SK13993A3 - Silage additive - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynále

sa týka silážnej prísady

C ' pôsobu

M-3í produkcie siláže.

Doterajší stav techniky

Siláž sa vyrába íermentáciou plodín ako sú trávy; obilniny, napríklad kukurica, pšenica, jačmeft a cirok; leguminózy, napríklad ďatelina, hrachy a lucerna; a ryža. Fermentácia je vo svojej najjednoduchšej podobe prírodnou íermentáciou, ktorú spôsobuje prirodzená mliečna kyselinu- produkujúca baktérie prítomné v plodine v čase jej zberu. Fermentácia môže však prebiehať lepšie pridaním silážnych prísad k plodine, pričom tieto silážne prísady môžu byť chemické alebo bakteriálne, to znamená obsahujúce vybrané, mliečnu kyselinu produkujúce baktérie. Použitie týchto silážnych prísad spôsobuje lepšiu konzerváciu a zvýšenú stabilitu silážneho produktu, zo zníženými stratami v sile, a. lepšiu úžitkovosť zvierat kŕmených týmto produktom. Silážne prísady sa môžu k zberanej plodine pridať buď vo forme tekutých suspenzií aplikovaných pri použití vhodného aplikáťora, alebo vo forme pevných prostriedkov obsahujúcich účinnú zložku, ktorá je zmiešaná s nosičmi.

V priebehu silážovania sa rastlinné bielkoviny vo veľkom rozsahu nydrolyzujú na peptidy a aminokyseliny pôsobením rastlinných proteáz a sa následne deaminujú mikrobiálnou činnosťou. Dusíkaté zložky siláže sú tvorené prevážne z aminokyselín, krátkych pepťidov a amoniaku, u protiklade k zelenej hmote, ktorá obsahuje priemerne 750 - 850 g pravého bieIkovinného dusíka na kg celkového dusíka.

Dusík siláže nie- je ako substrát dobre využívaný pre syntézu bielkovín mikróbami v bachore, a preto je nutné doplňovať výživu silážou drahými krmivami bohatými na bielkoviny ako sú sójová múčka a rybia múčka.

-2V súčasnosti je málo poznátkov o mechanizme, ktorým sa v priebehu silážovania tráv hydrolyzujú rastlinné bielkoviny.

Je však žiadúce zlepšovať nutričnú hodnotu siláže obmedzením alebo odstránením proteoiýzy, ktorá prebieha počas siiážovania.

Podstata vynálezu

Podľa vynálezu sa silážna prísada vyznačuje tým, že obsahuje účinnú zložku pre siiážovanie plodiny a aspoň jeden inhibítor enzýmu proteázy, vybraný zo skupiny zahrňujúcej inhibítory cysteínovej proteázy a inhibítory asparágovej proteázy, pričom tento inhibítor alebo inhibítory sú biologického pôvodu.

Ďalej sa podľa vynálezu spôsob výroby siláže vyznačuje tým, že sa plodina silážuje v prítomnosti aspoň jedného uvedeného inhibítora.

Cysteínové a asparágové proteázy môžu byť identifikované metódou,doporučenou autormi Storey a Wagner, Phytochemistry, 25, č. 12, 2701 až 2709 (1986),ktorou sa identifikujú vlastnosti proteáz v súlade s doporučením IUPAC - IUB.

Výhodné je použitie inhibítora enzýmov cysteínových proteáz.

Silážna prísada podľa vynálezu môže obsahovať ľubovoľnú vhodnú účinnú zložku. Môže ísť o chemickú zložku, ako je kyselina, napríklad kyselina mravčia alebo sírová , či ich zmesi, alebo o zložku bakteriálneho pôvodu. Veľmi vhodnými bakteriálnymi zložkami sú kmene Lactobacilius, Streptococcus, ďalej Pediococcus acidilactici a Pediococcus pentosaceus, a predovšetkým kmene Lactobacilius plantarum produkujúce mliečnu kyselinu. Zvlášť užitočný pre siiážovanie mnohých materiálov je kmeň Lactobacilius plantarum MTD1, ktorého kultúra bola uložená v Národných zbierkach priemyselných a morských baktérii (NCIMB = National Collections oí Industrial and Marine

Aberdeen AB2 1RY, UK, a bolo

Bacteria), 23 St Machar Drive, jej pridelené číslo NCIMB 4002”. Uloženie sa uskutočnili 12. novembra 1936 a bolo uznané ako uloženie pre patentové účely 20. júla 1933; medzinárodnú dokument podľa

Budapeštianskej dohody bol vydaný 26. júla 1933. Ďalšími vhodnými kmeňmi sú kmene druhov Lactobaci1lus amyiophilus, Lactobacillus caseii, Lactobacillus plantarum, Lactobaci1lus acidophilus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus brevis, Streptococcus lactis, Streptococcus thermophilus,Streptococcus faecium, Streptococcus íaecalis, Lactobacillus amyiophilus, Streptococcus lactis, Streptococcus thermophilus, a predovšetkým kmeň Lactobacillus amyiophilus č. NCIMB 11546, kmeň Streptococcus lactis č. NCIMB 6681 a kmeň Streptococcus thermophiius Č. NCIMB 8510. Tieto kmene sú verejne dostupné.

Výhodnými inhibítormi cysteínovej proteá.zy sú cystatiny, antipaín a predovšetkým peptidové epoxidy ako je trans-epoxysukcinyl-L-leucyl-amído(4-guanidíno)bután (E-64). Podľa výhodného uskutočnenia vynálezu sa siiäžovaná plodina ošetrí okrem inhibitoru cysteínovej proteázy innibítorom asparágovej proteázy, s cieľom dosiatnutia rozšíreného inhibičného účinku.

Medzi vhodné inhibítory asparágovej proteázy patrí pepstatín A.

E-64 je možné pripraviť podľa článku, ktorý uverejnili Hanada a koľ., Agric. Biol. Chem., 42 (3), 529 až 536 (1978).

Cystatin popísali Fossum a kol., Árch. Biochem. Biophys. 125, ·

367, 1968. Ďalej ho čistili a charakterizovali Sen a kol.,

Árch. Biochem. a Biophysics 158, 623, (1973). Antipaín popísali Suda a kol., J. Antibiotics. 25 263 (19732) a Umezawa a kol., J. Antibiotics 25 267 (1972). Pepstatín popísali

Umezawa a kol., J. Antibiotics 23 259 (1970).

V spôsobe podľa vynálezu sa inhibitor cysteínovej proteázy k plodine všeobecne aplikuje ako súčasť silážnej prísady spoiočne s účinnou zložkou pre silážovanie tejto plodiny, hoci môže byť inhibitor cysteínovej proteázy aplikovaný taktiež oddelene, a to buď pred aiebo po účinnej zložke. V mnohých prípadoch je výhodne aplikovať inhibítor cysteínovej proteázy ne čerstvú posekanú trávu predtým, než sa silážuje .Pokiaľ sa používajú inhibítory ako cysteínovej tak i asparágovej proteázy, je výhodne ich aplikovať v rovnakom čase.

Inhibítor cysteínovej proteázy je výhodne aplikovať k plodine, ktorá má byť silážovaná, v množstve v rozmedzí 10 až 130 /mol/kg plodiny. Výhodne je inhibítor aplikovať pri pH v rozmedzí 3 až 7,5. Pokiaľ sa s týmto inhibítorom aplikuje aj inhibítor asparágovej proteázy, je najvýhodnejšie aplikovať tieto dve látky spoločne, hoci môžu byť aplikované tiež oddelene v ľubovoľnom poradí.Inhibítor asparágovej proteázy je výhodne aplikovať v množstve a v rozmedzí 1 až 60 mg/kg plodiny.Silážovanie je výhodne uskutočňovať za podmienok, kedy je obmedzený prívod kyslíka, alebo je kyslík v podstate vylúčený.

Silážna prísada podľa vynálezu sa môže aplikovať ako kvapalina alebo ako pevná látka vo forme častíc. Pokiaľ sa má aplikovať ako kvapalina, obsahuje nosič vodu, a pripadne napr. nižší alkohol,napríklad propán-l-ol,zatiaľ čo ak má byť aplikovaná ako pevná látka, je nosičom pevný materiál. Všeo becne sa prísady, ktoré majú byt aplikované ako pevné látky, dodávajú užívateľovi ako kompletná zmes vrátane nosičov, avšak v prípade, že sa prísada aplikuje ako kvapalina, dodáva sa užívateľovi obecne účinná zložka, ktorá sa pred použitím suspenduje v zodpovedajúcom objeme vody.

Pokiaľ má byt prísada podľa vynálezu aplikovaná ako pevná látka, môže byt ako nosič silážnej prísady podľa vynálezu použitý ľubovoľný vhodný materiál. Príkladmi vhodných nosičov sú obilniny ako drvené kukuričné palice, jačmenný a pšeničný šrot a ďalšie materiály ako vápenec, íl, krieda, magnezit a mastenec.

Siiážné prísady všeobecne obsahujú okrem nosičov, účinných látok a inhibitorov proteázy ešte ďalšie látky pridané z rôznych dôvodov. Ako komponet v účinnej zložke podľa vynálezu môže byť pridaná aj ďalšia látka. Medzi takéto ďalšie látky patria živiny (ktorými môžu byt cukry ako sú sacharóza, laktóza atď.); rastové faktory, ktoré sú potrebné pre rast niektorých baktérii (vrátane kvasničnéno extraktu, kukuričného výluhu, vitamínov a aminokyselín); látky pridávané z dôvodov ochrany životaschopnosti baktérií; antioxidačné látky; látky, ktoré napomáhajú príjmu kyslíku a oleja a ďalšie látky znižujúce sklony prísad k prašnosti alebo zlepšujúca priľnavosť k plodinám.

Relatívne pomery nosiča a účinné zložky prítomné v silážnej prísade závisia na prísade a jej pôsobení.

Pokiaľ sa prísada podľa vynálezu aplikuje forme pevnej látky, je vhodné ju dodávať do zeleného krmiva , v množstve v rozmedzí 0, 1 až 5 kg· na tonu ošetrovaného zeleného krmiva, s výhodou v rozmedzí 0, Ξ kg až 1 kg na tonu. Pokiaľ sa prísada aplikuje ako kvapalina, je vhodné jú dodávať v množstve v rozmedzí 0,5 litra až 5 litrov na tonu ošetrovanej píce, pričom účinná zložka sa pridáva do vody v množstve v rozmedzí i g až 100 g na liter. Na aplikáciu prísady podľa vynálezu či už ako pevnej alebo kvapalnej látky, sa môže použiť ľubovoľný vhodný aplikátor.

Silážna prísada podľa vynálezu sa môže použiť na výrobu siláže z ľubovoľného vhodného materiálu vrátane už .vyššie uvedených plodín, je však predovšetkým vhodná pre silážovanie tráv.

Vynález ilustrujú nasledujúce príklady uskutočnenia vynálezu.

Príklady uskutočnenia

Príklad 1 (diagnostický)

Extrakty mätohu vytrvalého sa šesťdesiatnásobne čistia zrážaním síranom amónnym, gelovou filtráciou a chromatogrraí iou na iontomeničocn. Zistí sa , že aktivity takto vyčistených enzýmov sú nercvnorodé, ale predsa zdieľajú rovnaký model inhibície rôznymi inhibítormi proteáz (Tabuľka 1).Podstatná inhibícia sa zistila iba s p-chlórmerkuribenzoátom, ktorý je inhibitorom cysteínovej proteázy. Inhibícia sa tiež zistila s pepstatínom, ktorý je inhibítorom asparágových proteáz, ale v omnoho menšom rozsahu.Nebola zistená inhibícia s íenylmetylsulíony1-íluoridom, ktorý je inhibítorom šerínovej proteázy. Z týmto údajov bol vyvodený záver, že hlavná skupina proteáz prítomných v mätohu vytrvalom sú cysteínové proteázy.

Tabuľka 1

Inhibítor	Cieľový enzým	Konci	entrácia	Inhibícia
PCMB	cysteínový	i	mM	100
IODAÄ	cysteínový	i	mM	10
PMSF	šerínový	1	mM	2
Pepstatín	asparágrový	5	ug/ml	17

Legenda k tabuľke i:

PCMB : parachlórmerkuribenzoát, IODAÄ : jódoctová kyselina,

PMSF : íenylmetylsulíonyl-í .luorid.

Príklad 2

Príklad i sa opakuje pri použití puírovaných extraktov

- 7 mátohu vytrvalého. Extrakty sa inkubujú pri rozdielnych hodnotách pH v prítomnosti kombinácie antibiotík, ktoré sa používajú, aby zabránili fermentácii v priebehu inkubácie. Použité inhibítory proteáz boli špecifické pre rôzne skupiny proteáz a boli prevažne mikrobiálneho pôvodu. Výsledky sú zhrnuté v tabuľke 2. Inhibícia autolýzy bola menej zreteľná než inhibícia pozorovaná u čiastočne vyčistených preparátov v príklade 1. Inhibícia však bola opäť pozorovaná iba pri použití E-64 (špecifického inhibítora cysteínovej proteázy) a pepstatínu.

Tabuľka 2

Inhibítor	Cieľový enzým	Koncentrácia	pH	Inhibícia
E-64	cysteínový	10 /jM	4	13
Pepstatín	asparágový	5 ug/ml	5	47
Aprotinín	šerínový	5,6 TIU	6	0
A-PMSF	šerínový	130 /jM	6	0

Legenda k tabuľke 2 :

E-64 : trans-epoxy-sukcinyl-L-leucyl-amído(4-guanidíno)bután,

A-PMSF : (p-amidínofenyl)metylsulfonyl-fluorid,

TIU : trypsinová inhibičná jednotka.

Príklad 3

Silážuje sa viacročný mätoh vytrvalý (sušina (DM = dry matter) 279 g/kg, vodou rozpustné uhľohydráty 113 g/kg sušiny, celkový dusík 26,5 g N/kg sušiny, rozpustný dusík 433 g/kg N).

Tráva sa silážuje buď ošetrená alebo neošetrená kyselinou mravčou (.1,6 g/kg zelenej hmoty) čo má za ciel silážovať trávu pri pH 6,25 alebo pH 5. Uskutoční sa 6 ošetrení trávy (uvedených v Tabuľke 3) pri každom pH. Používajú sa štyri rôzne inhibitory proteáz: E-64 (inhibítor cysteínovej proteázy) pepsatín (inhibítor asparágovej proteázy), vodný extrakt zo zemiakov, ktorý obsahuje inhĺbítory ako serínové, tak i cysteínové proteázy, a formaldehyd, ktorý znižuje proteolýzu vytváraním reverzibiIných zasýtených väzieb medzi bielkovinami. Celkovo sa naplní 36 síl, pretože každé ošetrovanie sa opakuje v troch silách. Silá tvoria 100 mi odmerné valce vybavené Bunsenovými ventilmi, a v každom sile sa siläžuje 70 g trávy.

Silá sa otvoria po 82 dňoch. Vo všetkých siláž vyzerá dobre konzervovaná bez viditeľného poškodenia. Výsledky analýz siláže sú uvedené v tabuľke 4 a 5.

Zníženie pH silážovanej trávy pomocou kyseliny mravčej malo malý vplyv na zloženie siláže. Ošetrenie kyselinou mravčou však malo podstatný vplyv na koncentráciu kyseliny mliečnej, kyseliny octovej a etanolu, tieto rozdiely vznikali vplyvom zlej kvality fermentácie siláže konzervovanej po ošetrení ako kyselinou mravčou tak formaldehydom. Dôvody tohto javu nie sú jasné.

Inhĺbítory proteáz mali tiež malý vplyv na fermentáciu siláže. V porovnaní so silážami, ktoré neboli ošetrené formaldehydom pridanie extraktu zo zemiakov neovplyvnilo rozklad bielkovín v sile (tabuľka 5). Ani použitie pepstatínutínu neovplyvnilo kvalitu siláže. Avšak E-64, ktorý je inhibítorom cysteínovej proteázy, významne (P< 0,001) znižoval množstvo rozpustného dusíka (0,30 rozpustného dusíka kontroly) a amoniakálneho dusíka (0,73 amoniakálneho dusíka kontroly), produkovaných počas silážovania.

Výsledky týchto štúdii ukazujú, že cysteínové proteázy sú hlavným typom proteáz zúčastňujúcich sa na rozklade bielkovín v sile, a Že pridanie špecifických inhibítorov cysteínových proteáz, mikrobiálneho pôvodu, môže znižovať rozsah proteolýzy prebiehajúci v sile, bez toho aby v ňom nepriaznivo ovplyvňovalo tvorbu mliečnej kyseliny.

Tabuľka 3

Ošetrenie

Koncentrácia

Voda

E-64

Pepstatin

E-64 a Pepsatin Extrakt zo zemiakov

Forma!ín ako neriedený 3 g/ ,/uM 5 _zug/ml vyššie extrakt kg trávy

Tabuľka 4

Ošetrenie Sušina pH WSC Lac AC ET (g/ kg) (g/ kg sušiny)

Silážovanie pri pH 6,2

Kontrola 249	3,75	30,1	120	24, 3	5,37
E-64 244	3,76	30,6	115	22,7 .	3,15
Pepsatin 239	3,75	3 0 ,	126	22,2	9,26
E-64 + Pepsatin 247	3,76	30,1	111	22,5	2,56
Extrakt
zo zemiakov 244	3,72	30,0	124	23,1	7,22
Formaldehyd 254	3,76	29,6	115	20,8	2,67

Pokračovanie tabuľky 4:

Ošetrenie Sušina	PH (g/kg)	WSC	Lac	Ac (g/ kg sušiny)	Et
Silášovanie pri	pH 5,0
Kontrola	250	3,69	30,2	124	22,1	0,5
E-64	249	3,72	30,2	115	19,6	0,92
Pepstatin	251	3,72	29,9	115	21,0	0,5
E-64 + Pepsatín	244	3,80	30,9	102	17,5	2,25
Extrakt
zo zemiakov	247	3,74	30,3	110	24,2	13,7
Formaldehyd	252	4,49	29,7	51	19,3	18,5
SE	0,5	0,036	0,60	7,0	1,16	1,06

Legenda k tabuľke 4:

SE : Štandartná odchýlka priemeru zo 6 pozorovaní.

Lac : Kyselina mliečna

Ac : Kyselina octová

ET : Etanol

WSC : Uhľohydráty rozpustné vodou

Tabuľka 5

Ošetrenie

Celkový N (gN/kg sušiny)

Rozpustný N (gN/ kg N)

Amoniakálny N (gN/kg N)

Silážovanie pri pH 6,2

Kontrola

26,9

535

33,5

Pokračovanie tabuľky 5 :

Ošetrenie	Celkový N	Rozpustný N	Amoniakálny N
	gN/kg sušina)	gN/kg M)	gN/kg N)

E-64	26,3	424	68,3
Pepstatín	27,1	547	79,6
E-64 +· Pepstatín	26,8	454	54, 5
Extrakt
zo zemiakov	26,2	524	86,9
Formaldehyd	24,4	523	35,6

Siláž:ovanie pri pH 5,0

Kontrola	22,1	520	35,3
E-64	-27,4	357	58,1
Pepstatín	25,3	597	75,8
E-64 + Pepstatín	26,5	414	49,6
Extrakt
zo zemiakov	27,1	522	63,2
Formaldehyd	26,7	513	100,8
SE	0,49	2,4	0,48

Legenda k tabuľke 5:

SE : Standartná odchýlka priemeru zo 6 pozorovaní.

Príklad 4

Viacročný mätoh vytrvalý sa naseká na dĺžku približne 2 cm a pridá sa 20 ml vody alebo nižéie popísaného vodného roztoku na 70 gramov trávy. Zmes sa stlačí a uloží do uzatvo12 renýcn síl neumožhujúcich prístup vzduchu a uchovaných pri teplote miestnosti počas trvania experimentu. Mätoh vytrvalý obsahoval sušinu 190 g/kg, vodou rozpustné uhľohydráty v množstve 241 g/kg sušiny, celkový dusík v množstve 42,5 g/kg sušiny a rozpustný dusík v množstve 4S7 g/kg dusíku. Zvyšný dusík boí prítomný v podstate ako bielkovina. 20 ml vody alebo roztoku obsahovalo tam, kde je to uvedené, dostatočné množstvo inhibítora enzýmu alebo/a uvedeného bakteriálneho preparátu, aby sa siskaio množstvo v mikrogramoch na gram čerstvej trávy uvedené v následujúcej tabuľke.

Tabuľka 6

Ošetrenie	Koncentrácia
	,'ug/g čerstvej trávy /um/g čerstvej trávy

Voda (kontrola) E-64	11,25 22,5 45,0	0,03 0,06 0,12
Pepstatín	30,0		0,04
	(Pepstatín) (E-64)
Pepstatín a E-64	30,0 22,5	0,	04 0,06
Antipaín	32,0		0,04
Cystatín	1,2		0,9
'ECOSYĽ	3 1/t (2,65 g/1)
'ecosyľ	ECOSYĽ aplikov	aný
	v hore uvedenej	dávke
	E-64 aplikovaný	22,5 /	ug/g trávy

ECOSYL je . komerčná dostupná silážná prísada pre vodné suspenzie vyrobená Imperiál Chemical Industries PLC. ecOSYL ' je ochranná známka Imperiál Chemical Industries PLC. Tento produkt obsahuje ako svojú hlavnú účinnú zložku kmert L. plantarum NCIMB 48027 sušený vymrazením, spločne so divinami. Všetky ošetrenia sa uskutočnili v troch opakovaniach. Silá boli otvorené po 50 dňoch a siláž vo všetkých silách vypadala dobre konzervovaná bez viditeľného kazenia. Pepstatín je inhibítorom asparágovej proteäzy. Antipaín je inhibítorom cysteínových a serínových proteáz a Cystatín je inhibítorom cysteínových proteáz. Predpokladá sa u nich, že sa ekvimolekulárne viažu s proteázami. V následujúcih tabuľkách nebielkovinný dusík (rozpustný dusík) nezahrňuje amoniak .SE znamená štandartnú odchýlku, ktorá je vo všetkých tabuľkách pre tri pozorovania; symbol La znamená laktát; symbol Ac predstavuje acetát a Et znamená etanol. Laktát a acetát sú vyjadrené ako voľné kyseliny. Skúmanie produktov silážovania ukázalo, že inhibítory proteáz majú malý vplyv na íermentáciu siláže, a že produkcia kyseliny mliečnej nebola ovplyvnená. V následujúcich tabuľkách DM znamená sušinu.

Tabuľka 7

Vplyv zvyšovania koncentrácie E-64 na dusíkaté irakcie siláže

Koncentrácie E-64	Celkový N	Nebielkovinný N	Amoniakálny N
zug/g trávy	gN/kg DM	gN/kgN	gN/kgN
0	407	643	72,4
11,25	360	553	61,1
22,5	366	586	70,8
45,0	359	481	51,0
SE	0,89	Cj / 2 čL	0,71

SE : Štandartná odchýlka v troch pozorovaniach Nebielkovinný N nezahrňuje amoniak.

Pri silážach ošetrených E-64 v dávke 11,25 /ug/g trávy sa znížil obsah rozpustného dusíka (nebielkovinného dusíka) na 37 % pri porovnaní s obsahom dusíka v kontrolnej vzorke. U silážach ošetrených E-64 v dávke 45,0 _zug/g trávy sa znížil obsah rozpustného dusíka na 75 % pri porovnaní s obsahom rozpustného dusíka v· kontrolnej vzorke. Obsah amoniakáIného dusíka sa u silážach ošetrených E-64 v dávke 45 /ug/'g trávy znížil na 70 % pri porovnaní s obsahom amoniakálneho dusíka v kontrolnej vzorke.

Tabuľka 8

Vplyvy zvyšovania koncentrácie E-64 na zloženie siláže

Aplikačná	pH	DM	WSC	La	Ac	Et
dávka E-64	siláže
0	3,48	156	20,6	1S4	22,5	16,0
11,25	3,41	158	24,5	202	19,3	38,9
ci / 5	3,48	163	24, 2	188	22,2	33,3
45,0	3,40	164	31,3	175	18,4	35,5
SE	0,02	0,15	1,25	13,5	2,94	5,57

Legenda k tabuľke 8:

DM :	znamená sušinu v gramoch na kilogram
WSC :	znamená vodou rozpustné uhľohydráty.
La :	znamená kyselinu mliečnu.
Ac :	znamená kyselinu octovú,
Et :	znamená etanol,

a

-15 všetko je vyjadrené v gramoch na kilogram sušiny.

Pod pojmom sušina je mienený zvyšok po dehydratácii trávy alebo siláže.

Tabuľka 9

Vplyv E-64 a pepstatínu na zloženie siláže

Ošetrenie	Celkový N	Nebielkovinný N	Amoniakálny N
	gN/kg sušiny	gN/kgN	gN/ kgN

Kontrola 407	643	72,4
E-64 366	556	70,8
22,5 /ug/g trávy
Pepstatín 435	521	60,6
30,0 /ug/'g trávy
E-64 (30,0 z ug/g trávy)
a pepstatín 428	438	62,9
(22,5 zug/g trávy)
SE 1,51	0,63	0,54

Pepstatín znižoval množstvo rozpustného dusíka (81 % dusíka kontroly). Znížené množstvo rozpustného dusíka v silážach bolo vyššie pri spoločnej aplikácie pepsatínu a E-64 v porovnaní so samostatnou aplikáciou každého inhibítora. Pri silážach ošetrovaných spoločne pepsatínom a E-64 sa znížil obsah rozpustného dusíka na 68 % rozpustného dusíka v kontrole.

Tabuľka 10

Vplyv E-64 a pepstatinu na zloženie siláže

Ošetrenie 5	pH siláže	DM	WSC	La	Ac	Et
Kontrola	3,48	156	20,6	184	22,5	16,0
E-64	3,43	163	24,2	138	22,2	33,3
(22,5 /ug/g trávy)
Pepstatín	3,61	164	17,5	168	16,1	36,0
(30,0 /ug/g trávy)
E-64 (30,0 /ug/g	trávy)
a pepstatín	3,56	163	11,1	171	23,9	38,9
(22,5 yug/g	trávy)
SE	0,02	0,12	0,66	8,48	5,39	8,68

Legenda k tabuľke 10

DM	: znamená	sušinu v gramoch na kilogram
WSC	: znamená	vodou rozpustné uhľohydráty.
La	: znamená	kyselinu mliečnu,
Ac	: znamená	kyselinu octovú.
Et	: znamená	etanol,

SE všetko je vyjadrené v gramoch na kilogram sušiny, a znamená štandardnú odchýlku pre tri pozorovania.

Tabuľka 11

Vplyvy innibitorov cvsteínovei proteázv na dusíkaté frakcie

siláže
Ošetrenie	Celkový N	Nebielkovinný N	Amoniakálny N
	g N/kg DM	gN/kg N	gN/kgN

Kontrola	407	643	72,4
S-64	366	556	70,8
(22,5	zug/g trávy)
Cystatin	406	571	75,7
( 1,2	zug/g trávy)
Antipaín	411	524	69, 1
(32,0	zug/g trávy)
SE	1,02	2,40	0,76

Legenda k tabuľke 11 :

DM : znamená sušinu,

SE : štandardnú odchýlku pre tri pozorovania.

Obsah rozpustného dusíka bol v silážach ošetrených cystatínom znížený na 38 ?s rozpustného dusíka kontroly. Obsah rozpustného dusíka bol v siláži ošetrenej antipaínom znížený na 81 % rozpustného dusíka kontroly.

Tabuľka 12

Vplyvy innibitorov cysteínovej proteázy na zloženie siláže

Ošetrenie	si	pH láše	DM	WSC	La	A c	Et
Kontrola	3,	48	156	20,5	134	22,5	10,0
E-64	3,	48	163	ti *4 / £	190	22,2	33,3
(22,5 /ug/g	trávy)
Antipaín	3,	55	161	24, 1	163	28,8	4, 31
(32,0 z ug/g	trávy)
Cystatín	3,	65	160	17,2	183	29,4	4, 55
( 1,2 /ug/g	trávy)
SE	0,	03	3,09	0,93	19,2	8,57	5,07

Legenda k tabuľke 12 :

DM

WSC

La

Ac

Et znamená znamená znamená znamená znamená sušinu v gramoch na kilogram vodou rozpustné uhľohydráty, kyselinu mliečnu kyselinu octovú etanol,

SE všetko vyjadrené v gramoch na kilogram sušiny, a znamená štandardnú odchýlku pre tri pozorovania.

Tabuľka 13

Vplyvy E-64 a ECOSYL u na dusíkaté frakcie siláže

Ošetrenie	Celkový N	Nebielkovinný N	Amoniakálny N
	gN/kg DM	g N/ kg N	gN/ kgN

Kontrola	407	643	72,4
E-64	366	586	70,8
(22,5 x ug/g	trávy)
'ECOSYL'	378	533	63,2

(8,55 xug/g trávy)

E-64 (22,5 xug/g trávy) a 'ECOSYL ' (8,55 g/^z 1)

	355	421	53,3
SE	0,79	1,51	' 0,79

Legenda k tabuľke 13 :

DM : znamená sušinu,

SE : znamená Štandardnú odchýlku pre tri pozorovania.

U siláže ošetrenej ECOYSYL om bolo množstvo rozpusteného dusíka znížené na 82 % rozpustného dusíka kontroly. U siláže ošetrenej E-64 a ECOSYL om bolo zistené väčšie zníženie obsahu rozpustného dusíka v porovnaní s oddelenou aplikáciou každého ošetrenia. Pri spoločnon pridaní ECOSYL u a E-64 sa obsah rozpustného dusíka v siláži znížil na 65 % rozpustného dusíka kontroly.

Tabuľka 14

Vplyvy E-64 a ECOSYL u na zloženie siláže

Ošetrenie	PH siláže	DM	WSC	La	Ac	Et
Kontrola	3,48	156	20,6	184	22,5	16,0
E-64	3,48	163	24, 1	188	tĹj čj f tí.	33,3
(22,5 /ug/g	trávy)
'ecosyľ	3,63	154	16,0	149	42,6	11,2
(8,55 /ug/g	trávy)
'ecosyľ
(8,55 /ug/g	trávy)
a E-64	3,45	164	28,9	132	42,0	30,2
(22,5 /ug/g	trávy)
SE	0,03	0,11	0,92	13,9	8,53	5,45

Legenda k tabuľke 14 :

DM	: znamená	sušinu v	gramoch na kilogram,
WSC	: znamená	uhľohydráty rozpustné vodou,
La	: znamená	kyselinu	mliečnu,
Ac	: znamená	kyselinu	octovú,
Et	: znamená	etanol,

SE všetko je vyjadrené v gramoch na kilogram sušiny, a znamená štandardnú odchýlku pre tri pozorovania.

- 21 Závery :

Výsledky ukazujú, že v priebehu silážovania sú aktívne cysteínové a asparágové proteázy. Pridaním špecifických inhibitorov cysteínovej a asparágovej proteázy, biologického pôvodu znížil rozsah proteolýzy v sile, bez nepriaznivého ovplyvnenia produkcie mliečnej kyseliny v sile.

Zníženie obsahu rozpustného dusíka u siláží ošetrených ECOSYL om v porovnaní s obsahom u kontrolných siláží je možné pričítať vplyvu pH na proteolytické enzýmy mátohu vytrvalého (tieto vykazujú najvyššiu aktivitu pri pH 5 až 7); očakáva sa rýchlejšie zníženie pH v začiatočných štádiách silážovania u siláži ošetrených ECOSYL om v porovnaní s kontrolnými silážami .

Je možné konštatovať, že kombinácie inhibítorov cysteínovej a asparágovej proteázy alebo inhibítorov cysteínovej proteázy a ECOSYL u znižujú proteolýzu v sile vo väčšom rozsahu ako ošetrenie iba jedným činidlom.

Claims (16)

1. PATENTOVÉ 7 N .Á .R

   1. Silážna prísada, vyznačená t ý m, že obsahuje účinnú zložku pre siiážovanie plodiny a inhibítor enzýmov cysteínovej alebo asparágovej proteázy.
2. 2. Spôsob výroby siláže, vyznačený tým, že sa plodina ošetrí inhibítorom cysteínovej alebo asparágovej proteázy.
3. 3. Spôsob alebo prísada podľa nároku 1 alebo 2, vy značený t ý m , že účinnou zložkou je kyselina alebo zložka bakteriálneho pôvodu.
4. 4. Prísada alebo spôsob podľa nároku 3, vyznačené t ý m, že bakteriálnou zložkou je kmeft Lactobaccilus alebo/a Streptococcus alebo/a Pediococcus, produkujúci kyselinu mliečnu.
5. 5. Prísada alebo spôsob podľa ľubovoľného z predchádzajúcich nárokov, vyznačené tým, že inhibítorom je cystatín, antipaín, alebo peptidový epoxid.

   δ. Prísada alebo spôsob podľa nároku 5, vyznačené t ý m, že peptidovým epoxidcm je trans-epoxy-sukciny1-L-leucy1 -amidoí4-guanidino) bután.
6. 7. Prísada alebo spôsob podľa ľubovoľného z predchádzajúcich nárokov, vyzná č e n e t ý m, že inhibítorom je inhibítor enzýmu cysteínovej proteázy.

   3. Prísada alebo spôsob podľa ľubovoľného z predchádzajúcich nárokov, vyznačené tým, že je prítomný ako inhibítor enzýmu cysteínovej proteázy tak asparágovej proteázy.
7. 9. Spôsob podľa ľubovoľného z nárokov 2 až S, vyznačený tým, že sa inhibítor cysteínovej proteázy

   II aplikuje na čerstvo posekanú trávu predtým, ako je silážovaná.
8. 10. Spôsob podľa ľubovoľného z nárokov 2 až 9, v y z n a Č e n ý t ý m, že sa inhibítor cysteínovej proteázy aplikuje do plodiny, ktorá má byť silážovaná, v množstve v rozmedzí 10 až 130 /um/' kg plodiny.
9. 11. Spôsob podľa ľubovoľného z nárokov 2 až 10, vyznač en ý t ý m, že sa inhibítor asparágovej proteázy aplikuje v rozmedzí 1 až 60 mg/kg plodiny.
10. 12. Spôsob podľa ľubovoľného z nárokov 2 až 11, v y z n a č en ý t ý m, že v priebehu aplikácie inhibítora do plodiny je pH v rozmedzí 3 až 7,5.
11. 13. Siiážná prísada podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 8, v y zn a č e n ý tým, že obsahuje inhibítor cysteínovej alebo asparágovej proteázy v kvapalnom nosiči, ktorý obsahuje vodu.
12. 14. Spôsob podľa ľubovoľného z nárokov 2 až 12, vyznačený t ý m, že sa aplikuje kvapalná prísada obsahujúca inhibítor proteázy v množstve od 1 gramu do i00 gramov na 1 liter v nosiči obsahujúci vodu, v dávke v rozmedzí 0,5 až 5 litrov na tonu ošetrovaného zeleného krmiva.
13. 15. Spôsob podľa ľubovoľného z nárokov 2 až 12 alebo nároku 14, vyznačený tým, že sa siláž vyrába fermentáciou tráv, obilnín, leguminóz alebo ryže.
14. 16. Prísada podľa nároku 1 v podstate ako je popísaná v ľubovoľnom z príkladov.
15. 17. Spôsob výroby siláže podľa nároku 2 kedykoľvek je uskutočňovaný v podstate ako je popísaný v ľubovoľnom z príkladov.
16. 18. Siláž vyrobená spôsobom podľa ľubovoľného z nárokov 2 až

    III

    12, nároku 14 alebo nároku 15