidom podlá tohto vynálezu, pričom také analógy síce nevykazujú biologické aktivity chemokinov C-C alebo MDC, ale sú schopné kompetitívnej alebo nekompetitívnej inhibície väzby MDC polypeptidov k receptoru chemokinu C-C. Také polypeptidy sú napríklad užitočné pre moduláciu biologickej aktivity endogénneho MDC v hostitelovi a sú tiež užitočné pre zobrazovacie postupy v lekárstve, ktoré boli zmienené hore.

Pri určitých špecifických analógoch MDC sa predpokladá modulácia štruktúry, intermolekulárnych väzbových charakteristík a biologických účinností MDC. Tak napríklad, zmena štruktúry a funkcie MDC sa špecificky predpokladá pri analógoch vzniknutých deléciou u aminokonca a karboxylového konca (N-terminálnych a C-terminálnych skrátených analógov).

Do rozsahu vynálezu qpadajú ďalej nasledujúce špecifické alterácie jednotlivých aminokyselín (jednopočetné alebo kombinované):

1) nahradenie zvyšku bázickej arginínovej a/alebo lyzínovej aminokyseliny v polohe 24 a 27 sekvencie SEQ ID NO: 2 zvyškom nebázickej aminokyseliny;

2) nahradenie tyrozínového zvyšku v polohe 30 sekvencie SEQ ID NO: 2, tryptofánového zvyšku v polohe 59 sekvencie SEQ ID NO: 2 a/alebo valínového zvyšku v polohe 60 sekvencie SEQ ID NO: 2 zvyškom nabitej alebo polárnej aminokyseliny (napríklad serínu, lyzínu, arginínu, histidínu, aspartátu, glutamátu, asparagínu, glutamínu alebo cysteínu); a

3) nahradenie zvyšku glutámovej kyseliny v polohe 50 sekvencie SEQ ID NO: 2 zvyškom bázickej alebo malej nenabitej aminokyseliny (napríklad lyzínu, arginínu, histidínu, glycínu alebo alanínu).

Špecifické analógy zahŕňajúce tieto alterácie aminokyselín spadajú do rozsahu sekvencie SEQ ID NO: 25, ktorá je znázornená ďalej.

Met Ala Arg Leu Gin Thr Ala Leu Leu Val Val Leu Val Leu Leu Ala

-24 -20 -15 -10

Val Ala Leu Gin Ala Thr Glu Ala Gly Pro Tyr Gly Ala Aen Met Clu

-5 1 5

Asp Ser Val Cys Cya Arg Asp Tyr Val Arg Tyr Arg Leu Pro Leu Xaa 10 15 20

Val Val Xaa Hie Phe Xaa Trp Thr Ser Abp Ser Cys Pro Arg Pro Gly 25 30 35 40

Val Val Leu Leu Thr Phe Arg Asp Lys Xaa íle Cys Ala Asp Pro Arg 45 50 55

Val Pro Xaa Xaa Lye Met íle Leu Aen Lye Leu Ser Gin 60 65 kde aminokyselina v polohe 24 je zvolená zo súboru zahŕňajúceho arginín, glycín, alanín, valín, leucín, izoleucín, prolín, serín, treonín, fenylalanín, tyrozín, tryptofán, aspartát, glutamát, asparagín, glutamín, cysteín a metionín;

aminokyselina v polohe 27 je nezávisle zvolená zo súboru zahŕňajúceho lyzín, glycín, alanín, valín, leucín, izoleucín, prolín, serín, treonín, fenylalanín, tyrozín, tryptofán, aspartát, glutamát, asparagín, glutamín, cysteín a metionín;

aminokyselina v polohe 30 je nezávisle zvolená zo súboru zahŕňajúceho tyrozín, serín, lyzín, arginín, histidín, aspartát, glutamát, asparagín, glutamín a cysteín;

aminokyselina v polohe 50 je nezávisle zvolená zo súboru zahŕňajúceho kyselinu glutámovú, lyzín, arginín, histitín, glycín a alanín;

aminokyselina v polohe 59 je nezávisle zvolená zo súboru zahŕňajúceho tryptofán, serín, lyzín, arginín, histidín, aspartát, glutamát, asparagín, glutamín a cysteín; a aminokyselina v polohe 60 je nezávisle zvolená zo súboru zahŕňajúceho valín, serín, lyzín, arginín, histidín, aspartát, glutamát, asparagín, glutamín a cysteín.

Pri takých polypeptidových analógoch MDC sa predpokladá schopnosť špecifickej modulácie väzbových charakte ristík MDC k receptorom chemokinu a/alebo iným molekulám (napríklad heparínu, glykosaminoglykánom, erytrocytovým receptorom chemokinov), ktoré sú považované za dôležité pri prezentácii MDC k jeho receptoru. V jednom prednostnom rozpracovaní zahŕňajú analógy polypeptidu MDC podlá vynálezu aminokyseliny 1 až 69 zo sekvencie SEQ ID NO: 25.

Tiež boli syntetizované nasledujúce ďalšie analógy, ktoré rovnako spadajú do rozsahu tohto vynálezu:

a) polypeptid obsahujúci sekvenciu aminokyselín identifikovanú polohami 1 až 70 zo SEQ ID NO: 30;

b) polypeptid obsahujúci sekvenciu aminokyselín identifikovanú polohami 9 až 69 zo SEQ ID NO: 2;

c) polypeptid obsahujúci sekvenciu aminokyselín identifikovanú polohami 1 až 69 zo SEQ ID NO: 31; a

d) polypeptid obsahujúci sekvenciu aminokyselín identifikovanú polohami 1 až 69 zo SEQ ID NO: 32.

Do rozsahu tohto vynálezu tiež spadajú purifikované a izolované polynukleotidy kódujúce tieto analógy polypeptidu MDC. Tieto polynukleotidy sú užitočné napríklad pre rekombinantnú produkciu polynukleotidov MDC. Podobne spadajú do rozsahu tohto vynálezu tiež prokaryontné a eukaryontné hostiteľské bunky, ktoré sú stabilne transformované takými DNA alebo vektormi.

Ďalším aspektom tohto vynálezu sú protilátky (napríklad monoklonálne a polyklonálne protilátky, jednoretazcovej protilátky, chimerickej a humanizovanej protilátky apod.), ktoré sú imunoreaktívne s polypeptidmi MDC a ich analógy podľa tohto vynálezu. Tieto protilátky sú užitočné napríklad pri purifikácii polypeptidov podľa vynálezu, pre kvantitatívne meranie endogénneho MDC v hostiteľovi, napríklad pri použití dobre známych techník ELISA a pre moduláciu väzby MDC k jeho receptoru alebo receptorom. Do rozsahu vynálezu ďalej spadajú tiež hybridomálne bunečné línie produkujúce protilátky podľa tohto vynálezu.

Rekombinantné polypeptidy MDC a ich polypeptidové analógy podľa tohto vynálezu sa môžu používať podobným spôsobom ako protilátky pri väzbových reakciách pre identifikáciu buniek exprimujúcich receptor alebo receptory MDC a pri štandardných expresných klonovacích technikách za účelom izolácie polynukleotidov kódujúcich taký receptor alebo receptory. Také polypeptidy MDC, analógy polypeptidov MDC a MDC receptorové polypeptidy sú užitočné pre moduláciu MDC chemokinovej účinnosti a pre identifikáciu polypeptidu a chemického činidla (napríklad malé molekuly), ktorý je agonistom alebo antagonistom MDC.

Ďalšie aspekty tohto vynálezu sa vzťahujú k farmaceutickému využitiu polypeptidov MDC a analógov polypeptidov MDC podľa tohto vynálezu. Tak napríklad bolo ukázané, že MDC moduluje chemotaxiu leukocytov. Najmä bolo ukázané, že MDC indukuje chemotaxiu makrofágov a inhibuje chemotaxiu monocytov. Jedným aspektom tohto vynálezu je teda spôsob modulácie (napríklad regulácie smerom hore alebo dole) chemotaxie leukocytov v cicavcovi-hostiteľovi, ktorého podstata spočíva v tom, že zahŕňa stupeň podania MDC polypeptidu alebo polypeptidového analógu MDC podľa vynálezu, pričom tento polypeptid MDC alebo polypeptidový analóg MDC moduluje chemotaxiu leukocytov v hostiteľovi. V prednostných rozpracovaniach sú leukocyty tvorené monocytmi a/alebo makrofágmi. Tak napríklad sa podáva empiricky stanovené množstvo MDC (napríklad vo farmaceutický vhodnom nosiči) za účelom indukcie chemotaxie makrofágov alebo inhibície chemotaxie monocytov. Inhibičné analógy MDC polypeptidov sa používajú na dosiahnutie opačného účinku.

Ďalším aspektom tohto vynálezu je spôsob paliatívneho ošetrenia zápalového stavu pacienta, tento stav je charakterizovaný aspoň i) chemotaxiou monocytov smerom k miestu zápalu v organizmu pacienta a/alebo ii) proliferáciou fibroblastových buniek, ktorého podstata spočíva v tom, že sa pacientovi podá terapeuticky účinné množstvo MDC. Podlá jedného rozpracovania sa za terapeuticky účinné množstvo MDC považuje množstvo tejto látky, ktoré je schopné inhibovat chemotaxiu monocytov. V inom rozpracovaní sa za terapeuticky účinné množstvo MDC považuje množstvo tejto látky, ktoré je schopné inhibovať proliferáciu fibroblastových buniek. Také terapeuticky účinné množstvá sa stanovia empiricky pri použití dobre známych stanovení závislosti vyvolanej odpovedi na podanej dávke.

Ďalším aspektom tohto vynálezu sú farmaceutické prostriedky obsahujúce polypeptidy MDC alebo ich analógy podlá tohto vynálezu vo farmaceutický vhodnom nosiči. Podobne je predmetom vynálezu aj použitie prostriedkov podlá vynálezu na liečbu chorobných stavov, napríklad zápalových chorôb. Podlá jedného rozpracovania je zápalový chorobný stav charakterizovaný chemotaxiou monocytov smerom k miestu zápalu v tele pacienta postihnutého týmto chorobným stavom. Podlá iného rozpracovania je zápalový chorobný stav charakterizovaný proliferáciou fibroblastových buniek v tele pacienta postihnutého týmto chorobným stavom.

Hore uvedené aspekty a početné ďalšie aspekty tohto vynálezu budú zrejmé z pripojených výkresov a podrobného opisu, ktorý nasleduje.

Prehľad obr. na výkresoch

Na obr. 1 je uvedené porovnanie aminokyselinovej sekvencie humánneho MDC (SEQ ID NO: 2) s aminokyselinovými sekvenciami iných, prv charakterizovaných ľudských chemokinov C-C: MCP-3 [Van Damme et al., J. Exp. Med., 176: 59 (1992)] (SEQ ID NO: 18); MCP-1 [Matsushima et al., J. Exp. Med., 169: 1485 (1989)] (SEQ ID NO: 19); MCP-2 (maturovaná forma) [Van Damme, hore uvedená citácia; Chang et al., Int. Immunol., 1:388 (1989)] (SEQ ID NO 20); RANTES [Schall et al., J. Immunol., 141: 1018 (1988)] (SEQ ID NO: 21); ΜΙΡ-1β [Brown et al., J. Immunol., 142:679 (1989)] (SEQ ID NO:

22); ΜΙΡ-Ια [Nakao et al., Mol. Celí Biol., 10:3646 (1990)] (SEQ ID NO: 23); a 1-309 [Miller et al., J. Immunol., 143: 2907 (1989] (SEQ ID NO: 24). Zlomková čiara / označuje miesto, v ktorom sa odštepujú putatívne signálne peptidy, pomlky sú vložené pre optimalizáciu zákrytu sekvencií.

Na obr. 2 je znázornený graf opisujúci chemotaktický účinok (meraný v jednotkách fluorescencie) zvyšujúcich sa koncentrácií MDC na migráciu ľudských jednojadrových buniek pri stanovení chemotaxie. Plné krúžky ukazujú odpoveď ľudských jednojadrových buniek pochádzajúcich z bunečnej línie THP-1. Prázdne kosoštvorce ukazujú odpoveď na pozitívnu kontrolu, sérum aktivované zymosanom (ZAS).

Na obr. 3 je znázornený graf opisujúci chemotaktický účinok (meraný v jednotkách fluorescencie) zvyšujúcich sa koncentrácií MDC na migráciu ľudských polymorfonukleárnych pmn leukocytov. Plné krúžky ukazujú odpoveď na MDC a prázdne kosoštvorce ukazujú odpoveď na pozitívnu kontrolu, 11-8.

Na obr. 4 je znázornený graf opisujúci chemotaktický účinok (meraný v jednotkách fluorescencie) zvyšujú18 cich sa koncentrácií MDC na migráciu makrofágov a monocytov. Plné krúžky ukazujú odpoveď na MDC pri makrofágoch pochádzajúcich z bunečnej línie THP-1 a prázdne kosoštvorce ukazujú odpoveď na MDC pri monocytoch pochádzajúcich z bunečnej línie THP-1.

Na obr. 5 je znázornený graf opisujúci chemotaktický účinok (meraný v jednotkách fluorescencie) zvyšujúcich sa koncentrácií MDC na migráciu peritoneálnych makrofágov morčaťa. Plné krúžky ukazujú odpoveď na MDC pri makrofágoch. Prázdny trojuholník ukazuje odpoveď v prípade pozitívneho kontrolného pokusu, pri ktorom sa použije sérum aktivované zymosanom (ZAS).

Na obr. 6 je znázornený graf opisujúci inhibičný účinok na chemotaxiu (meraný v jednotkách fluorescencie) zvyšujúcich sa koncentrácií MDC na migráciu monocytov THP-1 indukovanú MCP-1. Plné krúžky označujú inhibičné účinky MDC na chemotaxiu indukovanú MCP-1. Prázdne krúžky opisujú inhibičné účinky MDC na chemotaxiu pri kontrolnom pokuse, pri ktorom sa použije základné médium (RPMI s 0,2% BSA, tzn. RBSA, ale bez MCP-1). Nulový bod na ose x zodpovedá odpovedi buniek na MCP-1 a RBSA v neprítomnosti MDC.

Na obr. 7 je znázornený graf opisujúci účinok (meraný v cpm, tzn. rozpadoch za minútu) zvyšujúcich sa koncentrácií MDC na proliferáciu fibroblastov. Plné krúžky ukazujú proliferatívnu odpoveď s purifikovaným MDC, ktorý bol rekombinantné produkovaný v bunkách CHO (príklad 10F). Prázdne krúžky ukazujú odpoveď na chemicky syntetizovaný MDC (príklad 11).

Na obr. 8 je schematicky znázornená konštrukcia expresného vektoru cicavca pDCl.

Príklady rozpracovania vynálezu

Vynález je ilustrovaný v nasledujúcich príkladoch, ktoré sa vzťahujú k íudskej cDNA označenej skratkou MDC cDNA, ktorá kóduje nový C-chemokin označený skratkou MDC (Macrophage Derived Chemokine, tzn. chemokin pochádzajúci z makrofágov). Príklad 1 konkrétne opisuje izoláciu časti MDC cDNA z cDNA knižnice ludského makrofágu. Príklad 2 opisuje izoláciu prídavných cDNA z cDNA knižnice pri použití cDNA z príkladu 1, ako próby. Jedna z týchto prídavných cDNA obsahuje úplnú MDC kódujúcu sekvenciu. V príklade2 je navyše uvedená zložená MDC cDNA nukleotidová sekvencia a je tu charakterizovaná dedukovaná aminokyselinová sekvencia chemokinu (MDC), ktorý je touto nukleotidovou sekvenciou kódovaný. V príklade 3 sú opísané experimenty ukazujúce hladinu expresie MDC génu v rôznych ludských tkanivách. Najväčšia expresia MDC génu bola pozorovaná v tkanivu týmusu, ovela slabšia expresia bola zistená v tkanivách sleziny a píúc. Príklad 4 opisuje expresiu génu MDC behom maturácie monocytov na makrofágy a behom indukcie diferenciácie buniek HL60 na bunečný typ podobajúci sa makrofágu.

Napriek tomu, že bola expresia génu MDC detegovaná v týmusu a slezine (pozri príklad 3), boli vykonané in situ hybridizačné štúdie za účelom ďalšej lokalizácie expresie génu MDC v týchto tkanivách. In situ hybridizácia ukázala koreláciu medzi zvýšenou expresiou génu MDC v črevnom tkanivu a Crohnovou chorobou. Tieto in situ hybridizačné pokusy sú opísané v príklade 5.

Príklad 6 opisuje rekombinantnú produkciu MDC, ako fúzovaného proteínu GST-MDC v prokaryontných bunkách, ako tiež štiepenie tohto fúzovaného proteínu a purifikáciu rekombinantného MDC. Príklad 7 opisuje konštrukciu alter20 natívneho DNA konštruktu, ktorý je užitočný pre expresiu rekombinantného proteínu MDC a opisuje produkciu MDC v bakteriálnom hostiteľovi, ktorý bol transformovaný týmto konštruktom.

V príklade 8 sú uvedené experimentálne protokoly purifikácie rekombinantného MDC produkovaného spôsobom opísaným v príklade 7. Príklady 9 a 10 obsahujú experimentálne protokoly pre rekombinantnú produkciu MDC v kvasinkách a bunkách cicavcov. Príklad 10 obsahuje protokoly purifikácie rekombinantného MDC. Príklad 11 opisuje produkciu MDC a MDC polypeptidových analógov peptidovou syntézou.

Príklady 12 až 17 obsahujú protokoly pre stanovenie biologických aktivít MDC. Tak napríklad príklad 12 obsahuje opis stanovenia účinkov MDC na bazofily, žírne bunky a eosinofily. Príklad 13 opisuje stanovenie vlastností MDC, ako chemoatraktantu a vlastnosti MDC pri aktivácii buniek. Pri posledne uvedených stanoveniach sa používajú monocyty/makrofágy, neutrofily a granulocyty.

Príklady 14 až 17 obsahujú protokoly stanovenia biologických účinností MDC in vivo. V príklade 14 je opísané stanovenie inhibičných vlastností MDC na rast nádorov.

V príkladoch 15 až 16 sú uvedené protokoly pre stanovenie účinnosti MDC pri intraperitoneálnom a subkutánnom injekčnom podaní. V príklade 17 sú uvedené protokoly pre stanovenie myelosupresívnej aktivity MDC.

Príklad 18 obsahuje protokol pre vytváranie monoklonálnych protilátok, ktoré sú špecificky imunoreaktívne s MDC.

Ostatné príklady obsahujú prídavné stanovenia účinnosti MDC. Tak napríklad príklad 19 obsahuje opis stanovení vápnikového toku za účelom zistenia schopnosti MDC indukovať aktivácii buniek. Príklad 20 obsahuje opis stanovenia účinnosti MDC proti HIV a antiproliferatívnej účinnosti MDC.

V príklade 21 sú ukázané antiproliferatívne účinky MDC na fibroblasty. Príklad 22 obsahuje opis in vitro skúšok pre zistenie účinkov MDC na proliferáciu ďalších typov buniek. Príklad 23 obsahuje opis in vivo skúšky vykonávanej za účelom stanovenia antiproliferatívnych účinkov MDC na fibroblasty. Príklad 24 obsahuje opis stanovení zameraných na identifikáciu MDC modulátorov.

Príklad 1

Izolácia časti cDNA C-C chemokiníi

Čiastková cDNA nového C-C chemokinu bola izolovaná ďalej uvedeným spôsobom. Z makrofágov pochádzajúcich z monocytov periférnej krvi sa zoberie poly A⁺ RNA. Pri použití súpravy Invitrogen Copy Kit (San Diego, Kalifornia, USA) sa vytvorí dvojretazcová cDNA s tupými koncami, k tejto cDNA sa ligujú adaptéry BstXI a potom sa vykoná inzercia do expresného vektoru cicavca, pRc/CMV (Invitrogen) [viď Tjoelker et al., Náture, 374: 549 až 552 (1955)]. Baktéria E. coli, XLl-Blue (Stratagene, La Jolla, Kalifornia, USA) sa transformuje elektroporáciou cDNA knižnicou tohto plazmidu a potom sa navzorkuje na 986 misiek obsahujúcich 100 μg/ml karbenicilinu (približne 3000 transformantov na misku). Baktérie sa nechajú rásť cez noc pri 37’C a potom sa nárast zoškrabe z každej misky, čím sa získa 986 bakteriálnych vzoriek. Z každej z týchto 986 bakteriálnych vzoriek sa izoluje plazmidová DNA pri použití systému Mágie Miniprep DNA Purification System (Promega, Madison, Wisconsin, USA), pričom sa pracuje podlá inštrukcií výrobca.

Purifikované vzorky plazmidovej DNA sa potom použijú na izoláciu individuálnych cDNA klonov, ktoré slúžia pre ďalšiu charakterizáciu. Pri tom sa postupuje takto: Plazmidová DNA z jednotlivých vzoriek sa použije na transformáciu buniek E. coli XLl-Blue. Bunky sa nanesú na misky a nechajú rásť cez noc za podmienok uvedených hore. Náhodným spôsobom sa vyberú jednotlivé trans formanty, ktoré sa nechajú rásť cez noc v 3 ml média LB doplneného karbenicilinom za účelom purifikácie plazmidu. Použije sa systém Wizard Miniprep Purification System (Promega) s nasledujúcimi obmenami: k väzbovej živici pre DNA dodávanej výrobcom sa pridá 250 mg kremeliny (Sigma Chem. Co. , St. Louis, MO,

USA). Purifikovaná plazmidová DNA sa sekvenuje na automatizovanom sekvenačnom zariadení Automated Sequencer Model 373 (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornie, USA) pri použití prajmeru JHS P6:

5' GACACTATAGAATAGGGC 3' (SEQ ID NO: 3).

Tento prajmer hybridizuje k plazmidovému vektoru pRc/CMV priliehajúcemu k miestu klonovania.

Nukleotidová sekvencia a dedukovaná aminokyselinová sekvencia jednotlivých cDNA sa porovná s databázami nukleotidových a peptidových sekvencií za účelom stanovenia, ktoré z klonov kódujú proteíny vykazujúce podobnosť so známymi mediátormi zápalu. Porovnávanie sekvencií bolo vykonané 14. decembra 1994 na pracovisku BLAST NetWork Service of the National Center for Biotechnology Information (E-mail: blast@ncbi.nim.nih.gov) pri použití priraďovacieho algoritmu opísaného v Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403 až 410 (1990). Analýza sekvencie ukazuje, že časť jedného z izolovaných klonov makrofágovej cDNA, ktorý je označený skratkou pMP390, obsahuje sekvenciu génu vykazujúcu približne 60 až 70% zhodu (totožnosť) so skôr identifikovanými génmi chemokinov, vrátane génu MCT3 človeka a génu ΜΙΡ-1β potkana.

2,85kb inzert cDNA z pMP390 sa subklonuje do vektoru pBlueScript SK^- (Stratagene, La Jolla, Kalifornia, USA) pre uľahčenie úplného sekvenovania. Štiepením pri použití systému Promega’s Erase-a-Basa System (Madison, Wisconsin, USA) sa vytvoria hniezdové delécie, začínajúce chvostom poly-A. Plazidy s deléciou sa opäť recirkularizujú a klonujú do E. coli a potom sa vykoná purifikácia a sekvenovanie pri použití prajmerov M13, T3.1 a T7.1 (SEQ ID NO: 4)

Ml3: 5’ GTAAAACGACGGCCAGT 3' (SEQ ID NO: 5)

T3.1: 5' AATTAACCCTCACTAAAGGG 3' (SEQ ID NO: 6)

T7.1: 5' GTAATACGACTCACTATAGGGC 3'

Úplná sekvencia tejto pMP390 cDNA zodpovedá nukleotidom 73 až 2923 zo SEQ ID NO: 1 (a dedukovaným aminokyselinám -6 až 69 zo SEQ ID NO: 2). Sekvencia, ktorá bola pôvodne porovnávaná so sekvenciami v databázach, zodpovedá nukleotidom 73 až 610 zo sekvencie SEQ ID NO: 1.

Príklad 2

Izolácia prídavných cDNA klonov obsahujúcich úplnú sekvenciu kódujúcu MDC

Pri použití klonu pMP390 cDNA izolovaného spôsobom opísaným v príklade 1 sa izolujú dalšie cDNA klony z rovnakej makrofágovej cDNA knižnice človeka. Tieto prídavné cDNA obsahujú prídavnú 5' sekvenciu a kódujú úplnú aminokyselinovú sekvenciu chemokinu pochádzajúceho z makrofágu.

Najskôr sa podrobí screeningu pomocou PCR 40 z 986 vzoriek plazmidovej DNA z cDNA knižnice makrofágu (pozri príklad 1) za účelom identifikácie vzoriek obsahujúcich prídavné cDNA klony, ktoré sú predmetom záujmu. Z pMP390 cDNA sekvencie získanej podlá príkladu 1 sa skonštruuje syntetický oligonukleotidový PCR prajmer 390-1F (uložený pod označením SEQ ID NO: 7) a 390-2R (uložený pod označením SEQ ID NO: 8) za účelom amplifikácie 211bp sekvencie pMP390 sčasti kódovaný génom chemokinu.

9 0-1F: 5’TCTATCTAGAGGCCCCTACGGCGCCAACATGGAAG 3 9 0-2R: 5'CACCGGATCCTCATTGGCTCAGCTTATTGAGAA 3'

Prajmer 390-1F zodpovedá nukleotidom 91 až 116 zo sekvencie SEQ ID NO: 1. Predchádza mu rozpoznávacie miesto pre reštrikčnú endonukleázu Xbal a štyri prídavné bázy pre ulahčenie štiepenia enzýmom. Prajmer 390-2R je komplementárny k nukleotidom 301 až 279 zo sekvencie SEQ ID NO: 1, pričom je fúzovaný k rozpoznávaciemu miestu pre enzým BamHI, ktoré je lemované štyrmi prídavnými bázami. Miesta Xbal a BamHI sú pridané pre ulahčenie klonovania výsledného fragmentu .

μΐ PCR reakčnej zmesi pre každú zvolenú plazmidovú vzorku obsahuje 0,2 μg plazmidovej DNA; l,5mM chlorid horečnatý; 50mM chlorid draselný; lOmM Tris, pH 8,4; 0,2mM každého z dNTP; 10 μg/ml každého z prajmerov a 0,5 μΐ Taq polymerázy (5 jednotiek/μΐ) (Boehringer Mannheim, Biochemicals (BMB), Indianapolis, IN, USA). Reakčné zmesi sa inkubujú 4 minút pri 94°C a potom sa urobí 30 cyklov denaturácie (15 sekúnd pri 94°C), teplotná hybridizácia (15 sekúnd pri 60’C) a predlžovanie (30 sekúnd pri 72’C).

Produkty PCR reakcie sa podrobia elektroforéze na 2% agarózovom géli (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD, USA) v 0,5X TBE tlmivom roztoku (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, 2. vydanie, Cold Spring Harbon, New York, Cold Spring Harbor Laboratory [1989]) a vizualizácia sa vykoná pomocou etídiumbromidu. Z 40 plazmidových vzoriek, ktoré boli podrobené skúšaniu sa pri 6 zistí intenzívny pás zodpovedajúci očakávanému 230bp PCR fragmentu (ktorý zahŕňa 211 bp sekvenciu chemokinového génu lemovanú reštrikčnými miestami Xbal a BamHI), čo ukazuje na prítomnosť jedného alebo viacerých plazmidov obsahujúcich génové sekvencie majúce vzťah k pMP390.

Pre izoláciu týchto príbuzných klonov sa alikvotné vzorky z troch z týchto šiestich pozitívnych plazmidových vzoriek zavedú elektroporáciou do buniek E. coli XLl-Blue. Bunky sa nanesú na misky a pestujú cez noc spôsobom opísaným v príklade 1. Kolónie sa prenesú na nitrocelulózové membrány a tie sa upravia podlá štandardných protokolov (Sambrook et al., hore uvedená citácia) pre hybridizáciu.

MDC próba značená rádioizotopom pre screening filtrov sa pripraví ďalej uvedeným spôsobom: 2,85kb fragment DNA obsahujúci MDC cDNA sa vyštiepi z pMP390 štiepením reštrikčným enzýmom, purifikuje sa elektroforézou na agarózovom géli v tlmivom roztoku TAE (Sambrook et al., hore uvedená citácia), podrobí elektroelúcii, extrakcii fenolom a chloroformom a zrážaniu etanolom. Purifikovaný fragment (250 ng) sa označí pri použití súpravy Random Primed DNA Labelling Kit (BMB) podlá odporúčania výrobca. Značená próba sa purifikuje priechodom cez stĺpec G-50 Quick Spin Column (BMB).

Filtre sa inkubujú 16 hodín pri 42°C pri použití próby (5 x 10⁷ rozpadov/min) v 40 až 50 ml roztoku obsahujúceho 50% formamid, 5X Denhardtov roztok, 5X SSC (IX SSC = 0,15M chlorid sodný a 15mM citran sodný), 50mM fosforečnan sodný, pH 6,5 a 0,1 mg/ml DNA z lososej spermy (sheared salmon sperm DNA) (Sigma, St. Louis, MO, jedn.SA). Po hybridizácii sa filtre 3 x premyjú v 0,2X SSC a 0,2% SDS pri 55°C (premývanie trvá 30 minút). Pre vizualizáciu hybridizácie sa premyté filtre exponujú cez noc pri -80°C na autorádiografický film XAR-5 Kodak (Rochester, NY, USA) pri použití intenzifikačných filtrov Lightning Plus (DuPont,

DE, USA).

PCR sa použije pre screening 50 hybridižujúcich bakteriálnych kolónií. Hore uvedeným spôsobom sa usporiada 50 reakcií PCR pri použití prajmerov 390-1F a 390-2R a baktérií z 50 kolónií namiesto templátovej DNA. Na počiatku sa reakčné zmesi 8 minút denaturujú pri 94°C. Potom sa vykoná 35 amplifikačných cyklov za hore opísaných podmienok. Jedna kolónia produkuje očakávaný 230bp produkt. Plazmid obsiahnutý v tomto klone sa označí skratkou pMP390-12.

Prídavné MDC cDNA, ktoré sú predmetom záujmu, sa identifikujú kolóniovou hybridizáciou pri použití próby špecifickej pre 5' koniec inzertu pMP390. Táto próba sa pripraví nasledujúcim spôsobom: Pomocou PCR sa spôsobom opísaným hore pripraví fragment DNA obsahujúci 211 báz z kódujúcej oblasti pMP390 cDNA (nukleotidy 91 až 298 zo sekvencie SEQ ID NO: 1) a 163 báz susednej 3' nekódujúcej oblasti. Pri tom sa ako templát použije 60 ng klonu pMP390 cDNA a ako prajmery sa použijú syntetické oligonukleotidy 390-1F (SEQ ID NO:

7) a 390-4R (SEQ ID NO: 9).

390-4R: 5’ AATGGATCCACAGCACGGAGGTGACC2ÍAG 3’

Prajmer 390-4R obsahuje reštrikčné miesto BamHI, po ktorom nasleduje sekvencia, ktorá je komplementárna k nukleotidom 461 až 442 zo sekvencie SEQ ID NO: 1.

PCR produkt sa purifikuje hore opísanou elektroforézou a 50 ng purifikovaného fragmentu sa označí pomocou súpravy Random Primed DNA Labelling Kit (BMB) a purifikuje priechodom cez stĺpec G-50 Quick Spin Column (BMB). Filtre sa podrobia screeningu pri použití tohto fragmentu, ako próby, spôsobom opísaným hore, premyjú sa trikrát 0,4X SSC a 0,2% SDS pri 48°C (30 minút). Autorádiografia sa vykoná spôsobom opísaným hore. Deteguje sa 5 hybridizujúcich kolónií, ktoré sa označia skratkami: MP390A, MP390B, MP390C, MP390D a MP390E.

Týchto 5 kolónií a kolónia transformovaná pMP390-12 sa izoluje a nechá rásť za účelom purifikácie plazmidu pri použití systému Wizard Miniprep Purification System (Promega, Madison, WI, USA) s prídavkom kremeliny, ako je to uvedené v príklade 1. Plazmidová DNA sa sekvenuje na automatickom sekvenačnom zariadení Applied Biosystems Model 373 pri použití syntetického prajmeru 390-3R (SEQ ID NO: 10):

390-3R: 5' AGTCAAGCTTAGGGCACTCTGGGATCGGCAC 3'.

Prajmer 390-3R je komplementárny k bázam 266 až 246 zo sekvencie SEQ ID NO: 1 a pri svojom 5' konci obsahuje miesto pre reštrikčnú endonukleázu HindlII a 4 prídavné bázové páry. Tento prajmer bol skonštruovaný pre teplotnú hybridizáciu pred (vzhľadom k smeru expresie) a za (vzhľadom k smeru expresie) nukleotidom 216 zo sekvencie SEQ ID NO: 1, tzn. miestom, v ktorom sa predpokladá intron v genómovej DNA kódujúcej chemokin podľa tohto vynálezu (viď Danoff et al., J. Immunology, 152: 1182 až 1189 (1994)).

Z týchto šiestich klonov obsahujú najväčšiu prídavnú 5' kódujúcu sekvenciu klony pMP390-12 a ρΜΡ-390-Β. Každá z týchto prídavných sekvencií obsahuje 72 prídavných nukleotidov predchádzajúcich (vzhľadom k smeru expresie) sekvencii, ktorá bola skôr získaná z klonu pMP390 cDNA. Kompozitná DNA sekvencia, ktorá je tu označená skratkou MDC cDNA, sa získa priradením sekvencií pMP390 a pMP390-12 cDNA. Táto 2923bp kompozitná cDNA sekvencia je uvedená v tomto texte ako SEQ ID NO: 1. Príslušná dedukovaná aminokyselinová sekvencia chemokinu MDC je v tomto texte uvedená ako SEQ ID NO: 2.

Manuálne porovnanie dedukovanej aminokyselinovej sekvencie MDC so sekvenciami známych chemokinov ukazuje, že sekvencia MDC cDNA kóduje nový C-C chemokin s dĺžkou 93 aminokyselín. Tento chemokin vykazuje 28 až 34% zhodu (identitu) v aminokyselinách s inými C-C chemokinmi (viď obr. 1 a tabuľka 1).

T a b u Ϊ k a l

Zhoda aminokyselinových sekvencií medzi MDC a skôr identifikovanými C-C chemokinmi (%)

	MDC	MCP-1	MCP-2	MCP-3	RANTES	MlP-la	MIP-10	1-309
MDC		29%	28%	33%	34%	29%	33%	32%
MCP-1	29%		62%	72%	34%	38%	34%	33%
MCP-2	28%	62%		59%	30%	36%	33%	34%
MCP-3	33%	72%	59%		34%	35%	35%	37%
RANTES	34%	34%	30%	34%		50%	44%	22%
ΜΙΡ-Ια	29%	38%	36%	35%	50%		55%	35%
MIP-1/3	33%	34%	33%	35%	44%	55%		31%
1-309	32%	33%	34%	37%	22%	35%	31%

Dôležité je, že sú 4 cysteínové zvyšky, ktoré sú charakteristické pre chemokiny v MDC konzervované. V 8 sekvenciách znázornených na obr. 1 je úplne konzervovaných 5 ďalších zvyškov.

Prvých 24 aminokyselín z 93 aminokyselinovej sekvencie MDC je prevážne hydrofóbnych, čo je konzistentné s Heijne-ovými pravidlami (Nucleic Acid Res. 14: 4683 až 4690 (1986)), ktoré riadia odštepovanie signálu. Tieto znaky a porovnanie polypeptidov znázornené na obr. 1 dohromady ukazujú, že MDC cDNA kóduje 24 aminokyselinový signálny peptid, ktorý sa odštepuje za vzniku maturovanej formy MDC, ktorá začína glycínovým zvyškom v polohe 1 sekvencie SEQ XD NO: 2. Tento predpoklad bol potvrdený priamym sekvenovaním proteínu MDC produkovaného rekombinantnou cestou v bunkách cicavcov, ako je to opísané ďalej v príklade 10. Kompozitná cDNA sekvencia pre MDC znázornená v SEQ ID NO:: 1 zahŕňa 19 nukleotidov predchádzajúcich (vzhľadom k smeru expresie) predvídaný iniciačný metionínový kodón a obsahuje 2,6 kb fragment za terminačným kodónom.

Príklad 3

Stanovenie expresie génu MDC v ľudských tkanivách

Pre stanovenie tkanív, v ktorých je exprimovaný gén MDC sa vykonajú analýzy Northern blot.

5' fragmentu pMP390 označeného rádioizotopom, opísaného v príklade 2 (ktorý zodpovedá oblasti MDC cDNA kódujúcej putatívnu maturovanú formu MDC plus 163 báz susednej 3' nekódujúcej oblasti) sa použije ako próby pre bloty Multiple Tissue Northern Blots (Clontech, Palo Alto, Kalifornia USA) obsahujúcej RNA z rôznych normálnych ľudských tkanivách Pred použitím sa próba denaturuje varom a hybridizácie sa vykonávajú podľa protokolu opísaného výrobcom. Autorádiografie sa exponujú 5 dní pri -80’C s dvoma intenzifikačnými tienidlami.

Najväčšia expresia génu MDC je pozorovaná v tkanivu týmusu a ovela menšia expresia je detegovaná v slezinnom a pľúcnom tkanivu. Expresia MDC v tkanivu tenkého čreva je ešte na nižšej úrovni a žiadna expresia nie je pozorovaná v mozgu, tlstom čreve, srdci, obličkách, pečeni, vaječníkoch, slinivke brušnej, placente, prostate, v kostrovom svalstve, vajciach, ani leukocytoch periférnej krvi.

Príklad 4

Expresia MDC génu behom maturácie makrofágu

S ohľadom na skutočnosť, že cDNA kódujúce MDC boli izolované z humánnej makrofágovej cDNA knižnice, bola skúmaná expresia MDC génu behom diferenciácie monocytov na makrofágy pri použití nasledujúceho postupu:

A.

Humánne monocyty od jediného darca sa kultivujú v sérii misiek pre tkanivové kultúry a bunky z jednej misky sa zberajú vždy po 0, 2, 4 alebo 6 dňoch (všeobecný postup je uvedený v publikácii Elstad et al., J. Immunol. 140,

1618 až 1624 a Tjoelker et al., hore uvedená citácia). Za týchto podmienok dôjde k diferenciácii monocytov na makrofágy do 4. až 6. dňa (Stafforini et al., J. Biol. Chem. 265, 9682 až 9687 (1990)).

Z RNA (10 μg/pás) buniek zobraných v každom časovom okamihu sa pripraví Northern blot, a ten sa podrobí skúšaniu pri použití próby obsahujúcej rádioizotopom značený fragment pMP390 charakterizovaný hore. V RNA pochádzajúcej z čerstvo izolovaných monocytov nie je detegovateľný žiadny signál, zatial čo bunky, v ktorých prebehla diferenciácia na makrofágy po 6 dňoch v kultúre, poskytovali velmi silný signál. Bunky kultivované počas 4 dní poskytovali oveía slabší signál, zatial čo signál pochádzajúci z buniek kultivovaných počas 2 dní mohol byť pozorovaný iba pri predĺženej expozícii filtra.

B.

Pre potvrdenie expresie MDC v diferenciovaných humánnych makrofágach sa supernatanty kultúry analyzujú metódou Western blot pomocou anti-MDC monoklonálnych protilátok produkovaných spôsobom opísaným ďalej, v príklade 18. Niekoľko misiek s ľudskými makrofágami sa diferencuje rastom na plaste počas 8 dní v prítomnosti faktoru stimulujúceho makrofágové kolónie (0,5 ng/ml, R&D Systems Minneapolis, Minnesota, USA).

Médium z diferenciovaných makrofágových bunečných kultúr sa odstráni a nahradí podobným médiom alebo médiom obsahujúcim nízkohustotný lipoproteín (LDL, Sigma), oxidovaný LDL (oxidovaný inkubáciou v 5μΜ pentahydrátu síranu meďnatého spôsobom opísaným v Malden et al., J. Biol. Chem. 266: 13901 (1991) alebo dexametazon (6nM, Sigma Chemical Company). Po 3 dňoch od každého ošetrenia sa kultivačné médium odstráni, jeho hodnota pH sa upraví na 6,8 prídavkom chlorovodíka a médium sa nechá prejsť cez stĺpec HeparinSepharose CL-6B (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA). Stĺpec sa premyje 0,2M chloridom sodným v 20mM tlmivého roztoku Tris s pH 8 a eluuje 0,6M chloridom sodným v 20mM tlmivého roztoku Tris s pH 8. Eluovaná látka sa frakcionuje na 18% akrylamidovom géli SDS-PAGE (Novex) a elektroblotuje na membránu PVDF (Millipore, Betford, MA, USA). Filter sa blo33 tuje, premyje a nechá reagovať s monoklonáInými protilátkami proti MDC pri použití štandardných techník (Sambrook et al., hore uvedená citácia). V každom z analyzovaných kultivačných médií bol MDC proteín detegovaný v koncentrácii približne 0,5 μg/ml, čo potvrdzuje, že dochádza k expresii MDC v diferenciovaných humánnych makrofágoch.

Expresia MDC bola tiež analyzovaná v humánnych epitelových bunečných líniách. Línie epitelových buniek tlstého čreva T84 (ATCC #CCL-248) boli pestované v médiu DMEM/F12 (Gibco, Gaithersburg, MD, USA) a bunečná línia plúcnych epitelových buniek A549 (ATCC #CCL-185) bola pestovaná v médiu F12. Screening na prítomnosť MDC mRNA v bunkách a MDC proteínu v kultivačnom médiu bol vykonaný rovnakým spôsobom ako v prípade makrofágov, pozri hore.

Žiadna známka expresie MDC nebola detegovatelná v týchto bunečných líniách, nech už sa použila akákoľvek metóda.

Okrem toho boli vzorky bunečnej línie T84 jeden deň spracovávané TNFa (5 ng/ml, PeproTech, Rocky Hill, New Jersey, USA), TGF-β (1 ng/ml, R&D Systems) alebo interferónom-gama (200 jednotiek/ml, PeproTech), vždy buď bez alebo za pridania rekombinantného MDC v koncentrácii 100 ng/ml (pochádzajúceho z transfektantov buniek CHO, pozri príklad 10). Vzorky bunečnej línie A549 boli spracované PMA (50 ng/ml, Sigma Chemical Company) počas 0, 1, 3, 5 alebo 7 dní. Žiadne z týchto spracovaní nemalo za následok detegovatelnú expresiu MDC mRNA v bunkách T84 alebo A549 pri screeningu metódou Northern blot, ako to bolo opísané hore.

C.

Ďalšie skúšanie expresie MDC génu v makrofágoch bolo vykonané spracovaním humánnej bunečnej línie HL60 buď 1% dimetylsulf oxidom (Sigma Chemical Company) alebo PMA (50 ng/ml,

Sigma). Spracovanie DMSO indukuje diferenciáciu buniek HL60 na bunky granulocytového typu, zatiaľ čo PMA indukuje diferenciáciu na makrofágy (Perussia et al., Blood, 58, 836 až 843 (1981)). RNA bola izolovaná z neošetrených buniek a z buniek spracovaných počas 1 až 3 dní buď DMSO alebo PMA, potom bola podrobená elektroforéze (10 μg/pás) a blotovaná. Northern blot získanej RNA bol podrobený skúšaniu pri použití próby obsahujúcej rádioizotopom značený 5' fragment pMP390 (pozri príklad 3).

Po 3 dňoch od spracovaní PMA bunky HL60 jasne exprimujú MDC mRNA, napriek tomu, že úroveň expresie je zreteľne nižšia ako úroveň, ktorá sa dosahuje pri makrofágoch po 6 dňoch v kultúre (viď hore). Žiadna expresia nebola pozorovaná po 1 dni spracovaní alebo pri neošetrených bunkách. Žiadna detegovateľná expresia MDC tiež nebola indukovaná spracovaním dimetylsulfoxidom počas 1 alebo 3 dní.

Príklad 5

In situ hybridizácia

Pretože expresia génu MDC bola detegovaná v týmusu a slezine, bola vykonaná in situ hybridizácia pre lokalizáciu zdroja tejto informácie v týchto tkanivách. In situ hybridizácia bola ďalej tiež použitá pre koreláciu expresie MDC génu so zápalom črevného tkaniva spojeným s Crohnovou chorobou.

Pre vytvorenie rádioizotopom značených in situ hybridizačných prób sa DNA fragment (nukleotidy 91 až 301 zo sekvencie SEQ ID NO: 1) obsahujúcej kódovaciu oblasť MDC subklonujú do vektoru pBluescript SK^-. Pre zavedenie ³⁵S-UTP do RNA transkriptov komplementárnych ku každému reťazcu génu sa použijú T3 a T7 RNA polymerázy (BMB) podľa inštrukcií výrobca.

Vzorky normálneho ľudského tkaniva sleziny, týmusu a tlstého čreva, ako tiež vzorky tkaniva tlstého čreva od pacientov s Crohnovou chorobou boli získané od National Disease Research Interchange (Philadelphia, PA, USA). Tkanivá pochádzali od týchto darcov: normálne tkanivo týmusu pochádza od 19-ročného Kavkazana, ktorý zomrel pri havárii motorového vozidla, tkanivo bolo odobrané pri pitve; normálne tkanivo sleziny pochádza od 51-ročného černocha, ktorý zomrel v dôsledku mozgového krvácania, tkanivo bolo odobrané pri pitve; normálne tkanivo tlstého čreva pochádza od černošky, tkanivo bolo odobrané pri chirurgickom ošetrení; tkanivo tlstého čreva postihnutého Crohnovou chorobou č. 1 pochádza od 46-ročnej pacientky neznámej rasy trpiacej vredovou kolitídou, tkanivo bolo odobrané pri chirurgickom zásahu; tkanivo tlstého čreva postihnutého Crohnovou chorobou č. 2 pochádza od 18-ročného pacienta neznámej rasy trpiaceho Crohnovou chorobou, tkanivo bola odobrané pri chirurgickom zásahu.

Okrem hore uvedených analýz bola tiež skúšaniu podrobené tkanivo krčných mandlí, ktoré boli pacientovi odňaté pri tonzilektómii. Pri skúšaní bola použitá nekódujúca čast MDC cDNA zodpovedajúca nukleotidom 677 až 1042 zo SEQ ID NO: 1. Táto čast bola vytvorená PCR amplifikáciou klonu MDC cDNA pri použití prajmerov 390-7F (SEQ ID NO: 26) a 390-8R (SEQ ID NO: 27)

390-7F: 5’- TAT TGG ATC CGT TCT AGC TCC CTG TTC TCC 3’ 390-8R: 5’- CCA AGA ATT CCT GCA GCC ACT TTC TGG GCT C 3’

Tento fragment bol klonovaný do vektoru pBluescript SK” za účelom vytvorenia RNA prób opísaných hore.

Vzorky tkaniva opísané v predchádzajúcich odsekoch boli pripravené pre in situ hybridizáciu nasledujúcim spôsobom: Vzorka tkaniva sa uloží do kompozície OCT (Miles Inc., Elkhart, IN, USA) a nareže na hrúbku 6 μιη v kryostate 2800E (Leica). Tkanivové rezy sa prilepia ku kľúčkom potiahnutých Vectabondom (Vector Laboratories, Burlingame,

CA, USA), fixujú 20 minút v 4% paraformaldehyde pri 4°C, dehydratujú etanolom a denaturujú pri 70°C 70% formamidom a 2X SSC.

Hybridizácie sa uskutočňujú tak, že sa preparáty 16 hodín inkubujú pri 55°C s kódujúcim a nekódujúcim reťazcom príslušnej próby, ktorý je označený rádioizotopom, vo vodnom hybridizačnom roztoku obsahujúcom 50% formamid, 0,3M chlorid sodný, 20mM tlmivý roztok Tris s pH 7,5, 10% dextransulfát,

IX Denhardtov roztok, lOOnM ditiotreitol a 5mM EDTA. Po hybridizácii sa preparáty 1 hodinu inkubujú pri teplote miestnosti v 4X SSC a lOmM DTT. Preparáty sa premyjú pri teplote miestnosti 2X SSC, pri 60’C v IX SSC a nakoniec pri teplote miestnosti v 0,lX SSC. Vzorky sa dehydratujú v etanole a potom potiahnu fotografickou emulziou Kodak NTB2, 2 hodiny sušia na vzduchu, 11 dní exponujú pri 4’C, vyvolajú a farbia hematoxylínom/eosinom.

Pozorovaná hybridizácia kódujúceho reťazca (obidvoch prób) ukazuje, že MDC gén je exprimovaný v bunkách v kortexe normálneho ľudského týmusu, pričom slabý signál je vo folikuloch. Expresia MDC týmusu môže ukazovať na úlohu MDC pri vývoji T-lymfocytov. Expresia v normálnej ľudskej slezine bola lokalizovaná v bunkách červenej drene, zatiaľ čo v bunkách bielej drene bol pozorovaný len slabý signál. Vysoká hladina expresie v zapálených krčných mandliach bola lokalizovaná v epitelovej oblasti, napriek tomu, že sa zdalo že zapálené bunky infiltrovali do celej vzorky tkaniva.

Vzorky tkaniva tlstého čreva od pacientov s Crohnovou chorobou vykazovali hybridizáciu v bunkách epitelu, lamina propria, Payerových ložiskách a hladkom svalstve. Naproti tomu normálne tkanivo tlstého čreva nevykazovalo hybridizáciu vyššiu, ako zodpovedá pozadie. Pozorovaný profil expresie MDC v tlstom čreve pacientov s Crohnovou chorobou úzko koreluje s expresiou génu špecifického vzhladom k makrofágom, PAF-AH (Plateled Activating Factor Acetylhydrolase) [Tjoelker et al., hore uvedená citácia]. Tento výsledok spolu s údajmi uvedenými v príklade 4 ukazuje, že makrofágy exprimujú MDC cDNA in vivo behom patogénneho zápalu. Okrem toho identifikácia MDC vo vzorkách tkaniva tlstého čreva postihnutého Crohnovou chorobou naznačuje diagnostickú relevanciu hladiny MDC (napríklad v krvi, stolici a/alebo v intestinálnych léziách pacienta) pre chorobný stav alebo klinickú prognózu pacienta.

Príklad 6

Produkcia rekombinantného MDC

Pre produkciu rekombinantného MDC proteínu sa sekvencia kódujúca putatívnu maturovanu formu proteínu amplifikuje pomocou PCR a klonuje do vektoru pGEX-3X (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA). Vektor pGEX sa skonštruuje pre produkciu fúzovaného proteínu obsahujúceho glutation-S-transferázu (GST) kódovanú týmto vektorom a proteín kódovaný fragmentom DNA sa vloží do klonovacieho miesta vektoru.

I tu sa používajú štandardné PCR podmienky opísané v príklade 2 pre amplifikáciu fragmentu MDC cDNA pri použití prajmerov 390-2R a 390-FX2 (SEQ ID NO: 11):

' TATCGGATCCTGGTTCCGCGTGGCCCCTACGGCGCCAACATCGAA 3 ' .

Prajmer 390-FX2 obsahuje reštrikčné miesto BamHI nasledované sekvenciou kódujúcou trombínové štiepiace miesto (Chang et al., Eur. J. Biochem. 151: 217 (1985)), ktoré je opäť nasledované bázami 92 až 115 zo sekvencie SEQ ID NO: 1. Trombínové štiepiace miesto má štruktúru leucin-valín-prolínarginín-glycín-prolín, kde glycín a prolín predstavujú prvé dva zvyšky maturovanej formy MDC. Predpokladá sa, že pri pôsobení trombínu na tento rekombinantný fúzovaný proteín dôjde k rozštiepeniu väzby arginín-glycín v tomto fúzovanom proteíne, pričom sa z GST fúzovaného produktu uvoíní maturovaný chemokin.

PCR produkt sa purifikuje elektroforézou na agarózovom géli, štiepi endonukleázou BamHI a klonuje do miesta BamHI plazmidu pGEX-3X. Konštrukt pGEX-3X/MDC sa transformuje do buniek E. coli XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, Kalifornia, USA) a jednotlivé transformanty sa izolujú a nechajú rásť. Plazmidová DNA z jednotlivých transformantov sa purifikuje a sčasti sekvenuje pri použití automatického sekvenačného zariadenia a prajmeru GEX-5 (SEQ ID NO: 12), ktorý hybridizuje k vektoru pGEX-3X v blízkosti klonovacieho miesta BamHI.

GEX-5: 5' GAAATCCAGCAAGTATATAGCA 3'

Sekvencia získaná s týmto prajmerom potvrdzuje prítomnosť požadovaného inzertu MDC v správnej orientácii.

Indukcia fúzovaného proteínu GST MDC sa vykoná tak, že sa kultúra transformovaných buniek XL-1 Blue nechá rásť v médiu LB (doplnenom karbenicilinom) pri 31 °C až do optickej denzity pri vlnovej dĺžke 600 nm 0,4, potom sa vykoná štvorhodinová inkubácia v prítomnosti 0,25 až l,0mM izopropyl^-D-tiogalaktopyranozidu (Sigma Chemical Company,

St. Louis, MO, USA).

Tento fúzovaný proteín, ktorý je produkovaný v podobe nerozpustného inkluzného telesa v baktérii, sa purifikuje takto: bunky sa zoberú centrifugáciou, premyjú 0,15M chloridom sodným, lOmM tlmivým roztokom Tris s pH 8 a lmM EDTA a spracujú lysozymom (0,1 mg/ml, Sigma Chemical Company) počas 15 minút pri teplote miestnosti. Lyzát sa vyčerí spracovaním ultrazvukom a rozbité bunky sa peletizujú lOminútovou centrifugáciou pri 12 000 x g. Peleta obsahujúca fúzovaný proteín sa resuspenduje v 50mM Tris s pH 8 a lOmM EDTA, suspenzia sa prevrství 50% glycerolom a 30 minút centrifuguje pri 6 000 x g. Získaná peleta sa resuspenduje v štandardnom roztoku chloridu sodného tlmeného fosforečnanom (PBS), ktorý neobsahuje horečnaté a vápenaté ióny. Fúzovaný proteín, ktorý zostáva nerozpustný, tvorí približne 80 až 90 % hmotnosti proteínu a migruje v denaturačných SDS-polyakrylamidových géloch pri relatívnej molekulovej hmotnosti 33 kDa. Výťažok proteínu odhadnutý farbením farbivom Coomassie robí približne 100 mg/liter kultúry E. coli.

Fúzovaný proteín sa podrobí štiepeniu trombínom za účelom odštiepenia GST od maturovaného MDC proteínu. Štiepiaca reakčná zmes (20 až 40 μg fúzovaného proteínu, 20 až 30 jednotiek ludského trombínu (4 000 jednotiek/mg, Sigma) v 0,5 ml PBS) sa 16 až 48 hodín inkubuje pri teplote miestnosti a potom nanesie na denaturačný gél SDS-PAGE, na ktorom sa vykoná frakcionácia reakčných produktov. Gél sa máča v 0,4M roztoku chloridu draselného, aby sa vizualizoval pás GST a MDC proteínu. GST migruje ako fragment s relatívnou molekulovou hmotnosťou asi 26 kDa a MDC proteín ako fragment s relatívnou molekulovou hmotnosťou asi 7 kDa.

Totožnosť 7kDa fragmentu z SDS page sa potvrdí čiastočnou analýzou aminokyselinovej sekvencie. Najskôr sa proteín vyreže z gélu, vykoná sa elektroelúcia v 25mM Tris báze a 25mM glycínu a potom sa proteín zhromaždí na membráne PVDF v stĺpci ProSpin (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA). Keď sa vzorka podrobí automatickému sekvenovaniu pri použití zariadenia od firmy Applied Biosystems Model 473A, získa sa 15 zvyškov poskytujúcich informácie o sekvencii, ktoré presne zodpovedajú očakávanému N-koncu pred vídanej maturovanej formy MDC (pozri SEQ ID NO: 2, aminokyselinové zvyšky 1 až 15).

Príklad 7

Konštrukcia bakteriálneho MDC expresného vektoru

Časť MDC cDNA kódujúca predvídaný maturovaný MDC proteín sa klonuje do plazmidu obsahujúceho arabinózový promótor a vedúcu sekvenciu pelB (viď Better et al., Science, 240: 1041 až 1043 (1988)).

MDC cDNA sa konkrétne amplifikuje PCR spôsobom opísaným v príklade 2 pri použití približne 0,1 μg pMP390-12 ako templátu, a syntetických oligonukleotidových prajmerov 390-2R a 390-Pel (SEQ ID NO: 13)

390-Pel: 5' ATTGCCATGGCCGGCCCCTACGGCGCCAACATGGAA 3'

Prajmer 390-Pel obsahuje reštrikčné miesto Ncol nasledované dvoma cytozínovými zvyškami a potom bázami 92 až 115 zo sekvencie SEQ ID NO: 1.

Očakávaný 232bp PCR produkt sa purifikuje elektroforézou na agarózovom géli, rozštiepi sa Ncol a BamHI a klonuje spolu s časťou arabinózového operónu a vedúcou sekven41 ciou pelB (Better et al., hore uvedená citácia) do vektoru pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA, USA). Výsledný konštrukt, ktorý je označený skratkou P2-390, kóduje fúziu vedúcej sekvencie pelB (kódované vektorom) k maturovanému MDC proteínu. Sekvencia tohto konštruktu sa potvrdí automatickým sekvenovaním pri použití prajmerov Aral (SEQ ID NO: 28) a Ara2 (SEQ ID NO: 29), ktoré sa teplotné hybridizujú k vektoru v susedstve klonovacieho miesta.

Aral: 5’ GCG ACT CTC TAC TGT TTC TC3’ Ara2: 5’-CAC AGG AAA CAG CTA TGA CC3’

Plazmid P2-390 sa transformuje do kmeňa E. coli MC1061 pri použití štandardných procedúr a ampicilín rezistentný kloň sa zvolí pre produkciu MDC. Tento kloň sa nechá rásť v troj litrovom fermentore (Applikon, Foster City, Kalifornia, USA) a prídavkom 50% arabinózy do konečnej koncentrácie 0,1% sa indukuje produkcia MDC. Po 1 dni inkubácie v prítomnosti arabinózy sa bunky zoberú. Analýza Western Blotting ukazuje, že MDC je prítomný v bunkách v koncentrácii približne 4 μg/g bunečnej pasty a je vylučovaný do kultivačného média pri koncentrácii približne 1 μg/ml.

Príklad 8

Purifikácia rekombinantného MDC z baktérií a kultivačného média

Nasleduje experimentálny protokol použitý pre purifikáciu rekombinantného MDC produkovaného spôsobom opísaným v príklade 7.

Vylúčený rekombinantný MDC proteín sa purifikuje z média bakteriálnej kultúry, napríklad pomocou prispôsobených metód, ktoré boli opísané skôr pre purifikáciu rekombinantne produkovaného chemokinu RANTES (Kuna et al., J. Immunol., 149: 636 až 642 (1992)), chemokinu MGSA (Horuk et al., J. Biol. Chem. 268: 541 až 546 (1993)) a chemokinu IP-10 (exprimovaného v hmyzích bunkách) (Sarris et al., J. Exp. Med. 178: 1127 až 1132 (1993)).

Príklad 9

Rekombinantná produkcia MDC v kvasinkách

Nasledujú protokoly použitia pre rekombinantnú expresiu MDC v kvasinkách a purifikácie rekombinantného MDC.

Kódujúca oblasť MDC cDNA sa pomocou PCR amplifikuje z pMP390-12 pri použití syntetických oligonukleotidov obsahu júcich sekvencie MDC cDNA, ako prajmerov, tzn. prajmerov 390-1F a 390-2R. DNA kódujúca kvasinkovú pre-pro-alfa vedúcu sekvenciu sa amplifikuje z kvansinkovej genómovej DNA PCR reakciou pri použití jedného prajmeru obsahujúceho bázy 1 až 20 génu párovacieho faktoru alfa (alpha mating factor gene) a ďalšieho prajmeru, ktorý je komplementárny k bázam 255 až 235 tohto génu (Kurjan a Herskowitz, Celí, 30: 933 až 943 (1982)). Fragment vedúcej sekvencie pre-pro-alfa a fragment sekvencie kódujúcej MDC sa liguje do plazmidu obsahujúceho kvasinkový alkohol dehydrogenázový promotor (ADH2) tak, že tento promotor riadi expresiu fúzovaného proteínu skládajúceho sa z faktoru pre-prop-alfa fúzovaného k maturovanému MDC polypeptidu. Ako ukázali Rosa a Broach, Meth. Enz. 185: 234 až 279, D. Goeddel ed., Academic Press Inc., San Diego, Kalifornia, USA (1990), tento vektor ďalej obsahuje ADH2 transkripčný terminátor za (vzhľadom k smeru expresie) klonovacím miestom, kvasinkový 2-mikrónový po43 čiatok replikácie, kvasinkový gén leu-2d, kvasinkové gény REP1 a REP2, beta laktamázový gén z E. coli a počiatok replikácie z E. coli. β-laktamázový gén a gén leu-2d tiež zaisťujú zvýšenie počtu kópií plazmidu v kvasinkách pre zvýšenie úrovne expresie. Gény REP1 a REP2 kódujú proteíny, ktoré sa podieľajú na regulácii počtu kópií plazmidu.

Konštrukt DNA opísaný v predchádzajúcom odseku sa transformuje do kvasinkových buniek známym spôsobom, napríklad spracovaním s octanom litným (Stearns et al., Meth.

Enz. , hore uvedená citácia, str. 280 až 297). Promotor ADH2 je indukovaný vyčerpaním glukózy v rastovom médiu (Price et al., Gene, 55: 287 (1987). Sekvencia pre-pro-alfa zaisťuje sekréciu fúzovaného proteínu z buniek. Súčasne kvasinkový proteín KEX2 odštepuje sekvenciu pre-pre od matúrovaného chemokinu MDC (Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330 až 5334 (1984)).

Alternatívne sa MDC rekombinantne exprimuje v kvasinkách pri použití obchodne dostupného expresného systému, napríklad Pichia Expression System (Invitrogen, San Diego, Kalifornia, USA) podlá inštrukcií výrobca. Tento systém sa pri riadení sekrécie tiež spolieha na sekvenciu pre-pro-alfa, ale transkripcia inzertu je poháňaná alkoholoxidázovým promótorom (AOX1) po indukcii metanolom.

Vylúčený MDC sa purifikuje z kvasinkového rastového média, napríklad spôsobmi použitými pre purifikáciu MDC zo supernatantov bakteriálnych buniek a buniek cicavcov (pozri príklady 8 a 10).

Príklad 10

Rekombinantná produkcia MDC v bunkách cicavcov

MDC bol rekombinantne produkovaný v bunkách cicavcov pri použití nasledujúcich postupov:

A. Syntéza expresného vektoru 390HXE

Skrátená verzia MDC cDNA sa syntetizuje PCR spôsobom opísaným v príklade 2 pri použití pMP390-12, ako templátu a syntetických oligonukleotidov 390RcH a. 390RcX, ako prajmerov.

(SEQ ID NO: 14)

390RcH: 5’GACCAAGCTTGAGACATACAGGACAGAGCA (SEQ. 3D NO: 15)

390RcX: 5’TGGATCTAGAAGTTGGCACAGGCTTCTGG

Prajmer 390RcH obsahuje reštrikčné miesto HindlII, ktoré je nasledované bázami 1 až 20 zo sekvencie SEQ ID NO: 1 a prajmer 390RcX obsahuje reštrikčné miesto Xbal, ktoré je nasledované sekvenciou, ktorá je komplementárna k bázam 403 až 385 zo sekvencie SEQ ID NO: 1.

Očakávaný 423bp PCR produkt sa purifikuje elektroforézou na agarózovom géli a klonuje do pRc/CMV (Invitrogen, San Diego, Kalifornia, USA) štiepeného HindlII/Xbal, čo je vektor, ktorý umožňuje priamu expresiu v bunkách cicavcov. Výsledný plazmid, ktorý sa označí skratkou 390HXE, obsahuje bázy 1 až 403 zo sekvencie SEQ ID NO: 1. Sekvencie tohto inzertu sa potvrdia automatizovaným sekvenovaním pri použití prajmerov DC03 (SEQ ID NO: 16) a JHSP6

DC03: 5' CGA AAT TAA TAC GAC TCA CT 3'

Prajmer DC03 sa teplotné hybridizuje k sekvencii pRc/CMV vektoru v mieste, ktoré susedí s klonovacím miestom.

B. Syntéza expresného vektoru 390HmX

Reakciou PCR sa zhotoví ďalší MDC cDNA konštrukt pri použití pMP390—12, ako templátu, a prajmerov 390RcH a 390mycRX (SEQ ID NO: 17)

390mycRX: 5’ TGGATCTAGATCAATTCAAGTCCTCCTCGCT

GATCAGCTTCTGCTCTTGGCTCAGCTTATTGAGAAT 3’

Prajmer 390mycRX obsahuje reštrikčné miesto Xbal, sekvenciu, ktorá je komplementárna k sekvencii kódujúcej epitop myc [Fowlkes et al., BioTechniques, 13: 422 až 427 (1992)] a sekvenciu, ktorá je komplementárna k bázam 298 až 278 zo sekvencie SEQ ID NO: 1. Touto reakciou sa amplifikuji očakávaný 354bp fragment obsahujúci bázy 1 až 298 zo sekven· cie SEQ ID NO: 1, ktorý je fúzovaný k epitopu myc” u karbo xylového konca MDC. Tento epitop sa môže použiť pre uľahčenie imunoprecipitácie, afinitnej purifikácie a detekcie fúzovaného proteínu MDC-myc pomocou metódy Western blotting. Získaný fragment sa klonuje do pRc/CMV, a tak sa získa plazmid 390HmX. Sekvencia tohto inzertu sa potvrdí automatizovaným sekvenovaním pri použití prajmeru DC03.

C. Expresia MDC v bunkách 293T a NSO

Pre expresiu dvoch konštruktov MDC cDNA, ktoré sú opísané hore v odsekoch A. a B., sa použijú dva transfekčrié protokoly: transientné transfekcie do bunečnej línie embryo nálnych ľudských obličiek 293T a stabilné transfekcie do myšej myelomatickej bunečnej línie NSO (ECACC 85110503).

Transientná transfekcia buniek 293T sa vykoná pri použití protokolu s precipitáciou fosforečnanom vápenatým, ktorý opísali Chen a Okayama v BioTechniques 6: 632 až 638 (1988) a Mol, Cel. Biol. 87: 2745 až 2752 (1987). Bunky a supernatanty sa zoberú 4 dni po transfekcii. Z 4 μ9 úplnej RNA z každého bunečného lyzátu sa zhotoví Northern blot, ktorý sa podrobí skúšaniu pri použití rádioizotopom značeného fragmentu MDC pripraveného PCR, ako próby. Ako templát pre značiacu reakciu sa použije PCR fragment predbežne pripravený amplifikáciou pMP390 pri použití prajmerov 390-1F a 390-4R (pozri príklad 2). Pri PCR reakcii sa použije približne 30 ng tohto fragmentu. Reakčná zmes pre PCR obsahuje chlorid horečnatý (l,5mM), chlorid draselný (50mM), Tris tlmivý roztok s pH 8,4 (lOmM), dATP (0,2mM), dTTP (0,2mM), dGTP (0,2mM), dCTP (ΙμΜ), a³²P-dCTP (50 μΰί) (DuPont/New England Nučlear, Boston, MA, USA), Taq polymerázu (2,5 jednotky) a prajmery 390-1F a 390-2R (vždy 10 μg/ml). Reakčná zmes sa denaturuje štvorminútovým zahrievaním na 94’C a potom sa uskutoční 15 amplifikačných cyklov opísaných v príklade 2. Próba sa purifikuje priechodom cez stĺpec G-25 Quick Spin (BMB). Hybridizačné podmienky sú opísané v príklade 2. Filtre sa následne premyjú 0,5X SSC a 0,2%

SDS pri teplote 42°C (30 minút). Autorádiografia sa vykonáva pri -80°C pri použití jedného intenzifikačného tienidla (16 hodín). Konštrukty MDC DNA sú v transfekovaných bunkách vysoko exprimované, zatiaí čo v netransfekovaných bunkách ich nie je možné detegovať.

Pri stabilných transfekciách sa bunky NSO nechajú rásť až do 80% konfluencie v D-MEM (Gibco), zoberú sa centrifugáciou a premyjú PBS. Plazmidová DNA (20 μ9) sa linearizuje pomocou reštrikčnej endonukleázy Seal (BMB), ktorá sa pridá k bunkám. Inkubácia sa vykonáva na íade počas 15 minút v 0,4cm štrbinovej kyvete (BioRad, Hercules, California, USA). Elektroporácia buniek sa vykonáva dvoma pulzmi s kapacitou 3 μΡ a napätí 1,5 kV. Bunky sa zriedia suspendovaním v 20 ml D-MEM, inkubujú sa pri 37°C počas 24 hodín v atmosfére obsahujúcej 5 % oxidu uhličitého. Za účelom selekcie sa bunky pri rôznom zriedení v D-MEM s obsahom geneticinu (800 μg/ml) navzorkujú na 96-jamkové platne, jamky obsahujúce len jednu kolónii rezistentnú voči liečivu sa expandujú v selekčnom médiu. Úplná RNA sa analyzuje metódou Northern Blotting, ako je to opísané v predchádzajúcom odseku. MDC je pozorovaný len v transfekovaných bunečných líniách.

MDC sa purifikuje zo supernatantov kultúr buniek cicavcov napríklad pri použití prispôsobených metód purifikácie rekombinantného chemokinu TCA3 (Wilson et al., J. Immunol., 145: 2745 až 2750 (1990)) alebo spôsobom opísaným ďalej v časti F.

D. Expresia MDC v bunkách CHO

Pre amplifikáciu báz 1 až 403 klonu MDC cDNA sa použije PCR pri použití prajmerov 390RcH a 390RcX (SEQ ID NO: 14 a 15), ktoré sú opísané hore, v časti A. Vzniknutý fragment sa klonuje do miest HindlII a Xbal expresného vektoru pDCl, čo je derivát vektoru pUC19, ktorý obsahuje cytomegalovírusový promotor (CMV) pre poháňanie expresie tohto inzertu. Konkrétne je možné uviesť, že vektor pDCl, ktorý je znázornený na obr. 8, bol získaný z pRc/CMV a pSV2-dhfr (ATCC vektor č. 37146). Vektor pDCl sa podobá expresnému vektoru cicavca pRc/CMV (Invitrogen, San Diego, Kalifornia, USA), len s tým rozdielom, že pDCl nesie myší dihydrofolát reduktázový (dhfr) gén, ako selekčný markér miesto neomycín fosfotransferázového génu. Transkripcia cieľového génu v pDCl je pod kontrolou silného CMV promotoru (viď Stenbert et al., J. Virology, 49: 190 až 199, 1984). Okrem toho je na 3’ strane cieľového génu obsiahnutá poly48 adenylačná sekvencia z génu hovädzieho rastového hormónu (Goodwin a Rottman, J. Biol. Chem. 267: 16330 až 16334 (1992)). Expresná kazeta dhfr (Subramani et al., Mol. Celí. Biol. 1: 854 až 864 (1981)) umožňuje selekciu na pDCl v bunkách postrádajúcich funkčný gén dhfr.

Pri použití štandardných techník inkubácie s chloridom vápenatým a tepelného šoku (Sambrook et al., hore uvedená citácia) sa baktérie XL-1 Blue (Stratagene) transformujú plazmidom pDCl/MDC. Transformanty sa nechajú rásť v médiu LB, ktoré obsahuje karbenicilín (100 p.g/ml). Plazmidová DNA z jednotlivých transformovaných klonov sa izoluje pri použití systému Promega Wizzard Maxiprep (Madison, WI, USA) a jeho sekvencia potvrdí automatickým sekvenovaním pri použití prajmerov 390-IF a 390-2R. Tento plazmid sa linearizuje štiepením reštrikčnou endonukleázou Pvul (Boehringer Mannheim), ktorý sekvenciu vektoru jedenkrát rozštiepi.

Ako bunečné línie vaječníkov čínskeho chrčka (CHO) pre produkciu MDC sa použije línia DG-44 získaná deléciou génu dhfr (viď Urlaub et al., Celí 33: 405 (1983)). Pre elektroporáciu sa 10⁷ týchto buniek CHO premyje v PBS, resuspenduje v 1 ml PBS, suspenzia sa zmieša s 25 μg linearizovaného plazmidu a prenesie do 0,4cm kyvety. Suspenzia sa podrobí elektroporácii pri použití zariadenia BioRad Gene Pulser (Richmond, Kalifornia, USA) pri 290 V a 960 pF. Transfektanty sa podrobia selekcii rastom na a“ médiu (katalógové číslo 12000 Gibco, Geithersburg, MD, USA) s obsahom 10 % dialyzovaného fetálneho hovädzieho séra (FBS) (Hyclone, Logan, UT, USA), ktoré neobsahuje hypoxantín a tymidín. Bunky z niekoľkých stoviek transfekovaných kolónií sa spoja a opäť navzorkujú na misky s a“ médiom s obsahom metotrexátu (20nM) (Sigma, St. Louis, MO, USA). Kolónie, ktoré prežijú toto selekčné kolo sa izolujú a expandujú v a“ médiu s obsahom metotrexátu (20nM).

E. Purifikácia MDC pre sekvenovanie proteínu

Transfekované klony CHO sa pestujú v plastových miskách pre tkanivové kultúry s a“ médiom do približne 90% konfluencie a potom sa a“ médium nahradí médiom P5, ktoré obsahuje FBS (0,2 až 1,0 %). Médium P5 sa skladá zo zložiek uvedených v tabulke 2. Použité médium bolo zhotovené zo zakúpeného predmiešaného prášku od firmy Hyclone, Logan, UT, y USA) doplnením nasledujúcich prídavných zložiek:

1 hydrogenuhličitan sodný, 3 g/liter (Sigma, St. Louis, MO USA) seleničitan sodný, 2 μg/liter (Sigma)

1% hydrolyzát sójových bobov (Quest International, Naarden, Holandsko)

IX roztok síranu železnatého/EDTA (Sigma) roztok EX-CYTE VLE, 1,45 ml/liter (Bayer, Kankakee, IL, USA)

6. rekombinantný inzulín, 10 μg/ml (Nucellin, Eli Lilly, Indianapollis, IN, USA)

7. Pluronic F-68, 0,1 % (Sigma)

8. glycín, 30 μg/ml (Sigma)

9. etanolamín, 50μΜ (Sigma) a

10. pyrohroznan sodný, lmM (Sigma).

Tabulka 2

Zložka	prášok 5 g/1
	chlorid sodný	4,0
A	chlorid draselný	0,4
N	fosforečnan sodný
0	dibázický, bezvodý	0,07102
R	fosforečnan sodný
G	monobázický.H20	0,0625
A	síran horečnatý, bezvodý	0,1
N	pentahydrát síranu
I	meďnatého z	0,00000125
C	heptahydrát síranu
K	železnatého	0,000417
É	heptahydrát síranu
	zinočnatého	0,0004315
S	nonahydrát dusičnanu
0	železitého	0,00005
L	chlorid vápenatý,
I	bezvodý chlorid horečnatý,	0,11661
	bezvodý	0

A	L-alanín L-arginín.HCI L-arparagín.H20 L-aspartová kyselina	0 0,15 0,075 0,04
M	L-cysteín.HCI.H20	0,12
I	L-glutámová kyselina	0,02
N	L-glutamín	0,5846
0	glycín	0,02
K	L-histidín.HCI.H20	0,04
Y	L-izoleucín	0,15
S	L-leucín	0,15
E	L-lyzín.HCl	0,1
L	L-metionín	0,05
I	L-prolín	0,05
N	L-fenylalanín	0,05
Y	L-serín	0,075
	L-treonín	0,075
	L-tryptofán dvojsodná sol	0,02
	L-tyrozínu.2H2O	0,075
	L-valín	0,125
	biotín	0,001
V	D-kalc iumpantotenát	0,0025
I	cholínchlorid	0,015
T	kyselina listová	0,005
A	i-inozitol	0,175
M	nikotínamid	0,005
z I	pyridoxal.HCI	0,005
N	pyridoxín.HCI	0,005
Y	riboflavín	0,001
	tramín.HCI	0,005
	kyanokobalamín	0,001

	D-glukóza	1,0
	sodná soľ hypoxantínu	0,005
	tymidín	0,005
I	putrescín.2HC1	0,000081
N	pyrohroznan sodný	0,11004
É	kyselina linolová	0,0001
	DL-alfa-lipoová kyselina	0,0002
	fenolová červeň, sodná soľ	0,0086022

Po ďalších 2 dňoch v kultúre sa alikvót každého supernatantu zmieša s rovnakým objemom acetónu. Vyzrážané proteíny sa peletizujú centrifugáciou, frakcionujú na 18% gélu Tris Glycine (Novex) a blotujú na membránu PVDF (Millipore, Bedford, MA, USA).

MDC viazaný k membráne sa deteguje pomocou monoklonálnej protilátky (príprava - príklad 18). Bunky z klonu vylučujúceho najvyššiu hladinu MDC proteínu (približne 1 μg/ml) sa z misiek odoberú roztokom 0,5 % trypsínu v 5,3mM EDTA (Gibco) a použijú sa pre zaočkovanie suspenznej kultúry v a“ médiu s prísadou 10 % fetálneho hovädzieho séra (FBS).

V priebehu 8 dní sa ku kultúre pridá 5 objemov média P5. Proteíny sa vyzrážajú v supernataňte kultúry prídavkom polyetylénglykolu (s molekulovou hmotnosťou 8 000, výrobok firmy Union Carbide, Danbury, CT, USA) do koncentrácie 200 g/liter a potom frakcionujú na 18% Tris glycínovom géli a potom elektroblotujú na membránu PVDF (Millipore Bedford, MA, USA) v tlmivom roztoku CABS (3-[cyklohexylamino]-l-propánsulfónová kyselina, pH 10,4) (Sigma, St. Louis, MO, USA). Oddelí sa prúžok filtračného papieru pre detekciu MDC analýzou Western Blot pri použití supernatantu hybridomálnej bunečnej línie produkujúci anti-MDC monoklonálne protilátky (pozri príklad 18). Reakčný pás, ktorý migruje pri relatívnej molekulárnej hmotnosti 6,4 kDa sa vystriehne zo zvyšnej časti filtračného papieru.

Pri použití automatického sekvenačného zariadenia (Applied Biosystems Model 473A, Foster City, Kalifornia, USA) sa zistí, že sekvencia u N-konca proteínu je GPYGANMEDS.

Táto sekvencia je identická so sekvenciou prvých 10 zvyškov SEQ ID NO: 2a zodpoveídá N-koncu predvídanej matúrovanéj formy MDC.

F. Purifikácia MDC pre biologické stanovenia

Pre pestovanie vo väčších kultúrach sa bunky CHO exprimujúce MDC nechajú narásť do 80% konfluencie v miskách pre tkanivové kultúry naplnených a médiom. Bunky sa z misiek odstránia spracovaním trypsínom a EDTA a resuspendujú sa pri hustote 3 x 10^ buniek/ml v médiu P5 doplnenom 1 % FBS v rotačných bankách pri 37°C. Podlá potreby sa pridáva ďalšie médium P5 s 1 % FBS tak, aby sa hustota buniek udržala v rozmedzí od 1 x 10⁶ do 3 x 10⁶.

Po 11 dňoch v kultúre sa bunky z média odfiltrujú. Hodnota pH kultivačného média sa nastaví na 6,8 a médium sa nechá prejsť cez stĺpec heparin-Sepharose CL-6B (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA). Stĺpec sa najskôr premyje 0,2M roztokom chloridu sodného v tlmivom roztoku na báze fosforečnanu draselného s pH 7 a potom sa vykoná elúcia lineárnym gradientom od 0,2 do 0,7M roztoku chloridu sodného. Frakcie sa analyzujú na SDS-PAGE a farbením pomocou farbiva Coomasie sa stanoví, ktorá frakcia obsahuje MDC. MDC sa eluuje zo stĺpca približne 0,6M roztokom chloridu sodného.

Frakcie obsahujúce MDC sa spoja a skoncentrujú ultra filtráciou v komore s miešanou kyvetou (Amicon, Beverley, MA, USA) pri použití filtru s vylučovacou medzou molekulovej hmotnosti 3 kDa. Ku koncentrovanému MDC sa pridá oktylglukozid (až do konečnej koncentrácie lOmM) (Boehringer Mannheim Biochemicals) a výsledná zmes sa nechá prejsť stĺpcom Sephacryl HR-100 (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA). Frakcie sa analyzujú na prítomnosť MDC pri použití SDS page. Konečný výťažok MDC proteínu robí približne 0,1 mg/liter supernatantu kultúry a jeho čistota je podlá farbenia Coomasie vyššia ako 95 %.

Príklad 11

Výroba MDC a analógov MDC peptidovou syntézou

Polypeptid MDC a jeho analógy boli pripravené chemickou syntézou peptidov pri použití technológií, ktoré už boli úspešne použité pri výrobe iných chemokinov, ako je 11-8 [Clark-Lewis et al., J. Biol. Chem., 266: 23128 až 23134 (1991)] a MCP-1. Tieto metódy sú výhodné, pretože sú rýchle, spoľahlivé, v prípade krátkych sekvencií, ako sú chemokiny, a umožňujú selektívne zavádzanie nových neprirodzených aminokyselín a iné chemické modifikácie.

Tak napríklad boli MDC a jeho analógy chemicky syntetizované pri použití optimalizovaných stupňovitých postupov v tuhej fáze (Schnolzer et al., Int. J. Pept.

Proteín Res. 40: 180, 1992) založenými na terc.butyloxykarbonylovej (Boe) chémii podlá Merrifielda (J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 až 2154, 1963) pri použití syntetizátoru peptidov Applied Biosystems 430A Peptide Synthesizer (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA). Proteíny boly purifikované pomocou HPLC s reverznou fázou a charakterizované štandardnými metódami, ako je elektrosprejová hmotnostná spektrometria a nukleárna magnetická rezonancia.

Chemicky syntetizovaný MDC, ktorý bol získaný, zodpovedá maturovanej forme rekombinantného MDC, ktorá sa skladá zo zvyškov 1 až 69 zo sekvencie SEQ ID NO: 2. Pre porovnanie chemicky syntetizovaného MDC s rekombinantným MDC produkovaným transfektantmi buniek CHO (pozri príklad 10) bolo použitých niekolko metód. Migrácia na denaturovanom géli SDS-PAGE (18% Tris glycínový gél NOVEX) chemicky syntetizovaného MDC je identická s migráciou rekombinantného MDC. Okrem toho obidva proteíny reagujú podobne pri analýze Western Blot pri použití monoklonáIných a polyklonálnych protilátok vypestovaných proti MDC produkovanému v baktériách (viď dalej, príklad 18). Chemicky syntetizovaný MDC sa tiež správa rovnakým spôsobom ako rekombinantný MDC pri imunoprecipitačných stanoveniach pri použití anti-MDC monoklonálnych protilátok. Tieto štúdie ukazujú, že denaturované a nedenaturované štruktúry chemicky syntetizovaného MDC sa podobajú štruktúram rekombinantného MDC.

Chemickou cestou boli tiež syntetizované nasledujúce analógy MDC

1) MDC (n+1) (SEQ ID NO: 30) skladajúci sa zo zvyšku leucínu nasledovaného zvyškami 1 až 69 zo sekvencie SEQ ID NO: 2

2) MDC (9-69) skladajúci sa zo zvyškov 9 až 69 zo sekvencie

SEQ ID NO: 2

3) MDC-yl (SEQ ID NO: 31) skladajúci sa zo zvyškov 1 až 69 zo sekvencie SEQ ID NO: 2 s nasledujúcimi substitúciami: zvyšky 59 až 60 (Trp-Val) sú nahradené sekvenciou Tyr-Leu

4) MDC-eyfy (SEQ ID NO: 32) skladajúci sa zo zvyškov 1 až 69 zo sekvencie SEQ ID NO: 2 s nasledujúcimi substitúciami: zvyšky 28 až 31 (His-Phe-Tyr-Trp) sú nahradené sekvenciou Glu-Tyr-Phe-Tyr pochádzajúcej z aminokyselinovej sekvencie chemokinu RANTES (zvyšky 26 až 29 zo sekvencie SEQ ID NO: 21)

Pri analógoch MDC (n+1), MDC (9 až 69) a MDC-yl sa očakáva antagonistická účinnosť vzhladom k účinnosti MDC, tzn. účinnosť spočívajúca v inhibícii účinnosti MDC vďaka kompetitívnej väzbe k rovnakému receptoru, ktorý rozpoznáva MDC. Tieto látky môžu alternatívne vyvolávať inhibíciu vďaka tvorbe heterodimérov s natívnym MDC. Z možných účinností analógu MDC-eyfy je možné uviesť inhibíciu MDC opísanú pri skorších analógoch. Na rozdiel od nich sa však môže MDC-eyfy správať podobne ako natívny MDC. Iné účinnosti tohto analógu môžu zahŕňať funkcie, ktoré sú typické pre chemokin RANTES, ako je chemotaxia T-lymfocytov, monocytov alebo eosinofilov.

Okrem toho spadajú do rozsahu vynálezu tiež nasledujúce špecifické alterácie jednotlivých aminokyselín (samotné alebo v kombinácii):

1) nahradenie bázickej aminokyseliny, arginínu v polohe 24 a/alebo lyzínu v polohe 27 v sekvencii SEQ ID NO: 2 nebázickými aminokyselinami;

2) nahradenie tyrozínového zvyšku v polohe 30 sekvencie SEQ ID NO: 2, tryptofánového zvyšku v polohe 59 sekvencie SEQ ID NO: 2 a/alebo valínového zvyšku v polohe 60 sekvencie SEQ ID NO: 2 zvyškom nabitej alebo polárnej aminokyseliny (napríklad serínu, lyzínu, arginínu, histidínu, aspartátu, glutamátu, asparagínu, glutamínu alebo cysteínu); a

3) nahradenie zvyšku glutámovej kyseliny v polohe 50 sekvencie SEQ ID NO: 2 zvyškom bázickej alebo malej nenabitej aminokyseliny (napríklad lyzínu, arginínu, histidínu, glycínu alebo alanínu).

Špecifické analógy vykazujúce tieto alterácie aminokyselín spadajú do rozsahu nasledujúceho vzorca (SEQ ID NO: 25)

Het

Ala

Arg

Leu

Gin

Thr

Ala

Leu

Leu

Val

Val

Leu Val Leu

Leu

Ala

-24

-20

-15

-10

Val

Ala

Leu

Gin

Ala

Thr

Glu

Ala

Gly

Pro

Tyr

Gly Ala A0n

Het

Glu

-5

1

5

Aep

Ser

Val

Cys

Cys

Arg

Asp

Tyr

Val

Arg

Tyr

Arg Leu Pro

Leu

Xaa

10

15

20

Val

Val

Xaa

Hie

Phe

Xaa

Trp

Thr

Ser

Asp

Ser

Cye Pro Arg

Pro

Gly

25

30

35

40

Val

Val

Leu

Leu

Thr

Phe

Arg

Asp

Lys

Xaa

íle

Cys Ala Aep

Pro

Arg

45

50

55

Val

Pro

Xaa

Xaa

Lys

Met

íle

Leu

Aen

Lys

Leu

i Ser Gin

65 kde aminokyselina v polohe 24 je zvolená zo súboru zahŕňajúceho arginín, glycín, alanín, valín, leucín, izoleucín, prolín, serín, treonín, fenylalanín, tyrozín, tryptofán, aspartát, glutamát, asparagín, glutamín, cysteín a metionín; kde aminokyselina v polohe 27 je nezávisle zvolená zo súboru zahŕňajúceho lyzín, glycín, alanín, valín, leucín, izoleucín, prolín, serín, treonín, fenylalanín, tyrozín, tryptofán, aspartát, glutamát, asparagín, glutamín, cysteín a metionín; kde aminokyselina v polohe 30 je nezávisle zvolená zo súboru zahŕňajúceho tyrozín, serín, lyzín, arginín, histidín, aspartát, glutamát, asparagín, glutamín a cysteín; kde aminokyselina v polohe 50 je nezávisle zvolená zo súboru zahŕňajúceho glutámovú kyselinu, lyzín, arginín, histidín, glycín a alanín; kde aminokyselina v polohe 59 je nezávisle zvolená zo súboru zahŕňajúceho tryptofán, serín, lyzín, arginín, histidín, aspartát, glutamát, asparagín, glutamín a cysteín; a kde aminokyselina v polohe 60 je nezávisle zvolená zo súboru zahŕňajúceho valín, serín, lyzín, arginín, histidín, aspartát, glutamát, asparagín, glutamín a cysteín. Pri týchto analógoch polypeptidu MDC sa špecificky očakáva modulácia väzbových vlastností MDC k chemokinovým receptorom a/alebo iným molekulám (napríklad heparínu, glykosaminoglykánom, receptorom erytrocytového chemokinu), ktoré sú považováné za dôležité pri prezentácii MDC k jeho receptoru.

Rekombinantné techniky, ako sú techniky opísané v predchádzajúcich príkladoch, sa tiež môžu použiť pre prípravu analógov polypeptidu MDC. Pri tom sa polynukleotidy kódujúce MDC modifikujú tak, aby kódovali polypeptidové analógy, ktoré sú predmetom záujmu, pri použití dobre známych techník, ako je miestne orientovaná mutagenéza a reťazová reakcia iniciovaná polymerázou (všeobecný prehlad viď Sambrook et al., hore uvedená citácia, kapitola 15). Tieto modifikované polynukleotidy sa exprimujú rekombinantnou cestou a rekombinantné analógy polypeptidu MDC sa purífikujú spôsobom opísaným v predchádzajúcich príkladoch.

Vlastnosti MDC a analógov polypeptidu MDC, ako chemoatraktantu a/alebo vlastnosti pri aktivácii jedného alebo viacerých typov buniek, ktoré sa podieľajú na zápalových procesoch (napríklad T-lymfocytov, monocytov, makrofágov, basofilov, eosinofilov, neutrofilov, žírnych buniek, endoteliálnych buniek, epiteliálnych buniek, fibroblastov apod.) sa skúšajú spôsobmi dobre známymi v tomto odbore, ktoré boli použité pri rade iných chemokinov. Účinnosť natívneho polypeptidu MDC, rekombinantného polypeptidu MDC alebo rekombinantných analógov polypeptidu MDC, ako tiež syntetického polypeptidu MDC a syntetických analógov polypeptidu MDC, ktoré boli purifikované a izolované spôsobom opísaným v jednom alebo viacerých predchádzajúcich príkladoch, sa stanovuje spôsobom opísaným v nasledujúcich príkladoch, v ktorých sa pre ilustráciu používa polypeptid MDC.

Príklad 12

Skúšanie účinkov MDC na bazofily, žírne bunky a eosinofily

Skúšanie účinkov MDC na bazofily, žírne bunky a eosinofily sa vykonáva napríklad spôsobmi opísanými v publikácii Weber et al., J. Immunol. 154: 4166 až 4172 (1995) pre stanovenie účinnosti MCP-1/2/3. Pri týchto spôsoboch sa merajú zmeny volného cytosolického vápnika a uvolňovanie ·' proinflamatorných mediátorov (ako je histamín a leukotrien).

Blokovanie aktivácie týchto buniek sprostredkované chemo^ς kinom vykazuje implikácie pri liečeniach alergických reakcií v pozdnej fáze, pri ktorých má významnú úlohu sekrécia proinf lamatorných mediátorov (Weber et al., hore uvedená citácia) .

Príklad 13

Skúšanie účinností MDC, ako chemoatraktantu a účinností na aktivácie buniek, ktorými sú ludské monocyty/makrofágy a ludské neutrofily

Účinky MDC na ludské monocyty/makrofágy alebo ludské neutrofily sa hodnotia napríklad spôsobmi opísanými v publikácii Devi et al., J. Immunol., 153: 5376 až 5383 (1995) pre hodnotenie aktivácie neutrofilov a makrofágov indukovanej myšiam TCA3. Indexy aktivácie merané pri týchto štúdiách zahŕňajú zvýšenú adhéziu k fibrinogénu, ku ktorej dochádza vďaka aktivácii integrinu, chemotaxii, indukcii reaktívnych dusíkových medziproduktov, respiračnej ruptúry (produkcie superoxidu a peroxidu vodíka) a exocytóze lysozymu a elastáz v prítomnosti cytochalazinu B. Ako uvádzajú Devi et al., sú tieto účinnosti korelované s niekolkými štádiami odpovedi leukocytov na zápal. Táto odpoveď leukocytov (prehlad viď: Springer, Celí. 76: 301 až 314 (1994)) zahŕňa adherenciu leukocytov k endoteliálnym bunkám ciev, migráciu cez endoteliálnu vrstvu, chemotaxiu smerom ku zdroju chemokinov a miestne špecifické uvoľňovanie mediátorov zápalu. Podiel MDC na ktoromkoľvek z týchto štádií poskytuje dôležitý ciel pre klinickú intervenciu zameranú na moduláciu zápalovej odpovedi .

Pri jednom stanovení chemotaxie, ktoré je známe v tomto odbore, modifikovanom stanovení s Boydenovými komorami (Boyden chamber assay), sa leukocyty, ktoré majú byť skúšané, fluorescenčné označia kalceinom 20minútovou inkubáciou s touto látkou pri teplote miestnosti. Označené bunky sa dvakrát premyjú médiom bez séra RPMI, resuspendujú v RPMI s obsahom BSA (2 mg/ml) a potom kvantitatívne pridajú do horných jamiek komôr, ktoré sú oddelené od spodných jamiek polykarbonátovým filtrom (Neuroprobe Inc., Cabin John, MD, USA). MDC, ktorý je zriedený rovnakým médiom ako leukocyty, sa v rôznej koncentrácii pridá do spodných jamiek. Komory sa inkubujú 2 hodiny pri 37°C. Na konci tejto skúšky sa bunky, ktoré nemigrovali membránou, odstránia opláchnutím filtru pomocou PBS a zoškrabnutím gumovým stieracím nožom. Bunky, ktoré migrovali cez filter, sa kvantifikujú zmeraním fluorescencie v jednotlivých jamkách pomocou doskového merača fluorescencie (Fluorescent Plate Reader, Cytof'luor, Millipore Inc., Boston, MA, USA).

Tiež sa vykoná séria experimentov pre stanovenie chemotaktických vlastností MDC. Pri týchto experimentoch sa používajú známe postupy. Najskôr sa stanoví odpoveď ludských jednojadrových buniek na MDC. Tiež sa stanoví účinok MDC na chemotaktickú odpoveď polymorfonukleárnych leukocytov (granulocytov).

Zistilo sa, že MCP-1, ktorý je C-C chemokinom vyvoláva ako verbovanie, tak aktiváciu monocytov, ale zdá sa, že má obmedzenú schopnosť indukovať migráciu makrofágov. Neschopnosť MCP-1 priťahovať makrofágy zrejme koreluje s procesom diferenciácie: pri diferenciácii monocytových buniek dochádza k postupnému znižovaniu odpovedi buniek na MCP-1 (Denholm a Stankus, Cytokine, 7: 436 až 440 (1995)). Zdá sa, že biologické účinnosti MCP-1 korelujú s expresiou tohto chemokinu s ohľadom na to, že sa v monocytoch vyskytuje MCP-1 mRNA, ale jej množstvo v týchto bunkách behom diferenciácie buniek klesá.

Profil expresie MDC sa zdá byt obrátený v porovnaní s opísaným profilom expresie MCP-1; množstvo mRNA pre MDC totiž stúpa pri diferenciácii monocytov na makrofágy. Za účelom zistenia, či tento profil expresie koreluje s biologickou odpoveďou na MDC, boli porovnávané s účinkami MDC na migráciu monocytov a makrofágov.

Pri skúškach chemotaxie a inhibície chemotaxie bol analyzovaný rad typov rôznych leukocytových buniek: ľudské jednojadrové a polymorfonukleárne leukocyty sa izolujú z periférnej krvi pri použití spôsobov známych v tomto odbore (Denholm et al., Amer. J. Pathol. 135: 571 až 580 (1989)). Ďalej sa použije bunečná linia ľudských monocytov, THP-1 (získaná zo zbierky ATCC, Rockville, MD, USA a uchovávaná v kultúre v RPMI s 10% FBS a s prísadou penicilínu a streptomycínu) . Bunky THP-1 sa môžu kultivovať ako monocyty alebo sa pri nich môže indukovať diferenciácia na makrofágy pôsobením forbolmyristátacetátu (PMA) (Denholm a Stankus, Cytokine, 7: 436 až 440 (1995)). V niektorých pokusoch sa použijú monocytické bunky THP-1 a v iných sa použijú monocytické bunky THP-1, pri ktorých bola indukovaná diferenciácia na makrofágy pôsobením forbolmyristátacetátu (PMA). Ďalej sa pripravia peritoneálne makrofágy morčaťa spôsobom opísaným v Yoshimura, J. Immunol. 150: 5025 až 5032 (1993). V krátkosti je možné túto prípravu opísať takto: 2 dni pred odberom buniek sa zvieraťom intraperitoneálnou injekciou podá 3% sterilný tioglykolát (Difco). Makrofágy sa získajú z peritoneálnej dutiny vypláchnutím roztokom chloridu sodného tlmeným fosforečnanom (PBS) s obsahom EDTA (lmM) a glukózy (0,1%). Bunky sa raz premyjú na odstredivke a potom sa použijú pri skúškach chemotaxie spôsobom opísaným ďalej.

Skúšky chemotaktickej účinnosti sa vykonávajú pri použití bunečných prípravkov pripravených hore opísaným spôsobom. Vlastné skúšanie sa uskutočňuje spôsobom opísaným v Denholm a Stankus, Cytometry 19: 366 až 369 (1995) pri použití 96-jamkových komôr (Neuroprobe Inc., Cabin John, MD, USA). Bunky sa označia fluorescenčným farbivom, kalceinom (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Polykarbonátové filtre použité pri tomto stanovení neobsahujú PVP (Neuroprobe Inc.). Pre rôzne typy buniek sa použijú filtre s nasledujúcou velkosťou pórov: monocyty a bunky THP-1 - 5 μιη; polymorfonukleárne leukocyty - 3 μιη; makrofágy morčaťa - 8 μκι.

Bunky označené kalceinom (50 000 buniek) sa resuspendujú v médiu RPMI s obsahom BSA (5 mg/ml) a umiestnia do horných jamiek. MDC alebo iné skúšané látky sa zriedia RPMI s obsahom BSA (konečná koncentrácia MDC je napríklad 25, 50, 100, 250 ng/ml) a umiestnia do spodných jamiek. Po dvojhodinovej inkubácii pri 37°C sa bunky, ktoré nemigrovali filtrom a zostali na jeho hornej strane, odstránia zotrením a filter sa usuší na vzduchu. Pre kontrolu sa pri týchto stanoveniach použije RPMI s BSA (negatívna kontrola) a MCP-1 s koncentráciou 50 ng/ml, ako tiež sérum aktivované 1 % zymosanu (Saz, príprava viď Denholm a Lewis, Amer. J. Pathol. 126: 464 až 474 (1987)) (pozitívne kontroly). Migrácia buniek sa kvantitatívne vyhodnotí v zariadení Fluorescent Plate Reader, Cytofluor, Millipore Inc., Boston, MA, USA. Počet buniek, ktoré migrovali, sa vyjadrí v jednotkách fluorescencie.

Pri skúškach inhibičnej účinnosti sa bunky v horných jamkách komôr suspendujú v MDC pri rôznej koncentrácii (0,005, 0,05, 0,5, 5,0 a 50 ng/ml). Spodné jamky komôr sa naplnia buď samotným médiom alebo chemotaktickými faktormi, tzn. MCP-1 alebo sérom aktivovaným zymosanom (Zas). Inhibícia sa zisťuje porovnaním počtu buniek, ktoré migrovali do MCP-1 alebo Zas v neprítomnosti MDC s počtom buniek, ktoré migrovali pri zvyšujúcich sa koncentráciách MDC. Príprava buniek a kvantitatívne vyjadrenie výsledkov sa robia presne tak, ako to bolo opísané hore v súvislosti so skúškami chemotaxie. Počet buniek, ktoré migrovali, sa vyjadrí v jednotkách fluorescencie.

Ako ukazuje obr. 2, MDC neindukuje migráciu jednojadrových buniek pochádzajúcich z THP-1, ale skôr takú migráciu inhibuje v koncentrácii v rozmedzí od 10 do 100 ng/ml. Iné C-C chemokiny, ako je MCP-1 a RANTES, v tomto koncentračnom rozmedzí obvykle indukujú maximálnu chemotaxiu monocytov.

Ako ukazuje obr. 3, MDC nemá v koncentrácii rozmedzia od 0,001 do 100 ng/ml žiadny výsledný účinok na migráciu granulocytov. Pokiaľ sa týka neprítomnosti účinku na chemotaxiu granulocytov, je MDC podobný iným už prv opísaným C-C chemokinom.

Odpoveď makrofágov a monocytových buniek THP-1 na MDC je znázornená na obr. 4. Makrofágy (plné krúžky) migrujú k MDC v rozsahu závislom od dávky, pričom optimálna aktivita sa dosahuje pri koncentrácii 50 ng/ml. Pokles chemotaktickej odpovedi makrofágov na MDC pri vyšších koncentráciách (100 ng/ml) odráža desenzitizáciu buniek, ktorá je typická pre väčšinu chemotaktických faktorov pri vyšších koncentráciách (Falk a Leonard, Infect. Immunol. 32: 464 až

468 (1981)). Monocytické bunky THP-1 (prázdne krúžky) však k MDC nemigrujú.

Chemotaktická účinnosť MDC na makrofágy sa ďalej overí v experimentoch pri ktorých sa používajú izolované peritoneálne makrofágy morčaťa. MDC indukuje migráciu makrofágov morčaťa, v rozsahu závislom od dávky (viď obr. 5) v koncentrácii v rozmedzí od 100 do 500 ng/ml. Koncentrácia, ktorá je potrebná na indukciu migrácie makrofágov morčaťa, je približne desaťnásobkom koncentrácie potrebnej v prípade ľudských buniek (pozri obr. 4). Podobné koncentračné rozdiely v maximálnej biologickej účinnosti ľudských chemokinov pri j iných druhoch boli oznámené tiež pri MCP-l (viď Yoshimura, J. Immunol. 150: 5025 až 5032 (1993)).

Výsledky týchto experimentov ukazujú, že biologické účinnosti MDC sú spojené s diferenciáciou monocytov na makro fágy. Naproti tomu, MCP-1 (Yoshimura , J. Immunol. 150: 5025 až 5032 (1993)) indukuje chemotaxiu makrofágov, ale nie monocytov .

Schopnosť MDC priťahovať makrofágy ukazuje, že tento chemokin by mohol vyvolávať indukciu fokálnej akumulácie tkanivových makrofágov. Akumulácia tkanivových makrofágov v špecifických oblastiach je dôležitá pri tvorbe granulomov, pri ktorej pľúcne makrofágy obklopujú a uzatvárajú cudzie častice alebo relatívne nerozložiteľné bakteriálne patogény, ako je Mycobacterium sp. (Adams, Am. J. Pathol., 84: 164 až 191 (1976)).

Pri niektorých chorobách, ako je artritída, je akumulácia makrofágov považovaná za škodlivú a deštruktívnu. Schopnosť MDC zvyšovať chemotaxiu makrofágov ukazuje na terapeutickú použiteľnosť inhibítorov MDC podľa tohto vyná65 lezu pre prevenciu, zníženie alebo elimináciu akumulácie makrofágov v tkanivách.

Výsledky skúšania chemotaxie pri použití jednojadrových ľudských buniek, ktoré sú zhrnuté na obr. 2, naznačujú, že by MDC mohol inhibovat migráciu buniek. V neprítomnosti MDC migrujú monocytové bunky THP-1 k MCP-1 (viď obr. 6; koncentrácia MDC 0 ng/ml). Keď sú však bunky vystavené pôsobeniu MDC, chemotaktická odpoveď na MCP-1 (plné krúžky) sa zníži. MDC v koncentrácii v rozmedzí od 0,005 do 0,5 ng/ml inhibuje chemotaktickú odpoveď monocytov na MCP-1. Napriek tomu, že MDC inhibuje chemotaktickú odpoveď monocytov na MCP-1, neexistuje žiadny významný účinok MDC na chemokinézu alebo náhodnú migráciu, ako to ukazujú počty buniek, ktoré migrovali do samotného média (prázdne krúžky; RPMI s BSA) buď v prítomnosti, alebo v neprítomnosti MDC.

Inhibičná účinnosť MDC na chemotaxiu monocytov ukazuje na terapeutickú užitočnosť MDC pri liečbe niekoľkých chronických zápalových stavov, ako je ateroskleróza, artritída a pulmonárna fibróza, pri ktorých chemotaxia monocytov zrejme hrá dôležitú patogénnu úlohu. Zvýšenie účinnosti MDC pri takých chorobách by mohlo mat za následok zníženú migráciu monocytov do tkanív, a teda zoslabnutie prudkosti symptómov choroby.

Príklad 14

Skúška inhibície rastu nádoru in vivo pri použití MDC

Inhibičné vlastnosti MDC na rast národu sa skúšajú napríklad pri použití modifikovaného protokolu, ktorý opísali Laning et al., J. Immunol. 153: 4625 až 4635 (1994) pre stanovenie inhibičných vlastností myšieho TCA3 na rast nádorov. cDNA kódujúca MDC sa transfekuje elektroporáciou do myelomárnej bunečnej línie J558 (zbierka American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA). Transfektanty sa podrobia screeningu na produkciu MDC pri použití štandardných techník, ako je ELISA (Enzyme-Linked Immunoadsorbent Assay) pri použití monoklonálnej protilátky vyvinutej proti MDC, ako je to opísané v príklade 18. Bolus 10⁶ buniek klonu produkujúceho MDC sa subkutánnou injekciou podá do spodného pravého kvadrantu myšej BALB/C. Pre porovnanie sa kontrolným myšiam injekčné podá 10⁶ netransfekovaných buniek. Pre porovnanie účinnosti MDC pri inhibícii rastu nádoru sa merí rýchlosť a početnosť tvorby nádorov pri týchto dvoch skupinách zvierať. Povaha bunečného infiltrátu, ktorá je spojená s nádorovými bunkami sa identifikuje histologický. Okrem toho sa rekombinantný MDC (20 ng) zmieša s netransfekovanými bunkami J558 a vzniknutý prípravok sa v dávke 20 ng/deň injekčné podáva do nádorov pochádzajúcich z týchto buniek pre stanovenie účinku MDC exogénne podaného do nádorových buniek.

Príklad 15

Intraperitoneálne injekčné stanovenie

Bunky, ktoré zodpovedajú na MDC in vivo sa stanovia tak, že sa 1 až 1000 ng purifikovaného MDC injekčné podá do intraperitoneálnej dutiny myši alebo iného cicavca (napríklad králika alebo morčaťa) spôsobom opísaným v Luo et al., J. Immunol. 153: 4616 až 4624 (1994). Po injekcii sa z periférnej krvi a z peritoneálnej dutiny izolujú leukocyty, ktoré sa identifikujú farbením pomocou súpravy Diff Quick Kit (Baxter, McGraw, IL, USA). V rôznom čase sa merí profil leukocytov za účelom stanovenia kinetiky výskytu rôznych typov buniek. Pri separátnych pokusoch sa spolu s MDC injekčné podávajú neutralizačné protilátky zamerané proti MDC (príklad 18) na potvrdenie, že k infiltrácii leukocytov došlo vďaka aktivite MDC.

- 67 Príklad 16

In vivo skúšanie aktivity - subkutánne injekcie

Vlastnosti MDC ako chemoatraktantu sa skúšajú in vivo pri použití prispôsobeného protokolu opísaného v publikácii Meurer et al., J. Exp. Med. 178: 1913 až 1921 (1993). Rekombinantný MDC (10 až 500 pmol/miesto) sa injekčné intradermálne podáva vhodnému cicavcovi, napríklad psovi alebo králikovi. Infiltrácia buniek v mieste injekcie sa histologickými metódami stanovuje po 4 a 24 hodinách. Prítomnosť MDC sa potvrdí imunocytochémiou pri použití protilátok zameraných proti MDC. Povaha bunečného infiltrátu sa identifikuj farbením pomocou súpravy Baxter's Diff Quick Kit.

Príklad 17

Skúška myelosupresívnej účinnosti

Myelosupresívna účinnosť MDC sa skúša tak, že sa myšiam alebo iným cicavcom (napríklad králikom alebo morčaťom) injekčné podá MDC, napríklad spôsobom opísaným v Maze et al., J. Immunol., 149: 1004 až 1009 (1992), za účelom stanovenia myelosupresívneho účinku ΜΙΡ-Ια. Myšiam C3H/HeJ (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA) sa intravenóznou injekciou v jedinej dávke podá 0,2 až 10 μg rekombinantného MDC. Myelosupresívny účinok chemokinu sa stanoví zmeraním rýchlosti cyklovania myeloidných progenitorových buniek vo femorálnej kosti a slezine. Potlačenie rastu ει delenia proge nitorových buniek má klinické implikácie pre liečbu pacientov, na ktoré je aplikovaná chemoterapia alebo ožiarovanie. Myeloprotektívny účinok takého liečenia chemokinom bol demonštrovaný na predklinických modeloch (viď publikácia

I

Dunlop et al., Blood 79: 2221 (1992)).

Pre meranie účinku MDC na myelosupresiu bolo tiež použité in vitro stanovenie, ktoré bolo uskutočnené spôsobom opísaným skôr v súvislosti s derivátmi chemokinov, interleukinom-8 (11-8) a faktorom krvných doštičiek 4 (PF-4) (viď Daly et al., J. Biol. Chem., 270: 23282 (1995)). Použitú skúšku je možné v krátkosti opísať takto: Normálne ludské bunky kosťovej drene s nízkou hustotou (hustota menšia ako 1,077 g/cm) sa navzorkujú na 0,3% agarové kultivačné médium s 10% fetálneho hovädzieho séra (HyClone, Logan, UT, USA), rekombinantným humánnym GM-CSF (100 jednotiek/ml) (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) a rekombinantným ludským Steelovým faktorom (50 ng/ml) (Immunex Corp., Seattle, WA, USA) v neprítomnosti (kontrolný pokus) alebo v prítomnosti MDC pre stanovenie prekurzorov granulocytov-makrofágov. Pre stanovenie jednotiek vytvárejúcich kolónie granulocytov erytroid myeloid megakaryocytov (granulocyte erythroid myeloid megakaryocyte colony forming units - CFU-GEMM) a jednotiek vytvárejúcich erytroidnú ruptúru (erythroid burst forming unit - BFU-E) sa bunky pestujú v 0,9% metylcelulózovom kultivačnom médiu v prítomnosti rekombinantného ludského erytropoietinu (1 až 2 jednotky/ml) v kombinácii 50 ng/ml Steelovho faktoru. Počet kolónií v miskách sa zisťuje po inkubácii pri 37°C v atmosfére so zníženým obsahom kyslíka (5 %) počas 14 dní. Kombinácia GM-CSF a Steelovho faktoru alebo erytropoietinu a Steelovho faktoru umožňuje detekciu velkých kolónií (obyčajne obsahujúcich viac ako 1000 buniek v jednej kolónii), ktoré pochádzajú z časných menej zrelých podmnožín CFU-GM, CFU-GEMM a BFU-E.

Príklad 18

Protilátky proti íudskému MDC

A. Monoklonálne protilátky

Pre získanie monoklonáIných protilátok bol použitý nasledujúci potup: Rekombinantný MDC získaný rozštiepením fúzovaného proteínu GST-MDC spôsobom opísaným v príklade 6 sa použije na imunizáciu myši. Okrem toho sa iná myš imunizuje chemicky syntetizovaným peptidom zodpovedajúcim N-koncu maturovanej formy MDC (zvyšky 1 až 12 zo sekvencie SEQ ID NO: 2). Tento peptid sa syntetizuje v syntetizátore peptidov Applied Biosystems Model 473A (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA) a konjuguje k hemocyaninu Keyhole Lympet Hemocyanine (Pierce) podía odporúčania výrobca. Pre úvodné ošetrenie sa použije subkutánna injekcia približne 10 μ9 proteínu MDC alebo konjugovaného peptidu v podobe emulzie v Freundovom úplnom adjuvans. Ďalšie alikvóty proteínu MDC sa emulgujú vo Freundovom neúplnom adjuvans v intervaloch 2 až 3 týždňov a tiež sa injekčné podajú. Pred podaním záverečnej prefúznej posilňovacej dávky (prefusion boost) sa očkovaným myšiam odoberie vzorka séra. Sérum sa skúša analýzou Western blot, aby sa v ňom potvrdila aktivita s proteínom MDC. Ako prefúzna posilňovacia dávka sa myši injekčné podá MDC v PBS a 4 dni potom sa myš usmrtí a vyberie sa jej slezina. Slezina sa umiestni do 10 ml média bez séra RPMI 1640 a rozmelnení medzi dvoma mikroskopickými sklíčkami z íadovaného skla ponorenými v médiu bez séra RPMI1640 (Gibco, Kanada) doplnenom L-glutamínom (2mM), pyrohroznanom sodným (lmM), penicilínom (100 jednotiek/ml), streptomycínom (100 μ9/ιη1) na suspenziu jednotlivých buniek. Vzniknutá suspenzia buniek sa prefiltruje cez sterilné bunečné sito Nitex (70 mesh, veíkosť oka 212 μιη) (Becton, Dickinson, Parsipanny, New Jersey, USA), 2 x premyje pri 5 minútovom odstreďovaní (200 x g) počas 5 minút a vzniknutá peleta sa resuspenduje v 10 ml média bez séra RPMI. Tymocyty odobrané trom naivným myšiam Balb/c sa pripravia rovnakým spôsobom a použijú sa ako vrstvy Feeder Layer. Myelomárne bunky NS-1 udržiavané v logaritmickej fáze v médiu RPMI s 10% fetálneho hovädzieho séra (FBS) (HyClone Laboratories Inc., Logan, Utah, USA) počas 3 dní pred fúziou sa 5 minút odstreďujú pri 200 x g a vzniknutá peleta sa 2 x premyje spôsobom opísaným v predchádzajúcom odseku.

Slezinové bunky (2 x 10⁸) sa zmiešajú s 4 x 10⁷ buniek NS-1 a odstredia, pričom sa supernatant odsaje.

Bunečná peleta sa rozruší poklepom na skúmavku a k bunkám sa v priebehu 1 minúty za miešania pridajú 2 ml polyetylénglykolu PEG 1500 (50% roztok v 75mM HEPES s pH 8,0, teplota 37°C (Boehringer Mannheim). Potom sa behom 7 minút pridá 14 ml média bez séra RPMI. Potom sa pridá ďalších 16 ml RPMI a bunky sa 10 minút odstreďujú pri 200 x g. Supernatant sa odloží a peleta sa resuspenduje v 200 ml RPMI s obsahom FBS (15%), hypoxantinu sodného (ΙΟΟμΜ), aminopterinu (0,4μΜ), tymidínu (HAT, Gibco) (16μΜ), 11-6 (Boehringer Mannheim) (25 jednotiek/ml) a tymocytov (1,5 x 10° ml ^x). Suspenzia sa navzorkuje na desať 96-jamkových platní s plochým dnom pre tkanivové kultúry (Corning, Corning, New York, USA).

V deň 2, 4 a 6 po fúzii sa z každej jamky z misiek, v ktorých prebieha fúzia, odoberie 100 μΐ média a odobrané médium sa nahradí čerstvým médiom. V deň 8 sa fúzia skúša screeningom metódou ELISA. Pri tomto stanovení sa zisťuje prítomnosť myšieho IgG naviazaného na MDC nasledujúcim spôsobom: misky Immulon 4 (Dynatech, Cambridge, MA, USA) sa behom dvoch hodín pri 37°C potiahnu MDC (25mM roztok v Tris s pH 7,5) v množstve 100 ng/jamka. Poťahovací roztok sa odtiahne a do každej jamky sa pridá 200 μΐ blokovacieho roztoku (0,5% želatína z kože ryby (Sigma) v médiu CMF-PBS) a jamky sa inkubujú 30 minút pri 37’C. Potom sa blokovací roztok odsaje a pridá sa 50μ1 supernatantu kultúry. Po 30minútovej inkubaci pri 37°C a trojnásobnom premytí PBS s obsahom Tween 20 (0,05%, PBST) sa pridá 50 μΐ konjugátu chrenovej peroxidázy s kozím protimyším IgG(fc) (Jackson, ImmunoResearch, West Grove, Pensylvánie, USA) zriedeným pomocou PBST v pomere 1 : 7000. Misky sa inkubujú hore opísaným spôsobom, x premyjú PBST a potom sa k nim pridá 100 μΐ substrátu skladajúceho sa z o-fenyléndiamínu (Sigma) (1 mg/ml) a peroxidu vodíka (30% peroxid vodíka v lOOmM citrátovom tlmivom roztoku s pH 4,5) (0,1 μΐ/ml). Farebná reakcia sa zastaví po minútach prídavkom 50 μΐ 15% kyseliny sírovej. V čítacom zariadení pre misky (Dynatech) sa zistí hodnota A_49Q.

U zvolených jamiek, v ktorých prebehla fúzia sa vykoná dvojité klonovanie, pri ktorom sa uskutoční zriedenie do 96-jamkových platní a potom sa po 5 dňoch zisťuje počet kolónií v jamkách. Monoklonálne protilátky produkované hybridómami sa izotypujú pri použití systému Isostrip (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA).

Anti-MDC protilátky sa dalej charakterizujú blotovaním (Western blot) proti rekombinantnému MDC produkovanému . hore opísaným spôsobom v E. coli alebo bunkách cicavca CHO.

Pre prípravu blotu sa približne 3 μΐ sedimentovaných buniek • (transformované bunky E. coli produkujúce MDC; transfekované bunky CHO produkujúce MDC; netransformované bunky E. coli (kontrolný pokus) a netrasfekované bunky CHO (kontrolný pokus)) rozdelí v štandardnom preparačnom vzorkovom tlmivom roztoku obsahujúcom SDS (dodecylsulfát sodný) a DTT (ditiotreitol) (Sambrook et al., hore uvedená citácia). Po povarení sa lyzáty frakcionujú denaturáciou na SDS-PAGE (18% akrylamidový Tris glycínový gél NOVEX) a elektroblotujú na PVDF membrány (Millipore, Bedford, MA, USA). MDC monoklonálne protilátky sa zriedia na koncentráciu 0,7 μg/ml v PBS pre použitie pri blotovaní Western. Pri tom sa použijú štandardné techniky (pozri hore uvedenú citáciu Sambrook et al.). Ďalej sa urobí prídavná kontrola spočívajúca v skúšaní monoklonáIných protilátok na krížovú reaktivitu s blotmi Western úplných tkanivových lyzátov z ludskej kože, krčných mandlí a týmusu.

Jedna z anti-MDC monoklonáIných protilátok, ktorá bola označená ako monoklonálna protilátka 191D reaguje silne s rekombinantným MDC produkovaným ako v baktériách, tak v bunkách cicavcov. Táto protilátka okrem toho vykazuje veľmi malú reaktivitu pozadia proti baktérii, bunečnej línii bunek cicavcov CHO alebo skúšaného úplného ľudského tkaniva. Táto protilátka ďalej tiež vykazuje schopnosť imunoprecipitácie rekombinantného MDC pochádzajúceho z buniek CHO, keď sa použijú štandardné imunoprecipitačné protokoly (Sambrook et al., hore uvedená citácia).

Hybridomálna bunečná línia produkujúca monoklonálnu protilátku 191D (označená názvom hybridom 191D) bola uložená v kolekcii American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA) za podmienok Budapeštianskej dohody (dátum uloženia: 4. júna 1996; číslo , sbírky ATCC: HB-12122). Dostupnosť uloženého materiálu nie je možné považovať za licenciu k vykonávaniu tohto vynálezu,

I ktoré by bolo považované za porušenie práv udelených v jednotlivých štátoch príslušnými patentovými úradmi.

B. Polyklonálne protilátky

Polyklonálne protilátky proti MDC boli vypestované v králikoch pri použití štandardných protokolov (Sambrook et al, hore uvedená citácia). V krátkosti je možné použitý postup charakterizovať takto: Rekombinantný proteín MDC produkovaný ako fúzovaný proteín GST-MDC (pozri hore) sa zriedi v PBS, emulguje vo Freundovom úplnom adjuvans a subkutánnou injekciou podá králikom. V intervaloch 3 a 6 týždňov sa ďalší MDC zriedený PBS emulguje vo Freundovom neúplnom adjuvans a vzniknutý prípravok sa subkutánne podá rovnakým králikom. 10 dní po treťom očkovaní sa králikom odoberie sérum a lOx zriedi roztokom chloridu sodného tlmeného Tris s obsahom namáčadla Tween 20 (0,5%) (TBS-T, viď publikácia Sambrook et al.) za účelom charakterizácie blotovaním Western proti rekombinantnému MDC, ktorá bola opísaná hore.

Príklad 19

Stanovenie vápnikového toku

Zmeny intracelulárnej koncentrácie vápniku, ktoré sú charakteristické pre aktiváciu buniek chemokinmi, boli sledované v niekoľkých bunečných líniách pri použití stanovenia vápnikového toku, ktoré je dobre známe v tomto odbore. Použitý postup je možné v krátkosti opísať takto: Bunky sa inkubujú v 1 ml úplného média obsahujúceho Fura-2/ΑΜ (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) (ΙμΜ) počas 30 minút pri teplote miestnosti, raz sa premyjú a resuspendujú v D-PBS na koncentráciu približne 10⁶ buniek/ml.

Suspenzia buniek (2 ml) sa umiestni do kontinuálne 1 miešanej kyvety (37°C) fluorimetru (AMINCO-Bowman Šerieš 2,

Rochester, NY, USA). Koncentrácia intracelulárneho vápnika sa zisťuje na základe fluorescencie, ktorá sa monitoruje pri emisnej vlnovej dĺžke 510 nm, pričom prepínanie na excitačnú vlnovou dĺžku 340 nm a 380 nm sa robí každých 0,5 s. Pomer emisie nameranej v prípade excitácie pri 340 nm k emisii nameranej v prípade excitácie pri 380 nm zodpovedá hladine intracelulárneho vápnika.

Hore uvedenej skúške boli podrobené nasledujúce bunečné línie: ludská embryonálna obličková bunečná línia HEK-293 stabilne transfekovaná putatívnym génom receptoru chemokinu V28 (Raport et al., Gene, 163: 295 až 299 (1995)); bunky HEK-293 stabilne transfekované génom receptoru chemokinu CCR5 [Samson et al., Biochemistry, 35: 3362 až 3367 (1996) a d’alej tiež US patentová prihláška s poradovým číslom 08/575 967 podaná 20. decembra 1995, ktorá bola prevedená na rovnakého majitela a ktorá je dosial v konaní;

R citácia tejto prihlášky predstavuje náhradu za prenesenie j jej celého obsahu do opisu tohto vynálezu; v tejto prihláške v

sú opísané látky, ktoré sú receptormi chemokinu a spôsoby vzťahujúce sa k týmto látkam, vrátane CCR5 (ktorý je v citovanej prihláške označovaný názvom 88C)], bunečná línia ludských monocytov THP-1, bunečná línia epitelu ludských plúc A-549 a bunečná línia ludských fibroblastov IMR-90. Žiadna z týchto bunečných línií nevykazovala vápnikový tok v odpovedi na rekombinantný proteín MDC. Silná odpoveď transfektantov HEK-293 na trombín (pozitívna kontrola) ukazuje, že stanovenie bolo platné. Okrem toho bunky THP-1 vykazovali silnú odpoveď na obchodne dostupné chemokiny MCP-1 a MCP-3 (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA) pri koncovej koncentrácii 25 ng/ml. Žiadne ďalšie stimuly neboli skúšané u bunečných línií A-549 a IMR-90.

Príklad 20

Inhibícia proliferácie HIV

Niekolko C-C chemokinov bolo implikovaných pri potlačovaní proliferácie vírusu humánnej imunodeficience (HIV), ktorý je kauzatívnym činidlom syndrómu získanej imunitnej nedostatočnosti (AIDS) (viď Gocchi et al., Science 270: 1811 (1995)). Antiproliferatívna účinnosť MDC proti HIV bola meraná spôsobom opísaným v hore uvedenej citácii Gocchi et al. Pri tejto skúške sa línia T-buniek CD4⁺ akútne infikuje kmeňom HIV a kultivuje v prítomnosti rôznych koncentrácií MDC. Po 3 dňoch sa k bunkám pridá čerstvý roztok MDC v kultivačnom médiu. Po 5 až 7 dňoch od infekcie sa merí hladina HIV skúšaním supernatantu kultúry na prítomnosť HIV p24 antigénu pri použití obchodne dostupnej súpravy pre skúšku ELISA (Coulter, Miami, FL, USA).

Protilátky proti MDC boli skúšané na svoju schopnosť neutralizovať supresívnu účinnosť produkovanú humánnymi lymfocytmi (Gocchi, hore uvedená citácia). Pri skúškach r inhibíce HIV boli tiež skúšané chemicky syntetizované analógy

MDC (pozri príklad 11) alebo analógy produkované rekombinantnými metódami.

Príklad 21

Účinky MDC na proliferáciu fibroblastov

Okrem schopnosti priťahovať a aktivovať leukocyty bola pri niektorých chemokinoch, ako je 11-8, zistená schopnosť ovplyvňovať proliferáciu neleukocytových. buniek (viď Tuschil, J. Invest. Dermatol 99: 294 až 298 (1992)). Fibroblasty sú v tele dôležité pre štruktúrnu integritu väčšiny tkanív. Proliferácia fibroblastov je dôležitá pre liečbu rán a v odpovedi na poškodenie, ale môže byť tiež škodlivá, ako je to v prípade chronických zápalových chorôb, ako je píúcna fibróza (Phan v Immunology of Inflammation, Elsevier (1983), str. 121 až 162).

Pre stanovenie účinkov MDC na proliferáciu fibroblastov bola použitá skúška s proliferáciou buniek in vitro. Úudské fibroblasty (CRL-635) získané z kolekcie ATCC boli uchovávané v kultúre s DMEM obsahujúcej FBS (10 %) a antibiotiká (1 %). Skúška proliferácie bola vykonávaná a kvan- 76 titatívne vyhodnocovaná spôsobom opísaným v tomto odbore, viď Denholm a Han, Amer. J. Pathol., 134: 355 až 363 (1989). Túto skúšku je možné v krátkosti opísať nasledujúcim spôsobom: V deň 1 sa bunky (2,5 x 10³ buniek/jamka) navzorkujú na 96-jamkové platne do DMEM s FBS (10 %). V deň 2 (24 hodín po navzorkovaní buniek) sa médium nad bunkami vymení za médium bez séra DMEM. V deň 3 sa médium z buniek odstráni a nahradí MDC zriedeným DMEM s obsahom FBS (0,4 %). V deň 5 sa do každej jamky pridá ³H-tymidín (1 μΰϊ) a pokračuje sa v inkubácii ďalších 5 hodín. Bunky sa zoberú na filtroch zo sklenených vláken. Proliferácia buniek sa vyjadrí v počtoch rozpadov za minútu (cpm) ³H-tymidínu zavedeného do fibroblastov. Pri kontrolných experimentoch sa používa základné médium pre toto stanovenie, tzn. DMEM s FBS (0,4 %), ako negatívna kontrola, a DMEM s FBS (10 %), ako pozitívna kontrola.

Ako je zrejmé z obr. 7, ošetrenie pomocou MDC znižuje proliferáciu fibroblastov v rozsahu, ktorý je závislý od dávky. Podobná inhibícia proliferácie fibroblastov bola tiež pozorovaná pri použití MDC získaného purifikáciou z buniek CHO (plné krúžky) a chemicky syntetizovaného MDC (prázdne krúžky). Antiproliferatívny účinok MDC na fibroblasty ukazuje na terapeutickú použiteľnosť MDC pri liečbe chorôb, ako je pľúcna fibróza a nádorové choroby, pri ktorých predstavuje zvýšená alebo nekontrolovaná proliferácia buniek dôležitý znak.

Príklad 22

Skúšanie proliferácie buniek

Účinky MDC na proliferáciu epiteliálnych buniek, T-buniek, fibroblastov, endoteliálnych buniek, makrofágov a nádorových buniek boli skúšané metódami známymi v tomto odbore, ako napríklad metódami opísanými v publikácii Denholm et al., Amer. J. Pathol. 134: 355 až 363 (1989), a v In Vitro Assays of Lymphocyte Functions v Current Protocols Immunology, časti 3 až 4, Wiley and Sons (1992) pre stanovenie aktivít rastových faktorov. Pri týchto metódach sa merí zvýšenie alebo inhibícia rastu buniek a uvoľňovanie rastových faktorov.

Účinky MDC na proliferáciu epiteliálnych buniek a endoteliálnych buniek boli skúšané pri použití rovnakých postupov, ktoré boli opísané hore v súvislosti s fibro» blastmi (pozri príklad 21).

Účinky na proliferáciu T-buniek boli skúšané pri použití lymfocytov periférnej krve. V krátkosti je možné použitý postup charakterizovať takto: Jednojadrové bunky sa izolujú z periférnej krve spôsobom opísaným v Denholm et et al., Amer. J. Pathol., 135: 571 až 580 (1989). Bunky sa resuspendujú v médiu RPMI s FBS (10 %) a inkubujú cez noc v plastových nádobách pre tkanivové kultúry. Lymfocyty zostanú v suspenznej kultúre a oddelia sa odstredením kultivačného média. Do každej jamky 96-jamkovej platne sa pridá 10⁵ lymfocytov a potom nasleduje trojdenná inkubácia v médiu RPMI doplnenom FBS (10 %) s obsahom PHA (1 μg/ml) a bez

J alebo s MDC (50, 125, 250 alebo 500 ng/ml). Behom posledných 18 hodín inkubácie sa pridá ³H- tymidín (1 μΰί). Bunky sa zoberú a proliferácia sa vyjadrí rovnakým spôsobom ako v prípade fibroblastov (pozri príklad 21).

Účinky MDC na proliferáciu makrofágov boli stanovené pri použití izolovaných peritoneálnych makrofágov morčaťa získaných spôsobom opísaným v príklade 13. Makrofágy sa umiestnia do 96-jamkových platní obsahujúcich médium RPMI s FBS (10 %) pri hustote 10⁵ buniek/jamka a potom sa vykoná dvojhodinová inkubácia umožňujúca adhéziu buniek. Potom sa médium odstráni a nahradí čerstvým médiom, ktoré MDC buď neobsahuje alebo ktoré obsahuje MDC v koncentrácii 50, 125,

250 alebo 500 ng/ml. Bunky s MDC sa inkubujú 3 dni a proliferácia sa stanovuje rovnakým spôsobom, aký bol opísaný hore v súvislosti s lymfocytmi.

Regulácia proliferácie týchto buniek sprostredkovaná chemokinom vykazuje terapeutické implikácie pri zvyšovaní opravy tkanív po ich poškodení a pri obmedzovaní proliferácie týchto buniek pri chronických zápalových reakciách, ako je psoriáza, fibróza a ateroskleróza a pri neoplastických chorobách.

Príklad 23

Skúšanie in vivo proliferácie fibroblastov

Antiproliferatívne účinky MDC na fibroblasty boli zisťované in vivo pri použití metód opísaných v tomto odbore, ako napríklad metódy publikovanej v Phan a Fantone, Amer. J. Pathol. 50: 587 až 591 (1984), pri ktorej sa používa potkanov model pľúcnej fibrózy, ktorá bola vyvolaná bleomycinom. Tento model je dobre charakterizovaný a umožňuje stanovenie proliferácie fibroblastov a syntézy kolagénu vo všetkých štádiách tejto choroby.

Použitý postup je možné v krátkosti opísať takto: potkany sa rozdelia podľa ošetrenia do 4 skupín:

1) kontrolné potkany, ktorým sa intratracheálnou injekciou podá normálny roztok chloridu sodného,

2) potkany, ktorým sa injekčné podáva roztok chloridu sodného, ale ktoré tiež každý deň obdržia intraperitoneálnu injekciu 500 ng MDC v roztoku chloridu sodného,

- 79 3) potkany ošetrené bleomycinom (Calbiochem, Palo Alto, Kalifornia, USA), ktorý bol podaný intratracheálnou injekciou v dávke 1,5 mg/kg a

4) potkany ošetrené bleomycinom, ktorým bola tiež každý deň podaná intraperitoneálna injekcia 500 ng MDC.

V deň 4, 7, 14, 21 a 28 po počiatočnej intratracheálnej injekcii sa potkany usmrtia (každá skupina obsahuje 3 potkany), vyberú sa ich pľúca a z každého pľúcneho laloku sa odoberú vzorky pre histologické vyšetrenie a zistenie obsahu kolagénu.

Príklad 24

Skúšanie modulátorov MDC

Modulátory účinnosti MDC môžu byť užitočné pri liečbe chorôb alebo symptómov chorôb, na ktorých sa podieľa MDC. Také modulátory môžu byť buď agonistami alebo antagonistami väzby MDC. Ďalej uvedené stanovenia väzby k receptoru predstavujú postupy, ktorými je možné identifikovať také modulátory MDC.

MDC sa označí detegovateľnou značkou, ako napríklad izotopom ¹²⁵I, ³H a ¹⁴C, biotínom alebo európiom. Z prírodných buniek zodpovedajúcich na MDC, ako sú ľudské makrofágy, bunky THP-1 stimulované forbolesterom, ľudské fibroblasty, bunečné línie ľudských fibroblastov alebo makrofágy morčaťa, sa vyrobí prípravok obsahujúci bunečné membrány s receptormi MDC. (Alternatívne sa vyrobí rekombinantný receptorový prípravok z buniek transfekovaných cDNA MDC receptoru, pokiaľ je taká cDNA MDC receptoru identifikovaná a klonovaná). Membránový prípravok sa napríklad vystaví pôsobeniu¹²⁵!80 značeného MDC a inkubuje za vhodných podmienok (napríklad 10 minút pri 37°C). Membrány s akýmkolvek viazaným ¹²⁵IMDC sa potom zhromaždí na filtru vákuovou filtráciou a premyjú sa, aby sa odstránil nenaviazaný ¹²⁵I-MDC. Rádioaktivita spojená s viazaným MDC sa potom kvantifikuje kvapalinovou scintilačnou spektrofotometriou filtrov.

Špecificitu väzby MDC je možné potvrdiť opakovaním hore uvedeného stanovenia v prítomnosti zvyšujúcich sa množstiev neznačeného MDC a meraním úrovne kompetitívnej väzby k receptoru. Tieto väzbové stanovenia sa tiež môžu použiť pre identifikáciu modulátorov väzby MDC k receptoru.

Hore uvedené stanovenie s väzbou k receptoru je tiež možné vykonávať vo verzii modifikovanej nasledujúcim spôsobom: Membránovému prípravku sa okrem značeného MDC exponuje tiež potenciálny modulátor MDC. Pri takto obmenenom stanovení ukazuje zvýšená hladina (množstvo) značky spojenej s membránou, že potenciálny modulátor je aktivátorom väzby MDC. Naopak, znížená hladina (množstvo) značky spojenej s membránou ukazuje, že potenciálny modulátor je inhibítorom väzby MDC. Toto stanovenie je možné využiť pre identifikáciu špecifických aktivátorov a inhibítorov väzby MDC z veľkých knižníc chemických zlúčenín alebo prírodných produktov. Konkrétne sa tento spôsob môže použiť pre rýchly screening väčšieho počtu potenciálnych modulátorov súčasne.

Biologické funkcie MDC, ktoré sú objasnené hore, predstavujú potenciál pre niekoľko klinických aplikácií.

Chemokiny všeobecne priťahujú a aktivujú monocyty a makrofágy (Baggiolini et al., hore uvedená citácia). MDC konkrétne priťahuje makrofágy a inhibuje chemotaxiu monocytov. Expresia MDC v patogénnej oblasti zápalu môže potlačovať chorobné stavy priťahovaním prídavných makrofágov alebo iných leukocytov do miesta choroby, aktiváciou leukocytov, ktoré sú tu už prítomné, alebo indukciou zotrvania leukocytov na tomto mieste. Od inhibície účinnosti MDC, ako chemoatraktanta, je teda možné očakávať potlačení škodlivých zápalových procesov. Významné je, že potenciálny úžitok vyplývajúci z tohto prístupu už bol priamo demonštrovaný v experimentoch s chemokinmi 11-8 a C-X-C, ktoré priťahujú a aktivujú neutrofily. Protilátky zamerané proti 11-8 vykazujú silnú schopnosť inhibovat zápalové choroby sprostredkované neutrofilmi (Harada et al., J. Leukoc. Biol., 56:

559 (1994)). Od inhibície MDC sa očakáva podobný účinok pri r chorobách, pri ktorých hrajú rolu makrofágy, napríklad pri

Crohnovej chorobe, reumatoidnej artritíde alebo ateroskleróze.

Alternatívne môže byt prospešné aj zvýšenie účinku MDC pri niektorých chorobách, pretože bolo ukázané, že chemokiny pozitívne ovplyvňujú hojenie rán a angiogenézu. Exogenný MDC a anogisty MDC by teda mohli byť prospešné pri rekonvalescencii z týchto chorôb.

Okrem toho, myelosupresívny účinok, ktorý bol demonštrovaný pri C-C chemokinu ΜΙΡ-Ια (Maze et al., hore uvedená citácia) naznačuje, že MDC by mohol vykazovať podobnú účinnosť. Taká účinnosť MDC alebo agonistov MDC by mohla poskytovať významný úžitok pacientom liečeným chemoterapiou alebo radiačnou terapií tým, že by znížila škodlivé účinky tohto liečenia na pacientove myeloidné progenitorové bunky.

MDC alebo agonisti MDC by tiež mohli byt klinicky dôležité pri liečbe nádorov, ako naznačuje schopnosť C-C chemokinu TCA3 inhibovat tvorbu nádorov u myší (viď Laning et al., hore uvedená citácia). MDC by mohol priamo alebo nepriamo inhibovat tvorbu nádorov, napríklad priťahovaním a aktiváciou rôznych nešpecifických efektorových buniek do miesta nádoru alebo stimuláciou špecifickej protinádorovej imunity. Antiproliferatívny účinok MDC na fibroblasty poukazuje na terapeutickú užitočnosť MDC pri liečbe takých chorôb, ako je pulmonárna fibróza a nádory, pri ktorých hrá hlavnú úlohu zvýšená alebo neregulovaná proliferácia buniek.

Vynález bol síce objasnený na svojich špecifických formách rozpracovania, ale je zrejmé, že do jeho rozsahu spadajú aj najrôznejšie variácie a modifikácie, pokiaľ sa na nich vzťahujú ďalej uvedené patentové nároky.

ZOZNAM SEKVENCIÍ (1) VŠEOBECNÉ INFORMÁCIE:

(i) PRIHLASOVATEĽ: ICOS Corporation (ii) NÁZOV VYNÁLEZU: Chemokiny pochádzajúce z makrofägov a ich analógy, polynukleotidy, ktoré ich kódujú, použitie týchto chemokinov a farmaceutické prostriedky na ich báze (iii) POČET SEKVENCIÍ: 32 (iv) ADRESA PRE KOREŠPODENCIU:

(A) ADRESÁT: ICOS Corporation (B) ULICA: 22021 20th Avenue S.E.

(C) MESTO: Bothell (D) ŠTÁT: Washington (E) ZEM: Spojené štáty americké (F) PSČ: 98021 (v) STROJNE ČITATEĽNÁ FORMA:

(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilný (C) OPERAČNÝ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Verzia #1.30 (vi) ÚDAJE O SÚČASNEJ PRIHLÁŠKE:

(A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY: PV 293-97 (B) DÁTUM PODANIA: 31. januára 1997 (C) ZATRIEDENIE:

(vii) ÚDAJE O PREDCHÁDZAJÚCEJ PRIHLÁŠKE:

(A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY: 08/558,658 (B) DÁTUM PODANIA: 16. novembra 1995 (vii) ÚDAJE O PREDCHÁDZAJÚCEJ PRIHLÁŠKE:

(A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY: 08/479,620 (B) DÁTUM PODANIA: 7. júna 1995 (viii) INFORMÁCIE O ZÁSTUPCOVI:

(A) MENO: Bušová, Ursínyová, Bušo

Advokátska kancelária (B) ADRESA: Tobrucká 6, 881 02 Bratislava

Slovenská republika (ix) TELEKOMUNIKAČNÉ INFORMÁCIE:

(A) TELEFAX: 0422 242 141 87 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 2923 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) MENO/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTNENIE: 20..298 (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK::

(A) MENO/KĽÚČ: mat_peptid (B) UMIESTNENIE: 92..298 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:1:

GAGACATACA GGACAGAGC ATG GCT CGC CTA CAG ACT GCA CTC CTG GTT GTC 52

Met Ala Arg Leu Gin Thr Ala Leu Leu Val Val -24 -20 -15

CTC Leu

GTC CTC CTT

GCT Ala

GTG GCG CTT Val Ala Leu

CAA GCA ACT GAG

GCA GGC CCC TAC

100

Val Leu

Leu -10

Gin -5

Ala

Thr

Glu

Ala Gly 1

Pro

Tyr

GGC

GCC

AAC

ATG

GAA

GAC

AGC

GTC

TGC

TGC

CGT

GAT

TAC

GTC

CGT

TAC

148

Gly

Ala

Asn

Met

Glu

Asp

Ser

Val

Cys

Cys Arg Asp

Tyr

Val

Arg Tyr

5

10

15

CGT

CTG

CCC

CTG

CGC

GTG

GTG

AAA

CAC

TTC

TAC

TGG

ACC

TCA

GAC

TCC

196

Arg

Leu

Pro

Leu

Arg

Val

Val

Lys

His

Phe

Tyr

Trp

Thr

Ser

Asp

Ser

20

25

30

35

TGC

CCG

AGG

CCT

GGC

GTG

GTG

TTG

CTA

ACC

TTC

AGG

GAT

AAG

GAG

ATC

244

Cys

Pro

Arg

Pro

Gly

Val

Val

Leu

Leu

Thr

Phe

Arg

Asp

Lys

Glu

íle

40

45

50

TGT

GCC

GAT

CCC

AGA

GTG

CCC

TGG

GTG

AAG

ATG

ATT

CTC

AAT

AAG

CTG

292

Cys

Ala

Asp

Pro

Arg

Val

Pro

Trp

Val

Lys

Met

íle

Leu

Asn

Lys

Leu

55

60

65

AGC CAA TGAAGAGCCT ACTCTGATGA CCGTGGCCTT GGCTCCTCCA GGAAGGCTCA 348

Ser Gin

GGAGCCCTAC CTCCCTGCCA TTATAGCTGC TCCCCGCCAG AAGCCTGTGC CAACTCTCTG 408

CATTCCCTGA TCTCCATCCC TGTGGCTGTC ACCCTTGGTC ACCTCCGTGC TGTCACTGCC 468

ATCTCCCCCC	TGACCCCTCT	AACCCATCCT	CTGCCTČCCT	CCCTGCAGTC	AGAGGGTCCT	528
GTTCCCATCA	GCGATTCCCC	TGCTTAAACC	CTTCCATGAC	TCCCCACTGC	CCTAAGCTGA	588
GGTCAGTCTC	CCAAGCCTGG	CATGTGGCCC	TCTGGATCTG	GGTTCCATCT	CTGTCTCCAG	648
CCTGCCCACT	TCCCTTCATG	AATGTTGGGT	TCTAGCTCCC	TGTTCTCCAA	ACCCATACTA	708
CACATCCCAC	TTCTGGGTCT	TTGCCTGGGA	TGTTGCTGAC	ACTCAGAAAG	TCCCACCACC	768
TGCACATGTG	TAGCCCCACC	AGCCCTCCAA	GGCATTGCTC	GCCCAAGCAG	CTGGTAATTC	828
CATTTCATGT	ATTAGATGTC	CCCTGGCCCT	CTGTCCCCTC	TTAATAACCC	TAGTCACAGT	888
CTCCGCAGAT	TCTTGGGATT	TGGGGGTTTT	CTCCCCCACC	TCTCCACTAG	TTGGACCAAG	948
GTTTCTAGCT	AAGTTACTCT	AGTCTCCAAG	CCTCTAGCAT	AGAGCACTGC	AGACAGGCCC	1008
TGGCTCAGAA	TCAGAGCCCA	GAAAGTGGCT	GCAGACAAAA	TCAATAAAAC	TAATGTCCCT	1068
CCCCTCTCCC	TGCCAAAAGG	CAGTTACATA	TCAATACAGA	GACTCAAGGT	CACTAGAAAT	1128
GGGCCAGCTG	GGTCAATGTG	AAGCCCCAAA	TTTGCCCAGA	TTCACCTTTC	TTCCCCCACT	1188
CCCTTTTTTT		TTTGAGATGG	AGTTTCGCTC	TTGTCACCCA	CGCTGGAGTG	1248
CAATGGTGTG	GTCTTGGCTT	ATTGAAGCCT	CTGCCTCCTG	GGTTCAAGTG	ATTCTCTTGC	1308
CTCAGCCTCC	TGAGTAGCTG	GGATTACAGG	TTCCTGCTAC	CACGCCCAGC	TAATTTTTGT	1368
ATTTTTAGTA	GAGACGAGGC	TTCACCATGT	TGGCCAGGCT	GGTCTCGAAC	TCCTGTCCTC	1428
AGGTAATCCG	CCCACCTCAG	CCTCCCAAAG	TGCTGGGATT	ACAGGCGTGA	GCCACAGTGC	1488
CTGGCCTCTT	CCCTCTCCCC	ACTGCCCCCC	CCAACTTTTT	tttttttttt	ATGGCAGGGT	1548
CTCACTCTGT	CGCCCAGGCT	GGAGTGCAGT	GGCGTGATCT	CGGCTCACTA	CAACCTCGAC	1608
CTCCTGGGTT	CAAGTGATTC	TCCCACCCCA	GCCTCCCAAG	TAGCTGGGAT	TACAGGTGTG	1668
TGCCACTACG	GCTGGCTAAT	TTTTGTATTT	TTAGTAGAGA	CAGGTTTCAC	CATATTGGCC	1728
AGGCTGGTCT	TGAACTCCTG	ACCTCAAGTG	ATCCACCTTC	CTTGTGCTCC	CAAAGTGCTG	1788
AGATTACAGG	CGTGAGCTAT	CACACCCAGC	CTCCCCCTTT	TTTTCCTAAT	AGGAGACTCC	1848
TGTACCTTTC	TTCGTTTTAC	CTATGTGTCG	TGTCTGCTTA	CATTTCCTTC	TCCCCTCAGG	1908
CTTTTTTTGG	GTGGTCCTCC	AACCTCCAAT	ACCCAGGCCT	GGCCTCTTCA	GAGTACCCCC	1968
CATTCCACTT	TCCCTGCCTC	CTTCCTTAAA	TAGCTGACAA	TCAAATTCAT	GCTATGGTGT	2028

GAAAGACTAC	CTTTGACTTG	GTATTATAAG	CTGGAGTTAT	ATATGTATTT	GAAAACAGAG	2088
TAAATACTTA	AGAGGCCAAA	TAGATGAATG	GAAGAATTTT	AGGAACTGTG	AGAGGGGGAC	2148
AAGGTGAAGC	TTTCCTGGCC	CTGGGAGGAA	GCTGGCTGTG	GTAGCGTAGC	GCTCTCTCTC	2208
TCTGTCTGTG	GCAGGAGCCA	AAGAGTAGGG	TGTAATTGAG	TGAAGGAATC	CTGGGTAGAG	2268
ACCATTCTCA	GGTGGTTGGG	CCAGGCTAAA	GACTGGGAGT	TGGGTCTATC	TATGCCTTTC	2328
TGGCTGATTT	TTGTAGAGAC	GGGGTTTTGC	CATGTTACCC	AGGCTGGTCT	CílAACTCCTG	2388
GGCTCAAGCG	ATCCTCCTGG	CTCAGCCTCC	CAAAGTGCTG	GGATTACAGG	CGTGAATCAC	2448
TGCGCCTGGC	TTCCTCTTCC	TCTTGAGAAA	TATTCTTTTC	ATACAGCAAG	TATGGGACAG	2508
CAGTGTCCCA	GGTAAAGGAC	ATAAATGTTA	CAAGTGTCTG	GTCCTTTCTG	AGGGAGGCTG	2568
GTGCCGCTCT	GCAGGGTATT	TGAACCTGTG	GAATTGGAGG	AGGCCATTTC	ACTCCCTGAA	2628
CCCAGCCTGA	CAAATCACAG	TGAGAATGTT	CACCTTATAG	GCTTGCTGTG	GGGCTCAGGT	2688
TGAAAGTGTG	GGGAGTGACA	CTGCCTAGGC	ATCCAGCTCA	GTGTCATCCA	GGGCCTGTGT	2748
CCCTCCCGAA	CCCAGGGTCA	ACCTGCCTGC	CACAGGCACT	AGAAGGACGA	ATCTGCCTAC	2808
TGCCCATGAA	CGGGGCCCTC	AAGCGTCCTG	GGATCTCCTT	CTCCCTCCTG	TCCTGTCCTT	2868
GCCCCTCAGG	ACTGCTGGAA	AATAAATCCT	TTAAAÄTAGT	AAAAAAAAAA	AAAAA	2923

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 93 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:2:

Met Ala Arg Leu Gin Thr Ala Leu Leu Val Val Leu Val Leu I.eu Ala

-24 -20 -15 -10

Val Ala Leu Gin Ala Thr Glu Ala Gly Pro Tyr Gly Ala Asn Met Glu

-5 1 5

Asp Ser Val Cys Cys Arg Asp Tyr Val Arg Tyr Arg Leu Pro Leu Arg 10 15 20

Val

Val

Lys

His

Phe

Tyr

Trp

Thr

Ser

Asp

Ser

Cys

Pro

Arg

Pro

Gly

25

30

35

40

Val

Val

Leu

Leu

Thr

Phe

Arg

Asp

Lys

Glu

íle

Cys

Ala

Asp

Pro

Arg

45

50

55

Val

Pro

Trp

Val

Lys

Met

íle

Leu

Asn

Lys

Leu

Ser

Gin

60

65

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 18 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:3:

GACACTATAG AATAGGGC 18 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 17 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:4:

GTAAAACGAC GGCCAGT 17 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:5:

AATTAACCCT CACTAAAGGG (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 22 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:6:

GTAATACGAC TCACTATAGG GC 22 (2) INFORMÁCIE 0 SEQ ID NO:7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 35 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:7:

TCTATCTAGA GGCCCCTACG GCGCCAACAT GGAAG 35 (2) INFORMÁCIE 0 SEQ ID NO:8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 33 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:8:

CACCGGATCC TCATTGGCTC AGCTTATTGA GAA 33 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 29 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:9:

AATGGATCCA CAGCACGGAG GTGACCAAG 29 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 31 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:10:

AGTCAAGCTT AGGGCACTCT GGGATCGGCA C 31 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 45 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:11:

TATCGGATCC TGGTTCCGCG TGGCCCCTAC GGCGCCAACA TGGAA (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 22 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:12:

GAAATCCAGC AAGTATATAG CA (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 36 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:13:

ATTGCCATGG CCGGCCCCTA CGGCGCCAAC ATGGAA 36 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 30 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:14:

GACCAAGCTT GAGACATACA GGACAGAGCA 30 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 29 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:15:

TGGATCTAGA AGTTGGCACA GGCTTCTGG 29 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:16:

CGAAATTAAT ACGACTCACT 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 67 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA

S (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:17:

TGGATCTAGA TCAATTCAAG TCCTCCTCGC TGATCAGCTT CTGCTCTTGG CTCAGCTTAT 60

TGAGAAT 67 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 99 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK::

(A) MENO/KĽÚČ: misc_feature (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: Hu MCP-3 (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK::

(A) MENO/KĽÚČ: Proteín (B) UMIESTNENIE: 1..76 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:18:

Met Lys Ala Ser Ala Ala -20

Leu

Leu Cys Leu Leu Leu Thr Ala Ala Ala

-15

-10

Phe

Ser

Pro

Gin Gly

Leu

Ala

Gin

Pro

Val

Gly

íle

Asn

Thr

Ser

Thr

-5

1

5

Thr

Cys

Cys

Tyr Arg

Phe

íle

Asn

Lys

Lys

íle

Pro

Lys

Gin

Arg

Leu

10

15

20

25

Glu

Ser

Tyr Arg Arg

Thr

Thr

Ser

Ser

His

Cys

Pro

Arg

Glu

Ala

Val

30

35

40

íle

Phe

Lys

Thr

Lys

Leu

Asp

Lys

Glu

íle

Cys Ala

Asp

Pro

Thr

Gin

45

50

55

Lys

Trp

Val

Gin

Asp

Phe

Met

Lys

His

Leu

Asp Lys

Lys

Thr

Gin

Thr

60

65

70

Pro

Lys

Leu

75

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 99 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK::

(A) MENO/KĽÚČ: misc_feature (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: Hu MCP-1 (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK::

(A) MENO/KĽÚČ: Proteín (B) UMIESTNENIE: 1..76 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:19:

Met

Lys

Val

Ser -20

Ala

Ala

Leu

Leu

Cys Leu -15

Leu

Leu

íle

Ala -10

Ala

Thr

Phe

íle

Pro -5

Gin

Gly

Leu

Ala

Gin 1

Pro Asp

Ala

íle 5

Asn

Ala

Pro

Val

Thr 10

Cys

Cys

Tyr

Asn

Phe 15

Thr

Asn

Arg Lys

íle 20

Ser

Val

Gin

Arg

Leu 25

Ala

Ser

Tyr

Arg Arg 30

íle

Thr

Ser

Ser Lys 35

Cys

Pro

Lys

Glu

Ala 40

Val

íle

Phe

Lys

Thr 45

íle

Val

Ala

Lys

Glu íle 50

Cys

Ala

Asp

Pro 55

Lys

Gin

Lys

Trp

Val 60

Gin

Asp

Ser

Met

Asp 65

His Leu

Asp

Lys

Gin 70

Thr

Gin

Thr

Pro Lys Thr 75 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 76 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK::

(A) MENO/KĽÚČ: misc_feature (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: Hu MCP-2

xi)

OPIS SEKVENCIE:

SEQ

ID NO:20:

Gin

Pro

Asp

Ser

Val

Ser

íle

Pro

íle

Thr

Cys

Cys

Phe

Asn

Val

íle

1

5

10

15

Asn

Arg

Lys

íle

Pro

íle

Gin

Arg

Leu

Glu

Ser

Tyr

Thr

Arg

íle

Thr

20

25

30

Asn

íle

Gin

Cys

Pro

Lys

Glu

Ala

Val

íle

Phe

Lys

Thr

Lys

Arg

Gly

35

40

45

Lys

Glu

Val

Cys

Ala

Asp

Pro

Lys

Glu

Arg

Trp

Val

Arg

Asp

Ser

Met

50

55

60

Lys

His

Leu

Asp

Gin

íle

Phe

Gin

Asn

Leu

Lys

Pro

65

70

75

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 91 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK::

(A) MENO/KĽÚČ: misc_feature (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: RANTES (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK::

(A) MENO/KĽÚČ: Proteín (B) UMIESTNENIE: 1..68

	(xi)	OPIS SEKVENCIE:	SEQ	ID NO:21:
	Met	Lys Val Ser Ala	Ala	Ala Leu Ala Val íle Leu íle Ala Thr Ala
		-20		-15 -10
	Leu	Cys Ala Pro Ala	Ser	Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro
		-5		1 5
	Cys	Cys Phe Ala Tyr	íle	Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His íle Lys
	10		15	20 25
	Glu	Tyr Phe Tyr Thr	Ser	Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe
		30		35 40
*	Val	Thr Arg Lys Asn	Arg	Gin Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp
		45		50 55
•	Val	Arg Glu Tyr íle	Asn	Ser Leu Glu Met Ser

65 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 91 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK::

(A) MENO/KĽÚČ: misc_feature (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: MIP-1 (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK::

(A) MENO/KĽÚČ: Proteín (B) UMIESTNENIE: 1..68 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:22:

Met Lys Leu Cys Val Thr Val Leu Ser Leu Leu Met Leu Val Ala Ala -20 -15 -10

Phe Cys Ser Pro Ala Leu Ser Ala Pro Met Gly Ser Asp Pro Pro Thr -5 1 5

Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Arg Glu Ala Ser Ser Asn Phe Val Val

15 20 25

Asp Tyr Tyr Glu Thr Ser Ser Leu Cys Ser Gin Pro Ala Val Val Phe

35 40

Gin Thr Lys Arg Ser Lys Gin Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Ser Trp 45 50 55

Val Gin Glu Tyr Val Tyr Asp Leu Glu Leu Asn 60 65 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 92 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK::

(A) MENO/KĽÚČ: misc_feature (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: MIP-1Ó (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK::

(A) MENO/KĽÚČ: Proteín (B) UMIESTNENIE: 1..70 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:23:

Met Gin

Val Ser Thr Ala -20

Ala Leu Ala Val Leu Leu Cys Thr Met Ala

-15

-10

Leu

Cys

Asn

Gin

Phe

Ser

Ala

Ser

Leu

Ala

Ala

Asp

Thr

Pro

Thr

Ala

-5

1

5

10

Cys

Cys

Phe

Ser

Tyr

Thr

Ser

Arg

Gin

íle

Pro

Gin

Asn

Phe

íle

Ala

15

20

25

Asp

Tyr

Phe

Glu

Thr

Ser

Ser

Gin

Cys

Ser

Lys

Pro

Gly

Val

íle

Phe

30

35

40

Leu

Thr

Lys

Arg

Ser

Arg

Gin

Val

Cys

Ala

Asp

Pro

Ser

Glu

Glu

Trp

45

50

55

Val

Gin

Lys

Tyr

Val

Ser

Asp

Leu

Glu

Leu

Ser

Ala

60

65

70

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 96 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK::

(A) MENO/KĽÚČ: misc_feature (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: 1-309 (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK::

(A) MENO/KĽÚČ: Proteín (B) UMIESTNENIE: 1..73

(xi)	OPIS SEKVENCIE: SEQ	ID NO:24:
Met	Gin íle íle Thr Thr -20	Ala	Leu	Val -15	Cys	Leu	Leu	Leu	Ala -10	Gly	Met
Trp	Pro Glu Asp Val Asp -5	Ser	Lys 1	Ser	Met	Gin	Val 5	Pro	Phe	Ser	Arg
Cys 10	Cys Phe Ser Phe Ala 15	Glu	Gin	Glu	íle	Pro 20	Leu	Arg	Ala	íle	Leu 25
Cys	Tyr Arg Asn Thr Ser 30	Ser	íle	Cys	Ser 35	Asn	Glu	Gly	Leu	íle 40	Phe
Lys	Leu Lys Arg Gly Lys 45	Glu	Ala	Cys 50	Ala	Leu	Asp	Thr	Val 55	Gly	Trp
Val	Gin Arg His Arg Lys 60	Met	Leu 65	Arg	His	Cys	Pro	Ser 70	Lys	Arg Lys

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 93 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK::

(A) MENO/KĽÚČ: Proteín (B) UMIESTNENIE: 1..69 (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK::

(A) MENO/KĽÚČ: misc_feature (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE:

(poznámka: Aminokyselina v polohe 24 je zvolená zo súboru zahŕňajúceho arginín, glycín, alanín, valín, leucín, izoleucín, prolín, serín, treonín fenylalanín, tyrozín, tryptofán, aspartát, glutamát, asparagín, glutamín, cysteín a metionín.) (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK::

(A) MENO/KĽÚČ: misc_feature (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE:

(poznámka: Aminokyselina v polohe 27 je nezávisle zvolená zo súboru zahŕňajúceho lyzín, glycín, alanín, valín, leucín, izoleucín, prolín, serín, treonín, fenylalanín, tyrozín, tryptofán, aspartát, glutamát, asparagín, glutamín, cysteín a metionín.) (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK::

(A) MENO/KĽÚČ: misc_feature (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE:

(poznámka: Aminokyselina v polohe 30 je nezávisle zvolená zo súboru zahŕňajúceho tyrozín, serín, lyzín, arginín, histidín, aspartát, glutamát, asparagín, glutamín a cysteín.) (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK::

(A) MENO/KĽÚČ: misc_feature (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE:

(poznámka: Aminokyselina v polohe 50 je nezávisle zvolená zo súboru zahŕňajúceho glutámovú kyselinu, lyzín, arginín, histidín, glycín a alanín.) (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK::

(A) MENO/KĽÚČ: misc_feature (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE:

(poznámka: Aminokyselina v polohe 59 je nezávisle zvolená zo súboru zahŕňajúceho tryptofán, serín, lyzín, arginín, histidín, aspartát, glutamát, asparagín, glutamín a cysteín.) (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK::

(A) MENO/KĽÚČ: misc_feature (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE:

(poznámka: Aminokyselina v polohe 60 je nezávisle zvolená zo súboru zahŕňajúceho valín, serín, lyzín, arginín, histidín, aspartát, glutamát, asparagín, glutamín a cysteín.) (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:25:

	Met Ala	Arg Leu Gin Thr -20	Ala Leu Leu Val Val Leu Val Leu Leu Ala
-15	-10
	Val Ala	Leu Gin Ala Thr	Glu Ala Gly Pro Tyr Gly	Ala Asn Met Glu
		-5	1	5
	Asp Ser	Val Cys Cys Arg Asp Tyr Val Arg Tyr Arg	Leu Pro Leu Xaa
	10		15 20
	Val Val	Xaa His Phe Xaa	Trp Thr Ser Asp Ser Cys	Pro Arg Pro Gly
	25	30	35	40
	Val Val	Leu Leu Thr Phe	Arg Asp Lys Xaa íle Cys	Ala Asp Pro Arg
		45	50	55
	Val Pro	Xaa Xaa Lys Met	íle Leu Asn Lys Leu Ser	Gin

65 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 30 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:26:

TATTGGATCC GTTCTAGCTC CCTGTTCTCC (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 31 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:27:

CCAAGAATTC CTGCAGCCAC TTTCTGGGCT C (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:28:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: CDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:28:

GCGACTCTCT ACTGTTTCTC 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:29:

CACAGGAAAC AGCTATGACC 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:30:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 70 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:30:

Leu

Gly

Pro

Tyr

Gly

Ala

Asn

Met

Glu

Asp

Ser

Val

Cys

Cys

Arg

Asp

1

5

10

15

Tyr

Val

Arg

Tyr

Arg

Leu

Pro

Leu

Arg

Val

Val

Lys

His

Phe

Tyr

Trp

20

25

30

Thr

Ser

Asp

Ser

Cys

Pro

Arg

Pro

Gly

Val

Val

Leu

Leu

Thr

Phe

Arg

35

40

45

100

Asp Lys Glu íle Cys Ala Asp Pro Arg Val Pro Trp Val Lys Met íle 50 55 60

Leu Asn Lys Leu Ser Gin 65 70 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:31:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 69 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:31:

Gly

Pro

Tyr

Gly

Ala

Asn

Met

Glu

Asp

Ser

Val

Cys

Cys

Arg

Asp

Tyr

1

5

10

15

Val

Arg

Tyr

Arg

Leu

Pro

Leu

Arg

Val

Val

Lys

His

Phe

Tyr

Trp

Thr

20

25

30

Ser

Asp

Ser

Cys

Pro

Arg

Pro

Gly

Val

Val

Leu

Leu

Thr

Phe

Arg

Asp

35

40

45

Lys

Glu

íle

Cys

Ala

Asp

Pro

Arg

Val

Pro

Tyr

Leu

Lys

Met

íle

Leu

50

55

60

Asn Lys Leu Ser Gin 65 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:32:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 69 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna

H)	TYP MOLEKULY: peptid
xi)	OPIS SEKVENCIE:	SEQ	ID NO:32:
Gly	Pro Tyr Gly Ala	Asn	Met Glu Asp	Ser	Val	Cys	Cys	Arg	Asp	Tyr
1	5			10					15
Val	Arg Tyr Arg Leu	Pro	Leu Arg Val	Val	Lys	Glu	Tyr	Phe	Tyr	Thr

25 30

101

Ser

Asp

Ser

Cys

Pro

Arg

Pro

Gly

Val

Val

Leu

Leu

Thr

Phe

Arg

Asp

35

40

45

Lys

Glu

íle

Cys

Ala

Asp

Pro

Arg

Val

Pro

Trp

Val

Lys

Met

íle

Leu

50

55

60

Asn

Lys

Leu

Ser

Gin

65

WO 96/40923

102

PCT/US96/10114

INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule 13hú)

A. The indications made bclow relaie to the microorganism referred 10 in ihe description on page . linc

B. IDENTIFICATION OF DEPOSIT Further deposits are identificd on an addilional shect [ |

Name of deposiiary institution

American Type Culture Collection (ATCC)

Address of deposiiary institution (including postál code and country)

12301 Parklawn Drive

Rockville MD 20852

United States of America

Uatc uf dcposil Acccssion Numbcr

June 1996 HB-12122

C. ADDITIONAL INDICATIONS (leave blonk iínot applicable) This inľormauon is continued on an additional sheet [ |

Depositor: ICOS Corporation

The deposit was made pursuant to the provisions of the Budapest Treaty

Deposit: Hybridoma 191D

D. DESICNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE fifthc indicattons are notfor all destgnated Statest

E. SEPARÁTE FURNISHING OF INDICATIONS fleave blankifnot applicable)

The indications listed bclow will be submirted to the International Bureau later tspcctiý the generál narureof the indtcanonse.g.. “Accesston Numbcr of Deposit”)

For receiving Office use only

IlX This sheet was received with the internacionál applicaxion

XL, z. '

For International Bureau use only

Autho fízed officer

□ This sheet was received by the International Bureau on:

Authorized officer

Form PCT/RO/I34 (July 1992,

103 ?í/ R -η

Claims (46)

1. Purifikovaný polynukleotid kódujúci polypeptid vykazujúci sekvenciu chemokinu pochádzajúceho z makrofágu (MDC), ktorá je znázornená v SEQ ID NO: 2.

2. Polynukleotid podľa nároku 1, ktorým je DNA.

3. DNA podľa nároku 2, obsahujúca nukleotidy 20 až 298 zo sekvencie SEQ ID NO: 1.

4. Purifikovaný polynukleotid kódujúci aminokyseliny MDC 1 až 69 zo sekvencie SEQ ID NO: 2.

5. Polynukleotid podľa nároku 4, ktorým je DNA.

6. DNA podľa nároku 5, obsahujúca nukleotidy 90 až 298 zo sekvencie SEQ ID NO: 1.

7. Purifikovaný polynukleotid zvolený zo súboru zahŕňajúceho

a) DNA so sekvenciou SEQ ID NO: 1;

b) polynukleotid, ktorý za stringentných podmienok hybridizuje k nekódujúcemu reťazcu DNA so sekvenciou SEQ ID NO: 1 ;

c) polynukleotid, ktorý by hybridizoval za stringentných podmienok k nekódujúcemu reťazcu DNA so sekvenciou SEQ ID NO: 1, keby nebolo redundancie genetického kódu; a

d) polynukleotid, ktorý kóduje rovnaký polypeptid MDC ako DNA so sekvenciou SEQ ID NO: 1.

104

8. Polynukleotid podlá nároku 7, ktorým je DNA.

9. Purifikovaný polynukleotid kódujúci polypeptid s aminokyselinovou sekvenciou SEQ ID NO: 25.

10. Polynukleotid podlá nároku 9, ktorým je DNA.

11. Purifikovaný polynukleotid kódujúci aminokyseliny 1 až 69 zo sekvencie SEQ ID NO: 25.

12. Polynukleotid podlá nároku 11, ktorým je DNA.

13. Purifikovaný polynukleotid zvolený zo súboru zahŕňajúceho

a) DNA podlá nároku 12;

b) polynukleotid, ktorý za stringentných podmienok hybridizuje k DNA podlá nároku 12; a

c) polynukleotid, ktorý by hybridizoval za stringentných podmienok k DNA podlá nároku 12, kedy nebolo redun dancie genetického kódu.

14. Polynukleotid podlá nároku 13, ktorým je DNA.

15. Vektor obsahujúci DNA podlá nároku 2, 5, 8, 10 12 alebo 14.

16. Vektor podlá nároku 15, ktorým je expresný vektor, v ktorom je DNA operatívne pripojená k sekvencii

DNA riadiacej expresiu.

105

17. Hostiteľská bunka stabilne transformovaná alebo transfekovaná DNA podľa nároku 2 alebo 5 spôsobom umožňujúcim expresiu MDC v hostiteľskej bunke.

18. Spôsob produkcie MDC, vyznačujúci sa t ý m , že sa hostiteľská bunka podľa nároku 17 pestuje v živnom médiu a z bunky alebo z média sa izoluje MDC.

19. Hostiteľská bunka stabilne transformovaná alebo transfekovaná DNA podľa nároku 10 alebo 12 spôsobom umožňujúcim expresiu polypeptidového analógu MDC v hostiteľskej bunke.

20. Spôsob produkcie polypeptidového analógu MDC, vyznačujúci sa tým, že sa hostiteľská bunka podľa nároku 19 pestuje v živnom médiu a z bunky alebo z média sa izoluje analóg polypeptidu MDC.

I

21. Purifikovaný polypeptid majúci aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 25.

22. Purifikovaný polypeptid podľa nároku 21 majúci aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 2.

23. Purifikovaný polypeptid obsahujúci aminokyseliny 1 až 69 zo sekvencie SEQ ID NO: 25.

24. Purifikovaný polypeptid podľa nároku 23 obsahujúci aminokyseliny 1 až 69 zo sekvencie SEQ ID NO: 2.

25. Polypeptid zvolený zo súboru zahŕňajúceho

a) polypeptid obsahujúci sekvenciu aminokyselín identifikovanú polohami 1 až 70 zo sekvencie SEQ ID NO: 30;

106

b) purifikovaný polypeptid obsahujúci sekvenciu aminokyselín identifikovanú polohami 9 až 69 zo sekvencie SEQ ID NO: 2;

c) polypeptid obsahujúci sekvenciu aminokyselín identifikovanú polohami 1 až 69 zo sekvencie SEQ ID NO: 31; a

d) polypeptid obsahujúci sekvenciu aminokyselín identifikovanú polohami 1 až 69 zo sekvencie SEQ ID NO: 32.

26. Polynukleotid kódujúci polypeptid podľa nároku

25.

27. Polynukleotid podľa nároku 26, ktorým je DNA.

28. Vektor obsahujúci DNA podľa nároku 27.

29. Hostiteľská bunka stabilne transformovaná alebo transfekovaná DNA podľa nároku 27 spôsobom umožňujúcim expresiu tohto polypeptidu v hostiteľskej bunke.

30. Protilátka, ktorá je špecificky reaktívna s polypeptidom podľa nároku 21, 22, 23, 24 alebo 25.

31. Protilátka podľa nároku 30, ktorou je monoklonálna protilátka.

32. Hybridomálna bunečná línia produkujúca protilátku podľa nároku 31.

33. Polyklonálne antisérum obsahujúce protilátku podľa nároku 30.

34. Protilátka, ktorá je špecificky reaktívna s MDC

107

35. Spôsob modulácie chemotaxie leukocytu v cicavcovi - hostiteľovi, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa stupeň

a) podávania polypeptidu podľa nároku 21, 22, 23,

24 alebo 25 cicavcovi - hostiteľovi, pričom tento polypeptid moduluje chemotaxiu leukocytov v hostiteľovi.

36. Spôsob podľa nároku 35, vyznačujúci sa t ý m , že leukocyty sú zvolené zo súboru zahŕňaj júceho leukocyty a makrofágy.

37. Spôsob zmierňovania zápalového stavu v pacientovi, pre tento stav je charakteristický aspoň jeden jav zvolený zo súboru zahŕňajúceho i) chemotaxiu monocytov smerom k miestu zápalu v pacientovi a ii) proliferáciu fibroblastových buniek, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa stupeň

a) podávania terapeuticky účinného množstva MDC pacientovi.

38. Spôsob podľa nároku 37, vyznačujúci sa tým, že terapeuticky účinným množstvom MDC je množstvo, ktoré je schopné inhibovat chemotaxiu monocytov

39. Spôsob podľa nároku 37, vyznačujúci sa tým, že terapeuticky účinným množstvom MDC je množstvo, ktoré je schopné inhibovat proliferáciu fibroblastových buniek.

40. DNA obsahujúca súvislú časť nukleotidovej sekvencie SEQ ID NO: 1 alebo nekódujúceho reťazca, ktorý je k nej komplementárny, pričom táto súvislá časť obsahuje pri108 najmenšom 18 nukleotidov a táto DNA je schopná hybridizovat za stringentných podmienok k ludskému génu MDC.

41. DNA podlá nároku 40, ktorá nie je schopná hybridizovat za stringentných podmienok ku génu ludského chemokinu zvolenému zo súboru zahŕňajúceho gény MCP-1, gény MCP-2, gény MCP-3, gény RANTES, gény ΜΙΡ-Ια, gény MIP-Ιβ a gény 1-309.

42. Farmaceutický prostriedok, vyznačuj úci sa t ý m , že obsahuje polypeptid podlá nároku 21, 22, 23, 24 alebo 25 a farmaceutický vhodný nosič.

43. Použitie farmaceutického prostriedku podlá nároku 42 na liečbu zápalového chorobného stavu.

44. Použitie podlá nároku 43, kde pre zápalový chorobný stav je charakteristická chemotaxia monocytov smerom k miestu zápalu v pacientovi postihnutom týmto chorobným stavom.

45. Použitie podlá nároku 43, kde pre zápalový chorobný stav je charakteristická proliferácia fibroblastových buniek v pacientovi postihnutom týmto chorobným stavom.

46. Spôsob identifikácie chemickej zlúčeniny vykazujúci modulačnú účinnosť na MDC, vyznačuj úci sa t ý m , že zahŕňa stupne

a) obstaranie prvej a druhej receptorovej zmesi obsahujúcej receptory MDC;

b) obstaranie kontrolnej zmesi obsahujúcej detegovatelne značený MDC;

109

c) obstaranie skúšanej zmesi obsahujúcej detegovateíne značený MDC a ďalej tiež hore uvedenú chemickú zlúčeninu;

d) kontaktovanie prvej receptorovej zmesi s kontrolnou zmesou za podmienok, pri ktorých sa MDC môže viazať k receptorom MDC;

e) kontaktovanie druhej receptorovej zmesi so skúšanou zmesou za podmienok, pri ktorých sa MDC môže viazať k receptorom MDC;

f) premývanie prvej a druhej receptorovej zmesi za účelom odstránenia detegovateíne značeného MDC, ktorý nie je viazaný k receptorom MDC;

g) meranie detegovateíne značeného MDC v prvej a druhej receptorovej zmesi; a

h) identifikácie chemickej zlúčeniny vykazujúcej modulačnú účinnosť na MDC, pričom modulačnej účinnosti na MDC zodpovedá rozdiel medzi hodnotami detegovateíne značeného MDC pri prvej a druhej receptorovej zmesi.