SK154298A3

SK154298A3 - Method for the transfer of electrons between an electrode and an enzyme in an electrochemical process

Info

Publication number: SK154298A3
Application number: SK1542-98A
Authority: SK
Inventors: Howard Dalton; Hugh A O Hill; Jurate Kazlauskaite; Patricia C Wilkins
Original assignee: British Gas Plc
Priority date: 1996-05-10
Filing date: 1997-05-08
Publication date: 2000-03-13
Also published as: CA2254352A1; US6231746B1; RU2157521C2; PL329761A1; KR20000011066A; AU2707897A; NZ332486A; GB9709215D0; WO1997043632A1; JP2000511630A; EP0897537A1; GB2312960A; GB2312960B; KR100354419B1; AU716380B2; CZ358898A3

Description

Spôsob prenosu elektrónov medzi elektródou a enzýmom pri elektrochemickom procese

Oblasť techniky

Vynález sa týka eletrochémie enzýmov, najmä hydroxyláz.

Doterajší stav techniky

Hydroxylázy sú známe ako katalyzátory oxidácie rôznych substrátov. Napríklad metánmonooxygenáza je účinným katalyzátorom oxidácie metánu molekulovým kyslíkom, ktorá poskytuje ako jediný produkt metanol.

V literatúre sa popísalo štúdium štruktúry a mechanizmu elektrochémie hydroxyláz.

Existujú dve formy enzýmu metánmonooxidázy: rozpustná (sMMO = soluble methan monooxydase) a monooxidáza v podobe častíc (pMMO = particulate methan monooxydase). Rozpustný enzým z Methylococcus capsulatus (Bath) sa skladá z hydroxyláz (250,5 kDa), reduktázy (38,5 kDa) a regulačnej zložky, proteínu B (15,9 kDa), pričom všetky sú potrebné nato, aby bol enzým aktívny. Hydroxyláza je vytvorená z dvoch protomérov v usporiadaní a2b2g2 a vyriešila sa rontgenová kryštalická štruktúra tejto zložky. Enzým sMMO z Methylosinus trichosporium OB3b má velmi podobné zloženie a je aj velmi dobre popísaný. Aktívne miesto na sMMO je centrum s dvoma atómami železa, premostené hydroxyskupinou (vo zvyšku enzýmu), ktorá sa nachádza v podjednotke hydroxylázy. Redukujúce ekvivalenty z NADH sa prenášajú do aktívnych miest prostredníctvom centier F₂S₂ a reduktázy FAD. Proteín B neobsahuje žiadne ióny kovov alebo kofaktory a detaily jeho regulačnej úlohy nie sú doteraz jasné. Vo zvyšku enzýmu sa železo nachádza v úplne oxidovanom stave Fe(III)Fe(III). Existujú ďalšie dva oxidačné stavy, ktoré sú možné pri zhluku dvoch atómov železa, a to stav Fe(III)Fe(II) so zmiešanou valenciou a úplne redukovaný stav Fe(II)Fe(II) . Stavom, ktorý reaguje s 0₂ a aktivuje ho v priebehu premeny enzýmu, je stav Fe(II)Fe(II) .

Redoxný potenciál centra s dvoma atómami železa v M. capsulatus (Bath) a M. trichosporium OB3b sa meral v troch nezávislých štúdiách. Hodnoty Eo' pre dvojice

Fe(III)Fe(III)/Fe(III)Fe(II) a Fe (III) Fe (II)/Fe (II) Fe (II) boli predmetom istých diskusií. Extenzívne sa skúmali redoxné vlastnosti hydroxylázových zložiek rozpustnej metánmonooxygenázy z dvoch rôznych organizmov. Predchádzajúce štúdie používali na určenie koncentrácie redukovaných foriem redoxnú indikačnú titráciu a spektroskopické metódy. V týchto štúdiách sa použila nepriama titrácia centra hydroxylázy s dvoma atómami železa s redoxnými aktívnymi mediátormi. Koncentrácie foriem hydroxylázy so zmiešanou valenciou a s úplne redukovanou valenciou sa určovali pomocou EPR alebo pomocou EPR a Mossbauerovej spektroskopie pri velmi nízkych teplotách (4,2 až 18 °K).

V oblasti proteínovej elektrochémie sa zistilo, že organické molekuly obsahujúce tiol alebo disulfid, sú osobitne dobrými modifikátormi, pretože chemisorbujú silnou väzbou zlata a vrstvy na jeho povrchu, čím vytvárajú stabilnú vrstvu pokrývajúcu povrch elektródy. Relevantné aminokyseliny sa môžu chemisorbovať aj týmto spôsobom, a tak sa využívať ako promotóry pri proteínovej elektrochémii na povrchoch elektród. Skúmalo sa použitie peptidov obsahujúcich cysteín, ktoré obsahujú aj funkčné aminokyseliny (napríklad arginín, lyzín, histidín) ako promótorov pre peptidovú elektrochémiu.

Na druhej strane v protiklade k oblasti proteínovej elektrochémie nie je triviálnou úlohou uskutočňovať priame elektrochemické merania bez pomoci mediátorov na redoxných enzýmoch. Hlavný problém spočíva v tom, že redukčné centrá sú často ukryté hlboko v proteíne ďaleko od povrchu, takže vzdialenosť, ktorú musia elektróny prejsť k elektróde, môže byť dostatočne velká nato, aby znížila velkosť prenosu elektrónov na zanedbateľné malé hodnoty. Väčšina redoxných enzýmov je tiež omnoho väčších a štruktúrne menej rigidných ako neredoxné proteíny a sú ďaleko náchylnejšie k deformáciám a strate účinnosti povrchov elektród.

Elektrochémia hydroxyláz v prítomnosti mediátora je komplikovaná možnosťou unterakcie medzi hydroxylázou a mediátorom, takže mediátor môže rušiť určovanie koncentrácie jednotlivých druhov pri teplotách, ktoré sú odlišné od teplôt, pri ktorých prebiehajú redoxné reakcie.

Cieľom predkladaného vynálezu je odstrániť vyššie uvedené nevýhody.

Podstata vynálezu

Predložený vynález sa týka spôsobu prenosu elektrónov medzi elektródou a enzýmom pri elektrochemickom procese, pričom v tomto spôsobe sa spôsobí, aby enzým prilipol k elektróde.

Prenos je výhodne priamy.

Predložený vynález sa týka aj spôsobu uskutočňovania elektrochémie enzýmov, v ktorom sa jedná o priamu elektrochémiu bez použitia mediátorov.

V jednom uskutočnení predloženého vynálezu je enzýmom monooxygenáza.

V inom uskutočnení predloženého vynálezu je enzýmom P450 alebo modifikovaný P450.

V ďalšom uskutočnení predloženého vynálezu je enzýmom metánmonooxygenáza.

V ešte ďalšom uskutočnení vynálezu je enzýmom hydroxyláza.

Enzým môže obsahovať aktívne miesto s dvoma atómami že leza alebo alternatívne môže enzým obsahovať aktívne miesto obsahujúce porfyrín.

Elektrochémia sa výhodne uskutočňuje za použitia modifikovaných zlatých elektród.

Vynález sa ďalej týka spôsobu modifikácie elektródy, ktorý zmení elektródu tak, že je vhodná na použitie v elektrochémii enzýmov v neprítomnosti mediátorov a zahŕňa ošetrenie elektródy peptidom.

Enzýmom je výhodne monooxygenáza.

Je vhodné, keď enzým má aktívne miesto obsahujúce dva atómy železa alebo porfyrín.

Peptidom je výhodne hexapeptid.

Hexapeptid výhodne obsahuje zvyšky Cys a Lys.

Hexapeptidom môže byť výhodne Lys-Cys-Thr-Cys-Cys-Ala.

Je vhodné, keď ošetrenie elektródy zahŕňa voltametrickú cyklizáciu elektródy v roztoku hexapeptidu, čím je možné vyhnúť sa redukčnému čisteniu elektródy.

Vynález sa ešte ďalej týka spôsobu oxidácie substrátu molekulovým kyslíkom v prítomnosti enzýmu, zahŕňajúceho uskutočňovanie priamej elektrochémie v neprítomnosti mediátora.

V jednom uskutočnení vynálezu je enzýmom monooxygenáza.

V inom uskutočnení vynálezu má enzým aktívne miesto, ktoré obsahuje dva atómy železa alebo porfyrín.

Substrátom môže byť metán, ktorý sa oxiduje na metanol alebo substrát môže predstavovať gáfor, ktorý sa oxiduje na 5-exo-hydrogáfor alebo substrát zahŕňa polycyklické aromatické uhľovodíky, ktoré sa oxidujú na 5-exo-hydrogáfor.

Hydroxyláza je výhodne odvodená z cytochrómu P450cam.

Cysteín sa výhodne odstraňuje z reakčného prostredia.

Zistilo sa, že elektróda modifikovaná peptidmi predstavuje vhodnejší povrch na pritiahnutie enzýmu.

Predpokladá sa, že nato, aby došlo k prenosu elektrónov medzi hydroxylázovou zložkou M. capsulatus (Bath) sMMO a elektródou, je výhodný kladne nabitý povrch: o e-aminoskupinu zvyšku Lys vo výhodnom hexapeptide sa predpokladá, že plní túto úlohu. Eletrochemická modifikácia elektródy týmto konkétnym peptidom vytvára stabilnú monovrstvu a rovnomernejšie pokrytie povrchu v porovnaní s elektródou modifikovanou chemisorpciou (t. j. jednoduchým ponorením elektródy do roztoku peptidu).

Elektródou môže byť modifikovaná zlatá elektróda, napríklad zlatá elektróda modifikovaná ošetrením hexapeptidom Lys-Cys-Thr-Cys-Cys-Ala. Ošetrenie sa môže uskutočňovať cyklizovaním elektródy v roztoku hexapeptidu tak, aby sa zabránilo redukčnému čisteniu elektródy.

Účinok proteínu B aj proteínu B' na elektrochémiu roztokov hydroxylázy je dôležitý. EPR spektroskopia stavu so zmiešanou valenciou ukázala, že väzba proteínu B k hydroxyláze mení okolie miesta s dvoma atómami železa. V každej z týchto predchádzajúcich štúdií sa pozorovalo aj to, že spôsobuje posun potenciálov dvoch atómov železa.

Je známe, že vytváranie komplexu hydroxylázy a proteínu B mení vlastnosti miesta s dvoma atómami železa, ovplyvňuje distribúciu produktu a zvyšuje rýchlosť vytvárania niektorých medziproduktov v katalytickom cykle sMMO. Všetky tieto účinky môžu vznikať zo schopnosti proteínu B indukovať zmeny konformácie v hydroxyláze, ak sa k nej viaže, čo je prenášané do aktívneho miesta. Prihlasovatelia zistili, že redoxné potenciály hydroxylázy sú ovplyvnené prítomnosťou proteínu B, ako sa pozorovalo v predchádzajúcich štúdiách. Vyslovil sa predpoklad, že negatívny posun redoxného potenciálu spôsobený väzbou proteínu B k hydroxyláze je spôsobovaný zmenou prvej koordinačnej sféry atómu alebo atómov železa alebo zmenou v protonačnom stave hydroxylového mostíka. Ďalšie účinky, ako je zmena dostupnosti rozpúšťadla alebo štruktúra okolia aktívneho miesta, spôsobené zmenami konformácie potom, čo došlo k väzbe proteínu B, môžu tiež vysvetlovať zmeny potenciálov. Prihlasovatelia odhadujú velkosť Kd pre komplex Fe(II)Fe(II) na 2,06 ± 0,23 M a pre komplex

Fe(II)Fe(III) na 7,01 ± 0,45 M. Pokles redoxného potenciálu preto môže byť jednoducho odrazom poklesu afinity medzi zložkami tvorenými hydroxylázou a proteinom B, ktorý závisí od oxidačného stavu hydroxylázy.

V enzymatickom systéme M. capsulatus (Bath) sa bežne purifikujú dve formy regulačného proteínu B. Tými sú proteín B s úplnou dĺžkou a jeho úsek s dvanástimi aminokyselinami označovaný ako proteín B'. Väzbové štúdie využívajúce povrchovú plazmónovú rezonanciu (SPR - surface plasmon resonance) ukázali, že proteín B' vytvára aj komplex s úplne oxidovanou hydroxylázou a ten je len trikrát menej stabilný ako príslušný komplex proteínu B. Výskumy prihlasovateľov naznačujú, že proteín B' sa viaže k tomu istému miestu ako proteín B, ale že nie je schopný spôsobiť rovnakú konformačnú zmenu hydroxylázy, ktorá sa odovzdáva centru s dvoma atómami železa a ktorá zmení redoxný potenciál a ďalšie vlastnosti aktívneho miesta. Vytváranie skráteného proteínu B' preto môže mať v organizme určitú regulačnú úlohu. Za istých podmienok sa proteín B rozštiepi a vytvorí proteín B' a môže nastať konformačná zmena (a súvisiace zmeny vlastností aktívneho miesta) hydroxylázy. Týmto spôsobom môže byť bunka schopná uchovávať vzácne zdroje, ak je vystavená stresu. Prihlasovatelia zistili, že je možné uskutočňovať priamu elektrochémiu bez využitia mediátorov s proteínom s neelektrónovým prenosom, ktorý je taký veľký ako hydroxylázová zložka rozpustnej metánmonooxygenázy.

Ako sa uviedlo vyššie, proces môže spočívať napríklad v oxidácii metánu na metanol alebo v oxidácii gáfru na 5-exohydroxygáfor, najmä v oxidácii gáfru na 5-exo-hydroxygáfor prostredníctvom hydroxylázy odvodenej z cytochrómu P450cam. Prihlasovatelia zistili, že v poslednom uvedenom procese je vhodné odstrániť z reakčného prostredia cysteín.

Hydroxylázy, ktoré majú centrum tvorené porfyrínom, ktoré sa nachádzajú u baktérií Pseudomonas putida (pestovaných na gáfre) sú ideálnym systémom na štúdium regulácie elektrónového prenosu medzi dvoma redoxnými centrami v oddelených molekulách proteínu.

Cytochróm P450cam katalyzuje monooxygenáciu D-(+)-gáfru na 5-exo-hydroxygáfor, pre ktorý sa vyžaduje vonkajší zdroj dvoch redukčných ekvivalentov. Tieto elektróny sa prenášajú z NADH na hemoželezo v P450cam prostredníctvom kombinovaného pôsobenia FAD-flavoproteínovej putidaredoxínovej reduktázy a putidaredoxínového proteínu so železom a sírou. V optickom hemospektre pri štúdiách využívajúcich Mossbauerovu a EPR spektroskopiu sa pozorovali dramatické zmeny spôsobené posunom spinového stavu ferihemového železa zo stavu nízkeho špinu v neprítomnosti substrátu na vysoký spin v proteíne viazanom na substrát. Navyše sa zistilo, že táto zmena spi9 nového stavu po väzbe gáfru je sprevádzaná zmenou redoxného potenciálu z -540 mV na -414 mV (vzhladom na SCE). Tento posun redukčného hemopotenciálu je kľúčovým dejom v katalytickom cykle P450cam, ktorý umožní to, aby došlo k prvému prenosu elektrónu z putidaredoxinu, a tým inicializuje katalytickú premenu.

Prihlasovatelia zistili, že špičkový katódový prúd prejavuje lineárnu závislosť od druhej odmocniny skanovacej rýchlosti (7v) pre P450cam viazaný na gáfor, čo indikuje, že celý proces je riadený difúziou.

Pozorovali sa však odchýlky od linearity pre enzým bez gáfru. To môže byť spôsobené buď adsorpciou na povrchu elektródy alebo tým, že heterogénny proces prenosu elektrónov už nie je riadený difúziou. Prvá možnosť je nepravdepodobná, pretože globálna štruktúra P450cam viazaného na gáfor a P450cam bez gáfru sú velmi podobné, a preto je možné očakávať, že obidve formy budú mať podobnú afinitu k povrchu elektródy. Z toho teda vyplýva, že rýchlosť heterogénneho prenosu elektrónov na formu bez gáfru je nižšia ako rýchlosť pri forme, ktorá je viazaná na gáfor. To môže byť spôsobené relatívne vysokou reorganizáciou, ktorá sa vyžaduje na vytvorenie päťčlennej železnatej formy s vysokým spinom zo šesťčlennej formy s nízkym spinom pri enzýme bez prítomnosti gáfru, čo má za následok stratu hemoviazaného vodného ligandu. Táto požiadavka sa podobá požiadavke na redukciu myoglobínu, u ktorého sa dokázalo, že má vysokú reorganizačnú energiu v porovnaní s redukciou cytochrómu, ktorý má hemoželezo s koordinačným číslom šesť v železitej aj v železnatej forme.

Pri P450cam, viazanom na gáfor, má železitá aj železnatá forma enzýmu hemoželezo s koordinačným číslom päť s vysokým spinom a reorganizačná bariéra pre homogénny aj pre heterogénny prenos elektrónov by mala byť nízka.

Elektrochemická odpoveď P450cam na holú záporne nabitú elektródu cpg silno naznačuje, že i napriek celkovému zápornému náboju proteínu pri pH 7,4 (pl = 4,55) zvýhodňuje špecifické usporiadanie kladne nabitých povrchových aminokyselinových zvyškov interakciu medzi enzýmom a povrchom elektródy takým spôsobom, že môže dôjsť k heterogénnemu prenosu elektrónov. Počítačové modelovanie a mutagénne štúdie naznačujú, že zásadité zvyšky Arg-72, Arg-112, Arg-364 a Lys-344 na povrchu P450cam interagujú s kyslými zvyškami na povrchu putidaredoxínu v komplexe medzi týmito dvoma proteínmi. Z kraštalografickej analýzy s vysokým rozlíšením pre štruktúru P450cam vyplýva, že povrchové zvyšky sú na proximálnej strane hemu a v tej oblasti enzýmu, kde hem je najbližšie (asi 10 Ä) k povrchu. Pretože konštanta rýchlosti elektrónového prenosu všeobecne klesá s oddelovaním donora a akceptora, zdá sa rozumné prepokladať, že táto oblasť na povrchu P450cam bude vytvárať väzbové miesto pre putidaredoxín aj oblasť interakcie s elektródou. Zdá sa teda, že tieto kladne nabité zvyšky sa zúčastňujú aj interakcie medzi P450cam a holou elektródou cpg.

Grafitová elektróda „edge-plane preto môže úspešne nahradiť reťazec fyziologických proteínov pre prenos elektrónov v prvom prenose elektrónov na cytochróm P450cam, pričom priama elektrochémia je substrátovo závislá.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Vynález sa bližšie vysvetlí prostredníctvom konkrétnych príkladov uskutočnenia uvádzaných výhradne na ilustráciu vynálezu s odvolaním na priložené výkresy, na ktorých obr. 1 znázorňuje diferenciálny voltamogram 23,6mM roztokov hydroxylázy na zlatej eletróde, modifikovanej proteínom Lys-Cys-Thr-Cys-Cys-Ala v 40mM MOPS, pH 7,0 (odčítal sa základný prúd), obr. 2A a 2B znázorňujú účinok rastúcich koncentrácií proteínu B (1) a B' (2) na potenciál prvého (a) a druhého (b) prenosu elektrónov. [Hydroxyláza] = 21 mM, 40 mM MOPS, pH 7,0. Pred každým meraním sa merala elektróda .

obr. 3A a 3B znázorňujú účinok rastúcich koncentrácií proteínu B na potenciál prvého (a) a druhého (b) elektrónového prenosu v prítomnosti proteínu B'. [Hydroxyláza] = 21 mM, [B'] =4 mM, 40 mM, pH 7,0.

obr. 4 znázorňuje cyklický voltamogram cytochrómu P450cam.

obr. 5 znázorňuje závislosť špičkového katódového prúdu od potenciálovej skanovacej rýchlosti u cytochrómu P450cam, viazaného na gáfor a cytochrómu P450 bez gáfru.

Príklady uskutočnenia vynálezu (I) Pestovanie enzýmu

Organizmus Methylococcus capsulatus (Bath) sa pestoval spôsobom popísaným v práci S. J. Pilkington & H. Dalton (1990) „Soluble Methane Monooxygenase from Methylococcus capsulatus (Bath), Methods in Enzymol. 188, 181-190.

Pri čistení zložiek tvorených hydroxylázou a proteínom B sa použila nasledovná modifikácia publikovaného postupu:

Po úvodnom kroku iónovej výmeny sa hydroxyláza spracovala gélovou infiltračnou kolónou Superdex 200. Záverečné čistenie sa uskutočňovalo vymývaním čistej hydroxylázy z ionexovej kolóny Mono Q za použitia 0 - 30% gradientu IM NaCl. Proteín B sa čistil podobným spôsobom s tou výnimkou, že sa použilo gélové fitračné médium Superdex 75.

(ii) Modifikácia elektród

Zlaté elektródy sa modifikovali cyklovaním elektródy pri redukčných potenciáloch v 5mM roztoku hexapeptidu LysCys-Thr-Cys-Cys-Ala. Pri uskutočňovaní redukčného cyklu sa venovala pozornosť tomu, aby nebola prekročená hranica -0,85 V, pretože redukcia protónov na vodík spôsobí redukčné čistenie zlatých povrchov. Zistilo sa, že desať cyklov poskytuje dostatočnú modifikáciu. Hexaptid použitý na modifikáciu zlatej elektródy sa zakúpil od spoločnosti Sigma Chemical Company, Poole, Dorset.

(iii) Meranie redoxného potenciálu

Ako metóda na meranie redoxného potenciálu hydroxylázových centier s dvoma atómami železa sa zvolila diferenciálna pulzná voltametria (DPV).

Experimenty DPV s hydroxylázou sMMO poskytovali pri katódovom skanovaní dve vlny pri 4±10 (vlna I na obr. 1) a -386+144 mV (vlna II na obr. 1). Vrcholy sa pričítajú prenosom prvých a druhých elektrónov v hydroxylázovom centre s dvoma atómami železa.

Diferenciálna pulzná voltametria (DPV) sa uskutočňovala s obvyklou stacionárnou polykraštalickou zlatou kruhovou elektródou (priemer 4 mm), umiestnenou v sklenej bunke s malým objemom (300 - 400 ml) s troma elektródami a dvoma oddielmi. Ako referenčná elektróda slúžila saturovaná kalomelová elektróda (SCE - saturated calomel electrode) (Radiometr K-401). Všetky tu uvádzané potenciály sa vzťahujú na SCE. Všetky experimenty sa uskutočňovali v tlmivom roztoku 40mM MOPS pri pH 7,0 a teplote 23 °C.

(iv) Účinky proteínov B a B'

Okrem toho sa určovali účinky proteínov B a B' na redoxné reakcie.

Ďalšie experimenty sa uskutočňovali s pridaním regulačného proteínu B k roztoku, použitému pre DPV, aby sa určilo, či ich prítomnosť má nejaký vplyv na elektrochémiu hydroxylázy. V týchto experimentoch sa pridal proteín B k hydroxyláze v maximálnom pomere 2:1 (B k hydroxyláze). Vyššie pomery B a hydroxylázy viedli k poklesu obidvoch prúdových vrcholov až na zanedbateľné malé hodnoty, pravdepodobne následkom znečistenia elektród.Eletródy sa modifikovali pred meraním každou z rôznych koncentráciií proteínu B, aby sa zaistilo maximálne rovnomerné a čerstvé pokrytie. Ako znázorňuje obr. 2, klesajúca koncentrácia proteínu B viedla k posunu prvého i druhého potenciálového vrcholu smerom k zápornej ším hodnotám. Každý z ptenciálov však bol ovplyvnený iným spôsobom. Celký posun prvého potenciálu bol 29 mV, zatiaľ čo posun druhého potenciálu bol 47 mV. To je spôsobené rôznymi väzbovými konštantami proteínu B, pokiaľ je hydroxylázové centrum s dvoma atómami železa vo svojom stave so zmiešanou valenciou alebo v úplne redukovanom stave.

Disociačné konštanty Kd = 2,06 ± 0,23 a 7,01 + 0,45 M pre väzbu proteínu B k formám Fe(III)Fe(II) a Fe(II)Fe(II) hydroxylázy sa určili spôsobom, ktorý popísali I. M. Klotz a D. L. Hunston (1970), „Properties of Graphical Representations of Multiple Classes of Binding Sites, Biochem. 10, 3065-3069. Ako je možné vidieť na obr. 2, pridanie čistého proteínu B', ktorý je skrátenou formou proteínu B, nemá žiadny vplyv na elektrochemické vlastnosti hydroxylázy sMMO. V zmesi B+B' je účinok proteínu B na posun potenciálu menej výrazný a pozoroval sa slabý vzrast Kd pre obidva redukované stavy proteínu. V prítomnosti proteínu B' boli disociačné konštanty komplexov hydroxyláza - proteín B odhadnuté na Kd = 3,49 ± 0,17 M pre zmeišanú valenciu a Kd = 8,50 + 0,20 M pre úplne redukovaný stav. Tieto pozorovania naznačujú, že pri zmesi B+B' sa redukcia hydroxylázy stáva istým spôsobom obmedzená. Redukčné potenciály a väzbové konštanty komplexov hydroxylázy a proteínu B za rôznych skúmaných podmienok sú prehľadne uvedené v tabulke 1.

Redukčné' potenciály (mV vzhľadom k SCE) a väzäoi/é konštanty pre sMMO hydroxylázu

Methylococcus capsulatus (Bath) . Exerimentáln^ podmimky popéane v popise materiálôi/ a metódy

• w H 'Í h H H É H d t4	m M· O -1 rH O r	LD O +1 »—< o Γ	8.50 + 0.20
M
H

0)
b

H	m	m		o*
H	OJ	OJ		H
		>		•
01	o	o		o
b i	+1	+1		+1
n	vo	<o		σ\
	o	o
•e	•	•		•
14	OJ	OJ		n
	n·
	rH	00		o\

$	+1	+1		+1
U)	m		o
	CO	m		n
	m			Ί1·
H	1	1		1
				r·
		r4		i-H
	o
>	r-4	+1		+1
e
	+1	in		n
b	v	OJ		r4
U	-h	1		i
	S	+	+	+	+
	23	17	I	17	Ϊ
	(0	(0	CO	<0	co
	N	N		N		*
	'<0	*<ΰ	m	'<0	CQ	n
		r—\|		i^-H
	>1	>,	c	>1	C	c
	X	x		X
>N	o	o	O)	O	D	(U
O	M	M	JJ	M	J_1	x>
r—1	Ό	Ό	o	Ό	O	O
N	>1	>1	M		M	i-l
	X!	Ä	d.	Ä	CU	Ch

Predchádzajúce štúdie redoxných vlastností hydroxylázovej zložky sMMO dali značne široké rozmedzie redoxných potenciálov pre jednotlivé kroky prenosu elektrónov. Dva formálne redoxné potenciály pre M. capsulatus (Bath) sa určili výhradne indikátorovou titráciou a spektroskopiou EPR. Rozsah redukcie sa monitoroval výhradne pomocou spinovej kvantifikácie charakteristík spektra EPR stavu so zmiešanou valenciou. Woodland a kol. určili hodnoty E* = 106 mV a E = -269 mV a hodnoty, ktoré určil Liu boli E' = 196 mV a E = -379 mV a v neskoršich meraniach E' = -144 mV a E'' = -344 mV.

V štúdiách sMMO M. trichosporium OB3b sa použila na určenie koncentrácie redukovaných foriem Mossbauerova spektroskopia súčasne so spektroskopiou EPR. Tietrácia sMMO M. trichosporium OB3b dala formálne potenciály E' = -168 mV a E = -233 mV.

Tieto údaje týkajúce sa redoxných potenciálov hydroxylázy sMMO sú prehľadne uvedené v tabuľke 2. V týchto štúdiách sa hodnoty redoxných potenciálov určili pre jednotlivé kroky prenosu elektrónov za použitia priameho elektrochemického spôsobu s využitím modifikovanej zlatej elektródy. Redukcia úplne oxidovanej formy Fe(III)Fe(III) na formu Fe(II)Fe(III) so zmiešanou valenciou nastáva pri 4±10 mV, zatiaľ čo potenciál na vytvorenie úplne redukovanej formy Fe(II)Fe(II) sa určil na -368±10 (E). Tieto hodnoty sa odlišujú od predchádzajúcich hodnôt, ktoré, ako sa uviedlo vyššie, sa navzájom líšia (tabulka 2). V súčasnosti nie je k dispozícii žiadne jasné vysvetlenie týchto rozdielov, ale môžu byť spôsobené spôsobom prípravy, čistotou a aktivitou proteínov, použitých v každom z pokusov ako aj morfologický17 mi odlišnosťami medzi hydroxylázami M. trichosporium OB3b a M. capsulatus (Bath). Avšak hydroxylázové zložky obidvoch organizmov majú v zásade rovnaké spektroskopické charakteristiky a veľmi podobnú morfológiu ako aj podobné substrátové vlastnosti.

Preto sa musia hľadať ďalšie možné zdroje nezhôd týkajúcich sa elektrochemických výsledkov. Navrhlo sa už hľadať jeden z možných zdrojov chyby v závislosti od absolútnej kvantifikácie spektier EPA len jedného z troch redoxných stavov hydroxylázy sMMO ako prostriedku na určenie rozsahu celkovej redukcie. Iným zdrojom môže byť samotný spôsob merania. Predtým používané viaczložkové reakčné zmesi sa skladali zo súboru redoxných farbív (na kalibráciu potenciálovej osi), ditionitu alebo redukovaného metylviologenu ako redukčného činidla a kyseliny ferricíniumkarboxylovej ako oxidanta. Interakcie, ku ktorým dochádza medzi proteínom a týmito zložkami, môžu ovplyvniť redoxný potenciál a popísal sa špecifický prípad interakcie redoxného indikátora s hydroxylázou. Okrem toho môže dochádzať k istej teplotnej závislosti spojenej s týmito potenciálmi.

Meranie spektier EPR a Mossbauerových spektier sa uskutočňovali pri teplotách 4,2 až 18 K.

v>

a >N

O

TÍ

TABUIÍKA 2

Ό

OS

7—4

Ä a>

M (X|

Reference j	kO	rM	r-	CO	h o 3 n •H •G XJ
w g u		o	in		OJ
>	in	o	m	rH	tT
	OJ	r-4	γΉ	OJ	rH
	1	1	1	+	1
>	*	*—’	·*-·	*—·	*«—'
e	en	T	cn	n	kO
*	kO	«3*	Γ'	OJ	CO
s	Ol	m	m	Ol	m
H	1	1	1	1	1
s NHE)	350)	00)	CO	kO
►	-t-	•H	<9·	O“	CO
·		+	+	+	TJ⁴
s	90		kO	CO	Ol +
w	iH	14	19	\o rH	v
H	+	1	1	¹	+
				3b
	x:	ň	-G	ca	Λ
	xJ	XJ	XJ	o	XJ
0	Ba	Ba	rd QQ	E	(d a
—	·-	—	3	—»
u M	cn	w	cn	•H J-l	M
3	□	□	3	o	3
O	XJ	XJ	XJ	a	J-J
a	id	(d	ftí	U1	(d
		rd	rH	o	r-M
a	3	3	3	x:	3
•H	ta	m	U	u	ca
a>	a	a	a	•H	a
jj	(d	<d	td	u	<d
o	u	u	a	u	u
u	•			•
cu	s	s	*?·	s	2

Tabuľka I ilustruje vzťah medzi redoxnými potenciálmi a väzbou proteínu B k hydroxyláze v situácii, kedy centrum s dvoma atómami železa je v rôznych oxidačných stavoch. Napriek rozdielom v redukčných potenciáloch medzi M. capsulatus (Bath) a M. trichosporium OB3b (tabuľka 2) sú disociačné konštanty pre obidva komplexy Fe(III)Fe(II).B podobné, t.j. Kd = 2,06 mM pre prvý z nich a Kd = 1,7 mM pre druhý. Avšak disociačné konštanty pre komplexy Fe(II)Fe(II).B sa značne líšia a predstavujú Kd = 7,01 pre M. capsulatus (Bath) a Kd = 500 mM pre M. trichosporium OB3b.

Pozorovali sa zaujímavé efekty, keď sa v roztoku hydroxylázy, ktorý sa má elektrochemický redukovať, nachádza proteín B'. Proteín B' samotný nemá žiadny vplyv na redoxné správanie hydroxylázy. Väzba proteínu B sa však stáva slabšou v prítomnosti proteínu B' a vedie k mierne vyšším pozorovaným Kd s hodnotou 3,49 ±0,17 M pre formu Fe(II)Fe(III) a 8,5 ± 0,20 M pre komplex Fe(II)Fe(II). To naznačuje, že proteín B' sa viaže aj k hydroxyláze, ale nevytvára taký silný komplex, čo je v súlade s výsledkami SPR.

(v) Eletrochémia

Uskutočnili sa priame elektrochemické merania hydroxylázy sMMO bez použitia mediátora s použitím modifikovaných zlatých elektród.

(vi) Použitie cytochrómu P450cam

Obr. 4 ukazuje cyklické voltamogramy na grafitovej elektróde „edge-plane s (1) 15 M cytochrómu pH 7,4 a (2) 18 M cytochrómu P450cam v 40 mM tlmivom roztoku, predstavovanom fosforečnanom draselným, pH 7,4 obsahujúcim 1 mM D-(+)-gáfor. Formy viazané na gáfor prejavujú podobne tvarované odpovede (obr. 4) pri -390 10 mV. Tieto potenciály a posun potenciálu pri gáfrovej väzbe s velkosťou 136 mV ku kladnejším hodnotám sú v rozumnej zhode s predchádzajúcimi potenciometricky určenými hodnotami -540 mV a -414 mV.

Obr. 5 znázorňuje závislosť špičkového katódového prúdu od rýchlosti potenciálového skanovania pre cytochróm P450cam viazaný na gáfor alebo bez gáfru. Podmienky sú rovnaké ako pri obr. 1, len teplota sa rovnala 18 *C. Špičkový katódový prúd prejavuje lineárnu závislosť od druhej odmocniny skanovacej rýchlosti (/v) pre P450cam viazaný na gáfor, čo naznačuje, že celkový proces je riadený difúziou.

(vii) Elektrochemická premena gáfru na 5-exo-hydroxygáfor

Po zvládnutí elektrochémie cytochrómu P450cam sa enzým použil na premenu gáfru na 5-exo-hydroxygáfor. Enzým sa udržiaval na povrchu elektródy Eastmanovou membránou AQ40. Potenciál sa menil od +0,2 na -0,8 V pomalým skanovaním pri 50 mV/s; do roztoku sa privádzal O; a celý systém sa periodicky analyzoval na obsah 5-exo-hydroxygáfru. Zistilo sa, že vytváranie 5-exo-hydroxygáfru sa po 2 hodinách zvýšilo na 100 %.

Aj keď sa v predloženom popise vynálezu uvádzajú výroky teoretickej povahy týkajúce sa mechanizmu, o ktorom sa predpokladá, že popisuje, ako niektoré tu popisované procesy prebiehajú, nie je rozsah predmetu predloženého vynálezu týmito výrokmi žiadnym spôsobom obmedzený.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob prenosu elektrónov medzi elektródou a enzýmom v elektrochemickom procese, vyznačujúci sa tým, že sa spôsobí prilipnutie enzýmu k elektróde.
2. Spôsob podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým, že prenos je priamy.
3. Spôsob elektrochémie enzýmu, vyznačuj úci sa t ý m , že sa jedná o priamu elektrochémiu uskutočňovanú v neprítomnosti mediátorov.
4. Spôsob podlá ktoréhokolvek z nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že enzýmom je metánmonooxygenáza.
5. Spôsob podlá ktoréhokolvek z nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že enzýmom je P450 alebo modifikovaný P450.
6. Spôsob podlá ktoréhokolvek z nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že enzýmom je hydroxyláza.
7. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že hydroxylázou je rozpustná monooxygenáza.
8. Spôsob podľa ktoréhokolvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že enzým obsahuje aktívne miesto s dvoma atómami železa.
9. Spôsob podľa ktoréhokolvek z nárokov 1 až 8, vy22 tým značujúci sa tým, že aktívne miesto, obsahujúce porfyrín.
10. Spôsob podlá ktoréhokoľvek z nárokov 3 až 9, vyznačujúci sa tým, že elektrochémia zahŕňa

I priamy prenos elektrónov.
11. Spôsob podlá ktoréhokoľvek z predchádzajúcich náro kov, vyznačujúci sa tým, že elektrochémia sa uskutočňuje s použitím modifikovanej zlatej elektródy.
12. Spôsob modifikácie elektródy, ktorý spôsobuje, že je vhodná na použitie v elektrochémii enzýmov v neprítomnos ti mediátorov, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa ošetrenie elektródy peptidom.
13. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci s tým, že enzýmom je monooxygenáza.
14. Spôsob podľa nároku 12 alebo 13, vyznačuj ú ci sa tým, že enzým má aktívne miesto obsahujúce dva atómy železa alebo porfyrín.
15. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 12 až 14, v y značujúci sa tým, že peptid zahŕňa hexapeptid.
16. Spôsob podľa nároku 15, vyznačujúci s tým, že hexapeptid obsahuje zvyšky Cys a Lys.
17. Spôsob podľa nároku 16, vyznačujúci s , že hexapeptidom je Lys-Cys-Thr-Cys-Cys-Ala.
18. Spôsob podía ktoréhokoľvek z nárokov 12 až 17, v yznačujúci sa tým, že ošetrenie zahŕňa voltametrické cyklovanie elektródy v roztoku hexapeptidu a zabránenie redukčnému čisteniu elektródy.
19. Spôsob oxidácie substrátu molekulovým kyslíkom v prítomnosti enzýmu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa priamu elektrochémiu v neprítomnosti mediátorov.
20. Spôsob podía nároku 19, vyznačujúci sa tým, že enzýmom je monooxygenáza.
21. Spôsob podía nároku 20, vyznačujúci sa tým, že enzým má aktívne miesto obsahujúce dva atómy železa alebo porfyrín.
22. Spôsob podía ktoréhokoľvek z nárokov 19 až 21, vyznačujúci sa tým, že substrátom je metán, ktorý sa oxiduje na metanol.
23. Spôsob podía ktoréhokolvek z nárokov 19 až 21, vyznačujúci sa tým, že substrátom je gáfor, ktorý sa oxiduje na 5-exo-hydroxygáfor.
24. Spôsob podía ktoréhokolvek z nárokov 19 až 21, vyznačujúci sa tým, že substrát obsahuje polycyklické aromatické uhľovodíky, ktoré sa oxidujú na 5exo-hydroxygáfor.
25. Spôsob podía ktoréhokolvek z nárokov 22 až 24, vyznačujúci sa tým, že hydroxyláza je odvodená z cytochrómu P450cam.
26. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že cysteín je odstránený z reakčného prostredia.
27. Spôsob prenosu elektrónov medzi eletródou a enzýmom v elektrochemickom procese v zásade tak, ako sa popísalo vyššie s odvolaním na príklady a obrázky.
28. Spôsob uskutočňovania elektrochémie enzýmu v zásade tak, ako sa popísalo vyššie s odvolaním na príklady a obrázky.
29. Spôsob modifikácie eletródy, ktorý spôsobuje, že je vhodná na použitie v elektrochémii enzýmov v neprítomnosti mediátorov v zásade tak, ako sa popísalo vyššie s odvolaním na príklady a obrázky.
30. Spôsob oxidácie substrátu molekulovým kyslíkom v prítomnosti enzýmu v zásade tak, ako sa popísalo vyššie s odvolaním na príklady a obrázky.