KR20000011066A

KR20000011066A - 효소의 직접 전기화학방법

Info

Publication number: KR20000011066A
Application number: KR1019980709218A
Authority: KR
Inventors: 하워드 달톤; 휴 알렌 올리버 힐; 유라트 카즐라우스카이트; 퍼트리샤 칼라한 윌킨스
Original assignee: 모건 데이비드 제이; 비지퍼블릭리미티드캄퍼니
Priority date: 1996-05-10
Filing date: 1997-05-08
Publication date: 2000-02-25
Also published as: US6231746B1; AU716380B2; GB2312960B; WO1997043632A1; CZ358898A3; EP0897537A1; KR100354419B1; JP2000511630A; SK154298A3; AU2707897A; GB2312960A; RU2157521C2; CA2254352A1; PL329761A1; NZ332486A; GB9709215D0

Abstract

본 발명은 효소의 직접 전기화학방법에 관한 것으로서,

효소가 전극에 부착되도록 전기화학적 방법으로 전극과 효소사이에 전자를 전달하고, 상기의 전달방법은 직접 일어나는 것을 특징으로 한다.

Description

효소의 직접 전기화학방법

본 발명은 효소의 전기화학방법, 특히 히드록실라제의 전기화학방법에 관한 것이다.

히드록실라제는 다양한 물질의 산화에 있어서 촉매로서 공지되어 있다. 예를들면 메탄 모노옥시게나제는 분자성 산소에 의해 메탄을 산화하여 유일한 생성물인 메탄올을 제공하는 유용한 촉매이다.

히드록실라제의 전기화학의 구조 및 기작의 연구는 문헌에 보고되어 있다.

효소인 메탄 모노옥시게나제는 가용성(sMMO)과 입자성(pMMO)의 두가지 형태가 있다. 메틸로코커스 캡술라투스(Methylococcus capsulatus(Bath))에서의 가용성 효소는 히드록실라제(Mr 250.5kDa), 환원효소(Mr 38.5kDa) 및 조절성분으로 단백질 B(Mr 15.9kDa)로 이루어지며, 모두 활성에 요구된다. 상기 히드록실라제는 a2b2g2 배열에서 2개의 프로모터로 이루어지고, 상기 성분의 X선 결정구조가 해결되었다. 메틸로시누스 트리코스포륨 OB3b(Methylosinus trichosporium OB3b)에서의 sMMO는 매우 유사한 조성을 가지며, 또한 잘 특징화되어있다. sMMO내 활성자리는 두 개의 철 중심과 (나머지 효소에서)히드록소그룹에 의해 브리지되며, 히드록실라제의 소단위에 위치한다. NADH에서 환원되는 당량은 환원효소내 F₂S₂및 FAD 중심을 통해 활성자리로 전달된다. 단백질 B는 금속이온 또는 보조인자를 포함하지 않으며, 그의 상세한 조절 역할은 명확하지 않다. 남은 효소에서, 철은 완전하게 산화된 Fe(III)Fe(III) 상태에 있다. 두 개의 철 클러스터, 즉 혼합된 원자가 Fe(III)Fe(II) 및 완전히 환원된 Fe(II)Fe(II)상태로 이용할 수 있는 두 개의 다른 산화상태가 있다. 효소가 전환하는 동안 O₂를 활성화할 수 있고 반응할 수 있는 히드록실라제는 Fe(II)Fe(II) 형태이다.

엠. 캡술라투스(Bath) 및 엠. 트리코스포륨 OB3b에서 두 개의 철 중심의 산화환원 전위는 세 개의 독립적인 연구에 의해 측정되었다. Fe(III)Fe(III)/Fe(III)Fe(II) 및 Fe(III)Fe(II)/Fe(II)Fe(II) 커플에 대한 Eo'값은 몇가지 토론의 주제이다. 두 개의 다른 생물체에서 가용성 메탄 모노옥시게나제의 히드록실라제 성분의 산화환원성질이 광범위하게 조사되었다. 환원된 종의 농도를 측정하기 위한 분광학적 방법 및 산화환원 지시약 적정이 이전에 연구되었다. 산화환원 활성 전달인자를 갖는 히드록실라제 2개의 철 중심의 간접 적정이 상기 연구에서 사용되었다. 혼합된 원자가 및 완전하게 환원된 히드록실라제종의 농도가 매우 낮은 온도에서(4.2-18°K) EPR 또는 EPR 및 모에스바우어(Moessbauer) 분광학에 의해 측정되었다.

단백질 전기화학 분야에서, 티올- 또는 디설피드-함유 유기 분자는 강한 금-황 결합을 통해 화학흡착을 하여 전극의 안정한 표면 피복층이 형성되기 때문에 상기는 특히 좋은 변형체로 알려져 있다. 또한 관련된 아미노산은 상기 형태로 화학흡착할 수 있으며, 전극표면에서 단백질의 전기화학을 촉진시킨다. 단백질의 전기화학에서 프로모터로 기능성 아미노산(예를들면 아르기닌, 리신, 히스티딘)을 함유하는 시스테인 함유 펩티드를 사용하여 조사되었다.

그러나 단백질 전기화학의 분야에 반하여, 산화환원 효소에서 전달인자를 사용하지 않고 직접 전기화학측정을 실시하는 것은 평범한 일은 아니다. 산화환원 중심이 표면에서 떨어져 단백질안에 깊게 묻혀있어, 전자가 전극으로 가로지를 수 있는 거리는 무시할 수 있을 만큼의 작은 값으로 전자 전달의 속도를 크게 감소시킨다는 주된 어려움이 있다. 대부분의 산화환원 효소가 더 커질수록 비산화환원 단백질보다 구조적으로 덜 견고해지며, 상기는 전극 표면상에서 활성의 손실 및 변형을 일으킬 수 있다.

전달인자의 존재하에서 히드록실라제의 전기화학은 히드록실라제와 전달인자사이의 반응 가능성에 의해 복잡하게 될 수 있고, 한편 전달인자는 산화환원반응이 실시될 때와는 다른 온도에서 종의 농도를 측정하는 것을 방해한다.

본 발명의 목적은 상기의 단점을 피하는데 있다.

본 발명의 한가지 측면에 따르면, 전기화학방법에서 전극과 효소사이에 전자의 전달방법은 전극에 효소를 부착시키는 것으로 이루어진다.

바람직하게 전달은 직접 일어난다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 효소의 전기화학방법은 전달인자 없이 실시되는 직접 전기화학방법으로 이루어진다.

본 발명의 한가지 구체예에서, 효소는 모노옥시게나제이다.

본 발명의 다른 구체예에서, 효소는 P450 또는 변형된 P450이다.

본 발명의 부가적인 구체예에서, 효소는 메탄 모노옥시게나제이다.

본 발명의 부가적인 구체예에서, 효소는 히드록실라제이다.

상기 히드록실라제는 가용성 메틸 모노옥시게나제이다.

상기 효소는 두 개의 철중심을 갖는 활성자리를 포함하거나 또는 선택적으로 상기 효소는 포피린-함유 활성자리를 포함할 것이다.

바람직하게, 상기 전기화학은 변형된 금전극을 사용하여 실시된다.

본 발명의 부가적인 측면에 따르면, 전달인자 없이 효소의 전기화학에 사용되는데 적당한 전극을 만들기위해 전극을 변형시키는 방법은 펩티드로 전극을 처리하는 것으로 이루어진다.

바람직하게 상기 효소는 모노옥시게나제이다.

적당한 상기 효소는 두 개의 철 또는 포피린-함유 활성자리를 갖는다.

편리하게 상기 펩티드는 헥사펩티드로 이루어진다.

바람직하게 상기 헥사펩티드는 cys 및 lys 잔기를 함유한다.

적당하게 상기 헥사펩티드는 lys-cys-thr-cys-cys-ala이다.

편리하게 전극의 환원세척을 피하는 한편 헥사펩티드 용액내 전극의 전압측정 사이클을 포함한다.

본 발명의 부가적인 측면에 따르면, 효소존재하에서 분자성 산소에 의해 기질을 산화시키는 방법은 전달인자 없이 실시되는 직접 전기화학방법으로 이루어진다.

본 발명의 한가지 구체예에서, 상기 효소는 모노옥시게나제이다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 효소는 두 개의 철 또는 포피린-함유 활성자리를 갖는다.

상기 기질은 메탄올로 산화될 수 있는 메탄일 수 있거나 또는 상기 기질은 캄퍼일 수 있고, 5-엑소-히드록시캄퍼로 산화되거나 또는 상기 기질은 5-엑소-히드록시캄퍼로 산화될 수 있는 다중고리형 방향족 탄화수소로 이루어진다.

상기 히드록실라제는 바람직하게 시토크롬 P450cam에서 유도된다.

적당하게, 시스테인은 반응매체에서 제거된다.

펩티드로 변형된 전극은 효소를 끌어당기게 하기위하여 더 많은 같은 성질의 표면을 제공하는 것을 알았다.

엠.캡술라투스(Bath) sMMO의 히드록실라제 성분과 전극사이에 전자전달이 일어나기위해 양성의 전하를 갖는 표면이 바람직한 것으로 사료된다. 바람직한 헥사펩티드내 lys잔기의 e-아미노기는 아마도 상기의 역할을 잘 이룰 것이다. 상기 특정 펩디드로 전극의 전기화학적 변형은 화학적 흡착에 의해 변형된 전극과 비교하여 안정한 단일층과 더 균일한 표면 피복력을 제공한다(예를들면 펩티드용액내 전극의 단순침지).

상기 전극은 변형된 금전극이며, 예를들면 금전극은 헥사펩티드인 lys-cys-thr-cys-cys-ala로 처리함에 의해 변형된다. 상기 처리는 전극의 환원 세척을 피하면서 헥사펩티드용액내 전극을 사이클링시킴에 의해 실시될 수 있다.

히드로라제 용액의 전기화학에서 단백질 B와 단백질 B'의 효과는 중요하다. 혼합된 원자가 상태의 EPR 분광기는 히드록실라제에 결합된 단백질 B가 두 개의 철자리의 주위환경을 바꾸는 것을 보여준다. 이전의 연구에서 또한 두 개의 철 전위에서 전이를 일으키는 것이 관찰되었다.

히드록실라제-단백질 B 착화합물의 형성은 두 개의 철 자리의 성질을 바꾸고, 생성물 분포에 영향을 주며, sMMO촉매 사이클내 몇가지 중간물의 형성속도를 증가시키는 것이 알려져 있다. 상기의 모든 효과는 활성자리로 전달될 수 있도록 결합되었을 때 히드록실라제내에서 단백질 B의 형태적 변화를 유도함에 의한 것이다. 상기 히드록실라제의 산화환원 전위는 이전의 연구에서 관찰된 것과 같이 단백질 B의 존재에 의해 영향을 받는다는 것을 알려져 있다. 히드록실라제에 단백질 B를 결합시킴에 의해 산화환원 전위내 음전이는 철의 제1 배위구 내에서의 변화 또는 히드록소 브리지의 양성자 상태에서의 변화에 의한 것이다. 단백질 B의 결합에서 형태적 변화에 의한 활성자리 환경의 구조 또는 용매 접근성에서의 변화와 같은 다른 효과는 또한 전위의 변화 때문이다. 출원인은 Fe(II)Fe(II) 착화합물에 대한 Kd값이 2.06±0.23M이고, Fe(II)Fe(III) 착화합물에 대해서는 7.01±0.45M로 측정되었다. 그러므로 산화환원전위내 감소는 히드록실라제의 산화상태에 의존하여 히드록실라제와 단백질 B 성분 사이의 감소된 친화성의 반영일 것이다.

엠. 캡술라투스(Bath) 효소계에서, 두가지 형태의 조절 단백질 B가 일반적인 방법으로 정제된다. 상기는 완전한 길이의 단백질 B와 12개의 아미노산이 뒤섞인 단백질 B'이다. 표면 플래즈몬 공명(SPR)을 사용한 결합연구는 단백질 B'가 완전히 산화된 히드록실라제와 착화합물을 형성하고, 상응하는 단백질 B의 착화합물보다 3배 덜 안정하다. 우리의 조사는 단백질 B'가 단백질 B와 같은 자리에 결합되고, 전자는 두 개의 철중심으로 전달되고 활성자리의 산화환원 전위 및 다른 성질을 바꾸는 히드록실라제내 같은 형태적인 변화를 일으킬 수 없다는 것을 제시하였다. 그러므로 뒤섞인 단백질 B'의 형성은 생물체내 몇 가지의 조절역할을 가질 수 있다. 특정의 조건하에서 단백질 B는 단백질 B'을 형성하기위하여 분해되고, 히드록실라제내 형태적 변화(및 부수적인 활성자리성질의 변화)가 일어날 수 있다. 이와같이 상기 세포는 스트레스를 받았을 때 부족한 자원을 보존할 수 있다. 우리는 전달인자의 개입없이 직접 전기화학방법은 가용성 메탄 모노옥시게나제의 히드록실라제 성분보다 큰 비-전자 전달 단백질일 수 있다는 것을 발견하였다.

이미 언급한 바와같이, 예를들면 시토크롬 P450cam에서 유도된 히드록실라제를 사용하여 메탄을 메탄올로 산화 또는 캄퍼를 5-엑소-히드록시캄퍼로 산화, 특히 캄퍼를 5-엑소-히드록시캄퍼로 산화하는 방법이 있다. 후자의 경우에, 우리는 반응매체에서 시스테인을 제거하는 것이 적당한 것을 알았다.

박테리움 슈도모나스 푸티다(캄퍼에서 성장, bacterium Pseudomonas putida)의 본래의 포피린 중심 히드록실라제는 분리형 단백질 분자에서 두 개의 산화환원중심사이에 전자전달의 조절을 연구하기위한 이상적인 시스템이다.

시토크롬 P450cam은 D-(+)-캄퍼의 모노옥시겐화를 촉진하여 두 개의 환원당량의 외부원이 요구되는 5-엑소-히드록시 캄퍼를 제공한다. 상기 전자가 NADH에서 FAD-플라보프로테인 푸티다레독신 환원효소와 철-황 단백질 푸티다레독신의 조합된 행동을 통해 P450cam의 헴(haem) 철로 전달된다. 캄퍼 결합하에서 헴 광학 스펙트럼내 관찰되는 놀라운 변화는 기질이 없을 때 저스핀상태에서 기질이 결합된 단백질에서 고스핀으로 페리헴 철의 스핀상태에서 전이하는 모스바우어(Mossbauer) 및 EPR연구에서 볼 수 있다. 또한, 캄퍼가 결합될 때 상기 스핀 상태의 변화가 -540mV에서 -414mV(대 SCE)로 산화환원 전위 변화에 의해 이루어질 수 있는 것이 알려져 있다. 상기 헴환원 전위에서 전이는 P450cam 촉매사이클의 중요한 특성이며, 제1 전자가 푸티다레독신에서 전달되고, 촉매의 전환이 개시된다.

양이온 피이크 전류는 전체 과정이 조절된 분산이라는 지적하에서 캄퍼-결합 P450cam에 대한 스캔 속도(v)의 제곱근에 의존하는 선형이다.

그러나 선형에서의 일탈은 캄퍼가 없는 효소에서 관찰된다. 상기는 전극 표면의 흡착에 의해서 또는 이종의 전자 전달방법이 더 이상 조절된 분산이 아니라는 사실에 의한다. 상기의 첫 번째는 캄퍼-결합 및 캄퍼가 없는 P450cam의 총체적 구조가 매우 유사하기 때문에 상기의 두형태는 전극표면에 대해 유시한 친화성을 가질 것으로 기대된다. 그러므로 상기는 캄퍼가 없는 형태로의 이종의 전자전달 속도는 캄퍼가 결합된 형태에서보다 더 낮다는 것을 의미한다. 상기는 6배위, 저스핀의 캄퍼가 없는 효소로부터 형성된 5배위 고스핀의 철(II)을 제조하기위하여 요구되는 상대적으로 높은 재조직화에 기인할 수 있으며, 헴-결합 물 리간드가 손실된다. 상기 필수조건은 철(III) 및 철(II) 형태에서 6배위 헴 철을 가지며, 시토크롬의 환원과 비교하여 높은 재조직화 에너지를 갖는 것으로 보여지는 마이오글로빈의 환원에 관한 것과 유사하다.

캄퍼-결합 P450cam과 같이, 상기 효소의 철(III) 및 철(II) 형태가 5배위의 고스핀 헴 철을 가지며, 동종 및 이종의 전자전달에 대한 재조직화 경계는 낮을 것이다.

노출된 음전하의 cpg 전극에서 P450cam의 전기화학적 반응은 pH 7.4(pl=4.55)에서 단백질의 전체 음전하에도 불구하고, 양전하를 띤 표면 아미노산 잔기의 특정 패턴은 이종의 전자전달이 일어나기 때문에 전극 표면과 효소사이의 반응이 유익하다는 것을 제시하였다. 컴퓨터 모델링 및 돌연변이화 연구는 P450cam의 표면에서 기본잔기인 Arg-72, Arg-112, Arg-364 및 Lys-344가 상기 두 개의 단백질사이의 착화합물내 푸티다레독신의 표면에서 산성 잔기와 반응한다는 것을 나타낸다. P450cam의 높은 해상도의 결정구조로부터, 상기 표면잔기는 헴의 근접한 측면에서 및 헴이 표면에 가장 가까운(약 10A) 효소의 영역에 있다. 상기 전자 전달속도 상수가 주개 받개 분리로 감소되기 때문에, P450cam의 표면에서의 영역은 푸티다레독신에 대한 결합자리 및 전극과 반응하는 영역에서 형성될 것이다. 이와같이, 상기 양전하를 띤 잔기는 또한 P450cam 및 노출된 cpg 전극사이의 반응에서 포함된다는 것을 보여준다.

이와같이, 가장자리면 흑연전극은 성공적으로 제1 전자 전달에서 생리적 전자 전달 단백질의 사슬을 시토크롬 P450cam으로 치환시킬 수 있고, 상기 직접 전기화학방법은 기질 의존성이 있다.

본 발명은 첨부된 실시예와 도면을 참고로 부가적으로 기술될 것이다.

도 1은 40mM MOPS, pH 7.0에서 lys-cys-thr-cys-cys-ala 변형된 금전극에서 23.6mM의 히드록실라제 용액의 차동 전압전류그램을 보여주며(배경전류는 빠진다);

도 2A 및 도 2B는 첫 번째(a) 및 두 번째(b) 전자 전달의 전위에서 단백질 B(1) 또는 B'(2)의 증가되는 농도의 효과를 보여준다. [히드록실라제]=21mM, 40mM의 MOPS, pH 7.0. 상기 전극은 각 측정전에 측정된다.

도 3A 및 도 3B는 단백질 B'의 존재하에서 첫 번째(a) 및 두 번째(b) 전자전달의 전위에서 단백질 B(1)의 증가되는 농도에서의 효과를 보여준다. [히드록실라제]=21mM, [B']=4mM, 40mM, pH 7.0

도 4는 시토크롬 P450cam의 고리 전압전류그람을 보여준다.

도 5는 캄퍼-결합 및 캄퍼가 없는 시토크롬 P450cam에 대한 전위 스캔 속도에서 양이온 피크 전류의 의존성을 보여준다.

(1) 효소의 성장

메틸로코커스 캡술라투스(Bath) 생물체의 성장이 필킹톤 에스.제이.(Pilkington, S.J.)와 달톤 에이취.(Dalton H.)(1990)의 “Soluble Methane Monooxygenase from Methylococcus Capsulatus(Bath)”에 기술된대로 실시되었다. Methods in Enzymol. 188, 181-190.

히드록실라제 및 단백질 B 성분의 정제에서, 발표되어 있는 방법을 하기와 같이 변형하여 실시하였다: 초기 이온교환 단계후에, 히드록실라제를 슈퍼덱스(Superdex) 200 겔 침투 칼럼에 가한다. 1M NaCl 0-30% 구배를 사용하여 모노 Q 이온 교환 칼럼에서 순수한 히드록실라제의 유출에 의해 최종적으로 정제된다. 단백질 B는 겔여과 매체가 슈퍼덱스 75라는 것을 제외하고는 유사한 방법으로 정제된다.

(2) 전극의 변형

금전극이 5mM의 헥사펩티드 lys-cys-thr-cys-cys-ala 용액내 환원전위에서 전극을 사이클링함에 의해 변형된다. 환원 사이클을 실시할 때, 수소로 양성자의 환원은 금표면을 환원적으로 세척하는데 유효하기 때문에 -0.85V의 한계를 초과하지 않는다. 10개의 사이클이 적절한 변형을 주는 것으로 알려져 있다. 금전극을 변형시키는데 사용되는 헥사펩티드는 Sigma Chemical Company, Poole, Dorset에서 구입할 수 있다.

(3) 산화환원 전위의 측정

차동 펄스 전압전류법(DPV)은 히드록실라제 두 개의 철 중심의 산화환원 전위를 측정하기위해 선택되는 방법이다.

sMMO 히드록실라제로 DPV 실험은 양이온 스캔동안 두 개의 파장인 4±10(도 1에서 파장 1) 및 -386±144mV(도 1에서 파장 2)를 생성한다. 상기 피크는 히드록실라제 두 개의 철 중심으로 첫 번째 및 두 번째의 전자를 전달하도록 기여한다.

차동 펄스 전압전류법(DPV)는 작은 부피의(300-400ml) 3개의 전극이 두 개의 격벽 유리전지에 배열되는 종래의 고정식 다결정 금(4mm 직경) 디스크 전극에서 실시된다. 포화된 칼로멜 전극(SCE)(복사계 K-401)이 기준전극으로 제공된다. 여기서 모든 전위는 SCE에 관한 것이다. 모든 실험은 pH 7.0 및 23℃의 40mM MOPS완충액에서 실시한다.

(4) 단백질 B 및 B'의 효과

부가적으로 산화환원반응에서 단백질 B와 B'의 효과가 측정된다.

또한, 상기 실험은 히드록실라제 전기화학에서 단백질 B의 존재의 효과가 있는지를 측정하기위하여, 차동 펄스 전압전류법에 대해 사용되는 용액에 조절 단백질 B를 첨가하여 실시된다. 상기 실험에서 단백질 B는 2:1(B:히드록실라제)의 최대비율로 히드록실라제에 첨가된다. 더 높은 단백질 B:히드록실라제 비율은 전극이 오염됨에 의해 무시할 수 있는 작은 양으로 양쪽의 전류 피크에서 감소된다. 상기 전극은 최대로 균일하고, 새로운 커버력을 유지하기위하여 각각 다른 단백질 B의 농도로 측정하기전에 변형된다. 도 2에서 볼 수 있는 것과 같이 단백질 B의 농도가 증가하면 더 음의 값을 향해서 제1 및 제2 파장 피크 전위가 전이된다. 그러나 각각의 전위는 다르게 영향을 받는다. 제1 전위에서 전체 전이는 29mV이지만, 제2에서는 47mV이다. 상기는 히드록실라제 두 개의 철 중심이 혼합된 원자가 또는 완전히 환원된 상태에 있을 때 단백질 B에 대한 다른 결합상수에 기인한다.

해리상수. Kd=2.06±0.23M 및 7.01±0.45M은 Klotz, I.M. & Hunston, D.L. (1970) “Properties of Graphical Representations of Multiple Classes of Binding Sites”, Biochem. 10, 3065-3069에 따라 각각 히드록실라제의 Fe(III)Fe(II) 및 Fe(II)Fe(II) 형태에 결합하는 단백질 B에 대해서 측정된다. 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 순수한 단백질 B'의 첨가인 단백질 B의 절단된 형태는 sMMO 히드록실라제의 전기화학에서 영향을 주지않는다. 그러나 B+B'의 혼합물에서, 전위 전이내 단백질 B의 효과는 덜 알려져 있고, 단백질의 환원된 상태들에서 Kd의 약간의 증가가 관찰된다. 단백질 B'의 존재에서, 혼합된 원자가에 대한 Kd=3.49±0.17M 및 완전히 환원된 상태에서 Kd=8.50±0.20M이 히드록실라제-단백질 B 착화합물에 대해 측정된다. 상기는 히드록실라제가 환원된 B+B'의 혼합물이 다소 한정된다는 것을 나타낸다. 조사되는 다양한 조건하에서 히드록실라제-단백질 B 착화합물의 결합상수 및 환원전위는 표 1에 요약하였다.

메틸로코커스 캡술라투스(Bath)에서 sMMO 히드록실라제에 대한 결합상수 및 환원전위(mV 대 SCE)

성분	E'(mV)	E''(mV)	Kd, mMFe(II)Fe(II	Kd, mMFe(II)Fe(II).B
히드록실라제 23mM	+4±10	-386±14	2.06±0.23	7.01±0.45
히드록실라제 17mM+단백질 B 8mM	-25±14	-433±8	2.06±0.23	7.01±0.45
히드록실라제 17mM+단백질 B 8mM+단백질 B' 4mM	-13±17	-430±9	3.49±0.17	8.50±0.20

상기에서, 실험조건은 물질 및 방법에 기술되어 있다.

sMMO의 히드록실라제 성분의 산화환원 성질에 대한 종래의 연구는 개개의 전자 전달 단계에 대한 산화환원 전위의 꽤 넓은 범위를 준다. 엠.캡술라투스(Bath)에 대한 두 개의 형식 산화환원 전위는 산화환원 지시약 적정 및 EPR 분광학을 사용하여 측정된다. 상기 환원의 정도는 혼합된 원자가 상태의 특징적인 EPR 스펙트럼의 스핀 정량화에 의해 모니터된다. 우드랜드(Woodland) 등은 E'=-106mV 및 E''=-269mV의 값을 보고하였고, LiU는 E'=-196mV 및 E''=-379mV이고, 최근 측정에 의하면 E'=-144mV 및 E''=-344mV이다.

엠. 트리코스포륨 OB3b sMMO의 연구에서, 모스바우어 분광학이 환원된 종의 농도를 측정하기위하여 EPR 분광학과 병렬적으로 사용된다. 상기 엠. 트리코스포륨 OB3b sMMO 적정은 E'=-168mV 및 E''=-233mV의 형식전위를 나타낸다.

sMMO 히드록실라제의 산화환원 전위의 데이터는 표 2에 요약되었다. 상기 연구에서, 산화환원 전위 값은 변형된 금전극을 가지고 직접 전기화학방법을 사용하여 개개의 전자 전달단계에 대해 측정되었다. 완전히 산화된 Fe(III)Fe(III) 형태에서 혼합된 원자가의 Fe(II)Fe(III) 상태로의 환원은 완전하게 환원된 Fe(II)Fe(II) 종의 형성에 대한 전위가 -368±10mV(E'')로 측정되는 것에 대해 4±10으로 나타난다. 상기의 원자가는 상기에 언급된 것과 같이 그들 사이의 차이에 대해 보고된 종래의 보고와는 차이가 있다. 여기에서, 상기의 차이에 대한 명확한 설명이 없으며, 엠.트리코스포륨 OB3b 및 엠. 캡술라투수(Bath) 히드록실라제 사이의 몇가지 형태적인 차이 뿐만아니라 각 연구에서 사용되는 단백질의 제조, 순도 및 활성이 관련될 것이다. 그러나 두 개의 생물체에서 히드록실라제 성분은 필수적으로 유사한 기질 특이성 뿐만아니라 매우 유사한 동질성 및 동일한 분광학 특성을 갖는다.

그러므로, 상기 전기화학 결과 사이의 상이함에 대한 다른 가능한 원인이 고려될 수 있다. 실수의 하나의 가능한 원인은 전체 환원의 정도를 측정하기위한 수단으로서 sMMO 히드록실라제의 3개의 산화환원 상태 중 오직 하나의 EPA 스펙트라의 절대 정량화에 의존한다는 것이 이미 제시되었다. 다른 원인은 측정방법 자체에 있다. 초기 다-성분 반응 혼합물은 산화환원 염료(전위축의 보정을 위하여), 디티오나이트 또는 환원제로 환원된 메틸비오로겐 및 산화제로 페리시늄카르복시산의 세트로 이루어진다. 단백질과 상기 성분사이에 일어나는 반응은 산화환원 전위에 영향을 주고, 히드록실라제로 산화환원 지시약 반응의 특정 경우가 보고되었다.

또한 상기 전위에 조합되는 약간의 온도 의존성을 갖는다.

상기 EPR 및 모스바우어 측정은 4.2-18K에서 실시된다.

sMMO의 히드록실라제 성분에 대해 보고된 환원전위의 요약

단백질원	E'mV(vs NHE)	E'', mV(vs NHE)	기준
엠. 캡술라투스(Bath)	+106(+350)	-269(-25)	6
엠. 캡술라투스(Bath)	-144(+100)	-344(-100)	1
엠. 캡술라투스(Bath)	-196(+48)	-379(-135)	7
엠. 트리코스포륨 OB3b	-168(+76)	-223(+21)	8
엠. 캡술라투스(Bath)	+4(+248)	-386(-142)	상기 작업

표 1은 두 개의 철 중심이환원적으로 다른 산화상태에 있을 때, 히드록실라제에 결합하는 단백질 B와 산화환원 전위 사이의 관계를 나타낸다. 엠. 캡술라투스(Bath) 및 엠. 트리코스포륨 OB3b 환원전위에서의 차이에도 불구하고(표 2), 두 개의 Fe(III)Fe(II).B 착화합물에 대한 해리상수는 전자에 대해 Kd=2.06mM 및 후자에 대해 Kd=1.7mM에서와 같이 유사하다. 그러나 Fe(II)Fe(II).B 착화합물에 대한 해리상수는 엠. 캡술라투스(Bath)에 대해 Kd=7.01mM이고, OB3b에 대해 Kd=500mM이다.

단백질 B'가 전기화학적으로 환원된 히드록실라제 용액내에 존재할 때 흥미로운 효과가 관찰된다. 단백질 B'의 단독은 히드록실라제의 산화환원 거동에서 영향을 주지 않는다. 그러나 단백질 B의 결합은 단백질 B'의 존재하에서는 덜 강하고, Fe(II)Fe(III) 형태에 대해 3.49±0.17M 및 Fe(II)Fe(II) 착화합물에 대해 8.5±0.20M의 Kd가 약간 높게 관찰된다. 상기는 단백질 B'가 히드록실라제에 결합하지만 SPR 결과에 일치하는 강한 착화합물을 형성하지는 않는다는 것을 나타낸다.

(5) 전기화학

sMMO 히드록실라제 두 개의 철 중심의 전달인자가 없는 직접 전기화학이 변형된 금전극을 사용하여 착수된다.

(6) 시토크롬 P450cam의 사용

도 4는 (1) 15M 시토크롬 pH 7.4 및 (2) 1mM D-(+)-캄퍼를 함유하는 pH 7.4의 40mM 인산칼륨 완충액내 18M 시토크롬 P450cam의 가장자리면에서 흑연전극에서 순환 전압전류 그램을 보여준다. 상기 효소의 캄퍼-결합 형태는 -390 10mV에서 유사한 형태의 반응을 보여준다(도 4). 상기 전위 및 136mV의 캄퍼 결합에서 전위가 더 양적인 값으로의 전이는 각각 -540mV 및 -414mV의 초기 전위측정된 값과 일치하는 것이다.

도 5는 캄퍼가 결합된 및 캄퍼가 결합되지 않은 시토크롬 P450cam에 대해 전위 스캔 속도에서 양이온 피크 전류의 의존성을 보여준다. 조건은 도 1과 같지만, 온도가 18℃이다. 상기 양이온 피크 전류는 캄퍼-결합된 P450cam에 대해 스캔 속도의 제곱근( )에서 선형 의존도를 나타내며, 이는 전체 방법이 조절된 분산이다.

(7) 캄퍼에서 5-엑소-히드록시 캄퍼로의 전기화학적 전환

시토크롬 P450cam의 전기화학을 이루기위하여, 상기 효소가 캄퍼에서 5-엑소히드록시캄퍼로 전환되는데 사용된다. 상기 효소는 이스트만 막(Eastman membrane)인 AQ40을 사용함에 의해 전극의 표면에서 압박된다. 상기 전위는 50mV/s의 느린 스캐닝에서 ±0.2V에서 -0.8V로 변화되고; 디옥시겐이 용액으로 혼입되어 주기적으로 상기 시스템은 5-엑소-히드록시 캄퍼에 대해 분석된다. 5-엑소 히드록시 캄퍼의 형성은 2시간 후에 100%로 증가되는 것을 알았다.

한편 본 명세서는 여기에 언급된 특정의 방법이 실시되는 기작에 관련된 이론적인 진술을 포함하지만, 본 발명은 상기 진술에 의해 한정시키려는 것은 아니다.

Claims

효소를 전극에 부착시키는 것을 특징으로 하는 전기화학적 방법으로 전극과 효소사이에 전자를 전달시키는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 전달방법은 직접 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
상기 전기화학방법은 전달인자 없이도 실시되는 직접 전기화학방법인 것을 특징으로 하는 효소의 전기화학방법
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 효소가 메탄 모노옥시게나제인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 효소는 P450 또는 변형된 P450인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 효소는 히드록실라제인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서,

상기 히드록실라제는 가용성 메틸 모노옥시게나제인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 효소는 두 개의 철-중심 활성자리를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 효소는 포피린-함유 활성자리를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 전기화학방법은 전자의 직접 전달을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 전기화학은 변형된 금전극을 사용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
전달인자 없이도 효소의 전기화학에 적당하게 사용할 수 있도록 전극을 만들기위하여 펩티드로 전극을 처리하는 것을 특징으로 하는 전극을 변형시키는 방법.
제 12 항에 있어서,

상기 효소는 모노옥시게나제인 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,

상기 효소는 두 개의 철 또는 포피린-함유 활성자리를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 펩티드는 헥사펩티드로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제 15 항에 있어서,

상기 헥사펩티드는 cys 및 lys 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 16 항에 있어서,

상기 헥사펩티드는 lys-cys-thr-cys-cys-ala인 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,

전극의 환원성 세척을 피하면서 헥사펩티드 용액내 전극의 전압전류 사이클링을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
효소의 존재하에서 직접 전기화학방법이 전달인자없이 실시되는 것을 특징으로 하는 분자성 산소에 의해 기판을 산화시키는 방법.
제 19 항에 있어서,

상기 효소는 모노옥시게나제인 것을 특징으로 하는 방법.
제 20 항에 있어서,

상기 효소는 두 개의 철 또는 포피린-함유 활성자리를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 19 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 기질은 메탄올로 산화되는 메탄인 것을 특징으로 하는 방법.
제 19 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 기질은 캄퍼이고, 5-엑소-히드록시캄퍼로 산화되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 19 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 기질은 5-엑소-히드록시캄퍼로 산화되는 다중고리형 방향족 탄화수소로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제 22 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,

히드록실라제가 시토크롬 P450cam에서 유도되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 25 항에 있어서,

시스테인이 반응매체에서 제거되는 것을 특징으로 하는 방법.
실시예 및 도면을 참고로 하여 기술한 것을 특징으로 하는 전기화학적 방법으로 전극과 효소사이에 전자를 전달하는 방법.
실시예 및 도면을 참고로 하여 기술한 것을 특징으로 하는 효소의 전기화학방법.
실시예 및 도면을 참고로 하여 기술한 것을 특징으로 하는 전달인자 없이 효소의 전기 화학에 사용하기 적당한 전극을 만들기위해 전극을 변형시키는 방법.
실시예 및 도면을 참고로 하여 기술한 것을 특징으로 하는 효소의 존재하에서 분자성 산소에 의해 기판을 산화시키는 방법.