SK16342001A3 - Použitie biodegradovateľných mikroguľôčok uvoľňujúcich protinádorovú látku na prípravu lieku na liečbu glioblastómov - Google Patents

Description

Použitie biodegradovatelných mikroguličiek uvoľňujúcich protinádorovú látku na prípravu lieku na liečbu glioblastómov

Oblasť techniky

Vynález sa týka použitia biodegradovatelných mikroguličiek uvolňujúcich protinádorovú látku na prípravu lieku na liečbu glioblastómov.

Doterajší stav techniky

Glioblastóm patrí medzi vzácne ochorenia registrované National Organisation for Rare Disorders.

Malígne gliové nádory sú pôvodné nádory centrálneho nervového systému a predstavujú 13 až 22 % vnútrolebkových nádorov. Na histologickej úrovni rozoznávame dva typy malígnych gliových nádorov: anaplastické astrocytómy a glioblastómy, ktoré predstavujú najmenej diferencovanú formu týchto nádorov.

V súčasnosti neexistuje účinná liečba malígnych gliových nádorov. Pacienti postihnutí glioblastómom neprežívajú dlhšie ako jeden rok ani vtedy, keď sa k chirurgickému zákroku pridá chemoterapia a rádioterapia.

Liečba malígnych gliových nádorov je obmedzená najmä tromi skutočnosťami.

Prvá je existencia hematoencefalickej bariéry (BHE), ktorá izoluje centrálny nervový systém od zvyšku organizmu. BHE prepúšťa len molekuly s malými rozmermi, ktoré sú rozpustné v tukoch. Ostatné molekuly je nutné podávať vo velmi vysokých dávkach, aby dosiahli centrálny nervový systém, a to za cenu významných vedľajších účinkov.

Druhý faktor obmedzujúci účinnosť liečby gliových nádorov je infiltrujúca povaha týchto nádorov. Vzhľadom na to, že mozog je vysoko funkčný orgán, nie je možné v ňom uskutočniť rozsiahly chirurgický zákrok z onkologickom zmysle slova. Akokoľvek je vybratie nádoru úplné, stále zostáva len makroskopický úplným vybratím, ktoré zanecháva veľký počet nádorových buniek infiltrovaných do steny dutiny po vybratí nádoru. Vela autorov ďalej ukázalo, že 90 % operovaných malígnych gliových nádorov následne ošetrených rádioterapiou recidivuje v oblasti dvoch centimetrov od pôvodného miesta nádoru.

Posledný faktor obmedzujúci účinnosť liečby gliových nádorov je nízky terapeutický index. Nádorové bunky sa skrývajú za normálnym a extrémne krehkým tkanivom, citlivým na podráždenie spôsobené rádioterapiou alebo niektorými protinádorovými látkami. Preto je ťažké zničiť nádorové bunky bez súčasného zničenia normálnych nervových buniek.

Pokroky dosiahnuté v liečbe gliových nádorov sú nedostatočné (Kornblith PL, Walker M, Chemotherapy for malignant gliomas, J. Neurosurg, 68: 1-17, 1998; Shapiro WR, Green SB, Burger PC, Selker RG, VanGilder JC, Robertson JT, Mahaley SM, A randomized comparaison of intra-arterial versus intravenous BCNU with or without intravenous 5-fluorouracil, for newly diágnosed patient with malignant glioma, J. Neurosurg. 76: 772-781, 1992) .

V súčasnosti je klasická liečba glioblastómov, ktorá nasleduje po chirurgickej resekcii, založená na externej rádioterapii. Neumožňuje predĺžiť čas života na viac ako jeden rok. Spojenie rádioterapie s chemoterapiou založenou na l-(2chlóretyl)-3-cyklohexyl-l-nitrozo-urei (BCNU) je účinné len na anaplastických astrocystómoch. Je malým prínosom, pretože zvyšuje percento žijúcich pacientom až najskôr v osemnástich mesiacoch. DÍžka prežitia sa pritom nemení.

Imunoterapia sa nikdy nepresadila a genetická terapia sa najskôr musí osvedčiť.

Bolo testovaných niekoľko postupov cielených na zvýšenie lokálnej koncentrácie protinádorových látok, ako je osmotické porušenie hematoencefalickej bariéry, injekcia do mozgovomiechového moku alebo do arteria carotis, prenos lieku do vnútra nádoru pomocou podkožných zásobníkov (Tamargo RJ et Brem H, Drug delivery to the centrál nervous systém, Neurosurgery Quaterly, 2: 259-279, 1992). Žiadny z týchto postupov nemohol zvýšiť čas prežitia pacientov a niektoré sa ukázali byť vysoko toxické.

Počas posledných rokov lekársky farmaceutický výskum umožnil vývoj implantovatelných polymérnych systémov, ktoré chránia účinné látky pred degradáciou a umožňujú ich uvoľnenie kontrolovaným spôsobom počas určeného času a zároveň znižujú vedlajšie systémové účinky. Výhody týchto implantovatelných polymérnych systémov nedávno podmienili niekoľko skupin k štúdiu ich aplikácie v patológii centrálneho nervového systému (Langer R, Polymér implants for drug delivery in the brain, J. Controlled Release, 16: 53-60, 1991). Konkrétne také systémy implantované do steny po odstránení malígnych gliómov oneskorujú nádorovú recidívu a predlžujú život pacienta. V okolí operačnej dutiny pretrvávajú izolované malígne bunky zodpovedné za 90 % recidív a vznikajú v oblasti 2 cm od operovaného miesta. V tejto oblasti je nervové tkanivo funkčné a hematoencefalická bariéra je dosial nedotknutá, čo obmedzuje účinnosť bežnej chemoterapie a rádioterapie.

Boli vyvinuté a na zvieratách boli otestované rôzne implantovatelné polymérne systémy uvolňujúce účinné molekuly.

Napriek skromným výsledkom v klinických štúdiách bol vyvinutý systém biodegradovatelných diskov zložených z PCPP-SA kyselina (poly-(1,3-bis(karboxyfenoxy)propán-ko-sebaková)) a uvoľňujúcich BCNU (GLIADEL^R) (Brem H, Polymers to treat brain tumors, Biomaterials 11: 699-701, 1990; Brem H, Mahaley MS, Viek NA, Black KL, Schold SC, Eller TW, Cozzens JW, Kenealy JN, Interstitial chemotherapy with drug polymér implants for the treatment of reeurrent gliomas, J. Neurosurg 74: 441-446, 1991; Brem H, Walter KA, Langer R, Polymers as controlled drug delivery for the treatment of malignant brain tumors, Eur J Pharm Biopharm, 39 (1): 2-7, 1993; Brem H, Piantadosi S, Burger PC, Walker M, a kol., Placebo-controlled trial of safety and efficacy of intraoperative controlled delivery by biodegradable polymers of chemotherapy for reeurrent glioma, Lancet, 345: 1008-1012, 1995) .

Boli pripravené mikroguličky uvoľňujúce BCNU, ale výsledky štúdií u zvierat boli málo povzbudzujúce (Torres Al, Boisdron4

Celie M, Benoit JP, Formulation of BCNU-loaded microspheres: influence of drug stability and solubility on the design of the microencapsulation procedúre, J. Microencapsulation, 13: 41-51, 1996; Painbéni T, Venier-Julienne MC, Benoit JP, Internal morphology of poly(D,L-lactide-co-glycolide) BCNU-loaded microspheres. Influence on drug stability, Eur. J. Pharm. Biopharm, 1998, 45, 31-39).

Podstata vynálezu

Vynález sa týka použitia implantovateľných biodegradovatelných mikroguličiek, ktoré uvoľňujú protinádorovú látku, na liečbu glioblastómu. Použitie týchto mikroguličiek je spojené s rádioterapiou a chirurgiou. Po vybratí nádoru sú do tkaniva v operačnej dutine injekciou implantované biodegradovatelné mikroguličky, ktoré uvoľňujú protinádorovú látku. Najneskôr do siedmich dní po zákroku sa pristúpi k rádioterapii.

Vďaka použitiu týchto mikroguličiek žiadateľ dokázal veľmi výhodným spôsobom predĺžit dvakrát čas prežitia pacientov, ktorí trpia glioblastómom. Použitie mikroguličiek podľa vynálezu skutočne umožňuje dosiahnuť časy prežitia najmenej 90 týždňov.

Vynález sa teda týka použitia biodegradovatelných mikroguličiek, ktoré uvoľňujú rádiosenzibilizujúcu protinádorovú látku, na výrobu lieku určeného na liečbu glioblastómu za súčasného, oddeleného alebo v čase rozloženého použitia s rádioterapiou, tieto mikroguličky sú určené na implantáciu do operačnej dutiny po vybratí gliového nádoru. Vynález sa vyznačuje tým, že mikroguličky s obsahom protinádorovej látky sú obalené polymérom oneskorujúcim uvoľňovanie protinádorovej látky a udržiavacím v parenchymovej oblasti počas jej terapeuticky účinnej koncentrácie tak, aby sa dosiahol u takto liečených pacientov čas prežitia najmenej 90 týždňov, výhodne 130 týždňov a ešte výhodnejšie 160 týždňov.

Mikroguličky použité v rámci vynálezu obsahujú protinádorovú látku, ktorá je prednostne hydrofilná a/alebo nepreniká hematoencefalickou bariérou. Je výhodné, keď protinádorová látka nie je pre centrálny nervový systém toxická. Táto protinádorová látka pôsobí prednostne na deliace sa bunky.

Protinádorová látka je tvorená jednou protinádorovou rádiosenzibilizujúcou zlúčeninou alebo zmesou protinádorových zlúčenín s obsahom najmenej jednej protinádorovej rádiosenzibilizujúcej zlúčeniny, tzv. protinádorové zlúčeniny sú vybrané zo skupiny, ktorá obsahuje 5-fluóruracil (5-FU), platinu ako karboplatina a cisplatina, taxany ako docetaxel a paklitaxel, gemcitabin, VP16, mitomycín, idoxuridín, inhibítory topoizomerázy I ako je irinotekan, topotekan a camtotecíny, nitrosourei, ako BCNU, ACNU alebo MCNU, metotrexát, bleomycín, adriamycín, cytoxan a vinkristin, imunomodulačné cytokíny ako IL2, IL6, IL12 a IL13 a interferóny.

Protinádorová látka je prednostne 5-FU.

5-FU je stará a dobre známa antimitotická látka. Je to hydrofilná látka, ktorá prechádza velmi slabo hematoencefalickou bariérou, jej aktivita je teda zvyšovaná lokálnym podaním (Bourke RS, West CR, Chheda G. a kol., Kinetics of entry and distribution of 5-fluorouracil in CSF and brain following intravenous injection in primáte, Cancer Res, 33: 1735-1746, 1973; Gerosa MA, Dougherty DV, Wison CB, Rosenblum ML, Improved treatment of a brain tumor model, Part 2: Sequential therapy with BCNU and 5-fluorouracil, J. Neurosurg. 58: 368, 1983; Kotsilimbas DG, Karpf R, Meredith S, Scheinberg LC, Evaluation of patenteral 5-FU on experimental brain tumors, Neurology, 16: 916-918, 1966; Levin VA, Edwards MS, Wara WM, Alien J, Ortega J, Vestnys P, 5-fluorouracil and 1-(2-chloroethyl)-3-cyclohexyl-l-nitrosourea (CCNU) followed by hydroxyurea, misonidazole and irradiation for brain stem gliomas: a pilot study of the brain tumor research center and the children cancer group, Neurosurgery, 14: 679-681, 1984; Oda Y, Tokurikiy, Tsuda E, Handa H, Kieler J, Trial of anticancer peliet in malignant brain tumors, 5-FU and urokinase embedded in silastic. Proceeding of the 6^ch European Congress of Neurosurgery, Acta neurochirurgica, Suppl. 28: 489-490, 1979; Penn RD, Kroin JS, Harris JE, Chiu KM, Braun DP, Chronic intratumoral chemotherapy of a rat tumor with cisplatin and fluorouracil, Appl. Neurophysio, 46: 240-244, 1983; Shapiro WR, Studies on the chemotherapy of experimental brain tumors: Evaluation of 1-(2-chloroethyl)-3-cyklohexyl-l-nitrosourea, Vinscristine and 5-Fluorouracil, J. Nat. Cancer Inštitúte, 46(2), 359-368, 1971; Shapiro WR, Green SB, Burger PC, Selker

RG, VanGilder JC, Robertson JT, Mahaley SM, A randomized comparison of intra-arterial versus intravenous BCNU with or without intravenous 5-fluorouracil, for newly diagnosed patients with malignant glioma, J. Neurosurg, 76: 772-781,

1992; Soloway AH, Mark VH, Dukát EG a kol., Chemotherapy of brain tumors. I-Transplanted murine ependymoblastomas, Cancer Chemother Rep., 36: 1-4, 1964).

Aktivita 5-FU je tiež zvýšená pri predĺženom podávaní. 5FU je látka, ktorej účinok je vyvolaný interferenciou so syntézou nukleových kyselín. Štúdie ukázali, že len 30 až 50 % buniek malígneho myšieho gliómu (L9) a 14 až 44 % buniek malígneho ľudského gliómu sa každú chvíľu delí. Navyše sú časy bunkového cyklu glioblastómu dlhé (20 hodín pre glióm L9, 3 až 7 dní pre ľudský glioblastóm). Klírens 5-FU v plazme je rýchly (polčas 30 minút) (Neuwelt EA, Barnett PA, Frenkel EP, Chemotherapeutic agent permeability to normál brain and delivery to avian sarcoma virus-induced brain tumors in the rodent: observations on problems of drug delivery, Neurosurgery, 14: 154-160, 1984). 5-FU teda nemôže pri systémovom podaní alebo lokálnej injekcii zničiť velký počet malígnych buniek.

bežnou cestou gastrointestinálne.

5-FU zásadne pôsobí na rýchlo sa obnovujúce tkanivá a je výnimočne neurotoxický. 5-FU zasahuje do syntézy nukleových kyselín, ktoré sa rýchlo rastúce tkanivá velmi potrebujú, aby zabezpečili svoju proliferáciu a regeneráciu. To samozrejme nie je prípad mozgového tkaniva, kde je mitóza za normálneho stavu vzácna, a dochádza k nej len v samotnom centre gliovej populácie. Toxické účinky 5-FU obmedzujúce jeho podávanie sú predovšetkým hematologické a Boli publikované len vzácne sekundárne neurologické účinky 5-FU, ich etiopatogenéza je málo známa a je dôsledkom viacerých faktorov (blokovania Krebsovho cyklu katabolytom 5-FU alebo zosilnenia vopred existujúceho nedostatku tyamínu (Aoki N, Reversible leukoencephalopathy caused by 5-fluorouracil derivates, presenting as akinetic mutism, Surg Neurol, 25: 279-282, 1986; Moore DH, Fowler WC, Crumpler LS, 5-fluorouracil neurotoxicity, čase report, Gynecol Oncology, 36: 152-1541 1990).

Nakoniec 5-FU je rádiosenzibilizujúcou látkou (Koutcher JA, Alfieri AA, Thaler H a kol., Radiation enhancement by biochemical modulation and 5-FU, Int. J. Radit. Biol. Phys., 39: 1145-1152, 1997). Väčší účinok spojenia 5-FU s rádioterapiou v každom jednotlivom liečení sa preukázal už v 60-tych rokoch na zvieracích modeloch a na nádorových bunkách in. vitro (Bagshaw M, A possible role of potentation in radiation therapy, Amer J. Roentgenol, 85: 822-833, 1961; Vietti T, Eggerding F, Valeriote F, Combined effect of Xradiation and 5-fluorouracil on survival of transplanted leukémie cells, J. Natl. Inst., 47: 865-870, 1971). Tento synergický účinok 5-FU je pravdepodobne spôsobený synchronizáciou nádorovej bunkovej populácie a obmedzením bunkových reparačných mechanizmov. Na človeku sa už tiež skúšalo spojenie 5-FU s antipyrimidínom (5-FU alebo BrudR) (Goffman TE, Dachowski LJ, Bobo H a kol., Long term follow-up on national cancer inštitúte phase I/II study of glioblastoma multiforme treated with iododeoxyuridine and hyperfractionated irradiation, J Clinical Oncology, 10: 264-268, 1992). Chýbajúcu priamu účinnosť je tu možné vysvetliť systémovým podávaním liečiva.

Ak je protinádorovou látkou 5-FU, koncentrácia protinádorovej látky v mozgovomiechovom moku, ktorá odráža koncentráciu v parenchymovom priestore, je 3 až 20 ng/ml.

Na obmedzenie neurotoxicity protinádorovej látky, ktorá sa nachádza v mikroguličkách použitých v rámci tohto vynálezu, je možné k protinádorovej látke pridať neuroprotektívnu zlúčeninu. Táto neuroprotektívna zlúčenina je vybraná z peptidových rastových faktorov ako je NGF alebo BDNF.

Biodegradovatelné mikroguličky použité v rámci vynálezu sú obalené polymérom, ktorý oneskoruje uvoľňovanie protinádorovej látky, a udržiava v parenchymovom priestore jej terapeuticky účinnú koncentráciu počas najmenej troch týždňov, prednostne najmenej štyroch týždňov.

Polymér je vybraný z nasledujúcich látok: etylcelulóza, polystyrén, poly(epsilon-kaprolaktón) , poly(kyselina d, 1mliečna) a poly(kyselina d,1-mliečna-ko-kyselina glykolová).

Polymér je prednostne poly(kyselina d,1-mliečna-kokyselina glykolová) alebo PLAGA, ktorý je autorizovaným biodegradovatelným polymérom na prípravu farmaceutických prípravkov s predĺženým uvoľňovaním účinnej látky (na rozdiel od PCPP-SA, ktorý nie je schválený pre široké klinické použitie).

Poly(kyselina prednostne PLAGA 50 d,1-mliečna-ko-kyselina : 50 (i.e. obsahujúca kyseliny mliečnej a kyseliny glykolovej), napríklad Resomer^R RG 506 dodávaný BI Chimie, France, s molekulovou hmotnosťou 72000, s polydisperzným indexom 1,8 a inherentnou viskozitou 0,80 dl/g (0,1 % roztok polyméru v chloroforme pri 25 °C).

glykolová) je rovnaké množstvo

PLAGA je hydrofóbny kopolymér, z ktorého hydrolytickou degradáciou vznikajú dva normálne biologické substráty, kyselina mliečna a kyselina glykolová, metabolizované na konci aeróbnej glykolýzy na CO₂ a H₂O. Dnes už staré štúdie ukázali, že dýchací reťazec je hlavnou cestou odbúravania týchto dvoch substrátov. Rýchlosť biodegradácie PLAGA závisí na vzájomnom pomere kyseliny mliečnej a kyseliny glykolovej. PLAGA je dokonalo kompatibilný a vyvoláva miernu reakciu k cudzorodým látkam (Visscher GE, RL Robinson, HV Mauding, Fong JW, Pearson JE, Argentiers GJ, Biodegradation of and tissue reaction to 50 : 50 poly(DL-lactide-co-glycolide) microcapsules, J. Biomed. Mat. Res. 19: 349-365, 1985). PLAGA sa objavuje v zložení chirurgických nití (Frazza EJ, Schmidt EE, A new absorbable suture, J. Biomed. Mater. Res., 5: 43-58, 1971) a farmaceutických podkožné implantovateľných foriem (Jalil R, Nixon JR, Biodegradable poly(lactic acid) and poly(lactide-coglycolide) microcapsules: problems associated with preparative techniques and release properties (Review), J. Microencapsulation, 7: 297-325, 1990). Bolo dokázané, že mikroguličky PLAGA 50 : 50 môžu byť sterilizované zrážaním γ, a pokiaľ sú stereotakticky implantované do mozgu hlodavca, sú celkovo biodegradované do dvoch mesiacov a spôsobujú len miernu nešpecifickú reakciu astrocytárneho a histiocytárneho typu (Menei P, Daniel V, Montero-Menei C, Brouillard M, PouplardBarthelaix A, Benoit JP: Biodegration and brain tissue reaction to poly(DL-lactide-co-glycolide) microspheres, Biomaterials 14: 470-478, 1993; Menei P, Croue A, Daniel V, Pouplard-Barthelaix A, Benoit JP: Fate and biocompatibility of three types of microspheres implanted into the brain, J. Biomed Mat Res, 28, 1079-1085, 1994) . Tento posledný výsledok bol odvtedy potvrdený Kou JH, Emmett C, Shen P a kol., Bioerosion and biocompatibility of poly (d,1-lactic-co-glycolic acid) implants in brain, J Control Release, 43, 123-130, 1997.

Biodegradovatelné mikroguličky podľa vynálezu majú prednostne stredný priemer 48 ± 20 pm, prednostne 46 ± 7 pm. Obsahujú 15 % až 35 % hmotn. protinádorovej látky, prednostne 19 % až 27 % hmotn. 5-FU, prednostne ešte 20 % hmotn. 5-FU a 65 % až 85 % hmotn. polyméru.

V rámci tohto vynálezu sú mimoriadne uprednostňované mikroguličky s obsahom PLAGA 50 : 50, ktoré slúžia ako vehikulum pre 5-FU.

Mikroguličky s obsahom PLAGA 50 : 50, ktoré slúžia ako vehikulum pre 5-FU, môžu in vitro uvoľňovať 5-FU počas 21 dní. In vivo, implantované podkožné králikovi, dovolia tieto mikroguličky dosiahnuť vyrovnané koncentrácie 5-FU v plazme počas 23 dní. Stále in vivo a v mozgu hlodavcov sú kryštály 5FU pozorovateľné v mikroguličkách najmenej do devätnásteho dňa. Po intracerebrálnej implantácii PLAGA-5-FU mikroguličiek (7 mg/kg 5-FU) králikovi nie sú v sére detegované žiadne stopy 5FU, čo naznačuje takmer nulový prechod drogy do systémového obehu.

Po intracerebrálnej implantácii PLAGA-5-FU mikroguličiek v celkovej dávke 17 mg/kg 5-FU neboli pozorované žiadne známky systémovej toxicity ani žiadne známky klinickej alebo histologickej neurotoxicity. Vo frakcionovanej dávke 24 Gy je spojenie 5-FU mikroguličiek s cerebrálnou rádioterapiou dokonale tolerované (Menei P, Vectorisation dans le SNC par implantation stéréotaxique de microspheres, These d’Université en Sciences Pharmaceutiques, Université d'Angers, 1995). Nakoniec tieto mikroguličky implantované stereotakticky do vnútra maligneho gliómu vyvinutého u krysy (glióm C6) významne znižujú úmrtnosť (Menei P, Boisdron-Celle M, Croue A, Guy G, Benoit JP, Effect of stereotactic implantation of biodegradable 5-fluorouracil-loaded microspheres in normál and C6-glioma bearing rats, Neurosurgery, 39: 117-124, 1996).

Výhodným spôsobom sú mikroguličky prevedené do suspenzie v sterilnom roztoku. Suspenzia je injektovaná do stien operačnej dutiny po vybrati nádoru.

Sterilný roztok obsahuje prednostne:

- 1 % až 1,5 %, prednostne 1,25 % hmotnostnoobjemových látky zvyšujúcej viskozitu, napríklad sodnú sol karboxymetylcelulózy,

-0,5 % až 1,5 %, prednostne 1 % tenzidu, napríklad polysorbátu 80^R a

-3,5 % až 4,5 %, prednostne 4 % izotonizujúcej látky, napríklad manitolu.

Mikroguličky sú prednostne prevedené do suspenzie rýchlo a tesne pred injekciou. Suspenzia prednostne obsahuje 3 ml vyššie opísaného roztoku a 700 až 800 mg biodegradovateľných mikroguličiek.

Po potvrdení glioblastómovej diagnózy a makroskopickom vybratí gliového nádoru je suspenzia mikroguličiek implantovaná do stien operačnej dutiny a do hĺbky najmenej dvoch centimetrov, prednostne 2 až 3 centimetrov, na najmenej každý cm .

Pokial je protinádorovou látkou 5-FU, celková dávka injektovanej suspenzie zodpovedá 50 až 200 mg 5-FU.

Rádioterapia je zameraná na oblasť nádoru, ožiarený objem obsahuje preoperačný nádor s okrajom najmenej dvoch centimetrov vo všetkých smeroch a aplikuje sa celková dávka 50 až 60 Gy.

Rádioterapia sa zaháji prednostne medzi druhým a siedmim dňom, ktorý nasleduje po operácii. Celková dávka 50 až 60 Gy je rozložená na obdobie 4 až 8 týždňov, napríklad 5 dávok za týždeň.

Rádioterapia je prednostne uskutočnená s celkovou dávkou 60 Gy počas šiestich týždňov, prednostne ešte s piatimi dávkami týždenne počas 6,5 týždňa.

Po injekcii mikroguličiek hneď po vybratí nádoru jedna alebo viacero nových injekcií mikroguličiek sa môže stereotakticky uskutočniť v prípade návratu nádoru.

Mikroguličky použité v rámci vynálezu sa môžu pripraviť emulzno-extrakčnou technikou, podlá jedného variantu opísaného Boisdron-Celle M, Menei P, Benoit JP: Preparation of biodegradable 5-fluorouracil-loaded microspheres, J Pharm Pharmacol, 47, 108-114, 1995.

Vynález sa zároveň týka postupu prípravy mikroguličiek s obsahom protinádorovej látky obalenej polymérom a použitých podľa vynálezu. Dôležité kroky v tomto postupe sú v príprave organickej fázy, v ktorej sú protinádorová látka a polymér dispergované v organickom rozpúšťadle. Organická a vodná fáza sa prevedú na emulziu, potom sa organické rozpúšťadlo extrahuje pridaním vody. Nakoniec sa získaná suspenzia mikroguličiek filtruje.

Postup v tomto vynáleze sa v prvom rade vyznačuje tým, že protinádorová látka je dispergovaná v organickom rozpúšťadle za silného miešania pred pridaním polyméru.

Podľa úprav zavedených do postupu podľa skoršieho stavu techniky sa účinná látka drtí v drviči s planetárnou guličkou. Veľkosť získaných kryštálov je 15 až 50 pm. Veľkosť kryštálov určených na zapuzdrenie a ich disperziu sú zásadné kritériá na zvládnutie kvality zapuzdrenia a kinetiky uvoľňovania účinnej látky in vitro.

Účinná látka sa potom a ešte pred pridaním polyméru disperguje v organickom rozpúšťadle, prednostne v dichlórmetáne, v skúmavke s guľatým dnom, za miešania homogenizačnou tyčinkou.

Homogenizácia umožni získanie homogénnej suspenzie, zmiernenie rozdielov medzi rôznymi šaržami, ktoré prešli drtením a zmenšenie veľkosti kryštálov účinnej látky.

Organická fáza je pripravená v rozpúšťadle bez druhého rozpúšťadla. Neprítomnosť druhého rozpúšťadla umožňuje spomaliť precipitáciu polyméru počas emulgačnej fázy a zároveň sú získané častice menej pórovité.

Disperzia účinnej látky sa preleje do prvého reaktora.

Polymér sa pridá v pomere 8 až 13 % hmotn., prednostne v pomere 11 % hmotn. Získaná organická fáza sa rovnomerne mieša pri izbovej teplote počas 2 až 4 hodín, potom 15 minút pri teplote 1 až 5 °C, prednostne 2 ’C. Dlhší čas miešania organickej fázy pri izbovej teplote zabezpečí celkovú solubilizáciu polyméru v rozpúšťadle.

V druhom reaktore sa pripraví vodná fáza a nechá sa prednostne pri rovnakej teplote ako fáza organická, prednostne pri 2 °C. Zníženie teploty vodnej a organickej fázy spôsobí zvýšenie ich viskozity a zvýšenie zapuzdrenia. Vodná fáza je napríklad vodný 10 % roztok PVA.

Používajú sa dva reaktory s dvojitými stenami a chladiaca kvapalina prúdi sériovo do obidvoch reaktorov. Je výhodné, aby bola pri miešaní obidvoch fáz teplota organickej a vodnej fázy identická, prednostne 2 °C. Dobré zvládnutie teploty podmieňuje totiž zároveň velkosť častíc, rýchlosť rozpúšťania účinnej látky a rýchlosť extrakcie rozpúšťadla.

Organická fáza sa preleje z prvého reaktora do druhého. Pomer objemu vodnej a organickej fázy je 80/3 a 120/3, prednostne 100/3.

Získaná emulzia sa mieša počas najmenej 3 minút, prednostne počas najmenej 3 až 6 minút a najlepšie počas 5 minút. Voľba tohto času priamo súvisí s kinetikou uvolňovania účinnej látky a najmä s burst účinkom po 24 až 48 hodinách.

Neprítomnosť druhého rozpúšťadla spojená s dostatočným emulgačným časom dovoľuje rozpúšťanie účinnej látky na povrchu alebo rozpúšťanie zle obalenej účinnej látky, takže kinetika uvoľňovania účinnej látky v počiatočnej fáze je lepšie zvládnutá.

K emulzii sa pridá voda v objemovom pomere emulzia/voda v rozsahu 1/3 až 1/2, prednostne 1/3, aby sa extrahovalo organické rozpúšťadlo. Teplota vody určenej na extrakciu je v rozsahu 1 až 5 °C, prednostne 4 °C.

Emulgačné aj extrakčné kroky sa uskutočňujú v rovnakom reaktore, aby sa zabránilo rozdielom medzi jednotlivými šaržami a získal sa čas. Teplota vody určenej na extrakciu je nízka, aby sa zabránilo príliš silnému rozpúšťaniu účinnej látky.

Získaná suspenzia mikroguličiek sa mieša počas niekoľkých minút a potom sa filtruje v inertnej atmosfére. Práca v inertnej atmosfére umožňuje zamedziť kontaminácii produktu.

Mikroguličky získané vyššie opísaným postupom sú výhodne lyofilizované.

K 2 až 5 g prášku mikroguličiek (filtračný koláč) sa pridá 10 ml sterilnej vody. Celok sa zamrazí pri -40 °C a prenesie sa do lyofilizátora. Lyofilizácia trvá 18 hodín. Teplota sa musí udržiavať pri dodatočnom vysušovaní pod 10 ’C.

Mikroguličky, aj vysušené, sa musia konzervovať pri 4 °C.

Vynález sa týka tiež suspenzie tvorenej sterilným roztokom s obsahom 1 až 1,5 % hmotnostnoobjemových látky zvyšujúcej viskozitu, 0,5 až 1,5 % tenzidu, 3,5 až 4,5 % izotonizujúcej látky a biodegradovatelnými mikroguličkami, ktoré uvolňujú protinádorovú látku obalenú polymérom, a ktoré boli opísané vyššie, prípadne boli získané vyššie opísaným postupom. Obsah mikroguličiek je 200 až 300 mg/ml sterilného roztoku, prednostne 230 až 270 mg/ml.

Tieto mikroguličky sú zložené prednostne z 15 až 35 % hmotn. protinádorovéj látky a 65 až 85 % hmotn. polyméru.

Polymér je výhodne poly(kyselina d,1-mliečna-ko-kyselina glykolová), ktorá obsahuje prednostne rovnaké množstvo kyseliny mliečnej a kyseliny glykolovej.

Sterilný roztok obsahuje prednostne 1,25 % hmotnostnoobjemových sodnej soli karboxymetylcelulózy, 1 % polysorbátu 80 a 4 % manitolu.

Vynález je ilustrovaný nasledujúcimi prikladmi, ktoré nemajú obmedzujúci charakter.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Mikroguličky pripravené emulzno-extrakčnou technikou, podľa variantu postupu opísaného Boisdron-Celle M, Menei P a Benoit JP (Preparation of biodegradable 5-fluorouracil-loaded microspheres, J Pharm Pharmacol, 47, 108-114, 1995).

Drtenie 5-FU

5-FU sa drtí v drviči s planetárnou guličkou typu Pulvérisette 7 (Fritsch). 8,5 g 5-FU sa vloží do každej jamky s obsahom 7 guličiek. Drtenie trvá 10 minút rýchlosťou 7. Prášok sa vyzbiera v boxe s laminárnym prúdením vzduchu. Získané kryštály majú veľkosť 15 až 20 pm a rozdeľujú sa na dve frakcie: na jemnú frakciu (veľkosť častíc menšia ako 1 pm) a hrubú frakciu (väčšia ako 30 pm) .

Disperzia 5-FU v organickom rozpúšťadle

5-FU sa drtí a disperguje sa za stáleho miešania v 45 ml dichlórmetánu pomocou homogenizátora typu ultra-turrax počas 3 minút pri 13500 rpm, v skúmavke s guľatým dnom.

Príprava organickej fázy

Disperzia 5-FU sa preleje do chladeného reaktora s dvojitou stenou s objemom 150 ml. Pridá sa PLAGA tak, že pomer PLAGA/dichlórmetán je 11 %. Organická fáza sa mieša lopatkou počas 4 hodín rýchlosťou 450 rpm pri teplote 20 °C, potom 15 minút pri teplote 2 °C. Pomocou kryostatu sa v reaktore udržiava stála teplota s presnosťou 0,1 °C.

Príprava emulzie

Pripraví sa 1500 ml 10 % autoklávového vodného roztoku

PVA, ktorého teplota sa udržiava pri teplote 2 °C v chladenom dvoj stenovom reaktore s objemom 6 litrov. Organická fáza sa následne preleje do tohto reaktora otvorením stavidla dna prvého reaktora. Počas 5 až 10 s sa organická fáza vyleje na vodnú fázu miešanú lopatkou, ktorá sa otáča rýchlosťou 375 rpm. Objemový pomer vodná/organická fáza je rovný 100/3.

Emulzia sa mieša počas 4 minút a 45 s.

Extrakcia

Keď je emulzia hotová, prileje sa na emulziu 4,5 1 vody určenej na extrakciu s teplotou 4 °C v objemovom pomere emulzia/voda 1/3. Extrakcia trvá 2 minúty.

Filtrácia

Celkový obsah druhého reaktora sa preleje dnom do inoxovej nádoby a stlačí sa dusíkom. Suspenzia sa filtruje cez filter s pórmi s priemerom 3 pm.

Po prechode celej suspenzie filtrom, sa filtračný koláč dvakrát premyje 3 litrami sterilnej vody.

Miera zapuzdrenia protinádorovej látky u získaných mikroguličiek je 20 %. Po presiatí sa uskutoční desorpcia dichlórmetánu v sušiarni počas 48 hodín. Mikroguličky sa potom upravia a sterilizujú sa γ-žiarením 19 kGy. Po sterilizácii sa uskutoční nová kontrola miery zapuzdrenia. Potom sa uskutočni stanovenie stop rozpúšťadla. Je výhodné detegovať zvyšný dichlórmetán s obsahom 0,5 %. Ďalej sa skontroluje sterilita a kinetika uvoľňovania účinnej látky in vitro u takto získaných mikroguličiek.

Získané mikroguličky majú obsah účinnej látky 23 ± 3,5 %.

Pripraví sa niekoľko šarží podlá vyššie opísaného protokolu a vypočíta sa priemerná veľkosť častíc 48 ± 20 pm na populáciu všetkých šárž, čo zodpovedá 46 ± 7 pm (priemer priemerov z pripravených šárž).

Získané mikroguličky majú obsah účinnej látky 23 ± 3,5 % a priemernú veľkosť 48 ± 20 pm.

Príklad 2

Mikroguličky sú pripravené emulzno-extrakčnou technikou podlá príkladu 1

Drtenie 5-FU

Postupuje sa ako v príklade 1 drtením 4 g 5-FU. Získané kryštály majú veľkosť 15 až 50 pm a rozdeľujú sa na dve frakcie: na jemnú frakciu (veľkosť častíc menšia ako 1 pm) a hrubú frakciu (väčšia ako 30 pm).

Disperzia 5-FU v organickom rozpúšťadle

5-FU sa drtí a disperguje sa za stáleho miešania v 40 ml dichlórmetánu pomocou homogenizátora typu ultra-turrax počas 3,5 minút pri 13500 rpm, v skúmavke s guľatým dnom.

Príprava organickej fázy a príprava emulzie sa uskutočnia ako v príklade 1.

Extrakcia a filtrácia sa uskutočnia ako v príklade 1. Charakteristika získaných mikroguličiek.

Obsah 5-FU: 22 %

Veľkosť: 46 ± 7 pm

Burst účinok 24 hodín po rádiosterilizácii 19 kGy: 40 ± 4 %

Príklad 3

Klinická vzorová štúdia fázy I/II sa uskutoční s mikroguličkami PLAGA 50 : 50/5-FU z príkladu 1.

Získané mikroguličky sa rýchlo prevedú na suspenziu v roztoku, ktorý obsahuje:

- 1,25 % hmotnostnoobjemových sodnej soli karboxymetylcelulózy (Cooper),

- 1 % polysorbátu 80,

- 4 % manitolu a

- dostatočné množstvo vody na injektovatelný prípravok na získanie celkového objemu 3 ml.

Roztok sa vopred sterilizoval autoklávovaním pri 121 °C počas 20 minút, potom sa rádiosterilizoval γ-žiarením s dávkou 5 až 25 kGy, prednostne 19 kGy.

Príprava tejto suspenzie je náročná, pretože je potrebné sa vyhnúť tvorbe bubliniek. Suspenzia sa injektuje ihneď po svojej príprave, pretože mikroguličky majú tendenciu sedimentovať a upchávať striekačku.

Po makroskopickom vybratí gliového nádoru sa suspenzia guličiek implantuje do hĺbky 2 až 3 cm po celom povrchu operačnej steny v množstve 100 μΐ na injekciu.

Injekcia sa podáva striekačkou s objemom 1 ml a katétrom (Insyte^R, Vialon™) 18 ga (1,3 x 45 mm), z ktorého sa odoberie kovové skľučovadlo a nechá sa len plastový katéter s nezabrúseným koncom, ktorým sa injektuje suspenzia do mozgového tkaniva. Použije sa také množstvo striekačiek s objemom 1 ml, koľko je potrebných. Injekcia suspenzie so zabrúsenou ihlou vytvára riziko hematómu a odlivu mikroguličiek. Priemer katétra musí byť dostatočne malý, aby nedošlo k zraneniu mozgového tkaniva a dostatočne veľký, aby sa neupchal suspenziou mikroguličiek.

Injekcia sa musí podávať velmi jemne a katéter musí zostať niekoľko minút na mieste, aby sa zabránilo odlivu mikroguličiek. Na miesto injekcie na priloží fragment hematostatického resorbovatelného obväzu s veľkosťou 1 cm² (Surgical^R alebo Spongel^R) .

Pacienti zahrnutí do štúdie sú vo veku od 18 do 68 rokov, bez predchádzajúceho novotvaru, s Karnofským indexom väčším ako 60, a majú klinickú históriu a obraz naznačujúci živý glioblastóm, podstúpili úplné makroskopické vybratie nádoru a ich operačné histologické vyšetrenie (uskutočnené podľa kritérií OMS; nekróza, vaskulárna proliferácia, nukleárny pleomorfizmus a mitotická aktivita) potvrdilo diagnózu glioblastómu.

Kritéria na vylúčenie pacienta sú nasledujúce: metabolická deficiencia, obezita, iná predchádzajúca rakovinová patológia.

Na začiatku boli pre štúdium vplyvu rastúcich dávok 5fluór-uracilu plánované tri skupiny: v chronologickom poradí 70, 132, 264 mg, liečba nasledujúcej skupiny bola zahájená po zistení tolerancie u skupiny, ktorá bola práve testovaná.

Vzhľadom k zisteniu neurologickej toxicity Gráde II u pacienta, ktorý prijal 132 mg 5-FU a podlá pravidiel ukončenia protokolu, sa zvyšovanie terapeutických dávok zastavilo a nasledujúci pacienti dostali rovnakú dávku 132 mg.

Bežná externá rádioterapia (zameraná na objem nádoru ohodnotený na predoperačnom IRM s energiou 10 MV) sa zahájila medzi druhým a siedmym dňom nasledujúcim po operácii.

Aplikuje sa celková dávka 60 Gy v 33 dávkach po 1,8 Gy, pri 5 dávkach počas 6,5 týždňa. Ožarovaný objem zahŕňa objem nádoru s okrajom najmenej 2 cm vo všetkých smeroch.

hodinách,

Pacienti sú sledovaní po klinickej aj rádiologickej stránke: scanner na potvrdenie kompletného makroskopického vybratia nádoru sa uskutoční 72 hodín po operácii a klinické hodnotenie 10., 20. a 30.

Stanovenie hladiny 5-FU 10., 20. a deň. IRM sa uskutoční 10. a 30. deň. v krvi a LCR sa uskutoční po 72 30. deň. Toxicita (neurologická, hematologická, slizničná a kardiologická) sa hodnotí stupňami podlá kritérií odvodených od OMS. Po uplynutí jedného mesiaca sa pacienti klinicky sledujú každé dva mesiace a podstupujú každé tri mesiace IRM.

U všetkých pacientov bola pozorovaná ľahká pooperačná anémia, hyperleukocytóza a ľahká lymfopénia.

Farmakologická štúdia umožnila potvrdiť predĺžené uvoľňovanie 5-FU účinnej látky v cefalorachidovej kvapaline (LCR) počas viac ako 30 dní a v menšej miere prechodný priechod týchto molekúl do systémového obehu. Ešte mesiac po implantácii je pomerne veľká koncentrácia 5-FU v LCR.

Profil uvoľňovania 5-FU do LCR vykazuje maximum v desiatom resp. dvadsiatom dni pre dávky 70 resp. 132 mg. Koncentrácia 5FU v plazme nebola u polovice pacientov detegovateľné od desiateho dňa.

Systémová tolerancia je vynikajúca u všetkých testovaných pacientov. Neboli pozorované žiadne chemické alebo bunkové zmeny LCR. Po zistení mozgového edému pri rádioterapii pacienta, ktorému bola podaná dávka 132 mg, nebolo dovolené ďalšie zvyšovanie dávok.

Osem pacientov, z ktorých boli štyria muži a štyri ženy s priemerným vekom 48,5 roka a s Karnofským indexom väčším ako 90, bolo teda zahrnutých do štúdie. Prvej skupine troch ľudí sa podala dávka 70 mg a druhej, s piatimi ľuďmi, dávka 132 mg.

Prvé predbežné výsledky o prežití pacientov neboli štatisticky interpretovatelné z dôvodu malého počtu pacientov. Boli však veľmi povzbudzujúce. Pri poslednom hodnotení v prvej skupine (70 mg) zomreli traja pacienti v 61., 114. a 125. týždni. Je nutné poznamenať, že pacient, ktorý zomrel v 114. týždni, zomrel na následky pľúcnych metastáz glioblastómu. V druhej spracovanej skupine (132 mg) zomreli traja pacienti v 31., 59., a 82. týždni a u ďalších choroba ustupovala ešte v 159. a 172. týždni, v čase písania týchto predbežných výsledkov.

Stredný čas prežitia pacientov je 98 týždňov (v literatúre je 50,6 týždňa pre pacientov zodpovedajúcich rovnakých kritériám (Devaux BC, O'Fallon JR, Kelly PJ, Resection, biopsy, and survival in malignant glial neoplasm, J Neurosurg, 78: 767775, 1993) . Päť z ôsmich pacientov, teda 62 %, prežilo 18 mesiacov, zatial čo literatúra uvádza u pacientov zodpovedajúcich kritériám pre prijatie do tejto štúdie, že 18 mesiacov prežije 20 % pacientov (Devaux BC, O'Fallon JR, Kelly PJ, Resection, biopsy, and survival in malignant glial neoplasm, J Neurosurg, 78: 767-775, 1993).

Priemyselná využiteľnosť

Vynález sa môže použiť vo farmaceutickom priemysle.

Claims (36)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použitie biodegradovatelných mikroguličiek, ktoré uvoľňujú rádiosenzibilizujúcu protinádorovú látku na prípravu lieku na liečbu glioblastómu za súčasného, oddeleného alebo v čase rozloženého použitia s rádioterapiou, pričom tieto mikroguličky sú určené, po vybratí gliového nádoru, na implantáciu do stien operačnej dutiny do hĺbky najmenej dvoch centimetrov, prednostne dvoch až troch centimetrov, na najmenej každý cm², mikroguličky s obsahom protinádorovej látky sú obalené polymérom, ktorý oneskoruje uvoľňovanie protinádorovej látky a udržiava v parenchymovom priestore jej terapeuticky účinnú koncentráciu na dosiahnutie prežitia pacientov najmenej 90 týždňov, prednostne 130 týždňov a ešte prednostne 160 týždňov.
2. 2. Použitie podlá nároku 1, keď protinádorová látka je hydrofilná a/alebo nepreniká hematoencefalickou bariérou.
3. 3. Použitie podľa nároku 1 alebo 2, keď protinádorová látka nie je toxická pre centrálny nervový systém.
4. 4. Použitie podľa jedného z predchádzajúcich nárokov 1 až 3, kde je protinádorová látka tvorená jednou protinádorovou rádiosenzibilizujúcou zlúčeninou alebo zmesou protinádorových zlúčenín, ktoré obsahujú najmenej jednu protinádorovú rádiosenzibilizujúcu zlúčeninu, tzv. protinádorové zlúčeniny sú vybrané zo skupiny, ktorá obsahuje 5-fluóruracil (5-FU), platinu ako karboplatina a cisplatina, taxany ako docetaxel a paklitaxel, gemcitabin, VP16, mitomycín, idoxuridín, inhibítory topoizomerázy I ako irinotekan, topotekan a camtotecíny, nitrosourei, ako BCNU, ACNU alebo MCNU, metotrexat, bleomycín, adriamycín, cytoxan a vinkristin, imunomodulačné cytokíny ako IL2, IL6, IL12 a IL13 a interferóny.
5. 5. Použitie podľa nároku 4, kde protinádorová látka je 5fluóruraci1.
6. 6. Použitie podlá nároku 5, keď koncentrácia 5-FU v mozgovomiechovom moku, ktorá odráža koncentráciu v parenchymovom priestore, je 3 až 20 ng/ml.
7. 7. Použitie podlá jedného z predchádzajúcich nárokov 1 až 6, keď sa k protinádorovej látke pridá neuroprotektívna zlúčenina, vybraná z peptidových rastových faktorov ako je NGF alebo BDNF.
8. 8. Použitie podľa jedného z predchádzajúcich nárokov 1 až 7, keď polymér obaľujúci mikroguličky, ktorý oneskoruje uvoľňovanie protinádorovej látky, udržiava v parenchymovom priestore jej terapeuticky účinnú koncentráciu počas najmenej troch týždňov, prednostne najmenej štyroch týždňov.
9. 9. Použitie podľa jedného z predchádzajúcich nárokov 1 až 8, kde je polymér vybraný z nasledujúcich látok: etylcelulóza, polystyrén, poly(epsilon-kaprolaktón) , poly(kyselina d,1mliečna) a poly(kyselina d,1-mliečna-ko-kyselina glykolová).
10. 10. Použitie podľa jedného z predchádzajúcich nárokov 1 až 9, keď polymér, ktorý obaľuje mikroguličky, je poly(kyselina d,1-mliečna-ko-kyselina glykolová).
11. 11. Použitie podľa nároku 10, keď polymér, ktorý obaľuje mikroguličky, je poly(kyselina d,1-mliečna-ko-kyselina glykolová) , ktorá obsahuje rovnaké množstvo kyseliny mliečnej a kyseliny glykolovej.
12. 12. Použitie podľa jedného z predchádzajúcich nárokov 1 až 11, keď mikroguličky majú stredný priemer 48 ± 20 pm, prednostne 46 ± 7 pm.
13. 13. Použitie podľa jedného z predchádzajúcich nárokov 1 až 12, keď mikroguličky obsahujú 15 až 35 % hmotn. protinádorovej látky a 65 až 85 % hmotn. polyméru.
14. 14. Použitie podľa nárokov 5 a 13, keď mikroguličky obsahujú 19 až 27 % hmotn. 5-FU, prednostne 20 % hmotn. 5-FU.
15. 15. Použitie podľa jedného z predchádzajúcich nárokov 1 až 14, keď sa mikroguličky prevedú do suspenzie v sterilnom roztoku, získaná suspenzia je určená na injekciu do stien operačnej dutiny po vybratí gliového nádoru a keď sterilný roztok obsahuje 1 až 1,5 % hmotnostnoobjemových látky zvyšujúcej viskozitu, 0,5 až 1,5 % tenzidu a 3,5 až 4,5 % izotonizujúcej látky.
16. 16. Použitie podľa nároku 15, keď roztok obsahuje 1,25 % hmotnostnoobjemových sodnej soli karboxymetylcelulózy, 1 % polysorbátu 80 a 4 % manitolu.
17. 17. Použitie podľa nároku 5, keď celková dávka injektovaného 5FU. je 50 až 200 mg, prednostne 130 mg.
18. 18. Použitie podľa jedného z predchádzajúcich nárokov 1 až 17, keď sa rádioterapia zacieli na oblasť nádoru tak, že ožiarený objem obsahuje preoperačný nádor s okrajom najmenej dvoch centimetrov vo všetkých smeroch, a keď sa aplikuje celková dávka 50 až 60 Gy.
19. 19. Použitie podľa jedného z predchádzajúcich nárokov 1 až 18, keď sa rádioterapia zaháji prednostne medzi druhým a siedmim dňom nasledujúcim po operácii.
20. 20. Použitie podľa jedného z predchádzajúcich nárokov 1 až 19, keď sa rádioterapia uskutoční s celkovou dávkou 60 Gy počas šiestich týždňov.
21. 21. Použitie podlá jedného z nárokov 15 až 16 alebo 18 až 20, keď sa suspenzia mikroguličiek injektuje stereotakticky jedenkrát alebo viackrát v prípade návratu nádoru.
22. 22. Spôsob prípravy biodegradovatelných mikroguličiek obsahujúcich protinádorovú látku obalenú polymérom pomocou emulgácie a extrakcie, ktoré spočívajú v disperzii protinádorovej látky a polyméru v organickom rozpúšťadle, v zmiešaní získanej organickej fázy s vodnou fázou na získanie emulzie, v extrakcii organického rozpúšťadla pridaním vody a vo filtrácii získanej suspenzie mikroguličiek, vyznačujúci sa tým, že protinádorová látka sa disperguje v organickom rozpúšťadle za silného miešania pred pridaním polyméru.

    Spôsob podľa nároku 22, vyznačujúci sa tým, rozpúšťadlo je dichlórmetán.

    že organické
23. 23.
24. 24. Spôsob podlá nároku 22 alebo 23, vyznačujúci sa tým, že vodná fáza a organická fáza majú v okamihu zmiešania rovnakú teplotu, prednostne 2 °C.
25. 25. Spôsob podlá jedného z nárokov 22 až 24, vyznačujúci sa tým, že organická fáza obsahuje 11 % polyméru.
26. 26. Spôsob podlá jedného z nárokov 22 až 25, vyznačujúci sa tým, že pomer vodná fáza/organická fáza je rovný 100/3.
27. 27.Spôsob podlá jedného z nárokov 22 až 26, vyznačujúci sa tým, že emulzia tvorená vodnou a organickou fázou sa mieša najmenej 3 minúty.
28. 28.Spôsob podlá jedného z nárokov 22 až 27, vyznačujúci sa tým, že voda potrebná na extrakciu organického rozpúšťadla sa pridá v takom množstve, aby bol objemový pomer emulzia/voda rovný 1/3.
29. 29. Spôsob podľa jedného z nárokov 22 až 28, vyznačujúci sa tým, že voda potrebná na extrakciu organického rozpúšťadla má teplotu 4 °C.
30. 30. Spôsob podľa jedného z nárokov 22 až 29, vyznačujúci sa tým, že sa protinádorová látka pred disperziou v organickom rozpúšťadle rozdrtí, aby bola veľkosť kryštálov protinádorovej látky 15 až 50 μπι.
31. 31.Spôsob podľa jedného z nárokov 22 až 30, vyznačujúci sa tým, že sa suspenzia získaná po pridaní vody určenej na extrakciu, filtruje v inertnej atmosfére.
32. 32.Spôsob podľa jedného z nárokov 22 až 31, vyznačujúci sa tým, že sa mikroguličky lyofilizujú.
33. 33. Suspenzia, vyznačujúca sa tým, že je tvorená sterilným roztokom s obsahom 1 až 1,5 % hmotnostnoobjemových látky zvyšujúcej viskozitu, 0,5 až 1,5 % tenzidu a 3,5 až 4,5 % izotonizujúcej látky a biodegradovateľnými guličkami obalenými polymérom, ktoré uvoľňujú protinádorovú látku, pomer mikroguličiek predstavuje 200 až 300 mg/ml sterilného roztoku.
34. 34. Suspenzia podľa nároku 33, keď mikroguličky sú tvorené 15 až 35 % hmotn. protinádorovej látky a 65 až 85 % hmotn.

    polyméru.
35. 35. Suspenzia podľa nároku 33 alebo 34, keď polymér je poly(kyselina d,1-mliečna-ko-kyselina glykolová), ktorá obsahuje prednostne rovnaké množstvo kyseliny mliečnej a kyseliny glykolovej.
36. 36. Suspenzia podľa jedného z nárokov 33 až 35, keď sterilný roztok obsahuje 1,25 % hmotnostnoobjemových sodnej soli karboxymetylcelulózy, 1 % polysorbátu 80 a 4 % manitolu.