NO312081B1 - Formulert proteinholdig fôr og anvendelse av slikt fôr - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse vedrører et formulert proteinholdig for, inneholdende en tilsetning bestående av en nøyaktig tilmålt, kontrollerbar mengde proteaseinhibitor.

Dette for som generelt sett er beregnet for både dyr, fugler og fisk kan særlig ha form av et partikkel-/pellet-/flakfor-met hovedfor for oppdrettsfisk.

Oppfinnelsen vedrører likeledes en anvendelse av et slikt for for et spesielt formål ved foring av oppdrettsfisk i merd eller landbasert oppdrettskar.

Ved foring med proteinholdig formulert for blir proteinet dårlig utnyttet fordi foret fordøyes fortere enn dyret, fuglen eller fisken klarer å nyttiggjøre seg proteinet. En vesentlig del av forets proteininnhold går derfor til energi i stedet for til muskelbygging.

Teknikkens standpunkt er blant annet representert ved forrå-stoffer som utmerker seg ved at proteinet har ulik fordøyel-seshastighet.

Slike kjente forstoffer har en svært begrenset virkning når det gjelder å iverksette en økt utnyttelse av protein slik at en større del av proteinet i foret kommer muskelbyggingen og således tilveksten til del. Ved kjent teknikk kompliseres rå-stoff valget og produksjonsprosessen.

Moderne fiskefor består av finmalte varmebehandlede råvarer som er "limt" sammen ved hjelp av stivelse, vanndamp og trykk. Proteinet i et slikt for er finpartikulært og denaturert, det vil si at molekylets tertiærstruktur, dets opprin-nelige unike form, er åpnet opp og endret.

I fiskens naturlige føde som er levende, hele byttedyr foreligger derimot proteinet intakt i sin native unike form bundet opp i store organer, eksempelvis muskulatur. Disse to proteinformers fordøyelsesforløp avviker forholdsvis meget fra hverandre, idet hastigheten igjennom mage-tarm-kanalen øker proporsjonalt med bearbeidelsesgraden uten at det går ut over proteinets fordøyelighet totalt.

Et proteins native unike form er slik at proteinfordøyelses-enzymer (proteolyttiske enzymer) vanskelig kan angripe det. Alle avvik fra den ene native biologiske form fører til at det oppstår nye angrepspunkter for proteasene, hvilket for-klarer den meget hurtigere nedbrytning av denaturert protein sammenlignet med nativt protein, og påfølgende hurtig opptak av aminosyrer.

Ved en for høy tilførsel av aminosyrer over kort tid til dy-rets proteinsynteseapparat, vil de biokjemiske prosesser som finner sted i fisk føre til at en større andel av de fordøyde aminosyrene blir forbrent som energi i stedet for å bli avleiret som fiskemuskel.

Det foreligger fra litteraturen rapporter om nesten dobbelt så høyt proteinutbytte i form av høyere avleiring som muskelprotein ved foring med relativt store fiskebiter sammenlignet med foring med finmalte forråvarer.

I moderne akvakultur er imidlertid bruk av formulert for ene-rådende av praktiske hensyn.

Teknikkens standpunkt er likeledes representert ved EP-A2-144993. Denne publiserte europeiske patentsøknad om-handler en fremgangsmåte til å fremme veksten hos dyr eller planter, og går ut på å tildele dyret, eventuelt via foret, eller til planten, eventuelt via dens voksested, en virksom mengde av en proteaseinhibitor så som leupeptin.

Leupeptin som er en lavmolekylær syntetisk serin-/cystein-proteasehemmer, er fortrinnsvis en endopeptidasehemmer med spesiell affinitet overfor trypsin og enkelte cysteinprote-aser så som papain og cathepsin B. Disse cysteinproteasene er for øvrig heller ikke sentrale fordøyelsesenzymer. Leupeptin har heller ingen effekt overfor chymotrypsin som er den mest sentrale fordøyelsesprotease.

Som eksempler på dyreslag og planteslag som er testet ved hjelp av denne kjente fremgangsmåte for å akselerere deres

veksthastighet, er hamsterunger og små erteplanter. Dette er selvsagt bare eksempler på mulige dyr og planter som kan be-handles og påvirkes positivt, men pattedyr, som i dette til-felle, ligger langt borte fra oppdrettsfisk som er foretruk-

ket dyreslag ved den foreliggende oppfinnelse.

Det er fra denne kjente publikasjon, EP-A2-144993, i og for seg kjent å tilsette en proteaseinhibitor i dyrefor, noe som har vært kjent innen bransjen. Imidlertid omtales det i EP-A2-144993 tildeling av en virksom mengde proteaseinhibitor, og det er enn videre angitt en foretrukket tildelingsmengde av denne inhibitor per kilogram dyrevekt, nærmere bestemt lik

ca. 0,002-0,05 gram per dag. Bruk av mer enn én proteasehem-mer (altså i blanding med en eller flere andre proteasehem-mere) er ikke nevnt i denne publikasjon.

I overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse er det erkjent at det foreligger et behov for å øke utnyttelsen av forproteinet i formulert for, og ifølge den foreliggede oppfinnelse er det tatt sikte på å treffe de nødvendige foran-staltninger og å skaffe til veie et tilsetningsmiddel for formulert for for realisering av dette generelle formål.

Proteinmolekylet består av hundreder til mange tusen aminosyrer som er bundet sammen i en kjede. Slike kjeder av aminosyrer er enn videre foldet eller pakket sammen til helt unike tredimensjonale strukturer, avhengig av deres aminosyrerekke-følge. Under fordøyelsen blir først denne tredimensjonale struktur forstyrret av den sure væsken i magesekken, hvoret-ter kjeden blir brutt opp av proteolyttiske enzymer og de enkelte aminosyrer frigitt. Noen aminosyrer vil foreligge som di- og tripeptider, men de fleste vil opptre i fri form. Denne nedbrytningen av proteinet skjer ved hjelp av en rekke proteinspaltende enzymer. Disse enzymene kan deles i to ho-vedgrupper: endopeptidaser og eksopeptidaser. Eksopeptidasene angriper inne i peptidkjeden og deler proteinmolekylet opp i mindre kjeder, mens endopeptidasene spalter én og én amino-syre fra enden av aminosyrekjeden. For å få en effektiv for-døyelse, må begge disse enzymgrupper være tilstede.

Eksempler på eksopeptidase er trypsin og kymotrypsin, mens eksempler på endopeptidase er kaboksypeptidase A og B.

Nærmere bestemt har formålet med den foreliggende oppfinnelse derfor vært å komme frem til et for som begunstiger utnyttelsen av proteinet i foret, det vil si fremmer økt tilvekst per proteinmengde målt ved normal foring, formengde og forings-hyppighet.

Det er likeledes tatt sikte på å anvise en anvendelse for et slikt formulert for i den hensikt å realisere et spesielt formål.

Nevnte formål er ifølge oppfinnelsen realisert ved å formu-lere foret i overensstemmelse med patentkrav 1, idet patentkrav 9 angir en spesiell anvendelse for et slikt for.

For å øke utnyttelsen av forproteinet er det ønskelig å endre opptakstiden for aminosyrer fra tarmen. Ifølge oppfinnelsen kan dette gjøres ved å blokkere en del av de protein-fordøyende enzymer (proteasene) som finnes i tarmen.

I overensstemmelse med oppfinnelsen utmerker et formulert for seg ved å inneholde en tilsetning bestående av en blanding av ulike proteaseinhibitorer, hvorav minst én oppviser affinitet overfor sentrale fordøyelsesenzymer, i den hensikt å tildele foret vekstpåskyndénde egenskaper.

Det er i og for seg kjent at proteaseinhibitorer kan opptre i visse forbestanddeler, men da utilsiktet, opptredende i helt ukontrollerte mengder. Et eksempel er den såkalte "soya-trypsin"-inhibitor som finnes i soyabønner. Dette er egentlig to inhibitorer, nemlig Bowman-Brink og Kunitz trypsin inhibitor, som er to inhibitorer som inhiberer det samme enzymet, nemlig trypsin. Denne soya-trypsin-inhibitor er ifølge flere rapporter blitt betraktet som uønsket på grunn av sin negative effekt idet den hemmer kun ett enzym.

Ved til formulert for å tilsette en blanding proteasehemme-re/-inhibitorer (enzymregulatorer) som kan utvinnes av vege-tabilske stoffer, så som planter, for eksempel fra poteter eller soya eller som kan være kjemisk fremstilt, for eksempel camostate, eller i ulike kombinasjoner av disse, har det - ved til foret å tilsette en blanding av flere ulike protease-hemmere i meget små, nøyaktig kontrollerte mengder - derimot vist seg å inntre en vesentlig forbedring av proteinutnyt-telsen og tilveksten.

Den aktive substans (proteasehemmerblandingen) kan eksempelvis utgjøre 0,001 - 0,2% beregnet på ferdig for.

Et for ifølge oppfinnelsen utmerker seg således i første rekke ved at det inneholder en tilsetning bestående av en nøye tilmålt blanding av ulike proteaseinhibitorer i en mengde som er meget liten i forhold til resten av det formulerte forets vekt.

Proteaseinhibitorene kan med fordel være tilsatt til foret i konsentrert form. En vesentlig virkning som er en iboende egenskap hos proteaseinhibitorer hvori inngår en konsentrert inhibitor isolert eller oppkonsentrert fra potetsaft, er at

blandingen inhiberer både endogene og eksogene proteaser.

Den foran angitte prosentvise andel/tilsetningsmengde av proteaseinhibitorer kan være basert på et proteinkildeantall

> 2. Ved 3 proteinkilder medregnes bidrag fra bindere.

Ved fem forsøksserier utført i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse ble det som tilsetningsmiddel til et or-dinært formulert fiskefor anvendt en blanding som inneholdt flere ulike proteasehemmende komponenter. Proteaseinhibitorblandingen ble tilsatt til foret i konsentrert form, blant annet innenfor det forannevnte mengdeområde på 0,001 - 0,2%.

Ved disse fem serier med forsøk ble det forsøkt kartlagt:

Om tilsetningen hemmet den enzymatiske aktiviteten i en fisketarm (på laks);

Å konstatere det optimale tilsetningsnivå av proteaseinhibitorblandingen ved foring av laks;

Fordøyeligheten av hovednæringsstoffer ved bruk av proteaseinhibitorblanding i for til laks;

Effekten ved bruk av proteaseinhibitor i kombinasjon med ulike proteinkilder i laksefor;

Opptaksforløpet for aminosyrer ved hjelp av proteaseinhibitorblanding.

Resultatene var som følger:

Undersøkelser in vitro viste at det kunne oppnås en reversibel delvis hemming av enzymaktiviteten i en enzymekstrakt isolert fra laksetarm. Dette indikerer at det skjer en mid-lertidig immobilisering av endo- og eksopeptidaser når det formulerte foret er tilsatt en proteaseinhibitorblanding i-følge oppfinnelsen;

Doseresponsforsøk viste at ved et tilsetningsnivå ble det oppnådd en vekstfremmende effekt ved å tilsette proteaseinhibitorblanding ifølge oppfinnelsen, uten at det ble funnet no-en negativ innvirkning på forutnyttelsen (forfaktor) eller totalfordøyelsen av proteinet;

Doseresponsforsøk viste også at det over et visst inn-blandingsnivå for proteaseinhibitorblandingen inntråtte en klar reduksjon i proteinfordøyeligheten målt som nitrogen-fordøyelighet. Det ble ikke registrert noen virkning på for-døyeligheten av fett;

Ved anvendelse av optimal proteaseinhibitorkonsentrasjon ble det oppnådd en klar tilvekstøkning med utgangspunkt i formulert, fiskemelbasert fiskefor sammenlignet med bruk av iden-tisk for uten tilsetningen ifølge oppfinnelen. Ved å erstatte noe av fiskemelforbestanddelen med hydrolysert protein (fiskeensilasje) ble tilveksten ytterligere forsterket; (Mengde hydrolysert protein tilsatt i et for kan måles som TNBS med en binding av frie alfa amino grupper til trinitrobenzo-sulphonic acid, L-leusin brukes som standard.) TNBS verdien bør ligge mellom 0,4 og 2,0.

Ved studier av opptaket i blodet av <14>C-merket intakt protein fra tarm ble det funnet et endret opptak ved tilsetning av konsentrert proteaseinhibitorblanding ifølge oppfinnelsen til foret.

Etterfølgende tabeller illustrerer relasjoner mellom tilsetning av proteaseinhibitorblandinger til formulerte for:

Tabell 1 illustrerer økningen i % daglig tilvekst ved bruk av fiskemelbasert for tilsatt proteaseinhibitor- blanding ifølge oppfinnelsen. Økningen er på 13%.

Tabell 2 illustrerer økningen i % daglig tilvekst når noe av fiskemelet i foret er erstattet med hydrolysert protein (fiskeensilasje). Økningen er på 32%.

Tabell 3 illustrerer grafisk nitrogenfordøyelsen (ordinat) i % som funksjon av tilsatt mengde proteaseinhibitorblanding (i gram per kg for), og anskueliggjør hvordan nitrogen- eller proteinfordøyelsen påvirkes ved økende tilsetning av proteaseinhibitorblanding ifølge oppfinnelsen.

Det konkluderes med at resultater oppnådd ved å tilsette en blanding av ulike proteaseinhibitorer i form av endo- og eksopeptidaseinhibitorer til et formulert for vil det som tilsiktet inntre en reversibel hemming av proteinfordøyelses-enzymene. Ved for høye tilsetninger av inhibitorblanding vil dette gå ut over den totale proteinfordøyelighet. Ved en optimal innblanding av inhibitorblanding oppnås det en til-vekstgevinst som forsterkes ved bruk av flere proteinkilder med ulikt opptaksforløp fra fisketarm.

Opptaksstudier av isotopmerkede aminosyrer indikerer at det foreligger en kombinasjon av økt enzymproduksjon som kompen-sasjon for hemmingen av en del fordøyelsesenzymer i tarmen, sammen med en opphevelse av enzymblokkeringen som følge av den reversible bindingen mellom enzym og inhibitor. Dette gir et annet opptaksmønster for aminosyrer ved bruk av en proteaseinhibitorblanding tilsatt i foret.

Claims (9)

1. Formulert proteinholdig for, inneholdende en tilsetning bestående av en nøyaktig tilmålt, kontrollerbar mengde proteaseinhibitor, karakterisert ved at foret inneholder en tilsetning bestående av en blanding av ulike proteaseinhibitorer, hvorav minst én oppviser affinitet overfor sentrale fordøyelsesenzymer, i den hensikt å tildele foret vekstpåskyndende egenskaper.

2. Formulert proteinholdig for som angitt i krav 1, karakterisert ved at foret inneholder en tilsetning bestående av en blanding av endo- og ekso-proteaseinhibitorer.

3. Formulert proteinholdig for som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at hver av de proteaseinhibitorer som inngår i den til foret tilsatte blanding, ved blandingen befant seg i konsentrert form.

4. Formulert proteinholdig for som angitt i ett eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at den til foret tilsatte blanding av proteaseinhibitorer i konsentrert form utgjør mellom 0,001 og 0,2% av forets vekt.

5. Formulert proteinholdig for som angitt i ett eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at en av nevnte ulike proteaseinhibitorer i den til foret tilsatte blanding er fremstilt på vegetabilsk basis, for eksempel potetmasse.

6. Formulert proteinholdig for som angitt i ett eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at en av nevnte ulike proteaseinhibitorer i den til foret tilsatte blanding er kjemisk fremstilt, for eksempel camostate.

7. Formulert proteinholdig for som angitt i ett eller flere av de foregående krav, karakterisert ved én eller flere av de i den til foret tilsatte blanding av ulike proteaseinhibitorer er valgt med henblikk på deres evne til å inhibere både endo- og eksoproteaser.

8. Formulert proteinholdig for som angitt i ett eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at proteininnholdet i det vesentlige utgjøres av fiskemel og hydrolysert protein, hvor TNBS verdien er mellom 0,4 og 2,0.

9. Anvendelse av formulert proteinholdig for som angitt i ett eller flere av de foregående krav som hovedfor ved foring av enmagede dyr, for eksempel laks og ørret, i den hensikt gjennom tilsetningen av blandingen av ulike proteaseinhibitorer i konsentrert form å avstedkomme en økt utnyttelse av proteinene i foret, slik at en større andel av de fordøyde aminosyrer blir avleiret som muskelprotein mens en mindre andel forbrennes som energi.