CZ404799A3 - Deriváty 20-araIkyl-5alfa-pregnanu - Google Patents

Abstract

Deriváty 20-aralkyl-5alfa.pregnanu obecného vzorce Ijsou látky, ovlivňující meiotické pochody, které je možno použít ve formě farmaceutického prostředku, rovněž tvořícího součást řešení, pro řízení plodnosti u člověka. Řešení se rovněž týká použití uvedených derivátů pro výrobu farmaceutických prostředků se zmíněnýmúčinkem.

Description

Vynález se vztahuje na deriváty 20-aralkyl-5alfa-pregnanu,_: farmaceutické prostředky je obsahující, stejně jako na po· užití derivátů 2O-aralkyl-5alfa-pregnanu pro výrobu farmaceutických prostředků, určených pro řízení fertility..

5-2LS-S-Σ-2-Ž.S-í______

Sexuální reprodukce zahrnuje cyklická střídání diploidních,, a haploidních stavů:

Diploidní buňky se dělí v rámci procesů meiózy za vzniku haploidních buněk, a haploidní buňky se při oplodnění spojují v páry,, a vytvářejí nové diploidní buňky. Proces v rámci meiózy je charakterizován dvojím buněčným dělením ( I a II ), unikátním u obou mužských a ženských zárodečných buněk,

Běliem procesu dochází ku dvěma buněčným dělením,, následujících po jedné sérii replikací LNA,, za vzniku 4 haploidních buněk z jedné samostatné diploidní buňky, Chromozomální překřížené pochody, při kterých dochází ku výměně otcovského a mateřského genetického materiálu,, se projevují během profáze ( klidové stadium), prvého meiotického dělení.

Ku konci prvého meiotického dělení je distribuován jeden člen z každého páru chromozomů, složeného ze dvou sesterských chromatidů, ku každé dceřinné buňce. Druhé meiotické děleni segreguje každý sesterský chromatid do separátní haploidní buňky. Mužské a ženské zárodečné buňky jsou vystaveny podobnému meiotickému dělení, liší se ale v regulaci těchto procesů. V rámci mužské meiózy se jedná o kontinuální proces v zárodečných buňkách, odvozených z populace nezralých zárodečných buněk, kmenových buněk spermatogonie.

Když muž pohlavně dospěje, zapojí se spermatogofaie z této populace kmenových buněk do meiózy. Prvé a druhé meiotické dělení pokračuje bez přerušení, po případě i za vzniku čtvěřice zralých spermií.

U žen .iniciuji primární oocyty prvé meiotické dělení už během embryonálního stadia,, zůstávají ale v profázi( klidové stadiu p),dokud žena pohlavně nedospěje. Meióaa pokračuje v průběhu ovulace ( zrání vajíčka), a po jeho skončení je úkon čeno i prvé meiotické dělení, a druhé meiotické dělení je iniciováno.

U většiny obratlovců je druhé meiotické dělení zastaveno v průběhu metsfáze, a je dokončeno pouze po oplodnění. Ku konci prvého a druhého meiotického dělení se cytoplasma asymetricky dělí za vzniku dvou sekundárních oocytů, z nichž každý obsahuje haploidní počet jednotlivých chromozomů, lišících se ale značně tielikostí-i

Jeden z nich je malé polární tělísko, které případně degeneruje, a další je velká buňka, vykazující veškerý vývojový potenciál.. Nakonec se vytvoří jedno zralé vajíčko.

Stadium, ve kterém je vyvinutý oocyt uvolňován z vaječní ků, a je připraven ku oplodnění, se u různých druhů liší.Jak u bezobratlých, tak u obratlovců, reagují přídatné buňky vaječníku na polypeptidy( ^onadotropiny), produkované jinde v organismu,, a tak ovlivňují zrání oocytu,. a případně ( u většiny druhů), i ovulaci.

U člověka jsou primární oocyty u novorozených děvčátek zadrženy v profázi meiotického dělení TJ s většinou jsou obklopeny jednou vrstvou folikulárnéh buněk, takže oocyt tvoří spolu s obklopujícími buňkemi prvotní folikul. Malá část prvot nich folikulů začíná postupně růst za tvorby vyvinutých folikulůJ.

Buňky folikulů se zvětšují, a proliferují za tvorby vícevrstvého obalu kolem primárního oocytu. Samotný oocyt se zvět• · « · « · · · • ·

suje, a vyvíjí se průsvitná zóna mimobuněčné matrice,, obsahu.8 jíoí většinou glykoproteiny/^ kortikální granule, specializované sekreční vezikuly, přímo pod membránou plasmy-ve ..vnější oblasti, koru vaječné cytoplasmy, ( když je vajíčko sktivováno spermií, tyto kortikální granule uvolňují svůj obsah exocvtosou. Obsahy granulí působí tak,, že mění obal vajíčka,, a tak zabraňují ostatním spermiím ve spojení s vajíčkem.)

Vyvíjející se folikuly ustavičně rostou, a některé z nich vytvářejí s tekutinou naplněné dutiny, nebo antrum( předsíň), a stávají se tak antrálními folikulami. Výyoj takových folikulů je závislý na gonsdotropinech ( hlavně na folikuly stimulujícím hormonu-ESH ), vylučovaném hypofýzou, a estrogenech, vylučovaných samotnými buňkami folikulů.

V počátcích puberty, vzedmuti h^pofyzární sekrece jiného gonadotropinu,. luteinizačního hořmonu,(LH), aktivuje jednotlivý antrální folikul tak, aby jeho vývoj byl ukončen. Nezralý primární oocyt zraje při dokončení meiotického dělení I, tak,, jak se stimulovaný folikul rychle zvětšuje, a puká na povrchu vaječníku, přičemž uvolňuje uvnitř sekundární oocyt.

Jako v případech, vyskytujících se u většiny sav®&,. je dělení II,. meiózy sekundárního oocytu ,,spuštěno teprve tehdy, dojde-li ku oplodnění spermií.

Studie, zabývající se kontrolními mechanismy iniciace, a regulace meiotických procesů v mužských a ženských zárodečných buňkách, naznačují roli cyklických nukleotidů při zprostředkování meiotické zástavy. Spontánímu zrání oocytů lze zabránit sloučeninami, které udržují zvýšené hladiny cyklického adenosin-3 ,'5-monof oefátu, ( cAMPl·, ( viz publikace v časopise Biol.Reprod.; 30, T.-11 ,/1984/J autoři Eppig J. a Down S,).

Puriny, jako na příklad adenosin a hypoxanthin, jsou považovány za složky, zprostředkující udržování hladin cAMP při meiotické zástavě*, ( Biol.Reprod., 33,1041-1049,/1985/, autoři Eppig J., Ward-B8Íley P. a Coleman D.

Přítomnost meiózu regulující látky v kultuře gonád my- šího zárodku, byla prvně popsána Byskovem A. se sp.,v odborném časopise Dev.Biol., 52,. 193-200,/1976/. Předpokládslo se, že koncentrace meiózu aktivující látky, ( meiosis activating substance = MAS); a meióze zabraňující látky,( meiosis preventing substance = MPS), shodně reguluje meiotické procesy, ( publikace The physiology of reproduction; vydavatel Knofeil E. a Neill J.; Raven Press, New York,/1994/, autoři Byskov A. se sp.

Teprve velmi nedávno byly identifikovány Byskovem se sp.

( viz publikace v časopise Nátur*³, .374,559-562/1995/; (3beta, 5alfa , 2OR)-4 ,.4-dimethylcholesta-8,14,24-trien-3-ol, (FF-MAS) * izolovaným z humánní folikulární tekutiny, a (3beta,5slfe,20R)

4,4-dimethylcholesta-8,24-dien-3-ol, izolovaným z býčích varlat,.. jako endogenní aktivační látky meiózy u člověka, po případě u skotu»

U těchto sterolů bylo prokázáno, že jsou schopné aktivovat meiózu u myší jak v nezralých oocytech v Graafově folikulu, ( CEO - cumulus enclosed oocytes ); tak i v dozrálých, uvolněných oocytech, ( DO = denuded oocytes).

Deriváty endogenních sterolů, majících buá nasycený, nebo nenasycený cholestsnový postranní řetězec, byly uvedeny v Mezinárodních patentových přihláškách WO 96/00235; WO 97/00883; a WO 97/00884;( NOVO NOSDISK A/S), jako meiózu regulující látky.

Nevýhoda těchto cholestanů spočívá v jejich náchylnostti ku rychlé dezaktivaci v organismu,( viz časopis Vitamins 8nd Hormones,42,315,/1985/, autor Halí P.F.), a tím i omezení jejich therapeutickéha působení_r jako látek, ovlivňujících fertilitu»

Existuje tedy potřeba regulátorů meiotických procesů, vykazujících zlepšené působení in vivo»

P_o_d_s_t_a_t_a___IJZ_2_É_l_e_z_u

Podstatu vynálezu tvoří deriváty 2O-aralkyl-5alfa-pregnsnu, obecného vzorce² 1,

kde,

R₁ = (H,OR), (H,OSQyi), nebo NOR,

S = H, ( alkylová, nebo (C₁ )acylová skupina,, každý

R2 a E3 je nezávisle vodík,, nebo (C^ )-8lkylová skupina,

X = rovný řetězec divalentního &j_g uhlovodíkového radikálu_r po' případě obsahující dvojnou,, nebo trojnou V8zbu, nebo X = -(CH_O) -CH₇R_r m /0-, s = 0-4, alespoň jeden R? a R_gje (C₁)alkvlová_r hydroxylové, (^1-4 skupina_r nebo halogen, další, je-li přítomen,, je vodík,,

nebo,

R^ s Βθ představují spolu O,, nebo NOR,

R* = EE?, (C^)alkylovou, nebo (C^)acylovou skupinu,, každý K^_r®5 ⁸ je nezávisle vodík, hydroxylové, (C|)alkoxyl°vá skupina, halogen, NRg,H^_Q,, nebo : «q _4Alkylová skupina, po případě substituované s hydroxylovou,, alkoxylovou skupinou, halogenem, nebo oxoskupinou, každý Rg a Σ^θ je nezávisle vodík, nebo (C^ )alkylová skupinaJ.

.8 tečkované čáry označují delta„nebo delta dvojnou vazbu, nebo pár konjugovaných dvojných vazeb, zvolených z delta⁷»¹¹⁴, delta⁸»'¹⁴, a delta⁶»^{8( 1 4 5}» za předpokladu, že (3hets,4alfa,24E)-25-(4-hvdroxyfenyl)4-methyl-26,.27-dinorcholesta-7,24-dien,3-ol, (gramisterol) je vyloučen, nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli.

Na základě publikace v časopise J.Am.Oil.Chem.Soc,,50,

300302,/1973/, autor Hiřoitho se sp., nevztahuje se ochrana na deriváty 2O-aralkyl-5-elfa^pregnanu, dle vzorce I, kdeR₁ je (H,0H), R^ je H, a R^ je CH^,. nebo R^ je CH^., a R^ je Η; X je -((CE^Í^-CHeCH-;, R^ a jsou H; R^ je OH, a kde tečkovaná čára označujme deltZ dvojnou vazbu , na příklad (3beta,4alfa,24E)-25(4-hydroxyfeny1)-4-methyl-26,27-dinirchole sta-7,24-dien-3-ol, ( gramisterol), jako4-methylsterolovou složku rostlinných olejů z obilních klíčků, a ostatních rostlinných tkání.

Bylo zjištěno, že deriváty 2O-aralkyl-5alfa-pregnanu, dle obecného vzorce L, vykazují zlepšené aktivační meioticképůsobení...

Vynález se dále vztahuje na farmaceutické prostředky, obsahující deriváty 20-eralky1-5alfa-pregnanu, dle obecného· vzorce 1.Farmaceutické prostředky, které obsahují (3beta,4alfa_r 24E )-25-(4-hydroxyfenyl)-4-methyl-26_r27-dinorcholesta-7,.24dien-3-oi; ( gramisterol),. jsou do předloženého vynálezu zahrnuty ·

Další aspekt předloženého vynálezu se vztahuje na použití derivátu 2O*aralkyl-5alfa-pregnanu_r dle obecného vzorce I_r týkající se výroby farmaceutických prostředků, určených pro řízení fertility.

Výraz (C^5alkyl, používaný při definování vzorce I, označuje rozvětvenou nebo neroívětvenou alkylovou skupinu,, mající 1-6 uhlíkových atomů,, jako na příklad hexyl,pentyl_r butyl,, isobutyl,. terciární butyl,. propyl. isopropyl_ř ethyl_r a methyl·

Podobně výraz (G^)alkyl, označuje alkylovou skupinu, mající 1- 4 uhlíkové atomy·

Výraz (C^_g)acyl, označuje acylovou skupinu,, odvozenou od karboxylové kyseliny, mající 1- 6 uhlíkových atomů, jako na příklad hexanoyl,, pentanoyl_r pivaloyl,, butyryl_ř propanoyl,. acetyl,, nebo formy!·

Pod definicí (C^g^acyl, jsou zahrnuty také acylové skupiny,. odvozené od dikarboxylových kyselin, jako na příklad hemi-glutaroyl,. iaemi-sukcinoyl, a hemi-maloyl.

Výhodná (C₁)acylová skupina, je hemi-sukcinoyl.

Výraz (C^_g)alkoxy, označuje slkoxvl, mající 1-4 uhlíkové atomy,, jako na příklad butyloxy, propvloxy_r isopropyloxy, ethyloxy,, a výhodně, methyloxy skupinu·

Výraz halogen označuje fluor,, chlor,, brom, nebo jod.

V případě, že halogen je substituentem u nějaké alkylové skupiny, jako na příklad při definování Εγ a Rg, jsou chlor, 8 fluor výhodné, přičemž fluor je nejvýhodnější·

Je pochopitelné, že .deriváty 20-er8lkyl-58lfs-pr'egnanu, uvedené’ve vynálezu, mají přirozenou konfiguraci 9alfa,1Obeta_y 14alfa»17ba ts₍·· 13beFta.

Výhodné sloučeniny_y uvedené v rámci vynálezu, jsoú deriváty 2O-aralkyl-5alfa-pregnanu_y dle vzorce I, kde R^ je(H, OH) a tečkované Čáry označují pár konjugovaných dvoňných vazeb, zvolených z delta?’¹⁴,, delta⁸’¹⁴,, 8 delta^¹⁴

Mezi těmito výhodnými sloučeninami,, jsou zvláště výhodné

14 delta ’’ dvojné vazby,

Nejvýhodnější jsou takové sloučeniny_t zahrnuté do vynálezu,, kde konfigurace 3-OH substituentu je beta-konfigurace.

Vysoce výhodné sloučeniny, zahrnuté do vynálezu,, jsou deriváty 20-sralkyl-5alfa-pregnanu, dle obecného vzorce I,. kde

R^ je (H,OR.)J R je H, nebo (G^ )acylová skupiny, každý R^ a

R^ je nezávisle vodík, nebo (C^)-alkylová skupina,. X = ⁸ mají již dříve označený význam. <420 8 1A

Tečkované čáry označují pár konjugovaných delta ’ * dvojných vazeb,, a kde konfigurace 3-OR substituentu je beta-konfigurace ,

Konfigurace v poloze 20 u 20aralkyl-5alfa-pregnanových derivátů,, může být buá R; nebo S, výhodně R.

Sloučeniny zahrnuté do vynálezu, kde X je divalentní uhlo vodíkový radikál,, obsahující dvojnou valínV^lít bu5 E,nebo Z konfiguraci, kolem dvojné vazby.

Oba izomery jsou zahrnuty do předloženého vynálezu.

Zvláště výhodné sloučeniny, zahrnuté do vynálezu,, jaour.

-(3be ta, 5alfa , 20R)-4,4,20-trime thy 1-21 -fen.ylpregna-8,14-dien· J-ol

-(3beta,5alfa,20R)-4,4^20-trimethy1-21 -/4-( trifluormethyl) fenyl/-pregna-8,14-dien-ol

-(3beta ,5alfa, 20S)-4,4-dime thyl-23-fenyl-24-norchola-8,14dien-22-yn-3-ol « · · · · ·

-(3beta,5alfa,20R)-4,4-dimethyl-24-(4-methylfenyl)-chola-8,14 diea.-3-a3L

- (3beta ,5alfe ,.2QR)-4 ,.4,20-trimethy1-21 -fenylpregna-6ýB( 14 )dien-3»čl

-(3beta, 5alfa, 20R )-4,,4,20-trimethy1-21 -/4-(trifluorme thyl)fenyl/-pregna-8,14-dien-3-ol-hydrogenbutandioát

Meiotické aktivační působení derivátů 2O-aralkyl-5alfapregnanu,, uvedených ve vynálezu,- je hodnoceno in vitro za pou žití oocytů,. jako schopnost překonat hypoxanthine® udržovanou meiotickou zástavu, u dozrálých, uvolněných oocytů.

Tyto sloučenin?/ mohou být použity pro stimulaci meiózy jak u mužů tak u žen, a mohou být také použity jako fertilitu regulující látky. Regulace fertility, nebo řízení fertility, zahrnuje antikoncepční působení, a léčbu neplodnosti.

V rámci ženské antikoncepce mohou být použity deriváty

20-aralkyl—5alfa-pregnanu, čile obecného vzorce I, pro indukci předčasného zrání oocytů,, které jsou stál®' ještě uvnitř vaječníků, ještě před tím,, než dojde ku přirozená se vyskytujícímu vyplavení gonadotropinu ( potlačení fertility indukcí předčasného zrání oocytů je demonstrováno u potkanů, a popsáno Mattheiem J. se sp.J v časopise Gynecnl.Obstet.Invest

16,, 129 - 135,71993/.

Při aplikaci in vivo ovlivňují sloučeniny, uvedené v pře dloženém vynálezu,specificky zárodečné buňky, a jsou tedy výhodné při udržování endogenních hormonálních hladin,, a násled ně i délky doby normálního cyklu.

Tento typ antikoncepčních, postupů nevyvolává žádné nežádoucí vedlejší účinky, spojené někdy se steroidní antikoncepcí ( na příklad thrombózy_y náladovost„ neočekávaná krvácení_y maligní onemocnění prsu).

V této souvislosti je důležité poznamenat,, že sloučeninv, uvedené v předloženém vynálezu, se nevážou ku steroidní® « · ·« · · ·· • · · · · • · t · ·

- 10 receptorům, protože nebyla zjištěna žádná vazba u proge-steronového receptoru, androgenového receptoru, estrogenového receptoru,. s receptoru glukokortikoidu.

Dále bylo zjištěno, že tyto sloučeniny nepůsobí ne steroidní synthesy, nebo metabolismus v buňkách humánních nadledvinek v dávkách, které indukují zrání oocytů in vivo.

Další výhoda derivátů 2O-aralkyl-5alfa-pregnanu, uvedených v předloženém vynálezu,, je jejich neschopnost indukovat zrání nevhodných oocytů( izolovaných z preantrélních folikulů), která naznačuje, že tyto sloučeniny nebudou ovlivňovat celkové rezervy oocytů ve vaječnících·

Pouze oocyty z antrálních folikulů, ( vhodné oocyty), mohou být indukovány ku zraní sloučeninami, uvedenými ve vynálezu^

Pro léčbu ženské neplodnosti, způsobené absencí zralých oocytů, mohou být sloučeniny, uvedené ve vynálezu, aplikovány in vivo tak, eby časově stimulovaly zrání vhodných oocytů»

Pro léčbu mužské neplodnosti., způsobené nedostatečným počtem zralých spermií, mohou být sloučeniny, uvedené ve vynálezu,. aplikovány in vivo za účelem stimulace zrání spermatogenie

Sloučeniny, uvedené ve vynálezu, mohou být také použity jako doplněk kultivačního media při oplodnění in vitro, za účelem zlepšení kvality oocytů.

Deriváty 2O-aralkyl-5alfa-pregnanu, uvedené v předloženém vynálezu, mají přirozenou konfiguraci 9alfa, 10beta,13beta, 14alfa,17beta, a obsahují -alespoň jeden nebo více dalších chirálních uhlíkových atomů»

Zmíněné sloučeniny mohou být tedy získány ve formě čistých diastereoizomerů, nebo jsko směs diastereřzomerů. Postupy použitelné pro získání čistých diastereoizomerů jsou v odborných kruzích, zabývajících se touto problematikou, velmi

dobře známy, na příklad krystalizace nebo chromátografie.

Pro therapeutické použití jsou sole sloučenin,, dle vzorce I, takové, kde opačně nabitý ion je farmaceuticky akceptovatelný.

Ale i sole kyselin, dle vzorce I,. ( na příklad sloučeniny, kde E^ je (H, OSO^H), a kyselé adiční sole baží dle vzorce I,, ( na přiklad sloučeniny, kde R^,E^ a/nebo Eg jsou NE^R-iq) mohou být také použity, na příklad při výrobě, nebo čištění farmaceuticky vhodné sloučeniny.

Všechny sole, aí už farmaceutcky vhodné nebo nikoliv,, jsou do předloženého vynálezu zahrnuty.Příklady solí kyselin, uvfe.dených : ve vynálezu,, se týkají minerálních solí,, jako je na příklad sodná sůl, draselná sůl,, a sole,, odvozené od organických baží, jako je na příklad amoniak, imidazol, ethylendiamin, triethylamin, a podobně.

Příklady kyselých edičních solí, zahrnují takové sole, které jsou odvozeny od minerálních kyselin,, jako je na příklad kyselina chlorovodíková,, kyseliha fosforečná* kyselina sírová,, výhodně kyselina chlorovodíková; a organické kyseliny jako na příklad kyselina citrónová, ( 2-hydroxypropan-1 ,.2,2trikarboxylová kyselina), kyselina vinná,( 2,3-dihvdroxybutsn diová kyselina), kyselina octová, kyselina mléčná( 2-hydroxypropanová kyselina), kyselina msleinová,( 7-but8ndiová kyselina), kyselina malonová,( propandiová kyselina),kyselina fumarová,( (E)-butandiová kyselina), glykolová kyselina, jantarová kyselina, ( kyselina butandiová)-Ji a podobně.

Sloučeniny dle vzorce I, nebo farmaceuticky vhodné sole z nich připravené,, jsou zde také uvedeny jako účinné složky, a mohou být aplikovány enterálněí střevní cestou), nebo parenterálně. Přesná dávka, a způsob aplikace účinné složky, nebo farmaceutického prostředku z ní připraveného, bude nutně

- 12 záviset ne požadovaném therspeutickém působení, které má být dosaženo, ( léčba neplodnosti, antikoncepce ), a bude se u jednotlivých sloučenin lišit ve způsobu aplikace, a věku a stavu jedince,, kterému má být farmaceutický prostředek splikovžn

Obecně vyžaduje parenterální aplikace nižší dávkování než ostatní způsoby aplikace, které jsou více závislé na adsorpci. Pro humánní použití se však výhodné dávkování pohybuje v rozmezí od 0,0001 do 25,0 mg na 1,0 kg tělesné hmotnosti.

Požadovaná dávka může být buč ve formě jedné dávky,, nebo vícedávková, aplikovaná v přiměřených intervalech během dne,, nebo v případě ženských příjemkyň, mohou být dávky aplikovámy ve '.vhodných denních..intarvářleeh iběhemu menstruačního cyklu.Dávkování, i způsob aplikace, se mohou u ženských a mužských příjemců lišit..

V případě aplikace in vitro nebo ex vivo, jako na příklad při oplodnění in vitro, mají být sloučeniny, uvedené ve vynálezu, použity v inkubačním mediu v koncentraci přibližně vc rozmezí od 0,01 do 5,0 ^ug/ml.

Předložený vynález se tedy vztahuje také ns farmaceutické prostředky, obsahující deriváty 2O-aralkyl-5alfa-pregnanu dle vzorce I, zahrnující na příklad farmaceutické prostředky, obsahující (3beta,4alfa, 23E)-25-(4-hydroxyfenyl)-4-methy1-26,27dinorcholeata-7,24-dien-3-ol, ( gramosterol), v příměsi s farmaceuticky vhodnými, pomocnými látkami, po případě s jinými therapeutickými látkami..

Pomocné látky musí být ,,akceptovatelné z hlediska kompaktibility s ostatními složkami prostředku,, a nesmí^být pro příjemce škodlivé.

farmaceutické prostředky zahrnují takové, které jsou vhodné pro orální, rektální„ nasální,, lokální, ( včetně transderjnálních, bukálníeh, nebo sublingkválních),, vaginaláíc^, neb® parenAérálních ( včetně subkutánní ch,. intramuskulární ch,,

- 13 intrsvenžních,. a intradermélních) aplikací.

Farmaceutické prostředky mohou být vyrobeny nějakým postupem,. dobře známým příslušným odborníkům ve farmacii,, ne příklad za použití takových postupů, které jsou ne příklad popsány v v odborné publikaci B_emingtons Pharmaceutical Scieences,, ( 18 vydáníJ Mack Publishing Co./1990/, autoři Gennaro se sp.., viz specielní část 8:: Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture).

Takové postupy zahrnují stupeň, související se spojením účinné složky s nějakou pomocnou látkou. Pomocné látky, označované také jako přídetné látky,, zahrnují takové, které jsou konvenčně v této oblasti používané, ( Gennaro,. viz výše), jako jsou na příklad plnidla, pojidla_r ředidla, rozvolňovadla_r klouzedla, barviva, aromatické přísady, a zvlhčovadla.

Farmaceutcké prostředky, vhodné pro orální aplikaci, se mohou vyskytovat ve formě balení individuálních dávek, jako jsou na příklad pilulky, tablety_r nebo kapsle,, nebo jako prášková forma, nebo granule,, nebo jako roztoky,, nebo suspenze.

Účinná složka muže být také navržena ve formě bolusu, ( Vslkár^pilulSK;.) ,,·nebo pasty. Prostředky mohou být teké zpracovány ve formě čípků,, nebo střevních nálevů,, pro rektální aplikaci.,

Pro parenterální aplikaci,, zahrnují vhodné prostředky vodné,, a nevodné sterilní injekce. Protředky se mohou vyskytovat ve formě jednodávkových, nebo vícedávkových halení„ na příklad jako uzsvřené lahvičky, nebo ampule, a mohou být skladovány v lyofilizovaném ( vymraženém) stavu,, vyžadujícím před použitím jenom přidání sterilního tekutého nosiče, na příklad vody.

Prostředky, nebo lékové formy„ vhodné pro aplikaci nasální inhalací, zahrnují jemné prášky, nebo mlhy, generované po- 14 mocí dávkovačích tlakových aerosolů, nebulizérů, nebo insuflátorů.

Deriváty 2O-aralkyl-5alfa-pregnanu, uvedené ve vynálezu,, mohou být také aplikovány ve formě implantovatelných farmaceutických zařízení, obsahujících jádro z ^účinného materiálu, uzavřeného; propustnou,, rychlost pronikání regulující membránou»

Takové imolantáty mají být aplikovány subkutánně nebo lokálně, s účinnou složkou uvolňovanou přibližně konstantní rychlostí, během relativně dlouhého časového období* na příklad od týdnů* až po roky»

Postupy, pro výrobu implentovatelných farmaceutických září zemí, na příklad takových, jejichž výroba je v příslušné oblasti známa, jsou popsány na příklad v Evropském patentu,, číslo 0,303..306;,( AKZO N.V. ).

Sloučeniny, zahrnuté do předložemého vynálezu, mohou být vyrobeny různými postupy, obecně známými odborníkům v oblasti organické chemie,, a zejména v oblasti - stexoidní chemie, (viz na příklad odborná publikace ,,0rganic Resctions in Steroid Chemistry* Svazek I a II* Van Nostrand Reinhold Co.,New York, /1972/,, autoři Fried «Γ. a Edwards J.A.

Deriváty 2O-aralkyl-5-alfa-pregnanu,. dle vzorce I* mohou být obecně vyrobeny z nenasycených derivátů 20-methylpregn83,21-diolu*. dle vzorce II*

- 15?

ve kterém,..

R₂ a R^ 3^aou nezávisle vodík, nebo (C₁)alkylová skupina,

R.

8 · označuje dei-tff' _F nebo delta dvojnou acylová chránící skupinB, jako na příklad benzoyl, •cetyl,. pivaloyl,, a podobně_F a kde tečkovaná čára vazbu,, nebo pár konjugovaných dvojných vazeb,, zvolených z delta⁶»⁸⁽¹⁴\ delta⁷»¹⁴,, a delta⁸»'¹⁴.

Výchozí masteřiál pro výrobu meziproduktů dle vzorce II, je na příklad (20S)-3-oxopregn-4-en-20-karboxaldehyd_ř který může být získán ozonolysou ae stigmasta-4,22-dien-3-onu, jak je popsáno v časopise Synthesis,. 807_F/1980/, autor Veysoglu ap, a který je také komerčně dostupný ( Sigma,, USA).

Aldehyd j,e selektivně redukován na (20S)-2l-hydroxy-20— miethylpregn.-4-en-3-on, ( viz časopis J,Amer.Chem.Soe· _ř105,5075 „ /1983/, autor B.M.Trošt se sp.), a výsledná hydroxylová funkde je ihned chráněna s nějakým etherem , jako je na příklad, ethoxyethylether,, tetrahydropyranyKTHP)ether, nebo silylether, jako na příklad triisopropylsilylether„ t-butyldimethylsilylether,. nebo t-butyldifenylsilylether,. a podobně.

Vhodné chránící skupiny jsou odborníkům v této oblasti známy,, viz na příklad publikace Protective Groups in Organic:

- 16 Synthesis,, druhé vydání, Wiley, New York,/1991/. autoři Greene

T,W, s Wuts P.G,M.

Po případě, výsledný,, chráněný*hydroxyl (20S)-21-hydroxy-20-methyl-pregn-4-en-3-omj., může být monos-_t-nebo'· dialkylován v poloze C-4·,- a na příklad může- být d ime thyl ován, Alkylsoe může být provedena za použití standardních postupů, jako je ne příklad postup s terc:,-butoxidem- čnaselným-methyljodidem ( viz J,Org,Ghem. ,51 ,-4047,./1 986/, autor E.E.Dolle se sp.), dále za použití lithium diisopropylamidu(LDA)-methyljodidu(MeJ), a podobnými postupy, známými odborníkům v této oblasti.

Po případě může být delta^-sloučenina konvertována ηβ delta -derivát reakcí s baží, a následným smícháníins vodou, ( viz časopis Gan.J.Chem. 46,.1459/1968/, autor J.B. Jones se sp

Karbonylová skupina v poloze C-3 může být následně redukována na hydroxy-skupinu za použití redukčních činidel, jako je na příklad tetrahydrohlinitan lithný_r tetrahydroboriten sod ný, a další redukční hydrédy, známé odborníkům v této oblasti.

Výsledné hydroxy-sloučeniny mohou být chráněny ve formě esterů,, jako je na příklad acetátový ester,, benzoátový ester, nebo pivalátový ester, a podobně, Belta^ gystém může být kon5 7 vertován: na čelta^y’ -dienový systém sekvenční bromací v poloze C-7„ β následnou dehydrobromscí.

Bromační reakce může být provedena thermálně( Schroepfer G.J.Jr, se sp.J Chem.Phys.Lipids,47,187,/1988/· nebo fotochemicky, ( Heterocycles,. 28,333,/7989/, autor Prelle,A.se sp.),

V obou případech,, bromační látky_ř které mohou být použity, jsou Ní-bromsukcinimid, 1 ,3-dibrom-5,5-dimethylhvdantoin, a podobně.

Dehydrobromační činidla zahrnují N,N-diisopropylethylamin;, 2,4,6-trimethylpyridin,. trimethylfosfit_r tetrabutylamonium fluoridy a další,

7

Delta^y* -dienový systém?může být nyní konvertován na delta^ ”⁸^^ ^-dienový systém,, a delta?’ ^-dienový systém, nebo delta⁸^-dienový systém. Použité postupy jsou odborníkům v této oblasti známy.

- 17 Konverze ns delta^*⁸^⁴ '-derivát popsána ‘na příklad v časopise Chem.Pharm.Bull.26,3582,/1978/, autor Kaneko G. se 7 14 sp., konverze na delta ^r -derivát popsána na příklad v časopise J.Org.Chem., 53,1713/1988/, autor ^;Wilson W.K. se sp. Konverze na delta ^r -derivát popsána na příklad v časopise Chem.Phys.Lipide, 47,187/1988/,. autor Schroepfer G.J.Jr.se sp., nebo J.Org.Chem.,53,1563,/1988/, autor Dolle E.E. se sp.

7

Výsledkem konverze delta ’ -dienového systému, ns ..ť;·. ďelta^”^^^ ^-dienový systém; delta?*^l4-dienový systém, nebo delta ’ -dienový systém,, může být směs těchto i z omerů. Postupy,. použitelné pro získání čistých sloučenin;,, jsou odborníkům v této oblasti velmi dobře známy _r jsko na příklad krystalizace, nebo chromatografie,, za použití sloupce s oxidem křemičitým, naplněném se stříbrnou solí.

5 7

Delta -sloučeniny se získají z delta ’ -dienového systému, redukcí s lithiem v tekutém amoniaku,( viz Bull.Soc.Chem. Fr._r 1295,/1965/, autor Lederer F. se sp.), hydrogenBCÍ»

Hydrogenační katalyzátory, které mohou být použity,, zahrnují Raney nikl, ( J.Biol.Chem.,233,1343,/1958/, autor Gautschi F.se sp., Wilkinsonův katalyzátor,( Steroids,11,287/1968/, autor Ganonica L. se sp.), a další»

8 14·

Delta -deriváty lze připravit z delte ’ -dienů v následujícím sledu*

Selektivní hydroborace delta^-dvojné vazby, následované s deoxygenací vyrobené 15-hydroxy-sloučeniny,( viz J.Amer.

Chem.Soc.,111_ř 278,/1989/,, autor Dolle R.E. se sp.).

Příprava nenasycených, v poloze 3,. chráněných derivátů

20-me thylpregna-3 ,.21-diolu,. dle vzorce II,. se ukončí sejmutím chránící 21-hydrox.y funkce.

Manipulace s delta ’ -dienovým systémem může být spojena s odstraněním chránění hydroxy-skupiny v poloze C-21 v případě, nebylo-li chránění hydroxy-skupiny dosud odstraněno.

Deriváty 21-ary 1-20-me thy lpregn,-3-oluJ ( X = -CH -); uvedené ve vynálezu, lze získat oxidací sloučenin dle vzorce II,, na příslušné pregna-20-karboxaldehydy, a následnou kondenzační reakcí těchto aldehydů, s nesubstituovsnou, nebo vhodně substituovanou fenylmetalovou sloučeninou, deoxygenací v poloze C-21 takto připravených, v poloze 3-chráněných 21-ary1-20me thylpregna-3,21-diolových derivátů, a konečně odstraněním chránění u'hydroxy-skupiny v poloze C-3Oxidace 21-hydroxy-skupiny může být provedena za použití Oppenauerovi oxidace, Swernovi oxidace, Moffatiho oxidace,Dess Martinovi oxidace, nebo za použití reagens chrómu (VI), jako Jonesova reagens, pyridinium dichromátu, pyridinium chlor chromátu, a podobných reagens, známých dobře odborníkům v této oblasti».

Nesubstituované, nebo substituované fenylmetalové sloučeniny, které mohou být použity při kondenzační reakci s pregna-2O-karboxaldehydy, zahrnují sloučeniny aryllithia-, arylmagnesia-, arylzinku-, nebo arylceru. Nahražení 21-hydroxy-skupi ny s vodíkem ( deoxygenace), u derivátů v poloze 3 chráněného

21-ary1-20-methylpregna-3,21-diolu, může být provedeno esterifikací s methyloxalylchloridem, a následnou reakcí s tributylstanniumhydridem/2,2-aza-bis( i s obutými tri lem).

Deoxygenace může být také provedena Bartoňovou deoxygenač ní reakcí, nebo podobnými technikami, známými odborníkům v pří slušné oblasti,( viz Te trahedron,. 43,3541,/1987/, autor Μ» Ramaish ), nebo konverzí 21-hydroxy-skupiny, na odstupující skupinu, na příklad halogen, tak třeba chlor, brom, nebo jod, nebo zvláště tosyloxy-skupinu, nebo mesyloxy-skupinu, a násled nou redukcí s hydridovým redukčním činidlem, nebo za použití RaneyOKa niklu, nebo ne příklad s triethylsilanem v kombinaci s Lewisovou kyselinou, a konečně odstranění chránící skupiny u 3-hydroxyfunkce, které se provede za použití standardních postupů.

- 19 Nenasycené sloučeniny 21-sryI-24-norcholanuJ(X = , uvedené v předloženém vynálezu, lze připravit z derivátů nenasyceného,, v poloze 3-chráněného 20-methylpregna3,21-diolu, dle vzorce II,. následujícím postupem ::

Hydroxy-funkce, v poloze Cf2l _r může být konvertována ma odstupující skupinu, na příklad halogen, jsko třeba chfor,, brom, nebo jod, nebo žvlášbě-.tosyloxy-skupinu, nebo mesyloxyskupinu, přičemž takto získané produkty mohou být ihned potom' konvertovány reakcí s kyanidem draselným, nebo s kyanidem sodným, na deriváty 20-methylpregna-21-karbonitrilu, které mohou být konvertovány na příslušné 21-karboxyaldehydy, zpracováním s redukčním činidlem, na příklad s diisobutylsluminium-hydri dem, nebo jinými redukčními činidly,, schopnými konvertovat karbonitrilovou skupinu, na karboxysldehydovou skupinu»

Protože při redukci dochází také ku sejmutí chránící skupiny u hydroxy-funkce v poloze C-3, má být 3-hydroxy-skupina opět chráněna ve formě etheru, na příklad za použití ethoxyethylether^v^etrahydropyranyl-etheru, silyletheru, tak třeba trimethylsilyletheru, nebo acylové chránící skupiny tak, jak je popsáno výše.

Konečná konverze na .^sloučeniny 2S-aryl-24-norcholan -3olu, uvedené ve vynálezu, může být provedena následujícím postupem :

Reakce s ne substituovanou, nebo vhodně substituovanou fenylmetalovou sloučeninou, nahrazením 23-hydroxy. skupiny vodíkem deoxygenacía konečně odstraněním chránění u 3-hydroxyskupiny.

Sloučeniny, uvedené v předloženém vynálezu,, u kterých X = rovný řetězec divalentního uhlovodíkového radikálu, lze připravit za použití postupů, podobných těm, které jsou už popsány u derivátů 23-sryl-24-norcholan-3-olu, výše.

Za prvé, sloučeniny dle vzorce II, jsou konvertovány na aldehyd, mající požadovaný počet methylenových skupin v

postanním řetězci.

Poté následuje přidání nesubstituované, nebo vhodně substituované fenylmetalové sloučeniny, deoxygenace vzniklé hydroxy-slouče.niny, a konečně odstraněním chránění u 3-hydroxyskupiny, postupem, popsaným už výše.

Techniky pro homologizaci jsou pracovníkům z této oblasti dobře známy( viz na příklad publikace Formation of C-C Bonds, Svazek I-III, Georg Thieme Publishers, Stuttgart¹, /1973/, autor J.Mathieu se sp. ).

Sloučeniny, uvedené v předloženém vynálezu,, u kterých X = označuje -(CHp^-CR^Rg-·, kde m = 0 -4, a kde R? je hydroxy-skupina, a R_g je vodík, mohou být .připraveny posobným postupem, popsaným výše.

V tomto případě, hvdroxy-skupina, která vznikne reakcí s arylmetelovou sloučeninou, je takto udržována, na příklad deoxygenace je vynechána. Vzniklé arylkarbinoly mohou být po případě konvertovány, za použití postupů, známých dobře odborníkům v oblasti obecné chemie, na jiné sloučeniny dle vzorce I, jmenovitě sloučeniny, uvedené v předloženém vynálezu,, u kterých

X « označuje “^^CH2^m“^CR7^R8“’ ^{kde m = 0} a kde R? a R_g jsÓTi nezávisle (C^ _₄ )alkylová‘, * ( lalkoxylová skupina, nebo halogen, nebo kde R? a R_g označují společně 0; nebo NOR, kde R^zje H; ( C₁ g)alkylová,. nebo (C₁ lacylová skupina.

Sloučeniny, uvedené v předloženém vynálezu, u kterých X. = rovný řetězec divalentního C-j__g uhlovodíkového radikálu, mohou být také připraveny z meziproduktů dle vzorce II, konverzí 21-hydroxy-skupiny na odstupující skupinu, jak již bylo popsáno^následovanou s kovem zprostředkovanou přeměnou, na příklad katalýzou s mědí(l), reakcí s vhodně substituovanou fenylmetalovou sloučeninou, nebo vhodně substituovanou omegarfeny^S^talovou sloučeninou, ( lithium, hořčík, zinek; viz

- 21 Chem.Pherm.Bull., 28,606/1980/, autor Morisaki M. ae sp. a publikace Org.Reactions,41,strana 135, Wiley, New York,/1992/, autor B.H.Lipschutz se sp.

Sloučeniny, uvedené v předloženém vynálezu, u kterých X = rovný řetězec divalentního C₁_g uhlovodíkového radikálu, obsahujícího dvojnou váznu, mohou být připraveny Wittigovou reakcí pregns-20-karboxaldehydů, nebo 20-methylpregna-2l-karboxeldehydů, jejichž synthesa je popsána výše, nebo derivátů cholan-24-slu, 8td., s ne substituovanými, nebo vhodně substitu ovánými helogenidy benzyltrif enylf osf onia,’ nebo nesubstituovanými, nebo vhodně substituovanými hrlogenidy omega-fenylalkvltrifenylfosfonia.

Pro postupy, použité v rámci Wittigovi reakce, viz publikace Org.Reactions,14, strana 270,, Wiley,New York,/1965/, autor Maercker A., případně může být použita Petersonova reakce, viz publikace Org.Reactions,38,stranal, Wiley, New York,/199OÚ autor Ager D.J.

Sloučeniny, (.uvedené v předloženém vynálezu, u kterých X = rovný řetězec divalentního uhlovodíkového radikálu, obsahujícího dvojnou vazbu, mohou být také připraveny s koveqi zprostředkovaným kuplováním 24-norchol-22-enů, chol-23-enů, ne bo 26,27-dinorcholest-24-enů, atd., substituovaných v poloze C-23, případně C-24, C-25, a halogenem, ( cfclor, brom,jod), ne bo skupinou kyseliny trifluormethansulfonové( triflst), s nesubstituovanou, nebo vhodně substituovanou fenylmetalovou slou Čeninou, nebo omegs-fenyImetalovou sloučeninou, ( na příklad hliník, lithium, hořčík,zinek,bor,cín,mě3, zirkonium).

Mohou být také připraveny podobnou reakcí 24-norchol-22enů, chol-23-enů, nebo 26,27-dinorcholest-24-enů, atd., substituovaných v poloze C-23, po případě C-24,C-25, s kovem, ( hliník, lithium hořčík,zinek,bor,měá, zirkonium), s vhodně substituovaným fenylhalogenidem, nebo omega-fenvlalkylhalogenidem,( c$lor,brom,jod), nebo sulfonátem.

- 22 Používané postupy jsou odborníkům z této oblasti dobře známy; viz publikace Comprehensive Organic Synthesis, 3,· strana 241, s 481,. Pergamon Press,, Oxford,/1991/, autor· Knight D.W., nebo tamtéž, 3, strana 435, autor Tamao K.

Sloučeniny, uvedené v předloženém vynálezu, u kterýchs X = rovný řetězec divalentního ^_g uhlovodíkového radikálu, obsahujícího trojnou vazbu, mohou být připraveny přeměnou s kovem zprostředkovaným kuplovýním 24-norchol-22-ynů, chol-23ynů, nebo 26,27-dinorcholest-24-ynů, s vhodně substituovaným fenyl halogenidem ( chlor, brom, jod, viz Synthesis, 627,/1980/, autor Takshashi S. se sp.).

Ostatní sloučeniny v této skupině, mohou být připraveny metsl8cí, (na příklad lithium hořčík, sodík, draslík, hliník), zmíněných acet.ylenových derivátů, a následnou reakcí s vhodně substituovanými omega-fenylalkylovými halogenidy, nebo sulfonátovými estery,( viz publikace Comprehensive Organic Synthesis, 3,, strana 271, /1991/, Pergamon Press, Oxford, autor P.J. Garratt.

Alternativně mohou být připraveny reakcí derivátů 20-methylpitegn, -21-olu, derivátů 24-norcholan-23-olu,. nebo derivátů cholan-24-olu, a tak dále, u kterých hvdroxy-skupina je konvertována na odstupující skupinu ( viz dále), s nesubstituovanou, nebo vhodně substituovanou omega-fenylelk-1-ynyl-metalovou sloučeninou.

Pro synthesy sloučenin,, u kterých R^ je (H,OR),, (H,OSO^H), nebo NOR, a R je H,, (C^)alkylová skupina, nebo (C_{1 —}& )acylová skupina, mohou být použity jako výchozí materiály, za použití postupů známým dobře odborníkům v příslušné oblasti,, sloučeniny dle vzorce I, u kterých R^ je (H, OH).

«►· · ·

- 23 P ⁸ čt. 2 2_r_°_v_e j3_e _n_í v_y_n_á_l_e_z_u

Vynález je objasněn dále následujícími příklady :

• * ·· » ·

- 24 Přiklaď 1’)

Příprava (3beta ,5alfa ,.20B)-4,4,20-trimethyl-2l -fenylpregna

8,14-dien-3-olu

Sloučenina T)

S cil e m a 1 )

Stupeň I)

Příprava (203)-21 -hydroxy-20-methylpregn-4-en-3-onu

Sloučenina 3;)

Ku roztoku,, připravenému rozpuštěním' 125,0 gj (2OS)-3~ oxopregn-4-en-20*-karboxaldehvdu, ( Sloučenina 2), ve Γ.250. ml vysušeného ethanolu, a vychlazeného na teplotu minus 10,0°C, byl přidán během 30 minut roztok, získaný rozpuštěním 4,40' g_ř tetrahydroboritsnu sodného, v 80,0' ml, ethanolu^ vysušehého).

Poté,, co byla vzniklá reakční směs míchána při teplptě minus 10',0:^oC, po dobu 2,0 hodin,_: byla reakce ukončena přidáním 50%ního vodného roztoku kyseliny octové» Poté byla reakční směs za sníženého tlaku zahuštěna na 25% původního objemu,,. a pcrté byla nalita do 5,0 litrů směsi ledu a vody.

Výsledná suspenze byla poté míchána přes noc,, a zfiltrována. Vzniklý zbytek byl promyt s vodou,, a vysušen»

Bylo získáno 124,d g žádaného,, v nadpise uvedeného (2OS)

21-hydroxy-2Q-methylpregn-4-en-3-onu;. (Sloučenina 3), který byl použit v následujícím Stupni II, bez jakéhokoliv dalšího čištění» • · « · * » * · • ·

- 25 S t u p e ni II)

Příprava ('2OS)-21-//(1 „1 -dime thylethyl)-dimethylsilyl/-oxy/20-me thy Ipre gn>4-enir3-onu

Sloučeain. 8 4)

Ku roztoku,, připravenému rozpuštěním 124,0 g, alkoholu.

( Sloučenina 3),· získaného v rámci předcházejícího,, výše popsaného Stupně I), a 176,0 g* imidazolu, ve 1.730'^?^/fl^t-§imethylformamidu, a vychlazenému na teplotu minus 1O',O°G,. bylo přidáno najednou 112,0 g, t-butyldimethylsilyl-chloriau_r a vzniklá reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 2,0 hodin.

Poté byla reakční směs nalita d.o 10,0 litrů směsi ledu a vody, a 750,0 ml, nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Výsledná suspenze byla zfiltrovánam a zbytek byl promyt s vodou,, a vysušen.

Bylo získáno 169,0 g, žádaného (2QS)-21-//(1,1-dimethylethyl)-dimethylsilyl/-oxy/-20-methylpregn-4-en-onu, který byl použit v následujícím reakčním stupni bez jakéhokoliv dalšího čištění..

Stupeň. III)

Příprava (^!2OS)-21-//(1 ,1 -dimethylethyl)-dimethylsilyl/-oxy/4,4,20-trimethylpregn-5-en-3-onu

Sloučenina 5;)

Ku směsi, připravené smícháním 169,5 gj t-butoxidu draselného,. 8 3.750 ml vysušeného t-butanolu, zahřátému na te• · » 0 * ·· · ·

- 26 plotu 45,O°C* byl přidán roztok,, připravený rozpuštěním 169* 3 Sr ketonu, ( Sloučenina 4),. získaného v rámci předcházejícího* výše popsaného Stupně II), ve 375,0 ml* vysušeného tetrahydrofuranu* a vzniklá reskční směs byla míchána po dobu 10,0 minut»

Poté bylo běhenr 10,0 minut přidáno ku reakční směsi

187,50 ml, methyljodidu* a tato směs byla dále míchána po ďobu 3,0 hodin» Poté byla reakční směs zs sníženého tlaku zahuš těna na objem 1,50 litru, a poté byla nalita do 10,0 litrů směsi ledu a vody»

Poté,, co byla směs míchána po dobu 2,0 hodin,, byla vznik lá susp^enze zfiltrována» Zbytek byl promyt s vodou* vysušen* a přečištěn krystalizací z acetonu»

Bylo získáno 136,0 g, žádaného (2OS)-21-//(1,1-dimethylethyl)-dimethylsilyl/-oxy/-4,4,2Q-trimethylpregn-5-en-3-onu, ( Sloučenina 5 ).

Stupeň IV)

Příprava (3heta,,20S)-21-//( 1 ,1-dimethylethyl)-dimethylsilyl/oxy/-4,4,20-trimethylpregn-5-en-3-olu

S 1 o u č e n- i n. a 6)

Roztok,, připravený rozpuštěním 140*0 g* ketonu,(Sloučeni na 5), získanému v rámci předcházejícího, výše popsaného Stup ně III), ve 1»400 ml* vysušeného tetrahydrofuranu* byl přidán během 30,0 minut do ledem vychlazené suspenze 35,0 g, tetrahydrohlinitanu lithného, v 1.750 ml, tetrahydrofuranu»

Poté, co byla vzniklá reakční směs míchána při teplotě místnosti po dobu 1,0 hodiny, byla reakce zastavena přidáním 152*0 ml, nasyceného* vodného roztoku sířenu sodného, násle- 27 ····

dovánému a 39,-0 ml„ vody. Po přidání 1.750 ml, ethy láce tátu,, byla směs zfiltrována přes oxid křemičitý„ a filtrát byl za sníženého tlaku zahuštěn.

Bylo získáno 136,30 g, žádaného (3beta,2GS)-21-//(1,1dime thyle thy1)-dime thylsilyl/-oxy/-4,4,20-trime thylpregn-5-en3-olu,, ( Sloučenina 6), který byl použit v následujícím stupni, bez jakéhokoliv dalšího čištění.

Stupeň V)

Příprava (3beta„2QS)-21 -//(1 ,,1 -dimethylethyl)-dimethylsily 1/oxy/-4,4 „20-trime thy lpregn-5-en-3,-olu- benzoátu

Sloučenina 7)

Ku roztoku,, připravenému rozpuštěním 132,5 g, alkoholu, ( Sloučenina 6), získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně IV), ve 1,310 ml, vysušeného pyridinu, a vychla zenému na teplotu 0°C, bylo přidáno během 5 minut,. 65,70 mlj benzoylchloridu„ a vzniklá reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 1,0 hodiny. Poté byla nalita do 6.650 ml, směsi ledu a vody, 8 výsledná suspenze byl8 míchána přes noc.

Vzniklá sraženina byla izolována filtrací,, a promyta s vodou,, o teplotě 40 - 50°C. Zbytek byl vysušen a přečištěn krystalizací z acetonu.

Bylo získáno 113,-60 g, žádaného (3beta,,20S)-21-//(1 ,1dimethylethyl)-dimethylsilyl/-oxy/-4„4,20-trimethylpregn-5-en3-olu.-^®²⁵oát», ( Sloučenina 7 ).

• · · ·

- 28 Stupeň V.I)

Příprava (3beta,2OS)-21-//(1,1-dimethylethyl)-dimethylsilyl/oxy/-4,.4,20-trimethylpregna-5,7-dien-3-ol- benzoátu

Sloučenina 8)

Směs_r připravená smícháním 94,0 g, benzoátu, ( Sloučenina 7), získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně V), vs 810,0 ml, vysušeného toluenu, a 810,0 ml, vysušeného c.yklohexanu, 8 36,,10 g, N-bromsukcinimidu,. byla zahřívána za refluxu pod zpětným chladičem,, po dobu 10,0 minut..

Poté byla reakční směs ochlazena, a po přidání další dávky 36,10 g, N-bromsukcinimidu,, byla zahřívána dále za refluxu pod zpětným chladičem, po dobu 10,0 minut. Poté byla reakční směs ochlazena,, a po přidání 1.620 ml, nasyceného vodného roztoku thiosíranu soáného, bvla vzniklá výsledná směs míchána po dobu 30,0 minut»

Po oddělení organické a vodné fáze, byla vodná fáze extrahována s toluenem(2x), a spojené organické fáze byly vysušeny se síranem sodným, a za sníženého tisku byly zahuštěny. Získaný roztok surového produktu ve 2.-835 ml, vysušeného toluenu,. a 284,0 ml, Ν,Ν-diisopropylethylaminu, byl zahříván za refluxu pod zpětným chladičem, po dobu 1,0 hodiny. Poté, po ochla zení, byl zmíněný roztok promyt postupně a nasyceným vodným roz tokem hydrogenuhličitanu sodného., a vnasyceným. vodným roztokem chloridu amonného, a nakonec se solankou. Vodná fáze byla pokaž dé extrahována s ethylacetátem.

Spojené toluenové a ethylscetátové extrakty byly vysušeny se síranem sodným,, a za sníženého tlaku byla zahuštěny.

Bylo získáno 134,0 g, žádaného (3beta,2OS)-2l-//(1,1-dime thyle thyl)-dime thylsilyl/-oxy/-4,4,20-trime thylpregna-5,7dien-3-ol-benzoátu, ( Sloučenina 8),. který byl použit v následujícím stupni,, bez jakéhokoliv dalšího čištění» • · · ·

- 29 Stupeň VII)

Přípravs směsi (3beta , 5alfa, 20S')-4,4,,20-trimethylpregna-8,14dien-3_r2l-diol—3-benzoátu,,

Sloučenina 9) a

(3beta , 5alfa ,.2QS )-4,4,2O-trimethylpregna-6,8( 14)-dien-3,21 diol-3-benzoátuJ ( 3 :: 1 )

Směs, připravená smícháním 32,3 g, Sloučeniny 8), získané v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně VI)· 84*0 ml, toluenuJ 588,,0 ml, 96%ního ethanolu, 8 84,0 ml, koncentrované kyseliny chlorovodíkové* byla zahřívána za refluxu pod zpětným chladičem,, po dobu 3,0 hodin..

Poté byla vzniklá reakční směs ochlazena, a nalita ďo 1,0 litru nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Vzniklý produkt byl extrahován do ethylacetátu, 8 spojené organické fáze byly poté promyty se solankou, vysušeny se síranem sodným, a za sníženého tlaku byla zahuštěny. ZBytek byl zpracován pomocí sloupcové chromátografie.

Byla získána směs 07,40 g); (3bete,5alfa,2OS)-4,4,2Otrimethylpregna-8,14-dien-3,21-diol-3-benzoátu, ( Sloučenina

9), a ( 3beta,5alfa,20S)-4,4,20-trimethylpregna-6,8( 14)-dien3,.2l-diol-3?-benzoátu; ( 3 : 1), která byla použita v následujícím stupni, jako taková.

S t u p e Si VIII)

Příprava (3beta,5alfa „20S)-3-(benzoyloxy )-4,4-dimethylpregne8,14-dien-20-karboxaldehydu

Sloučenina 10)

Ku roztoku,, připravenému rozpuštěním 1,97 ml,, vysušeného dimethylsulfoxidu, ve 76„0 ml,, vysušeného dichlormethanu* a vychlazenému na teplotu minus 78,0°0* byl přidán během 30' minut roztok* připravený smícháním 1,53 ml, oxalylchloridu,. ve 38,0 ml,, vysušeného dichlormethanu* a vzniklá směs byla míchána po dobu 5,0 minut.

Poté byl ku výše zmíněné směsi přidán během 20,0 minut roztok, získaný rozpuštěním 5,0 g, směsi* získané v rámci před cházejícího, výše popsaného Stupně VII), ve 36,0 ml, vysušeného tetrahydrofuranu, Vzniklá reakční směs byla dále míchána při teplotě minus 78,0°C, po dobu 5,0 hodin* a poté, co bylo přidáno 7,30 ml, triethylaminu, byla směs vytemperována na teplotu místnosti.

Po přidání vody ku směsi, byl produkt extrahován do dichlormethanu, Spojené organické fáze byly promyty s vodou* 8 po vysušení se síranem sodným* byly za sníženého tlaku zahuštěny.

Bylo získáno 6,14 g„ žádaného (3beta,5alfa,20S)-3-íbenzoyloxy)-4,4-dimethylpregna-8,14-dien-20-karboxaldehydu, (Slou čenina 10)„ který byl použit v následujícím stupni bez jakéhokoliv dalšího čištění.

Stupeň IX)

Příprava (3beta,5alfe , 20S)-4,4,2O-trimethyl-2l-fenylpregna-8, 14-dien-3,21-diol-3-benzoátu

Sloučenina 11)

Ku 13,0 ml, 1M roztoku fenylm8gnesiumbromidu, v tetra• · • ·

- 31' hydrofuranu, byl přidán po kapkách roztok,.pískaný rozpuštěním 2,0 g, aldehydu, ( Sloučenina 10), získaného v rámci před cházejícího, výše popsaného Stupně VIII)J v 17,0 ml, vysušené ho tetrshydrof uranu,, a vzniklá reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 3,0 hodin·

Poté byl ku reakční směsi přidán nasycený vodný roztok: chloridu amonného,, a produkt byl extrahován do ethylacetátu. Spojené organické fáze byly promyty s vodou,, vysušeny se síranem sodným,, a za sníženého tlaku byl;/ zahuštěny..

Byly získány 3_}0 g, žádaného (3beta,5elfs,2OS)-4,4,2Otrimethy1-21-fenylpregna-8,1 4-dien-3 ,,21 -diol-3-benzoátuJ (Slou čemina 11), který byl použit v následujícím stupni bez jakého koliv dalšího čištění·

Stupeň X)

Příprava (3beta,5elfa,2OS)-4,4,2O-trimethyl-2l-fenylpregna8,14-dien-3,21-diol-3-benzoát-2l-( methyl ethandionátu )

Sloučenina 12)

Ku ledem vychlazenému roztoku, připravenému rozpuštěním 1,95 ml, methyloxalylchloridu,, ve 9,70 ml,, vysušeného dichlor methanu, byl přidán po kapkách roztok,, získaný rozpuštěním 3,0 g,. alkoholu,. ( Sloučenina 11), získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně IX), ve 26,70 ml, vysušeného dichlormethanu, a 5,20 ml,_: vysušeného pyridinu,, a vzniklá reakční směs byla míchána při teplotě místnosti,, po dobu t,0'^! hodiny·

Po přidání vody ku směsi, byl produkt extrahován do ethylacetátu,, a spojené organické fáze byly promyty s 4ΕΓ roztokem kyseliny chlorovodíkové a s vodou, vysušeny sé sí- 32 rsnem sodným_ř a za sníženého tlaku byly zahuštěny.

Bylo získáno 3j>58 g, žádaného (3beta,5alfa,2OS)-4,4,trimethy1-21 -fenylpregna-8,14-dien-3,-2l -diol-3-benzoát-2l ( methyl ethandionátu), ( Sloučenina 12),. který byl použit v následujícím stupni,, bez jakéhokoliv d alšího čištění.

Stupeň XI)

Příprava (3bete,5alfs,203)-4,4,20-trimethy1-21-fenylpregna8,14-dien-3-ol-benzoátu

Sloučenina 13)

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním ethandionátuj(Sloučenina 12), získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně X)„ ve 150,0 ml, vysušeného toluenu, a zahřátému pod zpětným chladičem feu refluxu,, bylo přidáno 2,-50 ml, tributy 1stanniumhydridu, a poté ještě 35,0 mg; 2,2-aza-bis( isobutyro· nitrilu). Přidávání dalších dávek ( á 35,0 mg), 2,2-aza-bis( isobutyronitrilu), pokračovalo v 15niinutových intervalech,, dokud reakce nebyla dokončena ( 5,0 hodin).

Poté byla reakční směs ochlazena,, a po přidání vody byl produkt extrahován do dichlormethenu, Spojená organická fáze byly promyty s vodou,, vysušeny se síranem sodným, a poté byly za sníženého tlaku zahuštěny.

Zbytek byl zpracován pomocí sloupcové chromatografie.

Bylo získáno 0,84 g, žádaného (3beta,5alfa,20R)-4,4,20trime thy1-21-fenylpregna-8,T4-dien-3-ol-benzoátuJ ( Sloučenina 13).

Stupeň XII)

Příprava (3beta ,5alfa _r20E)-4,.4,20-trime thy 1-21 -f enylpregns8 ,.14-dien-3-olu

Sloučen; i m 8 1)

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 0,84 gj Sloučeniny 13), získané v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně XI), ve směsi, získané smícháním 8,40 ml, tetrahydrofuranuj 8,40 ml, methanolu,, a 0,45 ml_y vody, bylo přidáno 0,45 g, hy«i droxidu draselného,, a vzniklá reakční směs byla zahřívána za refluxu pod zpětným chladičem, přes noc.

Poté byla směs ochlazens,. a po přidání vod?/ byla vzniklá sraženina izolována filtrací. Zbytek byl promyt 3 vodou, a Vysušen, a dále zpracován sloupcovou chromátografií, a krystalizací,. ze směsi dichlormethan : aceton.

Bylo získáno 0,29 gj. žádaného (3beta,5alfa,2OR)-4,4,2Otrimethy1-21-fenylpregna-8,14-dien-3-olu;( Sloučenina 1). Teplota tání r. 179,0 - 186_r0°C

Získaný produkt obsahoval 30$, ( hmotnostní poměry)J (3beta,5alfa,20R)-4,4,20-trimethyl-21-fěnylpregns-6,8(14)dien-3-olu.

Příklad 2)

Příprava :

A) (3beta,5alfa,20R)-4,4,20-trimethyl-2l-(3-®ethylfenyl) pregna-8,14-dien-3-oluJ

- 34 a

Eb) (3beta,5alfa,20R)-4,4,20-trimethyl-21-/4-C’' trifluormethyl)fenyl/-pregna-8_r14-dien-3-olu

Analogickými reakčními postupy, popsanými výše v rámci Příkladu 7),. Stupně IX)_r až XII), byly za použití (3bete,5alfs, 20S )-3-(b.enzyloxy )-4,4-dimethylpregna-8,1 4-dien-20-karboxaldehydu_r ( Sloučenina 10), získaného v rámci výše popsaného Pří” kladu 1), Stupeň VIII), jako výchozího materiálu, připraveny násleéújící sloučeniny :

A·) (3be ta, 5elf a ,.20R) -4,4,20-trime thyl-21 - (3-me thylf envl )-pregna-8,.14-dien-3-ol*

Teplota tání :: 140,0 - 143,.5O°CJ

B-) (3beta , 5alfa , 20R)-4,4,20-trimethyl-21 -/4-(trifluormethyl)f enyl/-pregna-8,14-dien-3-ol*,

Teplota tání : 169,-0 - 171,.0°Cj

Příklad 3)

Přípravq (3beta,5alfa,20R)-4,4,20-trimethyl-21-fenvlpregna6,8(14)-dien-3-olu

Stupeň i)

- 35 Příprava (3beta , 5alfa, 20S)—21 -//(1 ,1 -dimethylethyl)-dimethylsilyl/oxy/-4,4,20-trimethylpregns-6,S(14 )-dien-3-ol-benzoátu

Do roztoku, připravenému rozpuštěním 25,0 g '_t (3be ta , 20S )21-//( 1 ,1 -dimethylethyl)-dimethylsilvl/oxy/-4,4,20-trimethylpregna-5,7-óien-3-ol-benzoátu, t.j. Sloučenina 8), získaného v rámci výše popsaného Příkladu 1), Stupeň VI), ve 40,0 ml, acetanhydridu_F ve 250,0 ml, chloroformu^ byl uváděn plynný chlorovodík, po dobu 30,0 minut.

Poté byla reakční směs zahřívána za refluxu pod zpětným chladičem po dobu 50,0 minut,, přičemž byl do směsi vháněn po dobu prvých 20,0 minut ještě další plynný chlorovodík. Po ochla zení směsi na teplotu 0°C, byl přidán 5 Žní vodný roztok hydroxidu amonného,, a reakční směs byla míchána po dobu 1,50 hodiny.

Poté byl produkt extrahován' do dichlormethanu, a spojené organické fáze byly promyty s nasyceným vodným roztokem hvdrogenuhličitanu sodného, a se solankou, a po vysušení se síranem sodným,, byly za sníženého tlaku zahuštěny.

Bylo získáno 24,60 g, žádaného, (3beta,5alfa,20S)-21-//(1, 1 -dime thylethyl )-dime thylsilyl/-oxy/-4,4y,2O-trime thylpregna6„8( 14)-dien-3-ol-benzoátu, který bvl jako takový použit v následujícím Stupni II).

Stupeň II)

Příprava (3b.ets,,5slfs,20S)-4,4,20-trimethylpregna-6,8(14)dien-3_r2l-diol-3-benzoátu

Roztok, připravený rozpuštěním 17,60 g, sloučeniny,, při pravené v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně I)_r ve 352,0 ml, acetonu,, byl smíchán se 3,52 mlj 6Bf vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové, a vzniklá reakční směs byla

míchána při teplotě 50,0°C, po dobu 3,0 hodin.

Poté byla směs za sníženého tlaku zahuštěna,, a zbytek byl nalit do vody, a produkt byl extrahován s ethylacetátem. Spojené organické fáze byly promyty s vodou, a po vysušení se síranem sodným,, byly za sníženého tlaku zahuštěny. Zbytek byl zpracován sloupcovou chromatografií.

Bylo získáno 7,69 g, žádaného (3beta,5alfs,20S)-4,4,2Qtrimethylpregna-6,8(14 )-dien-3,21-3-benzoátu.

Stupeň III)

Příprava (3beta,5alfa, 20R )-4,4,20-trime thy 1-21-feny lpregna6 ,.8 (14 )-dien-3-olu

Analogickými postupy, popsanými výše v rámci předcházejícího Příkladu 1), Stupně VIII) až XII),. byl produkt, získaný v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně II), konvertován na žádaný (3beta,5slfs_r30R)-4,4,20-trimethyl-2l-fenylpregns 6 ,.8( 14)-dien-3-ol.

Teplota tání :: 218,0 - 220,0°C*,

Příklad; 4)

Příprava (3beta,5alf a„20S)-4 ,4,20-trimethvl-21 -(3-methyIfenyl) pregna-8 ,.14-dien-3,21 -diolu • » 4 ·

4 ·

- 37 Stupeň I)

Příprava (3be ta, 5slf a, 20S)-4,4,20-trime thy 1-21 - (3-me thy lfeny 1) pregna-8,14-dien-3 ,.21 -diol-3-benzoátu

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 1), Stupeň IX),. bylo konvertováno 0,50 g, (3beta,5alfa,2QS)-3(benzpyloxy )-4,.4-dimethylpregna-8,14-dien-2O-karboxaldeh.ydu_r ( Sloučenina 10), získaného v rámci výše popsaného Příkladu 1) Stupeň Vili.), na Žádaný (3beta ,.5alfa ,.20S)-4,4 ,.20-trimethyl-2l (3-methylfenyl)-pregna-8,14-dien-3,21-diol-3-benzoát_r kterého bylo získáno 0,31 g.

Stupeň HL)

Příprava (3beta,5alfa,20S)-4,4,20-trimethy1-21-(3-methylfenyl) pregna-8,14-dien-3,21-diolu

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 1), Stupeň XII), bylo konvertováno 0,31 g, produktu, získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně I), na žádaný (3be ta, 5 alf a, 20S )-4,4 _ř20-trime thy 1-21 - (3-me thylfenyl)-pregna8, l4-dien-3,-21-diol* kterého bylo získáno 53,0 mg.

Teplota tání :: 169,0 - 173,.O°e*

Příklad 5>)

- 38 Příprava (3beta ,.5alfa , 20P)-4,4-dimethyl-23-( 2-methylfenyl124-norchola-8,14-dien-3-olu

Stupeň I)

Příprava (3beta,5slfa,20S)-4,4,20-trimethy1-21 -//(4-methylfenyl )-aulf ony l/oxy/-pregna-8, l4-dien-3-ol-benzoátu

Ku ledem vychlazenému roztoku, připraveného rozpuštěním 10,0 gj (3beta,5alfa,2OS)-4,-4,2O-trimethylpregna-8,.14-dien-3,

21-diol-3-benzoátuJ ( Sloučenina 9), připravená postupem popsaným výše v rámci Příkladu 1), Stupeň VII)* ve 40,0 ml, vysušeného pyridinu, bylo přidáno 20,0 g, anhvdridu kyseliny p-toluensulfonové, 8 vzniklá reakční směs byla míchána při teplotě místnosti přes noc.

Poté byla směs nelita do 400,0 ml, vody, a poté co byla . míchána po dobu 1,0 hodiny, tyla -výsledná sraženina izolována filtrací, a poté byla promyta s vodou, a následně byla při teplotě 50,0°C, za sníženého tlaku, vysušena.

Bylo získáno 14,10 g, žádaného (3beta,5alfa,20S)-4,4,20trime thy 1-21 -//(4-me thy lfenyl)-sulf ony l/oxy/-pregne-8,14-dienbenzoátu,. který byl použit v následujícím Stupni II), bez jakéhokoliv dalšího Čištění.

Stupeň II)

Příprava (3beta,5aIfs,.2QR)-3-( benzoyloxv)-4,4_ř20-trimethy1 pregna-8,14-dien-2l-karbonitrilu ··· · · · ···· • · · · ·*·· • ·

Ku suspenzi, připravené smícháním 9,.12 gj tosylátu, získaného v rámci předcházejícího,, výše popsaného Stupně I)J ve 31 ,.0 ml, vysušeného dimethylsulfoxidu, a zahřáté na teplotu 50,0°C, bylo přidáno 3,86 g,. kyanidu draselného,., a vzniklá reakční směs byla míchána po dobu 6,0 hodin. Poté bylo ku směsi přidáno dalších 31 ,0 ml, vysušeného dimethylsulf oxidu,, a tato reakční směs byla míchána po dobu dalších 10,0 hodin.

Po ochlazení,, byla směs nalita do 600,0 ml,, směsi ledu a vody, a vzniklá sraženina byla izolována filtrací, 8 promyta s vodou, a následně byla za sníženého tlaku, při teplotě 50,0°C, vysušena.

Bylo získáno 6,45 gj žádaného (3beta,5alfa,2OF)-3-(bento,yl oxy)-4,4,20-trimethylpregna-8,l4-dien-2l-kerbonitrilu, který byl použit v následujícím Stupni III), bez jakéhokoliv dalšího čištění.

Stupeň: III)

Příprava (3beta,5alfa,2Ofi)-3-hydroxy-4,4,20-trimethylpregne8,,14-dien-2l -karboxaldehydu

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 6,40 g, nitrilu,. získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně II), ve 64,0 ml, vysušeného toluenu, bylo přidáno 64,0 ml, 20%ního roztoku diisobut.ylaluminium-hydridu, v toluenu, a vzniklá reakční směs byla míchána při teplotě místnosti přes noc.

Poté byla reakce přidáním 71,0 ml,, 4M vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové zastavena, a po následné filtraci, byl produkt extrahován do ethylacetátu. Spojené organické fáze bvly promyty s vodou,, a po vysušení se síranem sodným byl§ za sníženého tlaku zahuštěny.

···· · ·· ···· · · · · ··· · · · · · · ·

- 40 Bylo získáno 4,59 gj Žádaného (3beta,5slfs,20R)-3-hydroxy-4,4,.20-trimethylpregna-8,14-dien-2l-kerboxaldehydu, který byl použit v následujícím Stupni IV), bez jakéhokoliv dalšího čištění.

Stupeň: IV)

Příprava (3beta , 5alfa, 20R)-3-/(1 -ethoxyethyl)i-oxy/-4,4,20-trimethylpregna-8,14-dien-2l-karboxaldehydu

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 4,59 g, aldehydu, získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně III), ve 28,0 ml, vysušeného dichlormethanu,. a 9,10 ml, ethvlvinyletheru,, bylo přidáno 0,29 g,· pyridinium-p-toluensulfonátu, a poté, co byle vzniklá reakční směs míchána po dobu 1,0 hodiny, byl k ní přidán 1,0 ml, pyridinu.

Reakční směs byla poté promyta s vodou, a po vysušení se síranem sodným, byla za sníženého tlaku zahuštěna.

Bylo získáno 5,64 g, žádaného (3beta,5alfa,20R)-3-/Oe thoxyethyl)-oxy/-4,-4,20-trimethylpregna-8,14-Sien- 21 -karboxaldehydu, který byl použit v následujícím Stupni V),, bez jakéhokoliv dalšího čištění.

Stupeň V)

Příprava (3be ta ,.5a lf a , 20R)-3-/(1-e thoxye thyl) -oxy/-4, 4-dime thv 1 23-(2-methylfenyl)-24-norchola-8,1 4-dien-23-olu

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 1), Stupeň IX), byl konvertován 1,0 g, ksrboxaldehydu,. získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně IV), ns žádaný, (3beta,5alfa , 2OR)-3-/( 1 -ethoxyethyl )-oxy/-4 ,,4-dimethyl-23-(2methylfenyl)-24-norchola-8,14-dien-23-olJ. kterého bylo získáno 1,63 g»

Stupeň VI)

Příprava (3beta,5a lfa,20R)-3-/(1-ethoxyethyl)-oxy/-4,4-dimethy 123-(2-me thylřeny1)-24-norehola-8,14-dien-23-ol-me thyl-ethandi oátu

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 1^!)_ř Stupeň X),. byl konvertován 1,,60 g, alkoholu, získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně V), na žádaný (3beta, 5alfa,20R)-3.-/(1-ethoxyethyl)-oxy/-4,4-dimethyl-23-(2-methylfeny1)-24-norchola-8„14-dien-23-ol-methyl-ethandioát, kterého bylo získáno 2,.11 g*

Stupeň VII)

Příprava (3be ta, 5alfá ,-20S )-3-/( 1 -e thoxyethyl )>oxy/-4,4-dimethyl23-(2-methylfenyl)-24-norchola-8,14-dienu

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 1)„ Stupeň XI)_r byl konvertován 2,11 g, methyl ethandioátu, získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně VI), na žádaný (3be ta, 5alf a ,..20R )-3-/ (1 -e thoxye thyl) -oxy/-4,4-dime thyl23-(2-methylfenyl)-24-norchola-8,14-dien, kterého bylo získáno 3,64 g··

Stupeň VIII)

Příprava (3bets,5alfs,20R)-4,4-dimethyl-23-(2-methylfenyl)-24norchola-8,,14-dien-3-olu

Roztok, připravený rozpuštěním. 3,64 g, sloučeniny, získané v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně VII), ve 20,0 ml,, acetonu, bylj smíchán se 2,0 ml, 4M vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové, a vzniklá reakční směs byla míchána po dobu 1,0 hodiny.

Poté byla směs nalita do vody, a produkt byl extrahován do ethylacetátu, Spojené organické fáze byly promyty s vodou, a po vysušení se síranem sodným, bylg za sníženého tlalu zahuštěny.

Krystalizací zbytku ze směsi dichlormethan : aceton, bylo získáno 0,40 g, žádaného (3beta,5alfa,20R)-4,4-dimethyl-23-(2methylfenyl)-24-norchola-8,14-dien.3-olu.

Teplota tání :: 184,0 - 186,O°CJ

Příklad 6)

Příprava

A ) (3be ta , 5alfa ,.20R) -4,4-dime thyl-23-(3-me thylfenyl)-24-norchols8,14-dien-3-olu, a

3) (3be ta,5alfa,20R)-4,4-dime thy1-23-/2-(trifluorme thyl)-feny 1/24-norchola-S,14-dien-olu

Analogickými postupy, popsanými výše v rámci Příkladu 5) Stupně V); s VII), bylo za použití (3beta,5slfa,2OR)-3-/(1 e thoxyethyl)-oxy/-4,4,20-trimethylpregna-8,14-dien-2l-karboxalóehydu, získanému v rámci Příkladu 5), Stupeň IV),, jako výchozího materiálu, byl§ připraveny následující sloučeniny

A) (3beta,5slffa,20R)-4,4-dimethy1-23-(3-methylfenyl)-24-norchola-8,14-dien-3-ol

Teplota tání : 159,0 - 161,0°CJ

B) (3beta,5alfs,2OR)-4,4-dimethyl-23-/2-( trifluormethyl)-fenyl/ 24-norchola-8,14-dien-3-ol

Teplota tni: 130,0 - 147,O°CJ

Produkt obsahoval 45%, (3beta,5alfa,20R)-4,4-dimethyl-23/2-(trifluormethyl)-fenyl/-24-norchola-6,8(14)-dien-3-olu;

Příklad 7)

Příprava směsi (3beta,5slfa,20R)-4,.4-dimethyl-23-fenyl-24-norchola-8,.1 4-diem-3-olu, a

(3beta , 5alfa ,,20R)-3-hydroxy-4,4-dime thyl-23-fenyl-24-norcholaS, 1 4-dien-23-onu

Stupeň I) ♦ ♦ ♦ · » · · · · · • · » ·

- 44 Pří prs ve směsi (3beta,5alfa,2QS)-4,4,20-trimeth.ylpregna-8,14di en-3 ,,21-Μθ1“2ΐ-a ce t át-3rt>en3 o-átu,, a (3beta ,,5alfa _ř2QS)-4,4,2Q-trimethylpregna-6 _r8 (14 )-dien-3,21--<ii ol-21 acetát-3-benzoátu, (6 :: 1 )

Směs, připravená smícháním 46,.50 g, (3beta,20S)-21-//(1 ,1dime thy le thy1)-dime thylsilyl/-oxy/-4,4 ,.20-trime thylpregna-5 _ř7dien-3.-ol-benzoátuJ. ( Sloučenina 8), získaného v rámci výše popsaného Příkladu 1), Stupeň VI), a 400,0 ml„ chloroformu,, a 400,0 ml.;, 1M roztoku chlorovodíku v kyselině octové, byla míchána při teplotě místnosti po dobu 45,0 minut,, a poté byla ještě zahřívána za refluxu pod zpětným chladičem po dobu dalších 45 minut»

Poté, co byla stejným způsobem, popsaným výše, zpracována další dávka 46,.50 g, výše zmíněného dienu, byly reakční směsi z obou operací ochlazeny, spojeny, a za sníženého tlaku byly, za účelem odstranění chloroformu,, zahuštěny. Vzniklý zbytek byl nalit do roztoku, připraveného rozpuštěním 150,0 g, hydroxidu sodného_r ve 2,50 litrech vody.

Výsledná sraženina byla izolována filtrací, promyta s vodou,, a vysušena» Surový produkt byl překry stalizován z acetonu.

Bylo získáno 51,,40 g,, směsi, sestávající ze (3beta,5alfa,

20S)-4,4 ,,20-trime thylpregna-8,14-dien-3,21 -diol-21-scetát-3benzoátu, a (3be ta ,.5alf a, 203)-4,4 ,,20-trime thy lpregne-6,8( 14 )dien-3„21-diol-2l-ecetát-3-benzoátu;, v poměru 6 : 1,0.

Tato směs byla použita jako taková v následujícím Stupni.

Stupeň; II)

Příprava (3beta,5alfa,2QS)-4,4,20-trimethylpregnB-8,14-dien3,21-diol-3-benzoátu • *r« · * * · 0· • · · · ·

-45—

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním-62,0 gj produktu, získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně I),. ve 400,0 ml, tetrahydrofuranu; 250,0 ml, methanoluj, a 100,OD ml,, vody, bylo přidáno 13,50 g„ hydroxidu draselného, a vzniklá reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 1„0 hodiny, a poté byla nalite do 10,0 litrů vody.

Vzniklá sraženina byla izolována filtrscí, a po promytí s vodou, byla vysušena.

Bylo získáno 58,0 g, žádaného (3beta,5alfa,2OS)-4,4,2OtrimethylpregHB-8,14-dien-3,21 -diol-3-benzoátu, který byl použit v následujícím: Stupni III); bez jakéhokoliv dalšího čištění.

Stupeň III)

Příprava (3bets,,5alfa,2QE)-3-hydroxy-4,4,20-trimethylpregna-8, 14-dien-2l-karboxaldehydu

Analogickými postupy,, popsanými výše v rámci Příkladu 5), Stupně I) až III), byl alkohol, získaný v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně II), konvertován na žádaný (3heta, alfa, 20E)-3-hydroxy-4,4,2G&-trimethylpregns-8,14-dien-2l-karboxaldehyd.

Stupeň IW) o

Příprava (3heta,5alfa,20H)-3-(benzýíoxy)-4,4,2Q-trimethylpreg· na-8,14-ďien-21-karboxaldehydu ··-· · *9 ···< «» ·» • · · «« · « # « « • · · ♦ · · « • · · · · *«·'»« ·» A.£ · · < · · · · · * « «

W 9« · · » · 4 «< » · «9

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 12,3 g, aldehydu, získaného v rámci předcházejícího,, výše popsaného Stupně III); ve 150,0 ml., vysušeného pyridinu, vychlazenému na teplotu 4,0°C, bylo přidáno během 5,0 minut; 8,0 ml benzoylchloridu, a vaniklár; reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu

1,50 hodiny» Poté byla směs nalita do 2,0 litrů vody, a výsledná směs byla míchána přes noc.

Vzniklý produkt byl extrahován do dichlormethanu, a spojené organické fáze byly za sníženého tlaku zahuštěny»

Bylo získáno 16,10 g; žádaného (3beta,5alf8,20R)-3v(benzoyloxy )-4,4,20-trime thylpregna-8,l4-dien-2l-karboxaldehydu, který byl použit v následujícím Stupni V), bez jakéhokoliv dalšího čištění»

Stupeň, V)

Příprava směsi (3beta,5alfa,20R)-4,4-dimethyl-23-fenyl-24-norchoIa-8,,14-dien-3 ,23-diol-3-benzoátu,.

a (3beta ,5a lf a „20R, 23S)-4 ,4-dime thyl-23-fenyl-24-norchola-8,14dien-3,23-diol-3-benzoátu

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 1), Stupeň IX), bylo konvertováno 15,0 g, aldehydu, získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně IV), na směs 23Ha 23S-fenylkarbinolů, které mohly být odděleny slupcovou chromstogrsfií, a tak bylo získáno 2,15 g, (3beta,5alfa,20R,23R)4,4-dime thy l-23-fenyl-24-norchola-8,14-dien-3,23r’diol-3-benzoátu; a 2,95 g, (3beta,5alfa,2OR,23S)-4,4-dimethyl-23-fenyl-24norchol8-8,14-dien-3,23-áiol-3-benzoátu.

Stupeň VH)

Příprava (3beta ,.5alfa, 20R)-4,4-dimethyl-23-fenyl-24-norchol88,14-dien-3-ol-benzoátu, a

(3be ta, 5alf a, 2OR)-3- (benzoýloxy )-4,4-dime thyl-23-f enyl-24-norchola-8„14-dien-23-onu

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 1,95 gj (3beta,5alfa, 2QS„23B)-4 „4-ůime tftyl-23-fenyl-24-norchole-8*14-dien-3,23-diol3-benzoátu* ve 150,0 ml,, ethanolu* bylo přidáno 100,0 g, suspenze Raneyova niklu ve vodě* a vzniklá reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 96,,0 hodiny 8 poté byl Raneyův nikl odstraněn filtrací.

V jiné operaci bylo stejným způsobem, popsaným výše, zpracováno 1,30 g„ (3beta,5slfa,20R,23S)-4,4-dimethyl-23-fenyl-24norchola-8,14-dien-3,23-diol-3-benzoátu,. a získané filtráty z obou operací byly spojeny* a za sníženého tlaku byly zahuštěny, a vzniklý surový produkt byl přečištěn chromatografií.

Byl získán 1,0 g· (3beta,5elfa,2OR)-4,4-dimethyl-23-fenyl24-norchola-8,14-dien-3-ol-benzoátu* a 0,40 g* (3bete,5alfa, 20R)-3-(benzoyloxy)-4,4-dime thy l-23-fenyl-24-norchola-8_r1'4-dien 23-onu.

Stupeň VII-A)

Příprava (3beta, 5elfa, 20R)-4,4-dimethyl-23-fenyl-24-norchole8,14-dien-3-olu

Analogickým postupem* popsaným výše v rámci Příkladu 1), Stupeň IV)„ bylo konvertováno 1,20 g; (3beta,5slfa,20R)-4*4- 48 dimethyl-23-fenyl-24-norchola-8,14-dien-3-ol-benzoátu; na 3hydroxy-sloučeninu, ze které bylo po krystalizací získáno 0,65 gJ (3be ta, 5alfa ,,20R)-4,4-dimethy 1-23-fenyl-24-norchola-8,14dien-3-olu.

Teplcta tání : 164,,3 - 165,7O°CJ

Stupeň VII-B)

Příprava (3beta,5alfa,20R)-3-hydroxy-4,4-dimethy1-23-feny1-24norchola-8„14-dien-23-onu

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 0,70 g, (3beta,5alfe, 20R)-3-(benzoyloxy)-4,4-dime thy 1-23-f eny l-24-norchola-8,¹4-dien 23-onuJ v lQ>0 ml, tatrahydrofuranu, 10,0 ml, methanolu, 1,0 ml dichlormethanu, a 1,0 ml, vody, bylo přidáno 0,40 g, hydroxidu sodného, a vzniklá reakční směs byla zahřívána za refluxu pod zpětným chladičem po dobu 6,0 hodin.

Poté byla směs ochlazena, a neutralizována přidáním 1,0 ml kyseliny octové. Produkt byl extrahován do dichlormethanu* a spojené organické fáze byly za sníženého tlaku zahuštěny, a získaný surový produkt byl krystalizován z ethanolu.

Bylo získáno 0,30 g, (3beta,5alfa,20R)-3-hydroxy-4,4-dimethy1-23-fenyl-24-norchola-8,14-dien-23-onu.

Teplota tání : 196,40 - 197,20°C;

Příklad 8) • · · · • ·

Příprava (3beta,5alfa,20R,23R)-4,4-dimethyl-23-fenyl-24-norchola-8,14-dien-3,23-diolu

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 1);, Stupeň IV.·), bylo konvertováno 0,75 g, (3beta,5alfa,20R,23R)4,4-dime thy1-23-feny1-24-norehola-8,14-dien-3,23-diol-3-benzoátu, ( získaného v rámci výše popsaného, předcházejícího Příkladu 7), Stupeň V)_r na 3-hydroxy-sloučeninu_ř ze které bylo po krystalizaci z ethanolu, získáno 0,28 g, (3beta,5alfa,2OR,23R) -4,4-dime thy1-23-fenyl-24-norchola-8,14-dien-3,23-diolu.

Teplota tání : 199,20 - 200,70°C;

Teplota tání :

Příklad 9) •Příprava (3beta,5alfa,20R,23S)-4„4-dimethy 1-23-fenyl-24-norchole-8,14-dien-3,23-diolu

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 1), Stupeň IV), bylo konvertováno 0,75 g, (3beta,5alfa,2OR,23S)-4,

4-dimethyl-23-fenyl-24-norchol8-8,14-dien-3,23-diol-3-benzoátu, ( získaného v rámci výše popsaného Příkladu 7), Stupeň V)J na 3-hydroxy-slouSeninu„ ze které bylo po krystalizaci z ethanolu získáno 0,13 g; (3beta,5alfa,20R,23S)-4,4-dimethyl-23-feny1-24norchola-8,14-dien-3,23-diolu.

208,0 - 2O9,3O°e;

- 5Ό Příklad 10)

Příprava (3be ta,5alfa,.20R,22E) -4,4-dimethy1-23-fenyl-24-norchola-8,14,22-trien-3-olu

Stupeň I)

Příprava (3beta,5alfa,20R,22E)-4,4-dimethy1-23-feny1-24-norchola-8,14,22-trien-3-ol-benzoátu

Ku suspenzi, připravené smícháním 4,-22 g;, benzylfenylfosfoniumchloridu, se 30,0 ml, vysušeného toluenu,, bylo přidáno 1,12 g, t-butoxidu draselného, a vzniklá směs byla zahřívána při teplotě 70,0°C*, po dobu 45,0 minut.

Poté byl. ku výše zmíněné aměai/přidán 1,0 g, (3beta,5alfa, 20S )-3.-( benzoyloxy )-4_r4-dimethylpregna-8„14-dien-20>karboxaldehydu;( Sloučenina 10), získaná v rámci výše popsaného Příkladu 1), Stupeň VIII), a reakční směs byla dále zahřívána ještě po dobu 1,0 hodiny. Po ochlazení, byla směs nalita do vody, a produkt byl extrahován~do ethyláce tátu. Spojené organické fáze byly promyty s vodou,, vysušeny se sírahem sodným, a za sníženého tlaku byly zahuštěny.

Po následné sloupcové chromátografii bylo získáno 0,70 g_y žádaného (3beta„5alfa,20R,22E)-4,4-dime thyl-23~fenyl-24-norchola^

8,14,22-trien-3-ol-benzoátu.

Stupeň II)

Příprava (3beta,,5alfa,20R,22E)-4,4-dimethyl-23-feny1-24-norchola-8,14,2 2-trien--3-olu e · ·

Analogickým postupem,, popsaným výše v rámci Příkladu t), Stupeň XIZ), bylo konvertováno 0,70 g„ produktu, získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně I), na žádaný (3be ta,5alfa, 20R, 22E )-4 „4-dime thy l-23-fěnyl-24-norchola-8,14,

22-trien-3-ol, kterého bylo získáno 0,23 g.

Teplota tání :. 131,.0- 144„0°CJ

Získaný produkt obsahovel 30%, (3beta,5alfa,20R,22E)-4,4-dimethyl-23-f enyl-24-norchola-6,8 (14), 22-trien-3-olu.

Příklad 11)

Příprava (3beta „5alfa ,,2QR, 22E )-4,,4-dimethyl-24-fenylchola-8,.14,

23-trien-3-oI.u

Stupeň I)

Příprava (3beta,,5alfs,20R_r23E)-3-/(1 -ethoxyethyl)-oxy/-4_r4-dimethyl-24-fenylchola-8,14,23-trienu

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 10), Stupeň I), bylo konvertováno 0,500 g, (3beta,5alfs,2QR)-3-/(1ethoxyethyl )-oxy/-4,4 ,20-trime thylpregns-8,14-dien-21 -karboxaldehydu, ( získaného v rámci výše popsaného- Příkladu 5),· Stupeň IW), na žádaný (3beta,5alfa,2QR,,23E)-3-/(1-ethoxyethyl)oxy/

4,4-dimethyl-24-fenylchola-8„14,23-trienu, kterého bylo získáno 0,86 g.

• · · · • ·

• · · · · · ···· • · · · » ·· ·· ·· ··

- 52 Stupeň II)

Příprava (3beta ,5elfa, 20E, 22E)-4,.4-dimethyl-24-fenylchola-8,

14,23-trien-3-olu

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 5); Stupeň Vlil) bylo konvertováno 0,24 g, produktu, získaného v rámci předcházejícího,, výše popsaného Stupně I), na hydroxysloučeninu, ze které bylo po následné sloupcové chromatografii, připraveno 0,139 g, Žádaného (3beta,5alfa,20R„22E)-4,4dimethyl-24-fenylchola-8,14,23-trien-3-olu.

Teplota tání : 126,,80 - 127„4O°C;

Získaná sloučenina obsahovala 30%; (3beta,5alfa,20R,23Z)-4,4dimethyl-24-fenylchola-S,14,23-trien-3-olu.

Příklad 12)

Příprava (3beta ,5alfa , 20S)-4,4-dimethy1-23-feny1-24-norchola

8,14-dien-22-yn-3-olu

Stupeň I)

Příprava (3beta,5slfa,20S)-3-(benzoyloxy)-4,4-dimethylpregna8,14-dien-20-karbox8ldehydu

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 12,60 gj (3beta, • *

- 52 5alfe,20S )-4,4,20-trimethylpregna-8,14-dien-3,21-diol-3-benzoátu,, ( získaného v rámci výše popsaného Příkladu 7), Stupeň

II), ve 130,0 ml, vysušeného dichlormethanu* bylo přidáno

8,79 g, p.yridinium-chlorchromátu, a vzniklá reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 1,50 hodiny.

Poté bylo ku směsi přidána další dávka (1,50 g), pyridinium-chlorchromátu, 8 reakční směs byla míchána po dobu další

1,50 hodiny. Poté byla směs zfiltrována, a filtrát byl nalit do nasyceného vodného roztoku hvdrogenuhličitanu sodného. Produkt byl extrahován do dichlormethanu, a spojené organické fáze byly promyty s vodou, vysušeny se síranem hořečnatým,. a za sníženého tlaku byly zahuštěny.

Bylo získáno 10,30 g; žádaného (3beta,5alfa,2OS)-3-(benzoyloxy)-4,4,-dimethvlpregna-8,14-dien-20-karbox8ldehydu, který byl použit v následujícím Stupni II), bez jakéhokoliv dalšího čištění,

Stu p-e ň II)

Příprava (3beta,5alfa,20S)-23-chlor-4,4-dimethyl-24-norchola8,14,22-trien-3-ol-benzoátu

Ku suspenzi, připravené smíchání® 17,50 g, (chlořmethy1)trifenylfosfohiumchloridu, se 140,0 ml, vysušeného tetrahydrofuranu,. a vychlazené na teplotu 0°C, bylo přidáno 4,64 g; t-butoxidu sodného, a vzniklá reakční směs byla míchána po dobu 20,0 minut.

Poté byl ku reakční směsi přidán roztok, získaný rozpuštěním 10,30 g, aldehydu, připraveného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně I), ve 80,0 ml,, vysušeného tetrahydrofuranu, a tato reakční směs byla míchána při teplotě 0°C, po dobu 30,0 minut, a poté ještě při teplotě místnosti další 2,0

- 54; hodiny. Po následném přidání ethylacetátu, byla směs, za účelem odstraněni tetrahydrofuranu, zahuštěna, a poté promyta s vodou, a se směsí, nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného, a solanky.

Oddělená organická ^áze byla vysušena se síranem hořečnetým, a za sníženého,tlaku byla zahuštěna. Po následné chromatografii bylo získáno 7,01 g, žádaného (3beta,5alfa,20S)-23chlor-4,4-dimethyl-24-norchola-6,14,22-trien-3-ol-benzoátu.

Stupeň III)

Příprava (3beta,5slfa,20S)-23-chlor-4,4-dimethy1-24-norchola8,14,22-trien-3-olu

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 1 )’, Stupeň IV),, bylo konvertováno 7,01 g, produktu, získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně II), na žádaný (3beta,5alfa,20S)-23-chlor-4,4-dimethyl-24-norchola-8,14,22trien-3-ol, kterého bylo takto připraveno 6,28 g.

Stupeň IV)

Příprava (3beta,5alfa,.20S)-23-chlor-3-/( 1 -ethoxyethyl)-oxy/4,4-dime thyl-24-norchola-8,14,22-trienu

Analogickým postupem,, popsaným výše v rámci Příkladu 5),, Stupeň IV), bylo konvertováno 6,28 g, produktu, získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně III), na žádaný (3be ta,5 alfa,20S)-23-chlor-3-/(1-e thoxye thy1)-oxy/-4,4-dime-

- 55 thyl-24-norchola-8,14,22-trienj kterého bylo takto připravé no 6,98 g

Stupeň V)

Příprava (3be ta, 5alf a,2QS)-3-/(1-ethoxyethyl)-oxy-/-4,4-dimethyl-24-norchola-8,14-dien-22-ynu

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 6,98 g, produktu, získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně IV); ve 75,0 ml„ vysušeného tetrahydrof uranu* 8 vychlazeného na teplotu minus 20,0°C, bylo přidáno během 20 minut, 28,50 ml,

1,6M roztoku n-butyllithia v hexanech, a vzniklá reakční směs byla míchána při teplotě minus 20,0°C, po dobu 15 minut, 8 poté ještě při teplotě 0°C, po dobu 3,50 hodiny.

Po přidání vody ku reakční směsi, byl produkt extrahován do ethylacetátu, s spojené organické fáze byly promyty se solankou, a po vysušení se síranem hořečnatým, byly za sníženého tlaku zahuštěny, a zbytek byl zpracován sloupcovou chromátografií.

Bylo získáno 4,34 g‘, žádaného (3beta,5alfa,2OS)-3-/(1 e thoxye thyl )-oxy/-4,4-dime thy l-24-norchola-8,14-dien-22-ynu.

Stupeň VI)

Příprava (3beta,5alfa,20S)-3-/(1-ethoxyethyl)-oxy/-4,4-dime thyl-23-fenyl-24-norchola-8,14-dien-22-ynu

Směs, připravená smícháním 0,50 g, produktu, získaného

v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně V), a dále 0,16 ml, jodbenzenu; 16,0 mg, palladium(II)acetátu; 62,0 mg, trifenylfosfinu, a 18,0 mg, jodidu mědného,. v 7,0 ml, pyrrolidinu, byla odplyněna, a poté byla zahřívána za refluxu pod zpětným chladičem po dobu 3,0 hodin»

Poté byla reakční směs nalita do nasyceného vodného roz toku chloridu amonného,, a produkt byl extrahován do ethylacetátu.. Spojené organické fáze byly promyty s nasyceným vodným roztokem chloridu amohného a se solankou, a vysušeny se síranem hořečnatým·. Další zpracování bylo proveden se sloupcovou chromátografií.

Bylo získáno 0,62 g, žádaného (3bet8,5alfa,20S)-3-/(1ethoxyethyl)-oxy/-4,4-dimethyl-23-fenyl-24-noechola-8,14-dien

22-ynu»

Stupeň VII)

Příprava (3faeta,5alfa,.20S')-4,4-dimethyl-23-fenyl-24-norchola8,14-dien-22-yn-3-olu

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 5); Stupeň VIII) bylo konvertováno 0,61 g, produktu, získaného v rámci předcházejícího,, výše popsaného Stupně VI), na 3-hydroxy-sloučeninu,. ze které bylo po zpracování sloupcovou chromatografií získáno 0,25 g, žádaného (3beta,5alfa,2OS)-4,4-dimethyl-23-fenyl-24-norchola-8,14-dien-22-yn-olu.

Teplota tání : 136,0°CJ

Sloučenina obsahovala 20%; (3beta,5alfa,2OS)-4,4-dimethyl-23 fenyl-24-norchola-6,8(14)-dien-22-yn-3-olu.

- 57 Přiklaď 13)

Příprava A )-(3beta,5alfa,2QS)-23-(4-methoxyfenyl)-4,4-dimethyl-24-norchola-8,14-dien-22-3-olu_r 8

B.) - (3be ta, 5slf a, 2 OS )-23- (4-chlorf eny 1) -4,4-dime thyl-24-norchola-8,.14-dien-22-yn-2—olu

Analogickými postupy, popsanými výše v rámci Příkladu 12) Stupně VI), 8 VII),. byly ze (3beta,5alfa_r2QS)-3-/(1-ethoxyethyl)-oxy/-4,4-dimethy1-24-norchola-8,14-dien-22-ynu, (získaného v rámci výše popsaného Příkladu 12), Stupeň V), jako výchozího materiálu, připraveny následující sloučeniny::

A') (3beta , 5alfa , 2QS )-23-(4-methoxyfenyl)-4,4-dimethyl-24-norchola-S,14-dien-22-yn-3-oi;

Teplota tání 165_r5Q-°GJ

Produkt obsahoval 30¾ (3beta,5alfa,20S)-23-(4-methoxyfenyl)

4.4- dime thy 1-24-norchola-6 ,,8(14)-dien-22-yn-3-olu a

H) (3beta,5alfa,2QS)-23-(4-chlorfenyl)-4,4-dimethy1-24-norchola-8,_;l4-dien-22-yn-3-olu;

Produkt obsahoval 25%; (3beta ,5alfa ,2OS)-23-(4-chlorfenyl)4.4- dimethyl-24-norchole-6,8(14)-dien-22-yn-3-o!uJ

Příklad 14) • · · · · 4

Příprava (3beta, 5alfa , 20R)-4,4-dimethy1-24-fenylchola-8 ,J4dien-23-yn-3-olu

- 58 S t u p e ň I) ^říprava (3beta,5alfa,20R)-3-/(1-ethoxyethyl)-oxy/-4,4-dimethylchola-8,14-dien-23-ynu

Analogickými postupy, popsanými výše v rámci Příkladu 12); Stupeň II); a V); byl konvertován (3beta,5alfa,20R)-3-/(£-ethoxyethyl)-oxy/-4,4_r20*trimethylpregna-8,14-dien-2l-karboxaldehyd,( získaný v rámci výše popsaného Příkladu 5), Stupeň IV), na žádaný (3beta,5alfa,20R)-3-/(1-ethoxyethyl)-oxy/-4,4-dimethylchola-8,14-dien-23-yn;

Stupeň II)

Příprava (3béta, 5alfa,2OR)-4,4-dimethyl-24-fenylchola-8,14dien-23-yn-3-olu

Analogickými postupy, popsanými výše v rámci ^ťříkladu 12); Stupeň VI); a VII);. byl konvertován alkyn, získaný v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně I), na žádaný (3beta, 5alfa, 20R.)-4,4-dimethyl-24-fenylchola-8,.14-dien-23-yn-3-ol. Teplota tání :: 84,80 - 85,,7Q?C;

Produkt obsahoval 15%J (3beta,5alfa,20R)-4,4-dimethyl-24fenylchcrle-6 ,S( 14 )-dien-23-yn-3-oluJ ···· · · · ···· ·· • · · ·· · ··· « · · · * « « # •· ··· ·· ··

- 59 Příklad 15)

Příprava A)-(3beta, 5alfa ,,20E)-24-(4-methoxyfenyl)-4_r4-dimethylchols-8,,14-dien-23-yn-3-oluJ a

B:)-(3beta, Šelfe, 20R)-24-(4-chlorf enyl)-4,4-dime thyl-8,14dien-23-yn-3-olu, a

G)-(3beta,5alfa,20R)-4,4-dimethyl-24-(2-methylfenyl)-chola8,14-dien-23-yn-3-olu, a

C)-(3be ta,5alf a,20R)-4,4-dime thy1-24-(4-me thylfeny1)-chola8.14- dien-23-yn-3-olu,

Analogickými postupy, popsanými výše v rámci Příkladu 12)J Stupeň VI), a VII),, byly připraveny z (3beta,5slfa,2OR)-3-/(1e thoxye thyl)-oxy/-4,4-dime thy lchola-8,,14-dien-23-ynu,, získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně l)j Příklad následující sloučeniny ::

A)-(3beta,5alfa,20R)-24-(4-methoxyfenyl)-4,4-dimethylchola8.14- dien-23-yn-3-olJ

Teplota tání : 91,30 - 92,6O°C;

Produkt obsahoval 15$, (3beta,5elfa,20R)-24-(4-methoxyfenyl)

4,4-dimethylchola-6,8(14)-dien-23-yn-3-olu, a

B.) - (3be ta, 5alf a, 20R)-24-(4-chlorfeny1)-4,4-dime thy 1-8,14dien-23-yn-3-olJ

Teplota tání :

128,20 - 129,4O°C;

• · · · · » ·

Produkt obsahoval 1 5%;(3beta,5alfa,20R)-24-(4-chlorfenyÍ)

4,4-dimethylchola-6,8(14)-dien-23-yn-3-olu

d) -(3be ta,5alfa,20R)-4,4-dime thy1-24-(2-me thylfenyl)-chola8.14- dien-23-yn-3-ol *,

Teplota tání: 136,50 - 137,80°C;

H) - (3be ta , 5alf a, 20R.) -4,,4-dime thy 1-24- (4-me thy lfenyl) -chola8.14- dien-23-yn-3-olJ

Teplota tání : 111,20 - 112„1O°C;

Příklad 16)

Příprava (3beta,5alfa,2OR)-2O-methy1-21-fenylpregna-8,14-dien 3-olu, a

(3beta,5alfa,20R)-20-methy1-21-fenylpregna-6,8(14)-dien-3-olu

Stupeň D

Příprava (3beta, 17Z)-pregna-5,17-dien-3-ol-benzoátu

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 1 ); Stupeň V),. bylo konvertováno 82,70 gj( viz časopis Chem.Ber. 604,/1965/, autor Drefahl G. se sp.), na (3beta,17Z)-pregna• 9 · · • » ···· ·« • ·

5,17-dien-3-ol-benzoát, kterého bylo získáno 104,70 g.

Stupeň II)

Příprava (3beta, 20S)-20-methylpregna-5,16-dien-3,21-diol-3 benzoátu

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 25,30 gj produktu, získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně I); ve 500,0 ml, vysušeného dichlormethanu, a vychlazenému na teteplotu 15,0°C, bylo přidáno 11,30 g, peraformaldehydu, a poté ještě 0,78 ml, borontrifluorid-diethyletherátu, a vzniklá reakční směs byla míchána po dobu 45,0 minut,, a poté byla zfil trována za účelem odstranění přebytku paraformaldehydu.

Po přidání 31,30 ml;. 6M roztoku kyseliny sírové, a 250,0 ml, methanolu, byla směs míchána při teplotě místnosti po dobu 5,0 hodin, a poté, po zneutralizování s 2M vodným roztokem? hydroxidu sodného, byla nalita do vody. Produkt byl extrahován do dichlormethanu, a spojené organické fáze byly vysušeny se síranem sodným, a poté byl^ za sníženého tlaku zahuštěny

Bylo získáno 26,,50 g, žádaného (3beta,2GS)-£O-methylpregna-5,16-dien-3,2l-diol-3-benzoátu, který byl použit v následujícím Stupni III), bez jakéhokoliv dalšího čištění.

Stupeň III)

Příprava (3beta, 2OS)-20-methylpregn-5-en-3,21 -di ol-3-benzoátu

Roztok,, připravený rozpuštěním 13,30 g, alkoholu, zís♦ I» « <*» · • * kaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně II); ve 135,0 ml, dichlormethanu, a 135,0 ml,, ethanolu, obsahujícího 4,18 g, platiny, ne aktivním uhlí ( 10$); byl hydrogenován při teplotě místnosti, a za atmosferického tlaku.

Poté byl roztok zfiltrován, a po zahuštění ze sníženého tlaku, byl zbytek krystalizován ze směsi dichlormethan/aceton.

Bylo získáno 10,60 g, žádaného (3bets,20S)-20-methylpregn

5-en-3,21-diol-benzoátu.

Stupeň IV) řříprava (3beta,20S)-3-(benzoyloxy )-pregn-5-en-20-karboxaldehydu

Ku suspenzi,, připravené rozmícháním pyridiniumchlorchromátu (44,30 g), ve 443,0 ml, vysušeného dichlormethanu,. byl přidán roztok, získaný rozpuštěním 22,20 g, alkoholu, získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně III); ve 444,0 ml, vysušeného dichlormethanu.

Poté, co byla vzniklá reakční směs míchána při teplotě místnosti, po dobu 2,50 hodiny, byla ochlazena na teplotu 5°C; a byl k ní přidán roztok, připravený rozpuštěním 90,0 g,_: hydrogensulfitu sodného, v 511,0 ml, vody, a směs byla míchána dále po dobu 1,0 hodiny.

Poté byla směs nalita do 3,0 litrů vody, a následně byla zfiltrována přes směs oxidu křemičitého, a celitu. Produkt byl poté extrahován do dichlormethanu,, a spojené organické fáze byly za sníženého tlaku zahuštěny. Vzniklý zbytek byl rozpuštěn ve směsi ethylacetátu, a tetrahydrofuranu, a promyt s vodou.. Organická fáze byla vysušena se síranem sodným, a po zpracování s aktivním uhlím, byla zfiltrována, a zahuštěna.

Bylo získáno 19,0 g, žádaného (3bets,20S)-3-(benzoyloxy)pregn-5-en-2O-karboxaldehydu, který byl použit v následujícím Stupni V); bez jakéhokoliv dalšího čištění.

- 63 Stupeň V)

Příprava směsi (3beta,20S,21R)-20-methyl-21 -fenylpregn-5-en3,21 -diol-benzoátu a

(3beta,20S,21S)-20-methy1-21-fenylpregn-5-en-3*21 -diol-3-benzoátu

Analogickým postupem,, popsaným výše v rámci Příkladu 1), Stupeň IX), bylo konvertováno 19*0 g* aldehydu,, získaného v rámci předcházejícího,, výše popsaného Stupně IV), na žádanou směs ( celkem 17,70 g),. (3beta, 20S, 21 R)-20-methy 1-21 -fenylpregn5-en-3,21-diol-benzoátu* a (3beta,20S,2lS)-20-methyl-21-fenylpregn-5-en-3,21-diol-3-benzoátu.

Stupeň VI)

Příprava (3beta,20S)-20-methy1-21-fenylpregn-5-en-3-ol-benzoátu

Ku roztoku* připravenému rozpuštěním 15,30 g, směsi alkoholů, získané v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně V), a 5,26 ml, triethylsilanu, ve 306,0 ml, vysušeného dichlormethanu* a vychlazenému na teplotu 0°C, bylo přidáno 4,20 nl, borontrifluorid diethyletherátu, a vzniklá reakční směs byla míchána po dobu 1,50 hodiny.

Poté byl8 směs nalita do nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného* a produkt byl extrahován do dichlormethanu. Spojené organické fáze byly promyty se solankou, a po vysušení se síranem sodným, bvly za sníženého tlaku zahuštěny. Surový produkt byl krystalizován z diethyletheru.

Bylo získáno 10,70 g, žádaného (3beta,2OR)-2O-methy1-21 fenylpregn-5-en-3-ol-benuoátu.

- 64 Stupeň. VII)

Příprava (3beta,20R)-20-methy 1-21-f eny lpregne-5,7-dien-3-olbenzoátu

Roztok,, připravený rozpuštěním 8,88 g;benzoátu, získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně VI), ve 450,0 ml,, vysušeného cyklohexsnu, obsahujícího 3,78 g, 1,3— dibrom-5,5-dimethylhydantoinu, byl zahříván za refluxu pod zpětným chladičem, po dobu 1,0 hodiny.

Potom byla vzniklá reakční směs ochlazena, a nalita do vody. Produkt byl extrahován do ethylscetátu, a spojené organické fáze byly promyty se solankou, a po vysušení se síranem sodným, byly za sníženého tlaku zahuštěny.

Vzniklý zbytek ( 11,30 g), byl rozpuštěn ve vysušeném tetrahydrofuranu (180,0 ml), a smíchán se 52,80 ml, 1M roztoku tetrabutylamonium-fluoridu, v tetrahydrof uranu.. Tato směs byla při teplotě místnosti míchána přes noc, a poté byla nalita do vody, a produkt byl extrahován s ethylacetátem.Spojené organické fáze byly,promyty se solankou, a po vysušení se síranem sodným, byly za sníženého tlaku zahuštěny, a vzniklý surový produkt byl dále krystalizován, a zpracován pomocí sloup cové chromátografie.

Šylo získáno 4,48 gj žádaného (3beta,2OR)-2O-methyl-21fenylpregna-5,7-dien-3-ol-benzoátu.

Stupeň VIII)

Příprava (3be ta, 5elfa, 20fi)-20-®«rt3iyl-2)-feBylpregna-8,14-disn3-ol-benzoátu, a (3beta,5alfa,2OR)-2O-methyl-2l-fenýlpregna- 6,8(14)-dien-3-ol-benzoátu

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 1) Stupeň VII), bylo izomerizováno 3,20 g, dienu, získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně VII), a z připraveného, surového produktu, (3,30 g), bylo opakovanou krystalizací, a chromatografií, získáno 1,51 g; (3beta,5alfa,20R)20-methyl-2l-fenylpregna-8,14-dien-3-ol-benzoátu; a 0,75 g, (3be ta, 5alfa, 2OR)-2O-me thy 1-21 -fenylpregna-6,8(14 )-dien-3-olbenzoátu.

Stupen IX-A)

Příprava (3beta,5alfa,2OR)-2O-methyl-21-fěnylpregna-8,14-dien3-olu

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 1), Stupeň IV),. bylo konvertováno 0,90 g;. (3beta,5alfa,2OR)-2Qmethy1-21-fenylpregna-8,14-dien-3-ol-benzoátu; na 3-hydroxysloučeninu, ze které bylo opakovanou krystalizací ze směsi diethylether/heptan, získáno 0,39 g; (3beta,5alfa,20R)-20-methyl 21-fenylpregna-5,14-dien-3-olu.

Teplota tání : 156,0 - 157,0°CJ

Stupeň IX-B)

Příprava (3beta,5alfa,2OR)-2O-methy1-21-fenylpregna-6,8(14)dien-3-rolu

Analogickým,postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 1),

- 66 • ·

Stupeň IV), bylo konvertováno 0,75 gf (3beta,5alfa,2OE)-2Ome thyl-21-fenylpregna-6,8(14 )-dien-3-ol-benzoátu;, na 3-hydroxy-sloučeninu,_:. ze které bylo po chromátografii, a vymrežení ze směsi dioxan/ t-butanol, získáno 0,21 g; (3beta,5alfa,20R)-20methyl-21-fenypregna-6,8(14)-dien-3-olu.

Příklad 17)

Příprava (3be ta, 5alf a , 20R) -4,4-dime th.y 1-23- (2-me thylf eny 1) -24norchola-8,14-dien-3-ol-hydrogen-butandioátu

Směs, připravená smícháním 0,15 gj (3beta,5alfa,20R)-4,4dime thy 1-23-(2-me thylf enyl )-24-norchola-8,14-dien-3-roluj (získaného v rámci Příkladu 5); popsaného výše); 2,20 ml, vysušeného pyridinu; 0,82 g, anhydridu kyseliny jantarové ( kyseliny butandiové), a 5,0 mg 4-dime thy laminopyridinu, byla zahřáta při teplotě 60,0°C, přes noc.

Poté byla vzniklá reakční směs ochlazena, a následně byla nalita do vody, a produkt byl extrahován s ethylácetátem. Spojené organické fáze byly promyty s 2M vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové, a s vodou, a po vysušení se síranem sodným, byly za sníženého tlaku zahuštěny. Surový materiál byl překrystalizován z acetonu.

Bylo získáno 0,106 g; žádaného (3beta,5alfa,20R)-4,4-dime thy 1-23-(2-me thylfeny1)-24-norchola-8,14-dien-3-ol-hydrogenbutandioátu.

Teplota tání :

144, 0 - 147,0°c;

·· ···· ·· , · · «I · · · » · · · * · ·

Příklad. 18)

Příprava dále definovaných sloučenin A);B);C) a Π)

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci předcházejícího Příkladu 17),. hylv připraveny následující sloučeniny t

A)-(3beta,5alfa,20R)-4,4,20-trimethy1-21-fenylpregna-8,14dien-3-ol-hydrogen-butandioátJ

Byl připraven ze (3beta,5alfa,2OR)-4,4,2O-trimethyl-2lfenylpregna-8,14-dien-3-olu,( Sloučenina 1), popsaná v rámci výše uvedeného Příkladu 1).

Produkt obsahoval 30%; (3beta,5alfa,2OR)-4,4,2O-trimethyl21-fenylpregna-6,8(14)-dien-3-ol-hydrogen-butandioátu.

B) - (3be ta, 5alf a ,.2OR)-4,420-trime thyl-21 -/4- (trif luorme thyl)fenyl/pregna-8,14-dien-3-ol-hydrogen-butandioát$

Byl připraven ze (3beta,5alfa,20R)-4,4,20-trimethyl-2l-/4'(trifluormethyl)-fenyl/-pregna-8,14-dien-3-olu; (popsaného výše v rámci Příkladu 2B).

Teplota tání : 147,0 - 151,0°Cj

0)-(3beta,5alfa,20R)-4,4-dimethy1-23-/2-(trifluormethyl)-feny!/

24-norchola-8,14-dien-3-ol-hydrogen-butandioátJ

Byl připraven, ze (3beta,58lfa,20R)-4,4-dimethyl-23-/2-(trifluormethyl)-fenyl/-24-norchola-8,14-dien-3-oluJ (popsaného výše v rámci Příkladu 6B).

Produkt obsahoval 30%, (3be ta, 5alf a, 20R )-4,.4-dime thy 1-23-=/2( trifluormethyl)-fenyl/-24-norchola-6,8(14)-dien-3-ol-hydrogen-butsndioátu.

E)-(3beta,5alfa,20R,22E)-4,4-dimethyl-23-fenyl-24-norchola-8,

14,22-trien-3-ol-hydrogen-butandioát J,

Byl připraven ze (3beta,5alfa,20R,22E)-4,4-dimethyl-23-fenyl-24-norchola-8,14.22-trien-3-oluJ (popsaného výše v rám ci Příkladu 10).

Produkt obsahoval 40%; (3beta,5alf8,20R,22E)-4,4-dimethyl23-fenyl-24-norchola-6,8,(14),22-trien-3-ol-hydrogen-butan dioátuj

Přiklaď 19)

Metoda procentického stanovení rozpadlých zárodečných vezikul (GVBD) v oocytech po kultivaci za přítomnosti testovaných sloučenin

Obecný postup

Oocyty obsahují při zástav^meiózy rozptýlené chromozómy, které jsou obklopeny intaktním jaderným obalem, známým jako zárodečná vezikula,( germinal vesicule = GV), Po opětovné ini ciaci meiózy vyplavovaným gonadotropinem uprostřed cyklu, doj de ku zhuštění chromozómů, a ku rozpadu zárodečné vezikuly, ( GVBD = GV break down).

Oocyt je in vivo vystaven působení hypoxanthinu, (HX), který podporuje udržení oocytů v klidové fázi meiózy. Toto zachycení v meiotické fázi může být in vitro imitováno přidáním hypoxanthinu do kultivačního media.

Působení sloučeniny, uvedených v předloženém vynálezu, lze hodnotit jako dchopnost překonávat meiotickou zástavu v dozrálých, uvolněných oocytech,(DO = denuned oocytes), na příklad indukcí pokračování meiózy in vitro.

- 69 Izolace nezralých ooéytů v Graafově folikulu

Vaječníky lze získat od nedospělých myších samiček;(B6D2F), kmen C57BL x DBA), kterým je ve stáří 19, 20 a 21 dní apli kováno subkutánně 20 ij.j. Humegonu, ( Organon, Holandsko), ve fyziologickém roztoku.

Po uplynutí 48 hodin, od zmíněné injekční aplikace, jsou myši utraceny cervikálni dislokací. Vaječníky jsou vyjmuty, zbaveny vnější tkáně, a umístěny v blokovém zařízení, opatřeném vhodnými prohlubněni, obsahujícími 1,0 ml preparačního media,, při teplotě 37,O°C.

Jako preparační medium je použito L—15 Leibovitzovo medium, ( Gibco, pH 7,3 1 0,1), doplněné s hovězím sérovým albuminem , (3,0 mg. ml” ); L-glutaminem,(0,23 mM); pvruvátem sod ným = 2-oxoproponoát sodný,( 2,0mM), a hypoxanthinem,( 4,0 mM)

Antrální folikuly vaječníků jsou pod pitevním mikroskopem propíchnuty, za použití dvou 27-kalibrovaných jehel, připojených ku dvěma injekčním stříkačkám, o obsehu 1,0 mlr

Nezralé oocyty v Graafově folikulu (CEO?= cumulus encloseá oocytes), jsou vytříděny s náústkem opatřenou pipetou, a vypláchnuty s 0,50 ml, čerstvě připraveného media.

Z jednoho vaječníku se získá cca 20 CEO.

Izolace dozrálých,uvolněných oocytů.

OOcyty, uvolněné z buněk Graafovs folikulu; t.j.dozrálé, • ··· · ·· · · · · ·· ·· ··· ·· · ·«·· • · ··· · Β · ·

- 70 uvolněné oocyty,(DO), lze získat· opatrným promytím nedozrálých oocytů v Graafově folikulu, pomocí úzké, s náústkem opatřené pipety. Dozrálé, uvolněné oocyty, jsou 2x promyty s čerstvým kultivačním mediem, a uchovávají se v kultivačním mediu, při teplotě 37,O°C, v atmosféře 100%ní vlhkosti, s obsahem 5% oxidu uhličitého, ve vzduchu.

Postup stanovení

Metoda stanovení pomocí oocytů se provádí ve 3 blocích, přičemž v každém, bloku jsou umístěny vaječníky od jedné myši, ( náhodné blokové uspořádání). Při t - OJ jsou dozrálé, uvolněné oocyty z prvého vaječníku prvé myši rozmístěny do prohlubní 1 a 3, a oocyty z druhého vaječníků, jsou rozmístěny do prohlubní v bloku 2 a 4J opatřeném štyřmi prohlubněmi, obsahujícími 0,50 ml kultivačního media, ku kterému se přidá derivát 2O-aralkyl-5alfa-pregnanu, uvedeného v předloženém vynálezu, ( prvý blok). Pro kontrolní účely bylo použito kultivační medium.

Stejně se postupuje s materiálem od druhé a třetí myši ( blok 2a 3). Použité kultivační medium je MEM-alfa-medium ( Gibco, pH 7,30 + 0,1), nasycené s oxidem uhličitým, a doplněné se 3,0 mg.ml”'' hovězího sérového albuminuj L-glutaminem, (0,23 mM), pyruvátem sodným,(2,0 mM), a hypoxanthinem, (4,0 mM)

Každé kontrolní hodnocení, nebo hodnocení testované sloučeniny, se provádí na 30 oocytech, ( 10 oocytů v jednom bloku). Při t = 0, je počet dozrálých, uvolněných oocytů s intaktními zárodečnými vezikulami (GV), nebo GVBD), ( rozpadlé zárodečné vezikuly), počítán pod invertním mikroskopem, opatřeným diferenčním, kontrastním interferenčním zařízením.

Při stanovení jsou použity pouze intaktní zárodečné vezikuly. Oocyty jsou kultivovány po dobu 22,0 hodin, při teplotě

37,0°C, ve 100%ně zvlhčené atmosféře, s 5% oxidu uhličitého ve vzduchu.

Ku konci kultivační doby, je v každé skupině odečten počet oocytů se zárodečnými vezikulami, nebo rozpadlými zárodečnými ve zikulami.

Pro účely statistické analysy je propočteno procento rozpadlých zárodečných vezikul pro každou skupinu v jednom bloku. Tato procentická vyhodnocení jsou závislá na tranformaci arcsinu, a rozdíly mezi kontrolami,, a testovanými sloučeninami, jsou analyzovány ANOVA testem pro randomizované blokové uspořádání.

Výsledky jsou publikovány v Tabulce I), na následujících stranách· ««««

TABULKA I)

Procenta rozpadlých zárodečných vezikul (GVBD), v oocytech, po kultivaci, za přítomnosti testovaných sloučenin _x) ( Stanovení pomocí dozrálých, uvolněných oocytů,( DO metoda'

Sloučenina Příklad	GVBD(%)	Kontrola
(3beta,5alfa,20R)-4,4,20-trimethyl- (1) 21-fenylpregna-8,14-dien-3-ol	1Ό0	CO)
(3be ta,5alfa,20E)-4,4y20-trime thyl- (2A) 2l-(3-methylfenyl)-pregns-8,14-dien3-ol	97	(8)
(3be ta, 5slf a, 20R)-4,4-r20-trime thyl- (2B) 21 -/4-(trifluorme thyl'-fenyl/-pre gn88,14-dien-3-ol	98	(0)
(3be ta,5alf a,20R)-4,4.20-trime thy1- (3) 21-fenylpregna—6,8(14)-dien-3-ol	WO ·	(0)
(3beta,5alfa,20s)-4,4.20-trimethyl- (4) 21-(3-methylfenyl)-pregna-8,14-dien3,21-diol	19	(4)
(3be ta, 5a lf a, 20R.)-4,4-dimethyl-23- (2- (5) methylfenyl)-24-norchola-8,11-dien-3ol	28	(0)
(3beta,5alfa,2OR)-4,4-dimethyl-23-(3- (6A) me thylfenyl)-24-norchola-8,14-dien-3ol	60	(8)
( 3beta,5slfa,2OE)-4,4-dimethyl-23-/2- (6S) (trifluormethyl)-fenyl/-24-norchola -8, i4-dien-3-ol	0	(0)
(3beta,5alfa,2QB)-4,4-dimethy1-23-fenyl-(7A) 24-norchola-8 ,.14-dienr3-ol	-	-
(3beta ,5alfa ,^OE)-3-hydroxy-4,4-dimetl^rl’C7B) 23-fbnýl-24-norchola-8,14-dien-23-on	-	-

*> · · 9 · 99 • 9 · 9 · · • · 9 · · · ·

Pokračování Tabulky I)

Sloučenina

Příklad GVBD(%)

Kontrola

(3beta,5alfa,20R·,234R) r.4,4-dime thy 1 23-feny1-24-norchols-8,14-dien3,23-diol	(8)
(3beta ,5alfa ,2OR,’23S )-4.4-dime thyl23-fenyl-24-norchola-8,14-dien-3,23áiol	(9)	**
(3be ta,5alf a,2OR,22E)-4,4-dime thyl23~fenyl-24-norc£ola-6,14,22-trien3-ol' ..... '	(10)	0	(0)
(3beta, 5alf a, 20R, 22E )-4,4-dime thyl24-f enylchola-8,14 ,23-trien-3-ol	(11 )	67	(0)
(3beta, 5alfa, 20S )-4,4-dimethy1-23fenyl-24-norchola-8,14-dien-22-yn3-ol	(12)	1W	(3)
(3be ta,5alfa,20S)-23-(4-me thoxyfeny1)-4,4-dimethy1-24-norchola-8,14dien-22-yn-3-ol	(13A)	5	(0)
(3beta,5alfa,20S)-23-(4-chlorfenyl)4,4-dimethy1-24-norehols-8,14-dien22-yn-3-ol	(1 35)	6,0	(0)
(3beta,5alfa,20R)-4,4-dimethy1-24fenylchola-8,14-dien-23-yn-3-ol	(14)	28
(3beta,5alfa,20R)-24-(4-methoxyfenvl)-4,4-dimethylchola-8,14-dien23-3Ď1-3 -ol	(15A)	. 51	(6)
(3beta,5alfa,20R)-24-(4-chlorfenyl)4,4-dime thy lchola-8,14-dien-23-yn«-3ol	(15B)	39	(6)
(3beta , 5alfa , 20R)-4,4-dimethy1-24(2-me thylfenyl)-chola-8,14-dien-23yn-3-ol	(150	4	(0)
120H.)-4,4-dime thyl-24(4-me thylfenyl)-chola-8,14-dien-23yn-3-ol	(15D)	100	(0)

- 74 Pokračování T a b u 1 k,y I) :

Slouč enina Přiklad	GVBD(%)	Kontrola
(3beta,5alfa,2QR)-20-methyl-2l - (Γ6Α) fenylpregna-8,l4-dien-3-o|	-	-
(3beta, 5alfa, 20R)-20-me thyl-21 - (16R) fenylpregna-é,8(l4)-dien-3-ol	-	-
(3beta,5alfa,20R)-4,4-dimethy1-23- (17) (2-methylfenyl)-24-norchola-8,14dien-3-ol-hyčrogen-butančioát	81	(0)
(3beta,5alfa,2OR)-4,4,2O-trimethvl- (18A) 21 -fenylpregna-8,14-dien-3-ol-hvdrogen-butandioát	38	(6)
(3beta,5alfa,2OR)-4,4.2O-trimethvl- (18B) 21-/4-(trifluormethyl)-feny l/-pregna8,14-dien-3-ol-hydrogen-butandioát	100'	(0)
(3beta,5alfa,20R)-4,4-dime thyl-23- (18C) /2-(trifluorme thyl)-fe nyl/-24-norchola-8,14-dien-3-ol-hydrogen-butandioát	98	(6)
(3beta,5alfa,20R,22E)-4,4-dimethyl- (18D) 23-fenyl-24-norchola-8,14,22-trien3-ol-hydrogen-butandioát	100	(6)
(3beta,5alfa,20R)-4,4-dimethvlcho- (EE-Mas) lesta-8,14,24-trien-3-ol,	84	(4)
x) = každá sloučenina byla hodnocena v koncentraci 10	/UM .

···· · · · · »·· ·· · · '

Claims (8)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Deriváty 20-aralkyl-5alfa-pregnanu obecného vzorce I kde

   R₁ znamená (H, OR), (H, OSO₃H) nebo NOR,

   R znamená H, alkyl nebo acyl vždy o 1 až 6 atomech uhlíku,

   R₂ a R₃ nezávisle znamenají vodík nebo alkyl o 1 až 6 atomech uhlíku,

   X znamená dvojvazný uhlovodíkový zbytek s přímým řetězcem o 1 až 8 atomech uhlíku, popřípadě obsahující dvojnou nebo trojnou vazbu nebo znamená skupinu -(CH₂)_m-CR₇R₈-, kde m = 0 až 4, alespoň jeden ze substituentů

   R₇ a R_s znamená alkyl o 1 až 4 atomech uhlíku, hydroxyskupinu, alkoxyskupinu o 1 až 4 atomech uhlíku nebo atom halogenu s druhý z těchto substituentů znamená atom vodíku nebo R₇ a R₈ společně tvoří atom kyslíku nebo skupinu NOR',

   R' znamená vodík, alkyl nebo acyl vždy o 1 až 6 atomech uhlíku,

   R₄, R₅ a R₆ nezávisle znamenají vodík, hydroxyskupinu, alkoxyskupinu o 1 až 6 atomech uhlíku, atom halogenu, skupinu NR₉R₁₀ nebo alkyl o 1 až 4 atomech uhlíku, popřípadě substituovaný hydroxyskupinou, alkoxyskupinou, atomem halogenu nebo oxoskupinou,

   Rg a R₁₀ nezávisle znamenají atom vodíku nebo alkyl o 1 až 4 atomech uhlíku a přerušovaná čára znamená delta⁷ nebo delta⁸ dvojnou vazbu nebo dvojici konjugovaných dvojných vazeb ze skupiny delta⁷·¹⁴, delta⁸¹⁴ a

   4 4 444 44 4 · · * ·· delta^{6 θ(14)}, za předpokladu, že z uvedených sloučenin je vyloučen (3beta,4alfa,24E)-25-(4-hydroxyfenyl)-4-methyl- 26, 27-dinorcholesta7,24-dien-3-ol (gramisterol), jakož i farmaceuticky přijatelné soli těchto látek.
2. 2. Deriváty podle nároku 1, v nichž R₁ znamená (H, OR) a přerušovaná čára znamená dvojici konjugovaných dvojných vazeb ze skupiny delta^7,14, delta^8,14 a delta^6,8(14).
3. 3. Deriváty podle nároku 2, v nichž je dvojná vazba v poloze delta^8,14.
4. 4. Deriváty podle nároku 2 nebo 3, v nichž má substituent 3-OR konfiguraci beta.
5. 5. Deriváty podle některého z nároků 1 až 4, v nichž R_d znamená (H,OR), R znamená vodík nebo acyl o 1 až 6 atomech uhlíku, R₂ a R₃ nezávisle znamenají vodík nebo alkyl o 1 až 6 atomech uhlíku, X znamená -CH₂-, R₄, R₅ a R_s mají význam, uvedený v nároku 1, přerušovaná čára znamená dvojici dvojných vazeb v poloze delta^8,14 a substituent 3-OR má konfiguraci beta.
6. 6. Deriváty 20-aralkyl-5alfa-pregnanu pro použití v therapii.
7. 7. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že jako svou účinnou složku obsahuje derivát 20-aralkyl-5alfa-pregnanu obecného vzorce I podle nároku 1 nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl spolu s farmaceutickými pomocnými látkemi.
8. 8. Použití derivátů 20-aralkyl-5alfa-pregnanu obecného vzorce I podle nároku 1 nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí pro výrobu farmaceutického prostředku pro řízení plodnosti.