SK16212001A3

SK16212001A3 - 14beta-H-steroly, ich použitie ako liečiv a farmaceutické prostriedky, ktoré ich obsahujú

Info

Publication number: SK16212001A3
Application number: SK1621-2001A
Authority: SK
Inventors: Peter Esperling; Joachim Kuhnke; Henry Laurent; Thorsten Blume; Christa Hegele-Hartung; Monika Lessl
Original assignee: Schering Aktiengesellschaft
Priority date: 1999-05-10
Filing date: 2000-05-05
Publication date: 2002-02-05
Also published as: BG106093A; NO20015488D0; CN1350543A; CA2373442A1; PL352029A1; JP2002544136A; WO2000068245A1; KR20020013541A; NO20015488L; IL145373A0; EA200101157A1; HUP0201098A2; ZA200110073B; AU4756100A; EE200100592A; BR0010449A; EP1177205A1; CZ20013981A3

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka farmaceutický účinných sterolov, farmaceutických kompozícii, ktoré obsahujú ako účinné látky tieto steroly a použitia týchto nových zlúčenín na prípravu liečiv. Zistilo sa najmä, že steroly podľa predkladaného vynálezu možno použiť na reguláciu meiózy.

Doterajší stav techniky

Meióza je jedinečným a základným procesom zárodkových buniek, na ktorom je založené pohlavné rozmnožovanie. Meióza zahŕňa dve meiotické delenia. Počas prvého meiotockého delenia sa predtým ako sa páry chromozómov rozdelia do dvoch dcérskych buniek uskutoční výmena medzi materskými a otcovskými génmi. Tieto obsahujú iba polovicu počtu chromozómov, tj. In, a 2c DNA. Druhé meiotické delenie prebieha bez syntézy DNA. Preto je výsledkom tohto delenia zostava haploidných zárodkových buniek, obsahujúcich iba lc DNA.

Meiotické procesy sú u samčích a samičích zárodkových buniek podobné, avšak časový priebeh a diferenciačné procesy, ktorých výsledkom je vajíčko a spermia, sa hlboko líšia. Všetky samičie zárodkové bunky vstúpia do profázy prvého meiotického delenia na začiatku života, často pred narodením, avšak všetky sú neskôr pozastavené ako cocyty v profáze (štádium diktyoténu) až do ovulácie po puberte. Takto, už od začiatku života, disponuje samica zásobou oocytov, ktoré sa uvoľňujú, pokiaľ sa zásoba nevyčerpá. Meióza u samíc nie je úplne dokončená až do obdobia po oplodnení, a jej výsledkom, pripadajúcim na zárodkovú bunku, je iba jedno vajíčko a dve abortívne polárne telieska. Na rozdiel od toho, po puberte iba niekoľko samčích zárodkových buniek ukončuje meiózu a opúšťa tak kmeňovú populáciu zárodkových buniek v priebehu života. Akonáhle meióza v samčích bunkách začne, prebieha bez signifikantného oneskorenia a jej výsledkom sú 4 spermie.

mechanizme, ktorý u samcov a u samíc reguluje začiatok meiózy, sa toho vie iba málo. Nové štúdie ukazujú, že v oocyte, môžu zodpovedať za pozastavenie meiózy folikulárne puríny, napr.

·· ···· • · · • · · » ·· • · · • · ·

hypoxantín	alebo	adenozín, viď. napr. Downs	, S. M.	a kol
Biol 82,	1985,	str. 454 až 458, Epplg,	J. J.	a kol.
Biol 119,	1986,	str. 313 až 321, a Downs,	S. M. ,	Mol
Dev 35, 1993, str. 82 až 94. Prítomnosť	difuzibilnej

Dev regulujúcej meiózu prvýkrát opísali Byskov a kol. v systéme kultúry fetálnych myších gonád v Byskov, A. G. a kol.: Dev Biol 52, 1976, str. 193 až 200. Meiózu aktivujúcu substanciu (MAS) vylučoval fetálny myší vaječník, v ktorom meióza pokračovala, a meiózu zabraňujúca substancia (MPS) sa uvoľňovala z morfologicky diferencovaného testes so zárodkovými bunkami v kľudnom šrádiu, u ktorých meióza neprebiehala. Toto naznačilo že relatívne koncentrácie MAS a MPS regulujú začiatok, pozastavenie a opätovné zahájenie meiózy u samičích a samčích zárodkových buniek, viď. napr. Byskov, A. G. a kol.: The Physiology c£ Reproduction, (editori Knobil, E. a Neill, J. D.), Raven Press, New York, 1994. Pokiaľ možno regulovať meiózu, potom možno samozrejme regulovať i reprodukciu. Nedávne články, napr. Byskov, A. G. a kol., Náture 374, 1995, str. 559 až 562, opisujú izoláciu určitých sterolov (T-MAS a FF-MAS), ktoré aktivujú meiózu u oocytu, z býčích semenníkov a z ludskej folikulárnej tekutiny.

Zlúčeniny, o ktorých je známe, že regulujú meiózu, opisujú WO 96/27658, WO 97/00884, WO 98/28323 a WO 98/52965.

Cieľom predkladaného vynálezu je poskytnúť nové zlúčeniny, použiteľné ako antikoncepčné prostriedky u samíc a samcov, najmä u ľudí, ktoré účinkujú prostredníctvom inhibície meiózy.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález vzorca I, sa týka 143-H-sterolov všeobecného

v ktorom

R³ znamená atóm vodíka alebo spoločne so substituentom R³ tvorí ďalšiu väzbu,

R⁴ znamená atóm vodíka alebo metylovú skupinu,

R⁷ znamená atóm vodíka alebo spoločne so substituentom R⁸ tvorí ďalšiu väzbu,

R⁸ znamená atóm vodíka alebo spoločne so substituentom R⁷, alebo spoločne so substituentom R⁹, tvorí ďalšiu väzbu,

R⁹ znamená atóm vodíka alebo spoločne so substituentom R⁸, alebo spoločne so substituentom R¹¹, tvorí ďalšiu väzbu,

R¹⁵ znamená atóm vodíka, hydroxyskupinu, atóm halogénu, alebo spoločne so substituentom R¹⁵ tvorí oxoskupinu, alebo spoločne so substituentom R¹⁶ tvorí ďalšiu väzbu, alebo spoločne so substituentom R²² tvorí kyslíkový mostík, ·· ···· • · • · · • · · • · · ·· ·

R¹⁵ znamená atóm vodíka, rozvetvenú alebo nerozvetvenú alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 8 uhlíkových atómov, arylovú skupinu obsahujúcu 6 až 10 uhlíkových atómov, alebo spoločne so substituentom R¹⁵ tvorí oxoskupinu,

R¹⁶ znamená atóm vodíka, hydroxyskupinu, atóm halogénu, alebo spoločne so substituentom R¹⁵ tvorí ďalšiu väzbu, alebo spoločne so substituentom R²² tvorí ďalšiu väzbu,

R²² znamená atóm vodíka, prípadne substituovanú, rozvetvenú alebo nerozvetvenú, alkylovú alebo alkenylovú skupinu obsahujúcu 1 až 8 uhlíkových atómov, prípadne substituovanú arylovú skupinu obsahujúcu 6 až 10 uhlíkových atómov, alebo spoločne so substituentom R¹⁶ tvorí ďalšiu väzbu, alebo spoločne so substituentom R²² tvorí rozvetvenú alebo nerozvetvenú alkylidénovú skupinu obsahujúcu 1 až 8 uhlíkových atómov,

R²² znamená atóm vodíka, hydroxyskupinu, alebo spoločne so substituentom R¹⁵ tvorí kyslíkový mostík, alebo spoločne so substituentom R²² tvorí rozvetvenú alebo nerozvetvenú alkylidénovú skupinu obsahujúcu 1 až 8 uhlíkových atómov, alebo ich estery.

Termín „alkylová skupina, použitý samotný alebo v kombináciách, znamená v predkladanom opise a patentových nárokoch priamu alebo rozvetvenú alkylovú skupinu. Termín „alkylová skupina obsahujúca 1 až 8 uhlíkových atómov označuje alkylovú skupinu ktorá obsahuje jeden až osem uhlíkových atómov, pričom jej vhodnými príkladmi sú metylová skupina, etylová skupina izopropylová skupina, butylová skupina terc-butylová skupina, pentylová skupina izopentylová skupina, hexylová skupina a cyklohexylová skupina Termínom „alkenylová skupina sa mieni nenasýtená alkylová Výhodnými príkladmi sú vinylová skupina, izopropenylová skupina a prenylová skupina.

propylová skupina, izobutylová skupina, alylová

Termín skupina. skupina, ,atóm halogénu znamená atóm fluóru, atóm chlóru, atóm brómu ·· · ·· ···· • · · • · · • · · · • · · ·· · • ·· ·· · · • · • · · • · «·· ···· alebo atóm jódu. Výrok napr. „substituent R¹⁵ spoločne so substituentom R¹⁵ tvorí oxoskupinu, použitý v predkladanom opise a patentových nárokoch, znamená to, že oxoskupina, t j. skupina 0=, je prítomná v polohe 15, a preto v polohe 15 nie je žiadny atóm vodíka. Termín „arylová skupina obsahujúca 6 až 10 uhlíkových atómov označuje fenylovú skupinu, ktorá je prípadne substituovaná halogénom, alkoxyskupinami obsahujúcimi 1 až 4 uhlíkové atómy, hydroxyskupinami alebo alkylovými skupinami obsahujúcimi 1 až 4 uhlíkové atómy. Termínom „priama alebo rozvetvená alkylidénová skupina obsahujúca 1 až 8 uhlíkových atómov sa mieni alkylidénová skupina obsahujúca jeden až osem uhlíkových atómov. Táto skupina sa viaže v polohe 22 prostredníctvom dvojitej väzby na atóm uhlíka steroidu. Výhodnými príkladmi sú metylénová skupina, etylidénová skupina, propylidénová skupina, izopropylidénová skupina, butylidénová skupina, izobutylidénová skupina, pentylidénová skupina, izopentylidénová skupina, neopentylidénová skupina a cyklohexylidénová skupina.

Prekvapivo sa zistilo, že β-konfigurácia atómu vodíka v polohe 14 (ide o číslovanie atómov uhlíka podlá nomenklatúry IUPAC) je dôležitá pre inhibičnú účinnosť na meiózu. V prítomnosti 14β-Η-5ίβΓθ1ον je aktivačný účinok FF-MAS na meiózu narušený alebo celkom potlačený. Až doteraz opisované látky regulujúce meiózu sú 14a-H a A14-cholestanové deriváty (Byskov, A. G. a kol., Náture 374, 1995, str. 559 až 562} , a vykazujú buď aktivujúcu účinnosť na meiózu alebo nízku inhibičnú účinnosť. Oproti tomu 14β-Η-3ίβΓθ1γ podlá predkladaného vynálezu silno antagonizujú účinok prírodných FF-MAS a sú tak inhibítormi meiózy. Týmito zisteniami sa stali opisované zlúčeniny obzvlášť zaujímavými pre antikoncepciu. Výhodnými zlúčeninami všeobecného vzorca I sú tie, ktoré inhibujú rozpad zárodkového mechúrika aspoň o 20 *, výhodne o 40 %, najmä o 60 %, v prípade, že sa testujú pomocou oocytového testu, ako sa opisuje v príklade 13, a ktoré neaktivujú meiózu v oocytovom teste opísanom v príkla6 ·· ···· • · · • · · • · · · • · · ·· · • ·· ·· ·· · · · · · • · · · • · · · · • · · · ··· ···· ·· · de 12.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I majú v molekule niekolko chirálnych centier, a preto sa vyskytujú v niekoľkých izomérnych formách. Všetky tieto izomérne formy a ich zmesi sú v rozsahu predkladaného vynálezu, pokiaľ nie je uvedené inak. Výhodnými zlúčeninami všeobecného vzorca I sú zlúčeniny s 3p-hydroxyskupinou a 8ň-dvojitou väzbou. Ďalej sú výhodné zlúčeniny všeobecného vzorca'I, v ktorých substituent R¹⁵ predstavuje atóm vodíka alebo hydroxyskupinu. Ďalšími výhodnými zlúčeninami všeobecného vzorca I sú tie, v ktorých substituent R²² predstavuje priama alebo rozvetvená, prípadne substituovaná, alkylová skupina, obsahujúca 1 až 8 uhlíkových atómov, alebo spoločne so substituentom R²² tvorí priamu alebo rozvetvenú alkylidénovú skupinu obsahujúcu 1 až 8 uhlíkových atómov.

Podľa iného uskutočnenia sa predkladaný vynález týka esterov zlúčenín všeobecného vzorca I. Takéto estery sa formálne odvodzujú esterifikáciou jednej alebo viacerých hydroxylových skupín zlúčeniny všeobecného vzorca I s kyselinou, ktorú možno napríklad zvoliť zo skupiny kyselín zahŕňajúcej kyselinu jantárovú, kyselinu glutárovú a iné alifatické dikarboxylové kyseliny, kyselinu nikotínovú, kyselinu izonikotínovú, kyselinu etylkarbónovú, kyselinu fosforečnú, kyselinu sulfónovú, kyselinu amidosulfónovú, kyselinu benzoovú, kyselinu octovú, kyselinu propiónovú a iné alifatické monokarboxylové kyseliny.

Obzvlášť výhodnými zlúčeninami všeobecného vzorca I podlá predkladaného vynálezu sú nasledujúce:

4.4- dimetyl-5a, 14p-cholest~8-en-33-ol,

4.4- dimetyl-5a,14p-cholest-8-én-3p,15p-diol,

4.4- dimetyl-5a,14p-cholest-8-én-3p, 15a-diol,

4.4- dimetyl-5oŕ, 14p-cholesta-8,15-dien-3p-ol,

4.4- dimetyl-5a,14p-cholesta-7,9(11),15-trien-33-ol,

4.4- dimetyl-5a,14p-cholesta-8,15,23(E)-trien-3p-ol, ·· ···· · ·· ·· ·· · ······ • · · · · · · • · · · · · · ·· · ··· ···· ··

4, 4-dimetyl-5α,14p-cholesta-8,15,24-trien-3p-ol,

4, 4-dimetyl-5α,14p-cholesta-8,24-dién-3p, 15p-diol,

4.4- dimetyl-5a,14p-ergosta-8,22-dien-3p-ol,

4.4- dimetyl-5a,14p-ergosta-8,22-dién-3P,15p-diol,

4.4- dimetyl-5a,14p-ergosta-8,22-dién-3P, 15a-diol,

4.4- dimetyl-5a,14p-ergosta-8,15,22-trien-3p-ol,

4.4- dimetyl-24-nor-5a,14p-cholest-8-en-3p-ol,

4.4- dimetyl-24-nor-5a,14p-cholest-8-én-3p,15p-diol,

4.4- dimetyl-24-nor-5a,14p-cholest-8-én-3P,15a-diol,

4.4- dimetyl-24-nor-5a,14p-cholesta-8,15-dien-3p-ol,

4.4- dimetyl-5a,14p-cholesta-8,15-dien-3p-ol-hydrogenbutándioát,

4.4- dimetyl-5a,14p-ergosta-8,15,22-trien-3p-ol-hydrogenbutándioát, (202?) -4,4,20-trimetyl-16p, 21-cyklo-5a, 14p-pregn-8-én-3P, 15a-diol, (2OR)-4,4,20-trimetyl-16P,21-cyklo-5a,14p-pregn-8-én-3P,15β-diol, (20R)-20-hydroxymetyl-4,4-dimetyl-5a,14p-pregn-8-én-3p,15p-diol,

Zlúčeniny všeobecného vzorca I podľa predkladaného vynálezu možno syntetizovať podobne, ako možno pripraviť známe zlúčeniny. Preto sa môžu syntézy zlúčenín všeobecného vzorca I uskutočňovať podľa zavedených syntetických ciest opísaných v obsiahlej literatúre týkajúcej sa sterolov a steroidov. Nasledujúcu literatúru možno použiť ako pomôcku pri syntéze:

L. F. Fieser & M. Fieser: Steroids, Reinhold Publishing

Corporation, NY, 1959,

Rooď s Chemistry o f Carbon Compounds (editor

S. Coffrey): Elsevier Publishing Company, 1971, a najmä

Dictionary of Stercids (editori R. A. Hill, D. N. Kirk,

H. L. J. Makin a G. M. Murphy) : Chapman & Halí.

Posledná uvedená citácia obsahuje obsiahly zoznam citácií pôvodných článkov pokrývajúcich obdobie až do roku 1990.

·· ···· ··

• ···· ·· ·

Zlúčeniny podlá predkladaného vynálezu sa syntetizujú najmä podlá nasledujúcich všeobecných postupov:

Steroly použité ako východiskové látky možno syntetizovať spôsobmi opísanými v literatúre:

4.4- dimetyl-5a-cholesta-8,14-dien-3p-ol {Biochem. J. 132,

1973, str. 439)

4.4- dimetyl-5a-ergosta-8,14,22-trien-33-ol (ako benzoát: J.

Org. Chem. 51, 1986, str. 4047)

5a-cholesta-8,14-dien-3p-ol (J. Am. Chem. Soc. 75, 1953, str. 4404)

5a-ergosta-8,14,22-βη-3β-ο1 (J. Org. Chem. 53, 1988, str. 1563) .

Ďalej sú detailne opísané iba zlúčeniny obsahujúce 4,4-dimetylovú skupinu. Zlúčeniny, ktoré nie sú v polohe 4 substituované, možno získať obdobným spôsobom.

14β-íí-deriváty možno syntetizovať z Δ-8,14-diénových systémov všeobecného vzorca 1 cez chránenie alkoholu, epoxidáciu a následné otvorenie epoxidu (viď. schéma 1). 3-alkohol možno chrániť ako benzoát. Epoxidáciu možno dosiahnuť pomocou činidiel podobných, ako sú napríklad dimetyldioxirán, hydrogenperoxid, v prítomnosti rôznych katalyzátorov, m-CPBA a iných peroxykyselín. Preskupenie na dekonjugovaný ketón všeobecného vzorca 4 možno dosiahnuť pôsobením rozličných kyselín alebo Lewisových kyselín, ako je napríklad bórtrifluorid (viď. Chem. Pharm. Bull. 38, 1990, str. 1976).

Schéma 1

Reakcie možno uskutočňovať v prítomnosti rozličných steroidových postranných reťazcov, t j . R_s, ako sú napríklad cholesterolový, ergosterolový, sitosterolový alebo stigmasterolový postranný reťazec.

Ak sa 15-ketóny všeobecného vzorca 4 redukujú pomocou lítiumalumíniumhydridu, získajú sa 3p,15p-dioly všeobecného vzorca 5. Zodpovedajúce 15a-alkoholy možno získať ako menej časté diastereoméry všeobecného vzorca 6 redukciou pomocou nátriumborohydridu. Výsledkom následného odštiepenia skupiny chrániacej hydroxyskupinu v polohe 3 sú 3β,15a-dioly všeobecného vzorca 7 (viď. schéma 2).

·· ····	• ··	··
• · ·	·· · ·	• ·
• · ·	• ·	• 9
• · ·	• ·	9 ·
·· ·	··· ····	«·

Schéma 2

A8,15-dién všeobecného vzorca 10 možno získať nasledujúcim postupom. Výsledkom redukcie ketónu všeobecného vzorca 4 pomocou nátriumborohydridu je 15p-alkohol všeobecného vzorca 8, t j. hlavný diastereomér. Elimináciu na á8,15-dién všeobecného vzorca 9 možno previesť pomocou Martinovho sulfuránu. Odstránenie chrániacej skupiny vedie k požadovaným alkoholom všeobecného vzorca 10 (viď. schéma 3).

·· ····	• ·· ·· · · • ·	·· • · • ·	··
• •	• · • ·
•	• · ·· ·	• · ··· ····	• · ··

Schéma 3

Deriváty, ktoré sú v polohe 15 nasýtené, možno získať nasledujúcou cestou. 15p-alkoholy všeobecného vzorca 8 možno podrobiť reakcii s chloridom kyseliny metánsulfónovej. Mesylát všeobecného vzorca 11 možno potom redukovať pomocou lítiumalumíniumhydridu. Výsledkom sú zlúčeniny všeobecného vzorca 12 (viď. schéma 4) .

Schéma 4

·· ···· • · · e • · · • · · · • · · ·· · · ·· ·· • · · · · • · · • · · · • · · ···· ·· ·

Modifikácie postranných reťazcov možno uskutočniť pomocou ozonolýzy ergosterolového postranného reťazca u zlúčeniny vzorca 4, v ktorom R_steroi znamená ergosterolový postranný reťazec. Po uskutočnení redukcie pomocou nátriumborohydridu možno hydroxyskupinu v polohe 22 22-alkoholu vzorca 13 premeniť na odstupujúcu skupinu, ako je napríklad tosylát (viď. schéma 5). Tento tosylát vzorca 14 možno podrobiť reakcii s rozličnými rozvetvenými alebo priamymi alkylovými, alkenylovými alebo arylovými Grignardovými činidlami pri katalytickom pôsobení medi, ktorého výsledkom sú zlúčeniny všeobecného vzorca 15.

Schéma 5

Tieto zlúčeniny možno premeniť na zodpovedajúce 3,15-dioly (viď. schéma 2), ú8,15-diény (viď. schéma 3) alebo nasýtené zlúčeniny (viď. schéma 4), ako je opísané pred týmto.

Ďalšie modifikácie postranných reťazcov, ako sú napríklad 24-keto-, 24-hydroxy- a A24-zlúčeniny, možno získať nasledujúcou cestou. Výsledkom ozonolýzy zlúčeniny vzorca 4 a následného spracovania pomocou trifenylfosfínu je aldehyd vzorca 16. Ten možno podrobiť aldolovej reakcii s izopropyl-metyl-ketónom, ktorej výsledkom je zlúčenina vzorca 17, ako zmes diastereomérov.

·· ···· • e · · • · · • · · ·· · · ·· ·· • · · · · • · · • · · • ···· ·· ·

Eliminácia pomocou Martinovho sulfuránu, hydrogenácia a následná redukcia dáva diol vzorca 20, ako zmes diastereomérov (viď. schéma 6).

Schéma 6

Dioly vzorca 20 možno podrobiť eliminácii, ktorej výsledkom sú nasledujúce steroly. Pôsobením Martinovho sulfuránu sa získa mono- a bis-eliminovaný produkt. Následné odštiepenie benzoátu možno lahko dosiahnuť pomocou redukcie, čoho výsledkom je diol vzorca 23 respektíve trién vzorca 24 (viď. schéma 7).

Zlúčeniny s ďalšou väzbou medzi atómom uhlíka v polohe 16 a atómom uhlíka v polohe 22 možno získať nasledujúcou cestou. Tosylát vzorca 14 možno podrobiť reakcii so zásadou, ako napríklad s lítium-diizopropylamidom alebo rozličnými Grignardovými zlúčeninami, na deprotonovanie ketónu v polohe 16. Enolát intramolekulárne alkyluje 22-tosylát, čím vznikne per.tacyklus vzorca 25. Ten možno podrobiť reakcii s lítiumalumíniumhydridom, ktorej výsledkom sú dioly vzorca 26 a vzorca 27 (viď. schéma 8).

·· • · ···· ·· • · ·· • · • · • · ·· ···· • · ··

Schéma 8

Predkladaný vynález sa ďalej týka farmaceutických kompozícií obsahujúcich jednu alebo viac zlúčenín všeobecného vzorca I, ako účinnej zložky. Kompozície môžu ďalej obsahovať farmaceutický prijateľné pomocné látky dobre známe v odbore, ako sú napríklad nosiče, riedidlá, činidlá zlepšujúce absorpciu, konzervačné činidlá, tlmivé roztoky, činidlá na reguláciu osmotického tlaku, činidlá rozrušujúce tablety a iné prísady, ktoré sa obvykle používajú v odbore. Príklady pevných nosičov sú uhličitan horečnatý, stearát horečnatý, dextrín, laktóza, cukor, mastenec, želatína, pektín, tragacanth, metylceluióza, nátrium-karboxymetylcelulóza, vosky s nízkou teplotou topenia a kakaové maslo.

Kvapalné kompozície zahŕňajú sterilné roztoky, suspenzie a emulzie. Takéto kvapalné kompozície môžu byť vhodné na injekčné podávanie alebo na použitie v súvislosti s ex vivo a in vitro fertilizáciou. Kvapalné kompozície môžu obsahovať zložky, ktoré sa obvykle používajú v odbore, niektoré z nich sú uvedené pred týmto. Ďalej možno kompozíciu pre transdermálne podávanie zlúčenín podľa predkladaného vynálezu poskytnúť vo forme náplasti, a kompozíciu pre nazálne podávanie možno poskytnúť vo forme nazálneho spreja, a to v kvapalnej alebo práškovej forme.

·· »··« e ·· ·· • · · ······· • · · · · · · ··· · · ···· • · · · · · · ·* ’ ..........

Konkrétnu dávku zlúčeniny podľa vynálezu, ktorá sa použije, stanoví ošetrujúci lekár, pričom táto dávka bude závisieť od mnohých rozličných faktorov, napríklad od konkrétnej použitej zlúčeniny, od spôsobu podania a od účelu použitia. Všeobecne sa kompozície podľa vynálezu pripravujú dôkladným zmiešaním účinnej zlúčeniny s kvapalnými alebo pevnými pomocnými látkami a potom v prípade, že je to nutné, vytvarovaním do žiaducej podoby.

Obvykle sa cicavcom, napr. ľuďom, nepodáva viac ako 1000 mg, výhodne sa nepodáva viac ako 100 mg, a v niektorých výhodných prípadoch sa nepodáva viac ako 10 mg, zlúčeniny všeobecného vzorca I denne.

Predkladaný vynález sa týka použitia zlúčenín všeobecného vzorca I na prípravu liečiva regulujúceho meiózu. Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu ovplyvňujú meiózu v oocytoch rovnako ako v samčích zárodkových bunkách. Zlúčeniny všeobecného vzorca I sa javia ako perspektívne nové činidlá regulujúce fertilitu bez obvyklých vedľajších účinkov na somatické bunky, ktoré sú známe u hormonálnych antikoncepčných prostriedkov používaných až doteraz, založených na estrogénoch a/alebo gestagénoch.

V tejto súvislosti je dôležité poznamenať, že biosyntéza progesterónu v kultúre ľudských granulóznych buniek, tj. somatických buniek folikulu, nie je ovplyvnená prítomnosťou látky regulujúcej meiózu, pričom estrogény a gestagény, obsiahnuté v hormonálnych antikoncepčných prostriedkoch používaných až doteraz, majú na biosyntézu progesterónu nepriaznivý účinok.

Antikoncepciu u samíc možno dosiahnuť podávaním zlúčeniny podlá vynálezu, ktorá blokuje meiózu tak, že sa netvoria· žiadne zrelé oocyty. Podobne možno dosiahnuť antikoncepciu u samcov podávaním zlúčeniny podlá vynálezu, ktorá blokuje meiózu tak, že sa netvoria žiadne zrelé spermie.

·· ···· · ·· ·· ·· · ······· • · · · · · · • · · · · · · ·· · ··· ···· ·· ·

Podľa ďalšieho uskutočnenia sa predkladaný vynález týka spôsobu regulácie meiózy, ktorý zahŕňa podávanie účinného množstva jednej alebo viac zlúčenín všeobecného vzorca I pacientom, ktorí takúto reguláciu potrebujú.

Spôsobom podávania kompozícií obsahujúcich zlúčeninu podlá vynálezu môže byť ktorýkoľvek spôsob, ktorý zaistí efektívny transport účinnej zlúčeniny na miesto jej pôsobenia.

Preto sú zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu v prípade, že sa podávajú cicavcovi, poskytované obvykle vo forme farmaceutickej kompozície, ktorá obsahuje aspoň zlúčeninu podľa vynálezu spoločne s farmaceutický prijateľným nosičom. Takéto kompozície pre orálne podávanie sú výhodne vo forme kapsúl alebo tabliet.

Zlúčeniny podľa vynálezu by sa mali v prípade, že sa používajú ako antikoncepčné prostriedky, podávať buď nepretržite alebo cyklicky.

Podľa ďalšieho uskutočnenia sa predkladaný vynález týka použitia 14β-hydrogenskupiny v sterolovej zlúčenine na zvýšenie inhibičnej účinnosti látky inhibujúcej meiózu.

Predkladaný vynález je ďalej ilustrovaný nasledujúcimi príkladmi.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

4,4-dimetyl-5a,14p-ergosta-8,22-dién-38,153-diol

a) 4,4-dimetyl-5a-ergosta-8,14,22-trien-3p-yl-benzoát

K roztoku 30,9 g 4,4-dimetyl-5a-ergosta-8,22-dien-3p-olu v 154 ml pyridínu sa pridalo pri 60 °C 40 ml benzoylchloridu

•	·· ···· • ·	• ·· ·· · ·	•	·· •
•	• ·	• ·	•	•
•	• ·	• ·	•	•
	·· ·	··· ····		··

v dvoch častiach. Reakčná zmes sa počas 1 hodiny miešala pri tej istej teplote a potom sa naliala do ľadovej vody. Potom sa odobral precipitát, premyl sa v ľade vychladenom etanolom, rekryštalizoval sa v zmesi so zmesou dichlórmetánu a metanolu, a potom sa sušil počas 12 hodín. Získalo sa 32 g 4,4-dimetyl-5a-ergosta-8,14,22-trien-3p-yl-benzoátu s teplotou topenia 146 °C.

¹H-NMR (deuterochloroform): δ = 0,80 - 1,12 (8x CH₃) ; 4,75 (dd,

J = 16 Hz, 4 Hz, 1H, H-3a); 5,22 (m, 2H, H-22/23); 5,38 (široký s, 1H, H-15); 7,46 (t, 2H); 7,57 (t, 1H); 8,07 (d, 2H)

b) 4,4-dimetyl-14,15a-epoxy-5a-ergosta-8,22-dien-33-yl-benzoát

Roztok 18 g 4,4-dimetyl-5a-ergosta-8,14,22-trien-3p-yl— benzoátu v 60 ml dichlórmetánu sa vychladil na 10 ’C. Po pridaní 3 g m-nitrofluóracetofenónu a 10 ml nasýteného roztoku hydrogenuhličitanu sodného sa reakčná zmes miešala počas 15 minút. Potom sa pridalo 12 ml 30% vodného roztoku peroxidu vodíka a roztok sa miešal počas 20 hodín pri 10 °C. Potom sa pridalo 12 ml 30% vodného roztoku peroxidu vodíka (30% vodný roztok) a roztok sa miešal počas 20 hodín pri 10 °C. Potom sa pridalo 20 ml nasýteného roztoku nátriumtiosulfátu a zmes sa miešala počas 20 minút, rozriedila sa pomocou dichlórmetánu, premyla 5% vodným roztokom hydroxidu sodného, vodou a roztokom chloridu sodného. Výsledkom sušenia pomocou síranu horečnatého a eliminácie rozpúšťadiel vo vákuu je 20 g surového epoxidu, ktorý sa ďalej podrobil reakcii, bez toho, aby sa purifikoval.

c) 3β^θηζογ1οχγ-4,4-dimetyl-5a,14p-ergosta-8,22-dien-15-ón

Rozpustilo sa 20 g surového epoxidu v 300 ml dioxánu. Žltý, mechanicky miešaný roztok sa podrobil pôsobeniu 2,5 ml bórtrifluorideterátu počas 30 minút a potom sa nalial do ľadovej vody. Perom sa odobral precipitát, premyl sa v ľadom vychladenej vode a sušil sa. Surová látka sa purifikovala pomocou chromatografie,

··	····	• ··	··
•	• ·	·· · ·	• ·
•	• ·	• ·	• ·
•	• ·	• ·	• ·
··	•	·· ····	··

ktorej výsledkom bolo 11,55 g 3p-benzoyloxy-4,4-dimetyl-5a,14β-ergosta-8,22-dien-15-ónu s teplotou topenia 176 ’C.

¹H-NMR (d5-pyridín): δ = 0,85 (2x, J = 7 Hz, 6H, H-27/26);

0,91 (s, 3H, 4-β-ΟΗ₃); 0,93 (d, J = 7 Hz, 3H, H-28); 1,05 (s, 3H, H-18); 1,06 (s, 3H, 4-a-CH₃) ; 1,07 (s, 3H, H-19) ; 1,13 (d,

J = 7 Hz, 3H, H-21); 4,89 (dd, J = 12 Hz, 4 Hz, 1H, H-3ct) ; 5,37 (m, 2H, H-22/23); 7,49 (t, 2H); 7,57 (t, 1H); 8,27 (d, 2H)

d) 4,4-dimetyl-5a,14P-ergosta-8,22-dién-3p,15p-diol

Pridalo sa 50 mg LiAlH₄ k miešanému roztoku 300 mg 3p-benzoyloxy-4,4-dimetyl-5a,14p-ergosta-8,22-dien-15-ónu v 30 ml dietyléteru a zmes sa potom miešala počas 30 minút pri teplote miestnosti. Potom sa pridal 1 ml nasýteného roztoku chloridu amónneho. Po 10 minútach sa roztok prefiltroval a rozpúšťadlo sa eliminovalo vo vákuu. Zvyšok sa rozdelil pomocou chromatografie, ktorej výsledkom bolo 100 mg 4,4-dimetyl-5a,14p-ergosta-8,22-dién-3P,15p-diolu.

¹H-NMR (deuterochloroform): δ = 0,78 - 1,2 (8x CH₃) ; 3,24 (dd,

J = 12 Hz, 4 Hz, 1H, H-3a) ; 3,7 (široký dd, J = 4 Hz, 4 Hz, 1H, H-15a); 5,24 (m, 2H, H-22/23)

Príklad 2

4,4-dimetyl-5a,14p-ergosta-8,22-dién-3p,15a-diol

a) 3p-benzoyloxy-4,4-dimetyl-5a,14p-ergosta-8,22-dien-15a-ol

Roztok 1 g 3p-benzoyloxy-4,4-dimetyl-5a,14p-ergosta-8,22-dien-15-ónu v 75 ml tetrahydrofuránu a 25 ml metanolu sa podrobilo pôsobeniu 750 mg nátriumborohydridu. Po miešaní pri teplote miestnosti počas 30 minút sa pridal 1 ml nasýteného vodného roztoku chloridu amónneho a zmes sa miešala počas 15 minút pri teplote miestnosti. Výsledkom filtrácie, eliminácie ·· ···· • · · • · • · · • · ·· · · · · · · ·· · .......

rozpúšťadla vo vákuu a purifikácie pomocou chromatografie bolo 60 mg 3p-benzoyloxy-4,4-dimetyl-5a,14β-ergosta-8,22-dien-15a-olu okrem 770 g zodpovedajúceho 150~alkoholu.

^XH-NMR (deuterochloroform): δ = 0,8 - 1,12 (8x CH₃); 4,07 (široký t, J = 4 Hz, 1H, H—15(3) ; 4,76 (dd, J = 12 Hz, 4 Hz, 1H, H-3ot) ; 5,23 (m, 2H, H-22/23); 7,44 (t, 2H); 7,57 (t, 1H); 8,05 (d, 2H)

b) 4,4-dimetyl-5a,14P-ergosta-8,22-άίέη-3β,15a-diol

Roztok 40 mg 3β-benzoyloxy-4,4-dimetyl-5a,148-ergosta-8,22-dien-15a-olu v 10 ml dietyléteru sa podrobil pôsobeniu 10 mg lítiumalumíniumhydridu počas 30 minút pri teplote miestnosti, ako je opísané v príklade ld. Po stĺpcovej chromatografii sa izolovalo 25 mg 4,4-dimetyl-5a,148-ergosta-8,22-άίέη-3β,15α-diolu v podobe bielej pevnej látky s teplotou topenia 148 ’C.

^XH-NMR (deuterochloroform): δ = 0,78 - 1,7 (8x CH₃) ; 3,25 (dd, J = 11 Hz, 5 Hz, 1H, H-3a); 4,04 (t, J = 4 Hz, 1H, H-15a) ; 5,22 (m, 2H, H-22/23);

Príklad 3

4,4-dimetyl-5a,140-cholesta-8,15-dien-30-ol

a) 4,4-dimetyl-5a-cholesta-8,14-dien-3β-yl-benzoát

Roztok 1,0 g 4,4-dimetyl-5a-cholesta-8,14^ίθη-3β-ο1ϋ v 5 ml pyridínu sa podrobil pôsobeniu 1,5 ml benzoylchloridu. Po miešaní pri teplote miestnosti počas 3 hodín sa roztok nalial do vody a vodná vrstva sa extrahovala pomocou etylacetátu. Organické vrstvy sa zmiešali a premyli 0,lM vodnou kyselinou chlorovodíkovou, nasýteným roztokom nátriumbikarbonátu a roztokom chloridu sodného. Organická vrstva sa sušila pomocou síranu sodného, filtrovala sa a koncentrovala pri zníženom tlaku za vzniku oleja, ktorý sa purifikoval pomocou stĺpcovej chromatografie,

·· ···· • · • · • · • · ·· • ·· ·· · · • · • · · • · ··· ···· ·· ktorej výsledkom bolo 900 mg 4,4-dimetyl-5a-cholesta-8,14-dien-3p-yl-benzoátu v podobe bielej pevnej látky s teplotou topenia 158 ’C.

¹H-NMR (deuterochloroform): δ = 0,83 (s, 3H, H-18); 0,87 + 0,88 (2x s, 3H, H-26/27); 0,95 (d, J = 6 Hz, 3H, H-21); 4,76 (dd, J = 11 Hz, 5 Hz, 1H, H-3a) ; 5,38 (široký s, 21, H-15); 7,45 (t, 2H); 7,57 (t, 1H); 8,06 (d, 2H)

b) 4,4-dimetyl-14,15a-epoxy-5a-cholest-8-en-33-yl-benzoát

K dobre miešanej suspenzii 4,4-dimetyl-5a-cholesta-8,14-dien-3p-yl-benzoátu v 120 ml dichlórmetánu sa pridalo 130 ml 0,09-0,llM roztoku dimetyldioxiránu v acetóne pri 0 °C. Po miešaní počas 30 minút pri 0 °C sa reakčná zmes koncentrovala vo vákuu až do sucha. Výsledný surový epoxid sa použil, bez toho, aby sa purifikoval.

c) 3p-benzoyloxy-4,4-dimetyl-5a,14p-cholest-8-en-15-ón

Roztok 1 g 4,4-dimetyl-14,15α-epoxy-5α-cholest-8-en-3β-yl— benzoátu v 15 ml dioxánu sa podrobil pôsobeniu 0,1 ml komplexu bórtrifluorid-dietyléter. Roztok sa miešal počas 20 minút pri teplote miestnosti a potom sa nalial do nasýteného roztoku nátriumbikarbonátu. Vodná vrstva sa extrahovala pomocou etylacetátu, premyla sa vodou a roztokom chloridu sodného, sušila sa pomocou síranu sodného a koncentrovala sa pri zníženom tlaku. Výsledkom stĺpcovej chromatografie bolo 440 mg 33-benzoyloxy-4,4-dimetyl-5a, 14β-ο1το1β3ί-8-βη-15-όηυ v podobe bielej pevnej látky s teplotou topenia 153 ’C.

¹H-NMR (deuterochloroform): δ = 0,83 - 1,1 (7x CH3); 2,31 široký s, 1H, Η-14β) ; 4,76 (dd, J = 11 Hz, 5 Hz, 1H, H-3a) ; 7,44 (t, 2H); 7,57 (t, 1H); 8,05 (d, 2H)

d) 3β^θηζογ1οχγ-4,4-dimetyl-5a, Κβ-οΐιοίοεύ-θ-εη-ΐδβ-οΐ ·· ···· • · • · · • · · • · · ·· · • ·· ·· ·· · · · · · • · · · • · · · · • · · · ··· ···· ·· ·

Roztok 440 mg, 0,83 mmol 3p-benzoyloxy-4,4-dimetyl-5a,14β-cholest-8-en-15-ónu v 15 ml suchého tetrahydrofuránu a 1 ml metanolu sa pri teplote miestnosti podrobil pôsobeniu 125 mg nátriumborohydridu. Po 2 hodinách sa roztok nalial do O,1M kyseliny chlorovodíkovej a extrahoval sa pomocou etylacetátu. Organická vrstva sa premyla vodou a roztokom chloridu sodného, sušila sa pomocou síranu sodného, filtrovala sa a koncentrovala sa pri zníženom tlaku, čoho výsledkom bola biela pena, ktorá sa použila bez toho, aby sa purifkovala.

e) 4,4-dimetyl-5a,143-cholesta-8,15-dien-3p-yl-benzoát

Roztok 500 mg 3p-benzoyloxy-4,4-dimetyl-5a, 14p-cholest-8-en-153~olu v 10 ml dichlórmetánu sa vychladil na 0 °C a potom sa pridalo naraz 1,1 g Martinovho sulfuránu. Reakčná zmes sa miešala počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Rozpúšťadlá sa odstránili vo vákuu. Zvyšok sa purifikoval pomocou chromatografie, ktorej výsledkom bolo 315 mg 4,4-dimetyl-5a,14β-cholesta-8,15-dien-3p-yl-benzoátu v podobe voskovej pevnej látky, ktorá sa použila priamo.

f) 4,4-dimetyl-5a,143-cholesta-8,15-dien-3p-ol

Roztok 315 mg 4,4-dimetyl-5a,14p-cholesta-8,15-dien-3p-ylbenzoátu v suchom dietyléteri sa podrobil pôsobeniu 35 mg lítiumalumíniumhydridu ako sa opísalo v príklade ld. Výsledkom stĺpcovej chromatografie surového produktu a následnej rekryštalizácie bolo 135 mg 4,4-dimetyl-5a,14p-cholesta-8,15-dien-3p-olu v podobe bielych ihličiek s teplotou topenia 138 °C.

¹H-NMR (deuterochloroform): δ = 0,81 (s, 3H, H-18); 0,83 - 1,02 (6x CH₃); 2,49 (široký s, IH, Η-14β) ; 3,24 (m, IH, H-3a); 5,64 + 5,79 (2x m, IH, H-15/16)

Príklad 4 ··

·· ··· • · • · · • · · ·· · ··

4, 4-dimetyl-24-nor-5a,14p-cholesta-8,15-άίθη-3β-ο1

a) (20S)-3p-benzoyloxy-20-hydroxymetyl-4,4-dimetyl-5a,14β-ρΓθςη-8-en-15-ón a (20S)-^-benzoyloxy-20-hydroxymetyl-4,4-dimetyl-5a,14β-ρΓθςη-8-θη-15β-όη

Roztok 2,18 g 3β-benzoyloxy-4,4-dimetyl-5a,14β-ergosta-8,22-dien-15-ón (viď. príklad lc) v 88 ml dichlórmetánu, 30 ml metanolu a 1 ml pyridínu sa vychladilo na -70 °C. Roztokom sa prepúšťala zmes ozón/kyslík v pomere 1:4 počas 12 minút pri kontrole pomocou chromatografie na tenkej vrstve.

Potom sa pridalo 130 mg nátriumborohydridu a miešaná reakčná zmes sa zohriala na 0 °C počas 2 hodín a potom sa naliala do nasýteného vodného roztoku chloridu amónneho. Roztok sa extrahoval pomocou etylacetátu a zmiešané extrakty sa ďalej premyli vodou a roztokom chloridu sodného a potom sa sušili pomocou síranu sodného. Roztok sa filtroval a odparoval vo vákuu. Surový produkt sa purifikoval pomocou chromatografie, ktorej výsledkom bolo 1,28 g (20S)-3β-benzoyloxy-20-hydroxymetyl-4,4-dimetyl-5a,14β-pregn-8-en-15-ónu s teplotou topenia 238,8 ’C a 330 mg zodpovedajúcej 15β-hydroxy-zlúčeniny.

Ή-NMR (deuterochloroform): δ = 0,9 - 1,1 (4x CH3) ; 1,16 (d, J = 6 Hz, 3H, H-21), 2,33 (široký s, 1H, Η-14β); 3,42 (m, 1H, H-22a); 3,63 (m, 1H, H-22b) ; 4,75 (dd, J = 11 Hz, 4 Hz, 1H, H-3a); 7,45 (t, 2H); 7,57 (t, 1H); 8,05 (d, 2H)

b) (20S)-3p-benzoyloxy-4,4,20-trimetyl-21-toluolsulfonyloxy-5a,14β-pregn-8-en-15-ón

Roztok 385 mg (20S)-3β-benzoyloxy-20-hydroxymetyl-4,4-dimetyl-5a,148-pregn-8-en-15-ónu v 5 ml pyridínu sa vychladil na 0 °C. Po pridaní 190 mg p-toluénsulfonylchloridu, sa reakčná zmes miešala počas 20 hodín pri 6 °C a potom sa naliala do roztoku chloridu sodného a miešala sa počas 20 minút. Odobral sa ·· ···· ·· • · • · · · · · · ··· · · ···· _ . ··· · · · · 24 ·· · ··· ···· ·· precipitát, premyl sa v ladom vychladenej vode a sušil sa pri °C vo vákuu. Výsledný surový produkt sa použil bez toho, aby sa ďalej purifikoval.

c) 3p-benzoyloxy-4,4-dimetyl-24-nor-5a,14p-cholest-8-en-15-ón

K miešanej suspenzii 1,6 g magnéziového prášku v 25 ml bezvodého tetrahydrofuránu sa pomaly pridávalo 3,42 g 2-metyl-propylbromidu počas 30 minút pri 50 °C. Výsledkom bol číry roztok Grignardových činidiel. Potom sa zmes vychladila na -10 °C a po kvapkách sa pridalo 3,32 ml roztoku LÍ2CUCI4, pripraveného zmiešaním 99 mg chloridu meďnatého, 86 mg chloridu lítneho a 10 ml tetrahydrofuránu.

Reakčná zmes sa miešala počas 1 hodiny pri -30 °C, a potom sa pridal pri 0 °C roztok 0,5 g (20S)-3£-benzoyloxy-4,4,20-trimetyl-21-toluolsulfonyloxy-5a,14β-8-βη-15-όηυ v 10 ml tetrahydrofuránu. Po 2 hodinách pri 0 °C sa zmes miešala pri teplote miestnosti po celú noc. Potom sa pridal etylacetát a nasýtený roztok chloridu amónneho a roztok sa miešal počas 15 minút. Organické extrakty sa premyli IM kyselinou chlorovodíkovou, vodou a roztokom chloridu sodného, sušili sa pomocou síranu sodného a odparovali sa do sucha. Surový produkt sa purifikoval pomocou stĺpcovej chromatografie, ktorej výsledkom bolo 250 mg 3p-benzoyloxy-4,4-dimetyl-24-nor-5a,14p-cholest-8-en-15-ónu v podobe bielej peny.

¹H-NMR (deuterochloroform): δ = 0,82 - 1,09 (“x CH;); 2,31 (široký s, ΙΗ, Η-14β) ; 4,75 (dd, J = 11 Hz, 4 Hz, 1H, H-3ot) ;

7,44 (t, 2H); 7,57 (t, 1H); 8,05 (d, 2H)

d) 3β-benzoyloxy-4,4-dimetyl-24-nor-5a,14β-οΗο1θ3ί-8-βη-15β-ο1

130 mg 3β-benzoyloxy-4,4-dimetyl-24-nor-5a,14β-οΗο1θ3ϋ-8-θη-15-ónu sa podrobilo pôsobeniu 100 mg nátriumborohydridu, ako sa opísalo v príklade 2a. Po spracovaní vodou sa získalo 130 mg ·· ···· • · • · • · · • · · ·· · • · ··

3p-benzoyloxy-4,4-dimetyl-24-nor-5a,146-cholest-8-en-156-olu v podobe bielej peny, ktorá sa použila priamo.

e) 4,4-dimetyl-24-nor-5a,14p-cholesta-8,15-dien-3p-yl-benzoát

400 mg Martinovho sulfuránu sa pridalo naraz k roztoku 100 mg 3β-benzoyloxy-4,4-dimetyl-24-nor-5α, 14β-ο1ιο1β5ί-8-βη-15β-olu v 10 ml dichlórmetánu. Zmes sa miešala počas 18 hodín pri teplote miestnosti. Výsledkom odparovania pri zníženom tlaku a chromatografie bolo 100 mg 4,4-dimetyl-24-nor-5a, 14β-σϊιο1β3ί3-8,15-dien-36-yl-benzoátu v podobe oleja, ktorý sa použil bez toho, aby sa purifikoval.

f) 4,4-dimetyl-24-nor-5a, Κβ-οΐιοίββίθ-δ, 15^ίβη-3β-ο1

100 mg 4,4-dimetyl-24-nor-5a, 14β-οΗο1θ3ί3-8,15^ίθη-3β^1— benzoátu sa podrobilo pôsobeniu 20 mg lítiumalumíniumhydridu ako sa opísalo v príklade ld. Výsledkom stĺpcovej chromatografie surového produktu a rekryštalizácie pomocou zmesi hexán/etylacetát bolo 36 mg 4,4-dimetyl-24-nor-5a, 14β-σΗο1ε3ί3-8,15-dien-36~ olu s teplotou topenia 104,3 °C.

¹H-NMR (deuterochloroform): δ = 0,82 (s, 3H, H-18); 0,83 - 1,03 (6x CH3); 2,49 (široký s, 1H, Η-14β); 3,24 (m, 1H, H-3a);

5,65 + 5,8 (m, 1H, H-15/16)

Príklad 5

4,4-dimetyl-24-nor-5a,14β-οΗο1β5ί-8-βη-3β-ο1

a) ^-metánsulfonyloxy-4,4-dimetyl-24-nor-5a, 14β-οΐΊο1β3^8-βη-3β-yl-benzoát mg 3β-benzoyloxy-4,4-dimetyl-24-nor-5a, ^β-οΐΊοΙθεί-δ-εη-3β-ο1 v 3 ml pyridínu sa podrobilo pôsobeniu 0,2 ml metánsulfonylchloridu pri 0 °C. Po miešaní počas 2 hodín pri teplote • · ···· • · · · • · · • · · ·

9 9 ·· · · ·· ·· • · · · · 9 · 9 9

9 9

9999 99 miestnosti sa reakčná zmes rozriedila vodou a extrahovala sa pomocou etylacetátu. Extrakty sa zmiešali a premyli IM kyselinou chlorovodíkovou, vodou a roztokom chloridu sodného, sušili sa pomocou síranu sodného a filtrovali sa. Výsledkom odstránenia rozpúšťadiel bolo 40 mg 15p-metánsulfonyloxy-4,4-dimetyl-24-nor-5a,14p-cholest-8-en-3p-yl-benzoátu, ktorý sa použil priamo.

b) 4,4-dimetyl-24-nor-5a,14p-cholest-8-en-3p-ol mg 15p-metánsulfonyloxy-4, 4-dimetyl-24-nor-5a,14p-cholest-8-en-3p-yl-benzoátu sa podrobilo pôsobeniu 10 mg lítiumalumíniumhydridu, ako sa opísalo v príklade ld. Surový produkt sa purifikoval pomocou chromatografie, ktorej výsledkom bolo 32 mg 4,4-dimetyl-24-nor-5a, 14p-cholest-8-en-3p-olu.

¹H-NMR (deuterochloroform): δ = 0,81 (s, 3H, H-18) ; 0,82 - 1,03 (6x CH₃); 3,25 (dd, J = 11 Hz, 4 Hz, 1H, H-3a)

Príklad 6

4.4- dimetyl-24-nor-5a,14p-cholest-8-én-3P,15p-diol mg 3p-benzoyloxy-4, 4-dimetyl-24-nor-5a,14p-cholest-8-en-15β-ο1υ sa podrobilo pôsobeniu 10 mg litiumalumíniumhydridu, ako sa opísalo v príklade ld. Surový produkt sa purifikoval pomocou stĺpcovej chromatografie, ktorej výsledkom bolo 23 mg

4.4- dimetyl-24-nor-5a,14p-cholest-8-én-3p,15p-diolu v podobe bielej peny.

^-NMR (deuterochloroform): δ = 0,82 (s, 3H, H-18); 0,84 - 1,04 (6x CH₃) ; 3,25 (široký d, J = 12 Hz, 1H, H-3a) ; 3,7 (široký q,

J = 7 Hz, 1H, H-15a)

Príklady 7+8 (2OR)-4,4,20-trimetyl-16P, 21-cyklo-5a,14p-pregn-8-én-3P,15p-diol ·· ···« · · • · · « · · · • · · ·· · ··· ·· ·· • · · · · • · · • · · · • · · ··· ·· · a (2OR}-4,4,20-trimetyl-16p,21-cyklo-5a,14β-ρΓθςη-8-έη-3β,15a-diol

a) (207?) -3p-benzoyloxy-4,4,20-trimetyl-16P, 21-cyklo-5a, 14 β-pregn-8-en-15-ón

1,10 g (20S)-3p-benzoyloxy-4,4,20-trimetyl-21-toluolsulfonyloxy-5a,14β-pregn-8-en-15-ónu sa podrobilo pôsobeniu 52 mmol fenylmagnéziumbromidu, analogicky k príkladu 4c. Po chromatografii sa izolovalo 560 mg (2 0/?)-3β-benzoyloxy-4, 4,20-trimetyl-16β,21-cyklo-5a,143-pregn-8-en-15-ónu vedľa iných produktov, ktoré boli výsledkom substitúcie tosylátu pomocou fenylového Grignardovho činidla.

b) (20/?)—4,4,20-ύΓίΓηθίγ1-16β, 21-cyklo-5a, 14β-pregn-8-én-3β, 15β-diol a (20R)-4,4,20-trimetyl-16β,21-cyklo-5a,14β-pregn-8-én-3β,15a-diol

460 mg (20R)-3β^εηζον1οχν~4,4,20-trimetyl-163,21-cyklo-5a,14β-pregn-8-en-15-ónu sa podrobilo pôsobeniu 50 mg lítiumalumíniumhydridu, ako sa opísalo v príklade ld. Surový produkt sa purifikoval pomocou stĺpcovej chromatografie, ktorej výsledkom bolo 40 mg (20R)-4,4,20-trimetyl-16β,21-cyklc-5a, 14β-pregn-8-έη-3β, 15β-άίο1ιι a 30 mg (20R)-4,4,20-ίΓίιηβίν1-16β, 21-cyklo-5a,14β-pregn-8-én-3β,15a-diolu v podobe bielej pevnej látky.

(20/?)—4,4,20-ίΓΪιηθίν1-16β, 21-cyklo-5a, 14β-pregn-8-én-3β, 15β-diol:

^-NMR (deuterochloroform): δ = 0,73 (s, 3H, H-18); 0,82 (s, 3H, H-19); 1,02 (s, 6H, 4-CH₃) ; 1,09 (d, J = 8 Hz, 3H, H-21); 2,72 (m, IH, H-16a); 3,25 (m, IH, H-3a) ; 4,07 (q, J = 8 Hz, IH, H-15a;

(2OR) -4,4,20-ίΓίπ^γ1-Ι6β, 21-cyklo-5a, 14β-pregn-8-én-3β, 15a-diol:

^XH-NMR (deuterochloroform): δ = 0,79 (s, 3H, H-18); 0,85 (s, 3H,

H-19); 1,0 - 1,08 (3* CH₃) ; 2,34 (d, J = 6 Hz, 1H, Η-14β); 2,68 (m, 1H, H-16a); 3,25 (m, 1H, H-3a) ; 4,07 (d, J = 6 Hz, 1H,

Η-15β)

·· • •	···· • · • ·	• ·· ·· · · • ·	·· • · • ·	··
•	• ·	• ·	• ·
··	•	··· ····	··	··

Príklad 9

4,4-dimetyl-5a, 14β-ο1ιο1β3ί3-8,24^ίέη-3β, 15β-^ίο1

a) (20S)-3β-benzoyloxy-4,4-dimetyl-15-oxo-5a, 148-pregn-8-én-20-karbaldehyd

Roztok 2,2 g 3β^θηζογ1οχγ-4,4-dimetyl-5a, 143-ergosta-8,22-dien-15-ónu v 87 ml dichlórmetánu a 53 ml metanolu sa vychladil na -78 °C. Roztokom sa počas 16 minút prepúšťala zmes ozón/kyslík v pomere 1:4. Pridalo sa 2,62 g trifenylfosfínu a roztok sa priviedol k teplote miestnosti. Rozpúšťadlá sa odstránili vo vákuu a zvyšok sa purifikoval pomocou chromatografie, ktorej výsledkom bolo 1,26 g (20S)-3p-benzoyloxy-4,4-dimetyl-15-oxo-5a,14β-pregn-8-én-20-karbaldehydu s teplotou topenia 205 °C.

^-NMR (d5-pyridín): 5 = 0,90 (s, 3H, H-19); 0,98 (s, 3H, H-18); 1,04 (s, 6H, 4-CH₃); 1,2 (d, J = 6 Hz, 3H, H-21); 2,41 (široký s, 1H, Η-14β); 4,83 (dd, J = 11 Hz, 4 Hz, 1H, H-3a) ; 7,5 (t, 1H) ; 7,58 (t, 1H); 8,27 (d, 2H); 9,82 (d, J = 2 Hz, 1H, H-22)

b) 3β^βηζογ1οχγ-22-Γ^Γθχγ-4, 4-dimetyl-5a, 148-cholest-8-én-15,24-dión

25,8 ml roztoku π-butyllítia (1,6M, hexán) sa pridalo k 6 ml diizopropylamínu v 48 ml tetrahydrofuránu pri -78 ’C. Zmes sa miešala počas 20 minút. Pridal sa roztok 4,5 ml 3-metyl-2-butanónu v 10 ml tetrahydrofuránu a zmes sa miešala pri -78 °C počas 15 minút. Výsledný kinetický enolát sa previedol pomocou kanyly pod dusíkom do vychladeného (na -⁷8 °C) roztoku 6,0 g (20S)-3β• · ·· ···· • · · • · · ·· • · · ·· · ···

-benzoyloxy-4,4-dimetyl-15-oxo-5a,14p-pregn-8-én-20-karbaldehydu v 40 ml tetrahydrofuránu. Počas jednej hodiny sa zmes priviedla na 0 °C a potom sa naliala do nasýteného vodného roztoku chloridu amónneho. Zmes sa extrahovala pomocou etylacetátu, a zmiešané organické extrakty sa ďalej premyli vodou a roztokom chloridu sodného a potom sa sušili pomocou síranu sodného. Výsledkom odstránenia rozpúšťadiel vo vákuu bol zvyšok, ktorý sa rozdelil pomocou stĺpcovej chromatografie, čím sa získalo 6,26 g 3p-benzoyloxy-22-hydroxy-4,4-dimetyl-5a, 14p-cholest-8-én-15,24-diónu v podobe oleja.

¹H-NMR (deuterochloroform): δ = 0,92 - 1,2 (7x CH₃) ; 2,33 (široký s, 1H, Η-14β); 4,1 (m, 1H, H-22); 4,74 (dd, J = 11 Hz, 4 Hz, 1H, H-3a); 7,45 (t, 2H); 7,57 (t, 2H); 8,05 (d, 2H)

c) 3p-benzoyloxy-4,4-dimetyl-5a,14p-cholesta-8,22-dién-15,24-dión

Roztok 4,78 g 3p-benzoyloxy-22-hydroxy-4,4-dimetyl-5a,14β-cholest-8-én-15,24-diónu v 60 ml dichlórmetánu sa vychladil na 0 °C a potom sa pridalo naraz 9,31 g Martinovho sulfuránu. Reakčná zmes sa miešala počas 30 minút pri 0 °C. Potom sa odstránili rozpúšťadlá vo vákuu. Výsledkom purifikácie zvyšku pomocou stĺpcovej chromatografie bolo 4,18 g 3p-benzoyloxy-4,4-dimetyl-5a,14p-cholesta-8,22-dién-15,24-diónu s teplotou topenia 163 °C.

¹H-NMR (deuterochloroform): δ = 0,9 - 1,2 (7x CH₃) ; 2,31 ;široký s, 1H, Η-14β); 4,75 (dd, J = 11 Hz, 4 Hz, 1H, H-3a); 6,14 (d, J = 16 Hz, 1H, H-23); 6,71 (m, 1H, H-22); 7,45 (t, 2H); 7,57 (t, 1H); 8,05 (d, 2H)

d) 3p-benzoyloxy-4,4-dimetyl-5a,14p-cholest-8-én-15,24-dión

500 mg paládia na aktívnom uhlí (10 %) sa pridalo k roztoku 4,2 g 3p-benzoyloxy-4,4-dimetyl-5a,14p-cholesta-8,22-dién-15,2430

··	····	• ··	··
•	• ·	·· · ·	• ·	• ·
•	• ·	• ·	•	•
•	• ·	• ·	•	•
··	•	··· ····	• ·	··

-diónu v 60 ml etylacetátu. Zmes sa počas 3 hodín miešala pod vodíkovou atmosférou. Potom sa zmes filtrovala. Výsledkom odstránenia rozpúšťadla vo vákuu bolo 4,22 g 3p-benzoyloxy-4,4-dimetyl-5a,148-cholest-8-én-15,24-diónu v podobe bieleho kryštalického zvyšku s teplotou topenia 129 ’C.

^-NMR (deuterochloroform): δ = 0,92 - 1,16 (7x CH₃) ; 2,33 (široký s, 1H, Η-14β); 4,74 (dd, J = 11 Hz, 4 Hz, 1H, H-3a) ;

7,45 (t, 2H); 7,57 (t, 1H); 8,05 (d, 2H)

e) 3β-benzoyloxy-4,4-dimetyl-5a,14β-cholest-8-én-15,24-diol a 3β-benzoyloxy-24-hydroxy-4,4-dimetyl-5a, 14β-ο1ιο1θ3ί-8-θη-15-όη

Roztok 4,2 g 38-benzoyloxy-4,4-dimetyl-5a, 14β-ο]ιο1β3ί-8-έη-15,24-diónu v 45 ml CH;Cl_ľ sa podrobil pôsobeniu 1,8 g komplexu terc-butylamín-borán. Roztok sa zohrieval do varu pod spätným chladičom počas jednej hodiny. Po ochladení na 0 °C sa pridalo 30 ml IM vodného roztoku kyseliny chlorovodíkovej. Zmes sa miešala počas jednej hodiny pri 0 °C roztokom kyseliny chlorovodíkovej, roztokom hydrogenuhličitanu sodného a roztokom chloridu sodného. Po sušení pomocou síranu sodného sa odstránili rozpúšťadlá vo vákuu. Výsledkom stĺpcovej chromatografie bolo 1,71 g 3β-όεηzoyloxy-4,4-dimetyl-5a,140-cholest-8-én-15,24-di-olu a 1,82 g 38-benzoyloxy-24-hydroxy-4,4-dimetyl-5a,14 8-cholest-8-en-15-ónu v podobe bielej peny.

Potom sa premyla IM vodným vodou, nasýteným vodným

3β-benzoyloxy-4,4-dimetyl-5a, 143~cholest-8-én-15,24-diol:

¹H-NMR (deuterochloroform): δ = 0,88 - 1,1 (7x CH₃) ; 3,33 (m, 1H, H-24); 3,74 (m, 1H, H-15); 4,75 (dd, J = 11 Hz, 4 Hz, 1H, H-3a);

7,45 (t, 2H); 57 (t, 1H); 8,05 (d, 2H)

3β-benzoyloxy-24-hydroxy-4,4-dimetyl-5a,14 8-cholest-8-en-15-ón:

^-NMR (deuterochloroform): δ = 0,88 -	1,1	(7x	CH₃); 2,	32	(širo-
ký s, 1H, Η-14β); 3,33 (m, 1H, H-24);	4,74	(dd,	J = 11	Hz,	4 Hz,
1H, H-3ct) ; 7,45 (t, 2H) ; 7,57 (t, 1H) ;	8,05	(d,	2H)

·· ···· • · e • · · • · · · • · · ·· · • ·· ·· ·· · · · · · • · · · • · · · · • · · · ··· ···· ·· ·

f) 3p-benzoyloxy-4 , 4-dimetyl-5or, 14p-cholesta-8,24-dien-15p-ol a

4.4- dimetyl-5a,14p-cholesta-8,15,24-trien-3p-yl-benzoát

1,0 g 3p-benzoyloxy-4, 4-dimetyl-5oí, 14p-cholest-8-én-15,24-diolu sa podrobil pôsobeniu 3,88 g Martinovho sulfuránu, ako sa opísalo v príklade 3e. Výsledkom purifikácie pomocou stĺpcovej chromatografie bolo 305 mg 3p-benzoyloxy-4,4-dimetyl-5a,14p-cholesta-8,24-dien-15p-olu v podobe bielej peny a 870 mg 4,4-dimetyl-5a,14p-cholesta-8,15,24-trien-3p-yl-benzoátu v podobe bielej pevnej látky.

3p-benzoyloxy-4,4-dimetyl-5a,14p-cholesta-8,24-dien-15p-ol:

^XH-NMR (d5-pyridín): δ = 1,15 (s, 1H, H-18); 2,84 (m, 1H, H-7a); 4,1 (m, 1H, H-15); 4,53 (dd, J = 11 Hz, 4 Hz, 1H, H-3a) ; 5,24 (t, J = 8 Hz, 1H, H-24); 7,45 (t, 2H) ; 7,57 (t, 1H) ; 8,05 (d, 2H)

4.4- dimetyl-5a,14p-cholesta-8,15,24-trien-3p-yl-benzoát:

¹H-NMR (deuterochloroform): δ = 1,4 (s, 3H, H-19); 2,19 (m, 1H, H-17a); 2,51 (široký s, 1H, Η-14β) ; 4,75 (dd, J = 11 Hz, 4 Hz, 1H, H-3a); 5,1 (t, J = 8 Hz, 1H, H-24); 5,65 (m, 1H, H-16); 5,79 (m, 1H, H-15); 7,45 (t, 2H); 7,57 (t, 1H) ; 8,05 (d, 2H)

g) 4,4-dimetyl-5a, 14p-cr.olesta-8,24-dién-3p, 15p-diol

120 mg 3p-benzoyloxy-4,4-dimetyl-5a,14p-cholesta-8,24-dien-15p-olu sa podrobilo pôsobeniu 30 mg lítiumalumíniumhydridu, ako sa opísalo v príklade Id. Surový produkt sa purifikoval pomocou veľmi rýchlej srĺpcovej chromatografie, ktorej výsledkom bolo 80 mg 4,4-dimetyl-5G, 14p-cholesta-8,24-dién-3P,15p-diolu v podobe bielej peny.

H-NMR (deuterochloroform): δ = 0,8-1,03 (5x CH3) ; 1,6 + 1,68 (2x s, 3H, H-26/27); 3,24 (m, 1H, H-3a) ; 3,70 (m, 1H, H-15a) ; 5,10 (t, J = 7 Hz, 1H, H-24) ·· ····

·· ·

Príklad 10

4,4-dimetyl-5a,14p-cholesta-8,15,24-trien-33-ol mg 4,4-dimetyl-5a,143-cholesta-8,15,24-trien-3p-yl-benzoátu, viď. príklad 9f, sa podrobilo pôsobeniu 20 mg lítiumalumíniumhydridu, ako sa opísalo v príklade ld. Surový produkt sa purifikoval pomocou stĺpcovej chromatografie, ktorej výsledkom bolo 20 mg 4,4-dimetyl-5a,14p-cholesta-8,15,24-trien-3β-ο1υ v podobe bielej pevnej látky s teplotou topenia 105 °C.

¹H-NMR (deuterochloroform): δ = 0,81 (s, 3H, H—18) ; 0,94 - 1,02 (4x CH₃); 2,5 (široký s, 1H, Η-14β); 3,23 (m, 1H, H-3a); 5,11 (t, J = 9 Hz, 1H, H-24); 5,64 (m, 1H, H-15/16a); 5,79 (m, 1H, H-15/16b)

Príklad 11 (20S)-20-hydroxymetyl-4, 4-dimetyl-5a, 14β-pregn-8-én-3β,Ιόβ-diol mg (20S)-20-hydroxymetyl-4,4-dimetyl-5a,14β-pregn-8-én-3β,15β^ίο1υ sa podrobilo pôsobeniu 20 mg lítiumalumíniumhydridu, ako sa opísalo v príklade ld. Surový produkt sa purifikoval pomocou stĺpcovej chromatografie, ktorej výsledkom bolo 42 mg (20S)-20-hydroxymetyl-4,4-dimetyl-5a, 14β-pregn-8-én-3β,153~diolu s teplotou topenia 214 °C.

¹H-NMR (deuterochloroform): δ = 0,82 (s, 3H, H-18); 0,93 - 1,04 (3x CH₃); 1,07 (d, J = 6 Hz, 3H, H-21) ; 3,23 (m, 1H, H-3a) ; 3,49 (m, 1H, H-22a); 3,68 (m, 1H, H-22b); 3,72 (m, 1H, H-15a)

Príklad 12

Testovanie látok aktivujúcich meiózu v oocytovom teste

Zvieratá

Oocyty sa získali od nedospelých myších samičiek (Fl-hybridy

·· • ···· • · ·· ·

C57BI/6J x DBA/2J, Bomholtgaard, Dánsko) , s telesnou hmotnosťou 13 až 16 gramov, ktoré sa udržiavali pri kontrolovanej teplote a svetle. Myšiam sa aplikovala intraperitoneálna injekcia 0,2 ml gonadotropinov (Gonal F, Serono, Solna, Švédsko, obsahujúca 20 medz. j. FSH, alternatívne Puregon, Organon, Swords, Írsko, obsahujúca 20 medz. j. FSH) a o 48 hodín neskôr sa zvieratá usmrtili cervikálnou dislokáciou.

Odber a kultivácia oocytov

Po odobratí vaječníkov sa oocyty izolovali v Hx-médiu (viď. ďalej) pod stereomikroskopom pomocou manuálnej ruptúry foiikulov použitím páru ihiel veľkosti 27. Sférické, nahé oocyty (NO), ktoré majú neporušený zárodkový mechúrik (GV) sa umiestnili do alfa-minimálneho esenciálneho média (a-MEM bez ribonukleozidov, Gibco BRL, kat. č. 22561) obohateného 3 mmol hypoxantínu (Sigma, kat. č. H-9377), 8 mg/ml albumínu ľudského séra (HSA, State Sérum Inštitúte, Dánsko), 0,23 mmol pyrubátu (Sigma, kat. č. S-8636), 2 mmol glutamínu (Flow, kat. č. 16-801), 10C medz. j./ml penicilínu a 100 pg/ml streptomycínu (Flow, kat. č. 16-700). Toto médium sa označilo ako Hx-médium. Oocyty sa trikrát prepláchli v Hx-médiu a kultivovali sa na 4-jarr.kových multiplatniach (Nuncion, Dánsko), pričom každá jamka obsahovala 0,4 ml Hx-média a 35 až 45 oocytov. Súbežne s testovacími kultiváciami, ktoré sa uskutočnili s rôznymi koncentráciami testovaných zlúčenín, sa uskutočnila vždy jedna kontrolná kultivácia, tj. 35 až 45 oocytov sa kultivovalo v Hx-médiu bez pridania testovanej zlúčeniny.

Kultivácie sa uskutočnili pri 37 ’C a 100 % vlhkosti vzduchu obsahujúceho 5 % oxidu uhličitého. Kultivačný čas sa pohyboval v rozmedzí 22 až 24 hodín.

·· ····

Skúmanie oocytov

Na konci kultivačného času sa pomocou stereomikroskopu alebo mikroskopu diferenčnú s obráteným zobrazením interferenčnú reguláciu oocytov so zárodkovým mechúrikom (GV) alebo rozpadom zárodkového mechúrika (GVB) a oocytov s polárnym telieskom (PB). V testovaných kultiváciách sa vypočítal percentuálny podiel oocytov s GVB vztiahnutý na celkový počet oocytov a percentuálny podiel oocytov s PB vztiahnutý na celkový počet oocytov a tieto podiely sa porovnali s kontrolnou ,<ultiváciou.

vybaveným zariadením na kontrastu zistil počet

Príklad 13

Testovanie látok inhibujúcich meiózu v oocytovom teste

Oocyty so zárodkovým mechúrikom (GV) sa získali od nedospelých myších samičiek ošetrených FSH použitím rovnakých postupov, ktoré sa opísali v príklade 12 (viď. pred týmto) . Nahé oocyty (NO) sa trikrát prepláchli v Hx-médiu. U 4,4-dimetyicholest-B,14,24-trien-3£-olu (FF-MAS) sa už skôr preukázalo, že indikuje meiózu u nahých oocytov in vitro {Byskov, A.G. a ko. , Náture 374, 1995, str. 553 až 562). Nahé oocyty sa kultivovali v Hx-médiu obohatenom 5 pmol FF-MAS v kultivácii súbežne s testovanými zlúčeninami v rôznych koncentráciách v 4-jamkových multiplatniach (Nunclon, ľánsko), pričom každá jamka obsahovala 0,4 ml Hx-média a 35 až 4Ξ oocytov. Súbežne s testovacími kultiváciami, ktoré sa uskutočnili s rôznymi koncentráciami testovaných zlúčenín, uskutočnila sa vždy jedna pozitívna kontrolná kultivácia, tj. 35 až 45 oocytov sa kultivovalo v Hx-médiu obsahujúcom FF-MAS bez pridania testovanej zlúčeniny. Súbežne s pozitívnou kontrolnou kultiváciou sa uskutočnila jedna negatívna kontrolná kultivácia, t j. 35 až 45 oocytov sa kultivovalo v Hx-médiu samotnom.

·· ·· ···· • · · · • · · • · · · • · · ·· · · ·· • · • · ···· ··

Skúmanie oocytov

Na konci kultivačného času sa pomocou stereomikroskopu alebo mikroskopu s obráteným zobrazením vybaveným zariadením na diferenčnú interferenčnú reguláciu kontrastu zistil počet oocytov so zárodkovým mechúrikom (GV) alebo rozpadom zárodkového mechúrika (GVB) a oocytov s polárnym telieskom (PB). V testovaných kultiváciách a v kontrolných kultiváciách, tj. pozitívnych a negatívnych, sa vypočítal percentuálny podiel oocytov s GVB + Pb vztiahnutý na celkový počet oocytov. Relatívna inhibícia testovaných zlúčenín sa vypočítala pomocou nasledujúceho vzorca:

inhibícia testovanej zlúčeniny (%) = 100 % - [{GVB + PB} (testovaná zlúčenina) - (GVB + PB} (negatívna kontrolné kultivácia) x 100 / {GVB + PB} (pozitívna kontrolná kultivácia) - {GVB + PB} (negatívna kontrolná kultivácia) ] %.

Oocyty u ktorých sa pozastavil priebeh meiózy sú charakteristické neporušeným jadrom a nápadným jadierkom, známe ako zárodkový mechúrik (GV). Po opätovnom rozbehnutí meiózy jadierko a jadrový obal miznú a toto je charakterizované rozpadom zárodkového mechúrika, čo sa označuje ako rozpad zárodkového mechúrika (GV3). Niekoľko hodín potom oocyty dokončujú redukčné delenie a vytvárajú prvé tzv. polárne teliesko (PB).

·· • ··

·· ···· • · • · • · • ·

Výsledky

Tabulka 1

Relatívna inhibícia (%) meiózy u nahých myších oocytov

Zlúčeniny	Počet oocytov	Inhibícia (¾)
GV	GVB	PB
Kontrolná kultivácia (Hx)	38	2	0	100
5 pmol FF-MAS	9	27	4	0
5 pmol FF-MAS + 10 pmol 4,4-dimetyl- -5a,14p-cholesta-8,15-dien-3p-olu	28	11	1	66
Kontrolná kultivácia (Hx)	40	0	0	100
5 pmol FF-MAS	8	25	6	0
5 pmol FF-MAS + 10 pmol 4,4-dimetyl- -5a, 14β-ergosta-8,22^ίέη-3β, 15β^ίο1η	37	0	0	100

Hx hypoxantín

GV zárodkový mechúrik

GVB rozpad zárodkového mechúrika PE polárne teliesko

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. 14p-H-steroly všeobecného vzorca I (I) v ktorom

R³ znamená atóm vodíka alebo spoločne so substituentom R³ tvorí ďalšiu väzbu,

R³ znamená atóm vodíka alebo spoločne so substituentom R³ tvorí ďalšiu väzbu,

R⁴ znamená atóm vodíka alebo metylovú skupinu,

R⁴ znamená atóm vodíka alebo metylovú skupinu,

R⁷ znamená atóm vodíka alebo spoločne so substituentom R⁸ tvorí ďalšiu väzbu,

R⁸ znamená atóm vodíka alebo spoločne so substituentom R⁷, alebo spoločne so substituentom R⁹, tvorí ďalšiu väzbu,

R⁹ znamená atóm vodíka alebo spoločne so substituentom R⁸, alebo spoločne so substituentom R¹¹, tvorí ďalšiu väzbu,

R¹⁵ znamená atóm vodíka, hydroxyskupinu, atóm halogénu, alebo spoločne so substituentom R¹⁵ tvorí oxoskupinu, alebo spoločne so substituentom R¹⁶ tvorí ďalšiu väzbu, alebo spoločne so substituentom R²² tvorí kyslíkový mostík,

R¹⁵ znamená atóm vodíka, rozvetvenú alebo nerozvetvenú alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 8 uhlíkových atómov, arylovú skupinu obsahujúcu 6 až 10 uhlíkových atómov, alebo spoločne so substituentom R¹⁵ tvorí oxoskupinu, ·· • · • · •· ····

R¹⁶ znamená atóm vodíka, hydroxyskupinu, atóm halogénu, alebo spoločne so substituentom R¹⁵ tvorí ďalšiu väzbu, alebo spoločne so substituentom R²² tvorí ďalšiu väzbu,

R“ znamená atóm vodíka, prípadne substituovanú, rozvetvenú alebo nerozvetvenú, alkylovú alebo alkenylovú skupinu obsahujúcu 1 až 8 uhlíkových atómov, prípadne substituovanú arylovú skupinu obsahujúcu 6 až 10 uhlíkových atómov, alebo spoločne so substituentom R¹⁶ tvorí ďalšiu väzbu, alebo spoločne so substituentom R²² tvorí rozvetvenú alebo nerozvetvenú alkylidénovú skupinu obsahujúcu 1 až 8 uhlíkových atómov,

R²² znamená atóm vodíka, hydroxyskupinu, alebo spoločne so substituentom R¹⁵ tvorí kyslíkový mostík, alebo spoločne so substituentom R²² tvorí rozvetvenú alebo nerozvetvenú alkylidénovú skupinu obsahujúcu 1 až 8 uhlíkových atómov, alebo ich estery.
2. 14p-H-steroly podľa nároku 1, všeobecného vzorca I, v ktorom R³ a R³ znamenajú atóm vodíka.
3. 14p-H-steroly podľa nároku 1 alebo 2, všeobecného vzorca I, v ktorom R^c a R^{5 * * * 9} znamenajú spoločne ďalšiu väzbu.
4. 14p-H-steroly podľa ktoréhokolvek z nárokov 1 až 3, všeobecného vzorca I, v ktorom R¹⁵ znamená atóm vodíka alebo hydroxyskupinu .
5. 143-H-steroly podľa ktoréhokolvek z nárokov 1 až 4, všeobecného vzorca I, v ktorom R²² znamená prípadne substituovanú, priamu alebo rozvetvenú alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 8 uhlíkových atómov alebo spoločne s R²²' znamenajú priamu alebo rozvetvenú alkylidénovú skupinu obsahujúcu 1 až 8 uhlíkových atómov.

·· • · • · • · • · ·· ····
6. 14p-H-steroly podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, ktorými sú

4, 4-dimetyl-5o(, 14p-cholest-8-en-3p-ol,

4, 4-dimetyl-5a,14p-cholest-8-én-3p,15p-diol,

4.4- dimetyl-5a,14p-cholest-8-én-3P,15a-diol,

4, 4-dimetyl-5a,14p-cholesta-8,15-dien-3p-ol,

4.4- dimetyl-5a,14p-cholesta-7,9(11),15-trien-3p-ol,

4.4- dimetyl-5a,14p-cholesta-8,15,23(E)-trien-3p-ol,

4.4- dimetyl-5a,14p-cholesta-8,15,24-trien-3p-ol,

4.4- dimetyl-5a,14p-cholesta-8,24-dién-3P,15p-diol,

4.4- dimetyl-5a,14p-ergosta-8,22-dien-3p-ol,

4.4- dimetyl-5a,14p-ergosta-8,22-dién-3p,15p-diol,

4.4- dimetyl-5a,14p-ergosta-8,22-dién-3p,15a-diol,

4.4- dimetyl-5a,14p-ergosta-8,15,22-trien-3p-ol,

4.4- dimetyl-24-nor-5a,14p-cholest-8-en-3p-ol,

4.4- dimetyl-24-nor-5a,14p-cholest-8-én-3p,15p-diol,

4.4- dimetyl-24-nor-5a,14p-cholest-8-én-3p, 15a-diol,

4.4- dimetyl-24-nor-5a,14p-cholesta-8,15-dien-3p-ol,

4.4- dimetyl-5a,14p-cholesta-8,15-dien-3p-ol-hydrogenbutándioát,

4.4- dimetyl-5a,14p-ergosta-8,15,22-trien-3p-ol-hydrogenbutándioát, (2OR)-4,4,20-trimetyl-16P,21-cyklo-5a,14p-pregn-8-én-3p,15a-diol, (20R)-4,4,20-trimetyl-16P,21-cyklo-5a,14p-pregn-8-én-3p,15p-diol, (20R)-20-hydroxymetyl-4,4-dimetyl-5a,14p-pregn-8-én-3P,15p-diol,
7. Farmaceutická kompozícia vyznačujúca sa tým, že obsahuje jeden alebo viac 14p-H-sterolov všeobecného vzorca I podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 6, spoločne s farmaceutický prijateľnou pomocnou látkou.
8. Použitie 14p-H-sterolov všeobecného vzorca I podľa akého• · «· ···· kolvek z nárokov 1 až 6 na prípravu liečiva regulujúceho meiózu.
9. Použitie podľa nároku 8 na prípravu antikoncepčného liečiva na liečenie samíc alebo samcov, výhodne ľudí.
10. Spôsob regulácie meiózy, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podávanie účinného množstva jedného alebo viac 14β-Η-3ύβΓθ1ον všeobecného vzorca I podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 6, pacientovi, ktorý takúto reguláciu vyžaduje.
11. Použitie 14β-νοάίkového substituenta u sterolu na zvýšenie inhibičnéj účinnosti látky inhibujúcej meiózu.