SK130894A3 - Improved production of reproductive hormones - Google Patents
Improved production of reproductive hormones Download PDFInfo
- Publication number
- SK130894A3 SK130894A3 SK1308-94A SK130894A SK130894A3 SK 130894 A3 SK130894 A3 SK 130894A3 SK 130894 A SK130894 A SK 130894A SK 130894 A3 SK130894 A3 SK 130894A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- cells
- subunit
- fsh
- subunits
- expression
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 title abstract description 34
- 239000005556 hormone Substances 0.000 title abstract description 34
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 title abstract description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 82
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 23
- 210000004739 secretory vesicle Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 11
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 claims description 11
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 8
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 8
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 claims description 8
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 claims description 8
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 claims description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 8
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims 1
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 34
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 34
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 34
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 20
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 19
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 18
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 12
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 11
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 11
- 102100040977 Follitropin subunit beta Human genes 0.000 description 11
- 108010081485 beta Subunit Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 11
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 11
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N FORSKOLIN Chemical compound O=C([C@@]12O)C[C@](C)(C=C)O[C@]1(C)[C@@H](OC(=O)C)[C@@H](O)[C@@H]1[C@]2(C)[C@@H](O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N 0.000 description 10
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 10
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 9
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 9
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 description 8
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 description 8
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 8
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 101800005309 Carboxy-terminal peptide Proteins 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 7
- 229940015047 chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 7
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 7
- 101710116299 Choriogonadotropin subunit beta Proteins 0.000 description 6
- 101710166590 Choriogonadotropin subunit beta 3 Proteins 0.000 description 6
- 102100031196 Choriogonadotropin subunit beta 3 Human genes 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N Deoxycoleonol Natural products C12C(=O)CC(C)(C=C)OC2(C)C(OC(=O)C)C(O)C2C1(C)C(O)CCC2(C)C SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 5
- 108010066058 beta Subunit Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 5
- OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N colforsin Natural products OC12C(=O)CC(C)(C=C)OC1(C)C(OC(=O)C)C(O)C1C2(C)C(O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 102000003864 Human Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 4
- 108010082302 Human Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000002269 analeptic agent Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 229940094892 gonadotropins Drugs 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 3
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 3
- 101710183224 Lutropin subunit beta Proteins 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 3
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 101000893054 Homo sapiens Follitropin subunit beta Proteins 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 102000005427 Asialoglycoprotein Receptor Human genes 0.000 description 1
- 241000713842 Avian sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 101710203050 Follitropin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 101000776619 Homo sapiens Choriogonadotropin subunit beta 3 Proteins 0.000 description 1
- 101001033280 Homo sapiens Cytokine receptor common subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 102100040947 Lutropin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 108010090665 Mannosyl-Glycoprotein Endo-beta-N-Acetylglucosaminidase Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- ABBQHOQBGMUPJH-UHFFFAOYSA-M Sodium salicylate Chemical compound [Na+].OC1=CC=CC=C1C([O-])=O ABBQHOQBGMUPJH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 101710087584 Thyrotropin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 102100029530 Thyrotropin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 1
- 210000002556 adrenal cortex cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 108010006523 asialoglycoprotein receptor Proteins 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001508 asparagines Chemical class 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 102000035824 beta Subunit Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 102000055647 human CSF2RB Human genes 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000011177 media preparation Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002684 recombinant hormone Substances 0.000 description 1
- 230000003830 regulated secretory pathway Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000000580 secretagogue effect Effects 0.000 description 1
- 210000002955 secretory cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 229960004025 sodium salicylate Drugs 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 229960000874 thyrotropin Drugs 0.000 description 1
- 230000001748 thyrotropin Effects 0.000 description 1
- 239000012049 topical pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
Oblasť techniky
Vynález sa týka spôsobov rekombinantnéj produkcie rozmnožovacích hormónov s umiestneniami glykosylácie bližšími natívnym typom, než sú obecne získatelné v transformovaných bunkách. Hlavne sa týka produkcie rekombinantných hormónov v podmienkach, ktoré vedú k účinnej produkcii a sekrécii a ktoré riadia usporiadanie glykosylácie proteínu.
Doterajší stav techniky
Ľudská rozmnožovacia funkcia je čiastočne riadená skupinou heterodimérnych ludských glykoproteínových hormónov, ktoré majú bežnú a podjednotku, ale líšia sa vo svojich hormón-špecifických β podjednotkách. Skupina zahŕňa folikulostimulujúci hormón (FSH), luteinizujúci hormón (LH), thyrotropín alebo thyroidstimulujúci hormón (TSH), a ludský chorionický gonadotropín (CG). Vo všetkých prípadoch je podjednotkou 92 aminokyselinový glykoproteín s dvoma konvenčnými glykosylačnými miestami pri asparaginoch umiestnených v polohách 52 a 78. β podjednotky sú tiež glykoproteíny, naviac k N-naviazanej glykosylácii vykazovanej β reťazcami všetkých štyroch hormónov, obsahuje ludský CG štyri mucínu podobné O-naviazané oligosacharidy pripojené ku karboxy-terminálnemu predĺženiu unikátne u tohto hormónu. O-naviazaná glykosylácia nie je zrejme závažná vzhladom k sekrécii a zostave hormónu (Matzuk, M.M. et al. 68 Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 84:6354-6358) .
Boli pripravené genomové a cDNA klony, zodpovedajúce ludskému a reťazcu (Boothby, M. et al. J. Biol. Chem. (1981) 256:5121-5127 Fiddes, J.C. et al. J. Mol. App. Genet. (1981)
1:3-18). Tiež boli pripravené cDNA a/alebo genomové sekvencie β podjednotiek. Pre CG je β-kódujúca DNA opísaná Fiddesom J.C. et al. Náture (1980) 286:684-687 a Policastrom, P. et al. J. Biol. Chem. (1983) 258:11492-11499. Pre luteinizujúci hormón opisuje tieto Boorstein , W.R. et al. Náture (1982) 300:419-422, pre TSH Hayashizaki, Y. et al. FEBS Lett (1985) 188:394-400 a Whitfield, G.K. et al. vo Frontiers in Thyroidology, (1986) Medeiros-Nato, G. et al. (eds) str. 173-176, Plénum Press, NY. Tieto DNA segmenty boli rekombinantne exprimované a bol produkovaný biologicky aktívny materiál.
Genomová sekvencia, kódujúca FSH-β reťazec, bola použitá pre konštrukt rekombinantného expresného vektoru, obsahujúceho kompletný β reťazec kódujúci sekvenciu, ako je opísané v PCT prihláške WO 86/045 89 publikovanej 14. augusta 1986. Ďalej genomové klony pre ludský FSH-β boli pripravené aj inými autormi (Watkins, P.C. et al. DNA (1987) 6:205-212, Jameson, J.L. et al., Mol. Endocrinol. (1988) 2:806-815, Jameson, J.L. et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. (1986) 64:319-327, Glaser, T. et al. Náture (1986) 321:882-887). PCT prihláška WO 9G/09800 opisuje expresiu ludského FSH v bunkách vaječníkov čínskych škrečkov. Bol tiež získaný hovädzí β-FSH gén, ako je uvedené v prácach, ktorých autormi sú Kim, K.E. et al. DNA (1988) 7:227-333.
Vyššie citovaná PCT prihláška WO 90/09800 opisuje mnoho expresných systémov pre ludské rozmnožovacie hormóny, obsahujúce ich a podjednotky a β podjednotky. Naviac táto prihláška opisuje určité muteíny a podjenotky a β podjednotky, ktoré sú vhodné včfaka svojej zmene sekrečných charakteristík alebo typu glykosylácie. Avšak expresné systémy špecificky opísané vo vyššie citovanej PCT prihláške sú obmedzené na myšie bunky a bunky vaječníku čínskeho škrečka. Predložená prihláška opisuje použitie expresných systémov typu opísaného vo vyššie uvedenej prihláške v bunkách obsahujúcich sekrečné granule, zvlášť v bunkách získaných z hypofýzy. Získajú sa tak maturo3 vané formy B podjednotiek alebo heterodimérov glykosylovaných spôsobom analogickým ich natívnym formám, ako aj zvýšená schopnosť buniek sekretovať hormón.
Podstata vynálezu
Vynález poskytuje kultúry, ktoré sú schopné sekretovat formy ludských gonadotropínov, vrátane ich individuálnych B podjednotiek, a zahrňujúce muteíny hormónov a podjednotiek ktoré majú glykosylačné usporiadanie podobné, ako u prirodzene produkovaných materiálov a ktoré sú schopné byť sekretované do média. Sekrécia do média značne ulahčuje proces čistenia hormónu, ktorý je produkovaný a napodobenie glykosylácie prirodzenej substancie umožňuje lepšiu predvídatelnosť chovania in vivo z hladiska zhromaždenia údajov s ohľadom na prirodzené materiály.
V jednom aspekte je vynález riadený na spôsob produkcie ludských rozmnožovacích hormónov (gonadotropínov) alebo ich B podjednotiek rekombinantné, a táto metóda zahŕňa kultiváciu buniek získaných zo živočíšneho tkaniva, kde tieto bunky obsahujú sekrečné granule, ktoré boli transformované expresným vektorom schopným expresie DNA kódujúcej uvedený ludský rozmnožovací hormón alebo jeho B podjednotku za podmienok, kečf sa uvedená expresia uskutoční a získania hormónu alebo podjednotky zo supernatantu kultúry. Z iného aspektu je vynález riadený na kultúry týchto transformovaných buniek vhodné v spôsobe podlá vynálezu.
Opis obrázkov na výkresoch
Obr. 1 - diagram konštrukcie ludskej a podjednotky minigénu a vektory pre jej expresiu.
Obr. 2 - diagram konštrukcie predĺženej formy FSH β podjednotky .
Obr. 3 - fotokópia gélovej dráhy rekombinantných supernatantov 35S-cysteín značenej LH-α podjednotky a 35SO4
O c značeného alebo S-cysteín značeného LH diméru.
Obr. 4 - panel A je fotokópia gélu 1 lysátov a média sulfátom značených LH-exprimujúcich buniek za prítomnosti alebo neprítomnosti látky ovplyvňujúcej sekréciu, pa nel B predstavuje výsledky dosiahnuté pri ošetrení s Endo F.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Ľudská a podjednotka a íudské FSH, LH, TSH a CG-β podjednotky, ako aj heterodimérne formy, majú všeobecne svoje konvenčné definície a týkajú sa proteínov obsahujúcich aminokyselinové sekvencie známe v odbore ako také, alebo ich alelických variantov, ich zámerne konštruovaných muteínov, zachovávajúcich si aktivitu prirodzeného proteínu bez ohíadu na vykazované usporiadanie glykosylácie alebo ich mutantných foriem s aspoň 90% homológiou s natívnymi formami. Ľudské rozmnožovacie hormóny alebo gonadotropín a ich podjednotky sa týkajú všetkých týchto štyroch heterodimérov (alebo ich muteínov) a ich podjednotiek.
Prirodzené formy týchto hormónov alebo podjednotiek sú tie, ktoré majú aminokyselinové sekvencie izolované z ľudského tkaniva a majú tieto známe sekvencie per sa, alebo ich alelické varianty.
Muteínové formy týchto proteínov sú tie, ktoré majú zámerné zmeny v aminokyselinových sekvenciách, dosiahnuté napríklad miestne špecifickou mutagenézou alebo inými rekombi5 nantnými manipuláciami alebo ktoré sú pripravené synteticky. Tieto zmeny vedú k aminokyselinovým sekvenciám, kde je biologická aktivita podjednotky zachovaná a/alebo kde podjednotka má aspoň 90% homológiu s prirodzenou formou.
Napríklad preferovaný muteín a podjednotky pre použitie v antagonistoch rôznych heterodimérov má zmeny v aminokyselinách v polohách 88 - 92.
Zvlášť preferovaný muteín FSH-β alebo LH-β, je napríklad predĺžený FSH-β alebo LH-β, kde je aminokyselinová sekvencia, obsahujúca karboxy terminálny peptid (CTP) hCG, fúzovaná ku karboxy-koncu FSH-β alebo LH-β. Použitý výraz CTP sa týka extra sekvencie pri C-konci CG-β peptidu v porovnaní s inými príbuznými hormóny. Dĺžka účinného CTP v porovnaní s inými β podjednotkami sa môže mierne meniť, ale siaha zhruba od aminokyselín 112-118 CG k zvyšku 145 na C-konci. Presná dĺžka CTP v konštruktoch bude jasná z kontextu.
V opísaných fúziách môže byt použitý prirodzený CTP alebo jeho variant. Variantom je mienený konzervatívny analóg peptidových zvyškov od asi 112 - 118 do 145, t.j. tá sekvencia, kde asi 1-5 aminokyselín je v sekvenčii zmenených bez podstatnej zmeny vlastností. Často táto variácia vzniká jednoducho z mutácie pre získanie vhodných reštrikčných miest.
Aj keď je treba uznať, že glykosylačné usporiadanie má vplyv na aktivitu ako kvalitatívne, tak kvantitatívne, pre zjednodušenie výrazy FSH, LH, TSH a CG β podjednotky, sa týkajú charakteristiky aminokyselinovej sekvencie peptidov ako podjednotky. Ak je uvádzaný len reťazec, výraz bude napr. FSH-β, ak je uvádzaný heterodimér bude použitý jednoduchý výraz FSH. Z kontextu bude zrejmé, ako je usporiadanie glykosylácie ovplyvnené napr. rekombinantným expresným hostiteíom alebo zmenou glykosylačných miest. Formy glykoproteínu so špecifickými typmi glykosylácie budú tiež uvedené.
Ako je tu použité, a podjednotka minigén označuje génovú konštrukciu opísanú v PCT prihláške WO 90/09800 v opise konštrukce pM2/CGa alebo pM2/a. Tento minigén je charakterizovaný zachovaním len jednej intronovej sekvencie, ako je sekvencia medzi exonom III a exonom IV, všetky ďalší introny boli vypustené. V tu opísanej výhodnej konštrukcii N-terminálnych kódujúcich sekvencií, ktoré sú odvodené od exonu II a časti exonu III, sú dodané z cDNA a sú ligované priamo cez Xbal reštrikčné miesto do kódujúcej sekvencie exonu III tak, že introny medzi exonmi I a II a medzi exonmi II a III nie sú prítomné. Avšak je zachovaný intron medzi exonmi III a IV, ako aj signály 3' kódujúca sekvencia. Výsledný minigén môže byt bežne inzertovaný ako Bam HI/BglII segment. Iné spôsoby pre konštrukciu zrovnatelného minigénu sú samozrejmé a definícia nie je obmedzená na výhodnú konštrukciu, kde sú kódujúce sekvencie napojené cez Xbal miesto. Je to však vhodný spôsob pre konštrukciu génu a iné riešenia nie sú o nič výhodnejšie, ako napríklad syntetická alebo čiastočne syntetická príprava génu. Definícia zahŕňa tiež kódujúce sekvencie pre a podjednotku, ktorá zachováva jeden intron, ako je intron medzi exonmi III a IV, ale nie iné introny.
Transformovaná rekombinantné hostitelské bunka, tj. bunka transformovaná rekombinantnými expresnými systémami podlá vynálezu, označuje hostitelskú bunku, ktorá bola premenená, takže obsahuje expresný systém, akýmkoľvek vhodným spôsobom zavedenia tohoto systému, zahrňujúcim transfekciu, vírovú infekciu atď. Výraz transformovaný označuje bunky, obsahujúce tento expresný systém, pričom systém je integrovaný do chromozómu alebo je extrachromozomálny. Transformované bunky môžu byt buď stabilné vzhladom k inklúzii expresného systému, alebo nestabilné. Skrátka, rekombinantné hostitelské bunky transformované expresným systémom podlá vynálezu označujú bunky, ktoré obsahujú tento expresný systém ako výsledok ich spracovania pre zahrnutie takého systému, keď nie sú prirodzené, bez ohladu na spôsob prevedenia tejto inkorporácie.
Expresní systém označuje DNA sekvenciu obsahujúcu kódujúcu sekvenciu, ktorá má byť exprimovaná a pripojené kontrolné DNA sekvencie nevyhnutné pre uskutočnenie expresie kódujúcej sekvencie. Typicky tieto kontroly obsahujú promotor, terminačné regulačné sekvencie a v niektorých prípadoch operátor alebo iný mechanismus pre reguláciu expresie. Kontrolné sekvence sú tie, ktoré sú zostavené tak, aby byly funkčné v jednotlivých cielových rekombinantných hostiteľských bunkách a preto musí byť hostiteľská bunka zvolená tak, aby bola kompatibilná s kontrolnými sekvenciami v konštruovanom expresnom systéme.
Výrazy bunky bunečné kultúry a bunečné línie sú tu vzájomne zameniteľné bez ohladu na významové nuancie. Kde je rozdíl medzi nimi dôležitý, bude zrejmé z kontextu. Tam, kde môže byt použitý akýkoľvek výraz, sú zahrnuté všetky.
určitých bunkách je známe, že obsahujú sekrečné granule s hustými jadrami a že sekretujú proteíny regulovaným spôsobom, ktorý môže byt stimulovaný určitými substanciami, napríklad forskolinom. Tieto bunky alebo bunečné línie získané z vhodných živočíšnych tkanív sú hostiteľskými bunkami podľa vynálezu. Medzi také bunky patria bunky sekrečných komponentov hormonálneho systému, ako je hypofýza, β ostrovkové bunky a bunky adrenálneho kortexu. Zvlášť sú v spôsobe podľa vynálezu preferované bunky získané z hypofýzy.
V súlade s predchádzajúcim odstavcom bunky získané z hypofýzy označujú bunky alebo bunečné línie, ktoré sú kultivované z tkaniva hypofýzy získanej zo živočíšnych druhov, zvlášť savčích druhov a hlavne ľudských alebo myších hypofýz. Ilustratívna je tu GH3 myšia bunečná línia opísaná Tasjianem J., Methods Enzymol (1979) 58:527. Avšak sú tiež známe iné línie získané z hypofýzy a sú dostupné z verejných zbierok.
Ďalej môžu byt použité bunky získané priamo z hypofýz.
Bunky, obsahujúce sekrečné granule poskytujú prostredie omnoho podobnejšie hypofyzárnym bunkám na rozdiel od CHO buniek. Toto vedie k usporiadaniu glykosylácie, ktoré je viac podobné prirodzeným formám a zvyšuje účinnost sekrécie proteínov, ktoré majú byt sekretované. Produkcia gonadotropínov v takých bunkách, obsahujúcich sekrečné granule s hustým jadrom schopné sekrécie proteínov regulovaným spôsobom, tak vedie k produkcii sekretovaných foriem týchto materiálov s glykosylačným usporiadaním podobným tomu, ktoré bolo nájdené v prirodzených hormónoch alebo podjednotkách. Výhodne tieto formy hormónov alebo podjednotiek, ako je LH, ktoré zadržujú rádioaktívne značenú síru dodanú vo forme sulfátu, ak sú produkované v týchto bunkách, indikujú, že v týchto formách sú prítomné sulfátované glykosylačné jednotky. Značený SO4 2- nie je inkorporovaný do LH produkovaného v CHO bunkách alebo myších C127 bunkách.
Ak FSH je normálne sialylovaný, je podjednotka LH normálne sulfátovaná. Sialylácia N-pripojených oligosacharidov bola dlho pokladaná za chrániacu cirkulujúce gonadotropíny pred elearenciou hepatickými asialoglykoproteínovými receptormi. Naopak prítomnosť sulfátu na LH vedie k rýchlej clearencii hormónu, sulfátovaný hovädzí LH má 4 a 5 krát rýchlejšiu metabolickú clearens v porovnaní so zodpovedajúcim sialylovaným rekombinantným hovädzím LH. Sulfátovaný LH sa odstráni z obehu naviazaním k špecifickému receptoru na povrchu pečeňových epiteliálnych buniek, ktorý rozpoznáva špecificky sulfátovaný trisacharid v N-naviazanej glykosylácii. Desulfátovaný LH sa chová podobne ako sulfátovaný LH v receptorovej väzbe a signálnej transdukcii v MA-10 bunkách, ale pre stimuláciu ovulácie sú vyžadované vysoké in vivo dávky pravdepodobne preto, že cirkulačný polčas životnosti je sulfatáciou zmenený. Predpokladá sa, že klinické použitie LH pri rozmnožovaní ľudí a zvierat bude vyžadovať hormón v sulfátovanéj forme.
Expresné vektory
Pre konštrukciu vhodných expresných vektorov pre použitie v sekrečných bunkách podľa vynálezu sa vhodný konštrukt, ilustrovaný pre a podjednotkový minigén, reprodukuje z vyššie zmienenej PCT prihlášky ako obr. 1. Ako je na tomto obrázku znázornené a podrobnejšie vysvetlené vo vyššie citovanej prihláške, sekvencie kódujúce a podjednotku sa pripravia ako minigén, kde časti peptidu, kódované exonmi XI - III, sú fúzované ale oddelené od exonu IV. Tento konštrukt sa liguje do hostiteľského vektoru pM2 pod kontrolou dlhého terminálneho opakovania, ako je znázornené na obr.l, pre získanie pM2/CGa alebo pre získanie ρΜ2α , ktorý obsahuje ďalšie inzerčné miesto pre ďalšiu kódujúcu DNA. Ako je ďalej uvedené na obr. 1, Bam Hl miesto obsiahnuté v hostiteľskom vektore pM2 môže byť použité k prispôsobeniu β podjednotiek ľudských rozmnožovacích proteínov pre expresiu týchto podjednotiek per sa, ako aj poskytnutie separátneho expresného vektoru pre súčasnú produkciu a a β podjednotiek bunkami transformovanými oboma vektormi.
β podjednotky per se môžu byt produkované ligáciou kódujúcej DNA do pM2, ako je uvedené, alebo heterodimér môže byt produkovaný kotransformáciou pM2, obsahujúcim DNA kódujúcu β podjednotku s pM2/CGa. Preferovaná je produkcia heterodiméru. Heterodimér môže byt tiež produkovaný z jediného vektoru, kde inzert je ligovaný do BamHI miesta pM2/a vytvoreného ligáciou EcoRI - štiepeného pM2 s EcoRI-štiepeným modifikovaným pM2/CGa.
Predchádzajúce konštrukcie sú samozrejme skôr ilustráciou expresných vektorov alebo systémov, ktoré môžu byt konštruované pre produkciu a podjednotiek alebo zodpovedajúcich heterodimérnych hormónov. Alternatívne kontrolné sekvencie zahrňujúce napríklad rôzne promotory, môžu byť ligované ku kódujúcej sekvencií ludských β podjednotiek alebo a minigénu pre uskutočnenie expresie. V odbore je známych mnoho kontrolných sekvencií a metódy ligácie β podjednotiek alebo a minigén kódujúcej sekvencie (alebo iného - kódujúceho konštruktu) sú samozrejme tiež dostupné. Vhodné savčie promotory zahrňujú včasné a pozdejšie promotory SV40 alebo iné vírové promotory ako sú tie, ktoré sú získané z polyoma, adenovíru 2, hovädzieho papilloma víru alebo avian sarkoma vírov. Môžu byt tiež použité vhodné vírové a savčie zosilňovače.
Ako bolo uvedené v časti Doterajší stav techniky, je získanie génov z rôznych ludských rozmnožovacích hormónov, obsahujúcich ich β podjednotky, už opísané. Gény môžu byt získané z prírodných zdrojov, ako je v odbore opísané, alebo môžu byt úplne alebo čiastočne syntetizované za použitia štandardných techník syntézy oligonukleotidov v pevnej fáze, ako je opísané napríklad v práci, ktorej autorom je Nambiar
K.P. a kol., Science (1984) 223:1299 alebo Jaye E. a kol., J. Biol. Chem. (1984) 259:6311. Samozrejme je jasné, že môžu byt použité nielen špecifické prirodzené nukleotidové sekvencie, ale tiež nukleotidové sekvencie využívajúce kodony, ktoré sú nimi degenerované, ako aj allelické formy.
Ako je opísané vo vyššie citovanej PCT prihláške, môžu byt získané muteíny rôznych hormónov, ktoré majú aktivitu agonistu alebo antagonistu. Tieto muteín kódujúci gény môžu byt inzertované do relevantných hostitelských vektorov spôsobom podobným tomu, ktorý je opísaný pre prirodzené formy. Zvlášt zaujímavé sú muteíny, kde sú β podjednotky LH, TSH alebo FSH predĺžené karboxyterminálnym peptidom prirodzeným k chorionickému gonadotropínu. Jeden taký konštrukt je ilustrovaný na obr. 2 pre ludský FSH. Ďalej viac než jedna z CTP jednotiek môže byt použitá pre prodíženie β reťazcov.
Transformácia a bunečná kultúra
Všeobecne sa vybraný expresný vektor alebo vektory transfektujú alebo ináč transformujú do hostitelských buniek podlá vynálezu za použitia postupov podobných tým, ktoré boli použité všeobecne pre savčie bunky. Techniky pre transformáciu sú v podstate tie, ktoré boli aplikované na bunky vaječníkov čínského škrečka a systémy pre selekciu úspešných transformantov sú tiež v podstate identické. Podmienky bunečnej kultivácie pre transformované bunky môžu byť modifikované, ako je treba obecne chápať, pre uspokojenie konkrétnych potrieb vybranej hostitelskej bunečnej línie, ktorá bude obsahovat regulované sekrečné granule, podmienky kultivácie sú však v podstate podobné tým, ktoré sa používajú pre CHO bunky.
V ilustratívnom prevedení transfekcie a kultivácie je β podjednotku - kódujúci gén inzertovaný do pM2 a potom transfektovaný samotný alebo spolu s pM3/CGa do buniek vhodných pre metódu podlá vynálezu, ktoré obsahujú regulované sekrečné granule alebo do buniek vaječníkov čínskeho škrečka, ako opísal Matzuk M.M. a kol. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 84:6354-6358, Maztuk, M.M., et al., J. Celí. Biol.(1988) 106:1049-1059. Úspešné transformanty sú selektované v 0,25 ug/ml G418 a expresia môže byť detekovaná imunoprecipitáciou metabolický značených buniek pre výber monomér- a dimér-sekretujúcich bunečných línií.
Ako stabilný transfektovaný hostitelia, obsahujúci regulované sekrečné granule, tak stabilné transfektované CHO bunečné línie sa udržujú v médiu - 1 (Ham's F 10 médium doplnené 15 % konského séra a 2,5 % fetálneho telacieho séra, penicilínom (100 j/ml) streptomycínom (100 μ9^1), glutamínom (2 mM) a 0,125 mg/ml G418) vo zvlhčovanom inkubátore s 5 %
Značenie
Ako bunky podlá vynálezu, tak CHO bunky sa umiestia v množstve 300 000 až 350 000 buniek na jamku do 12-jamkových misiek v 1 ml F-10 média, obsahujúcom 15 % konského séra a 2,5% fetálneho telacieho séra a premiestni sa znovu na misku za 3-4 dny. Pre kontinuálne značenie sa bunky dvakrát premyjú bezcysteínovým médiom - 2 (médium 1 doplnené 5 % dialyzovaného telacieho séra) a značí sa 6 hodín v 1 ml bezcysteínového média 2, obsahujúceho 20 ^Ci/ml značeného cysteínu. Pre pulzné pokusy sa bunky premyjú dvakrát a preinkubujú 1,5 hodiny v bezcysteínovom médiu - 2 s nasledujúcim 20 minútovým značením v bezcysteínovom médiu - 2, obsahujúcom 100 ^Ci/ml značeného cysteínu, potom sa premyjú dvakrát médiom 2, obsahujúcom 1 mM, neznačeného cysteínu a inkubujú sa v neznačenom médiu.
Experimenty so značením používajúce 35S - značený sulfát sa uskutočnili podobne.
Podrobnejšie o príprave média a bunečných lyzátov, ich imunoprecipitácii a spracovaní viď Corless, C.L. et al., J Celí Biol (1987) 104:1173-1181 a vo vyššie citovanom Matzukovom PNAS článku. Antiséra proti CG-B, LH-B,FSH-B a TSH-B a a podjednotke sa pripravia štandardnými metódami, antiséra vyvinuté proti CG-B krížovo reagujú plne s LH-B a môžu byť použité aj pre detekovanie LH-B . Pre charakterizáciu imunoprecipitátov na SDS géloch sa 15 % SDS polyakrylamidové gély ponoria na 10 minút do 1 M salicylátu sodného, sušia sa a autorádiografujú s preflash filmom a skanujú, ak je to žiadúce, pomocou LKB Ultrascan XL laserového densitometra.
Expresia v CHO bunkách
Ako kontrola sa výsledky produkcie ludského FSH v CHO bunkách hodnotia značením s cysteínom. Expresné systémy opísané vyššie pre ludský FSH-β inzertovaný do pM2 pre expresiu
O
FSH-β samotného alebo do pM a pre expresiu v tandeme s podjednotkou sa transfektujú do CHO buniek a stabilné klony vykazujúce expresiu β podjednotky alebo diméru sa kontinuálne značia - cysteínom 6 hodín. Výťažky poskytujú sekretovaný FSH v množstve asi 1 mg/106 buniek/24 h kultivácie vil média .
Proteíny sekretované do média a z bunečných lyzátov sa imunoprecipitujú vhodným antisérom a štiepia sa pomocou SDS -PAGE. Získané výsledky porovnávajú chovanie podobných transformantov exprimujúcich gén pre ludský CG-β.
Bunky zo 6 hodinového značenia ukazujú, že neprítomnosť a podjednotky FSH-β je zachovaná v lyzáte, zatialčo ak je prítomná a podjednotka, je dimér tvorený a účinne sekretovaný do média.
n c
Ak sú bunky pulzne značené S - cysteínom po 20 minút a súťažia s neznačeným cysteínom až do 12 hod., výsledky pre β podjednotku CG ukazujúce polčas životnosti v lyzátoch a výskyt CG-β v médiu sú zhodné po asi 2 hodiny a môžu byť získané temer všetky sekretované podjednotky. β nižšej molekulovej hmotnosti je prítomná v médiu zrejme v dôsledku rozdielov v presahu glykosylácie na 2 Asn-napojených glykosylaóných miestach na CG-β a je jedinečný pre túto β podjednotku. FSH-β samotný je sekretovaný omnoho menej účinne a, ako CG-β, mizne z bunečného lyzátu po asi 5 hodinách, menej než 20 % sa získa v médiu po 12 hodinách.
Podobne ako β podjednotky LH a TSH, je FSH-β samotný neúčinne sekretovaný a pomaly intracelulárne degradovaný. Avšak prítomnosť a podjednotky stabilizuje a zvyšuje sekréciu β podjednotky pre FSH. Polčas životnosti pre vymiznutie z lyzátov bol asi 90 minút a 90 % bolo získané v médiu po 12 hod.
Toto chovanie je podobné chovaniu uvedenému pre TSH, ale odlišné od CG i LH.
Z predchádzajúcich výsledkov je zrejmé, že ťažkosti so sekréciou sú zistené pre expresiu v CHO bunkách pre gény, kódujúce β podjednotky samotné, v niektorých prípadoch je schopnosť sekrécií zmiernená prítomnosťou vektoru kódujúceho a podjednotku. Avšak všeobecne sa javí, že CHO bunky nie sú účinnými sekretormi požadovaných β podjednotiek alebo zodpovedajúcich ludských rozmnožovacích hormónov.
Inou ťažkosťou, ktorá je zjavná z pokusov, používajúcich sulfátové značenie ako zdroj 35S je to, že u LH-β podjednotky alebo LH heterodiméru, ktorý je známy, ako obsahujúci sulfátovanú glykosyláciu vo svojom prirodzenom stave, inkorporácia značenia neprebieha v CHO bunkách. Tak aspoň pre LH a pre časť heterodiméru, ktorý tiež obsahuje sulfátovanú glykosyláciu, sú CHO bunky neschopné reprodukcie prirodzeného usporiadania glykosylácie. Bolo dokázané, že pri použití miesto cysteínu, značeného sulfátu ako zdroja rádioaktivity, značenie sa neobjavuje v dimére alebo β podjednotke LH produkovaného v CHO bunkách.
Expresia v hypofvzárnvch bunkách
Expresné vektory opísané vyššie, obsahujúce β podjednotky LH-fl, CG-β alebo FSH-β buď spolu s alebo bez a podjednotky, a s a podjednotkou kódovanou tým istým alebo rozdielnym vektorom sú transformované do krysej hypofyzárnej bunečnej línie GH3. Po značení buď sulfátom (pre LH) alebo S35 cysteínového pôvodu (pre všetky formy) sa zrelé formy LH, FSH a hCG, ktoré obsahujú opracované oligosacharidy, uchovávajú v bunkách a ich uvolnenie je stimulované forskolinom. Väčšina β podjednotiek týchto hormónov sa javí byt Endo H senzitívna a tak usadená v ER, ale Endo H rezistentná frakcia, ktorá je v ma15 túrovanej forme, bola cielená k regulovanej sekrečnej dráhe s účinnosťou, ktorá bola medzi dimérom a B podjednotkou.
Obr. 3 ukazuje výsledky získané z GH3 buniek, ktoré boli transformované pM /a, do ktorých bola kódujúca sekvencia pre LH-β podjednotku inzertovaná do alternatívneho Bam Hl miesta. Dráhy 1 a 2 sú kontroly z GH3 buniek, ktoré sú transformované len pM2/CGa, ako je z výsledkov zrejmé, je podjednotka nachádzaná väčšinou v bunkách samotných (C) skôr než v supernatante (S). Naopak, dráhy 3 a 4 predstavujú výsledky získané imunoprecipitáciou heterodiméru značeného ako je opísané vyššie použitím cysteínu alebo sulfátu a skúšaním bunečného média. Ako je z týchto výsledkov zrejmé, je velké množstvo heterodiméru sekretované do média a ako a, tak β podjednotka sú schopné prijať značenie z S35sulfátu.
V ďalšom pokuse boli bunky exprimujúce LH značené s [ S]04 po 16 hod. pre umožnenie akumulácie značených hormónov v ukladacích granúliach. Pre zníženie podstaty konštitutívnej sekrécie (tj. materiál nesekretovaný cez granule s hustým jadrom regulovanou cestou) s nasledujúcim značením, bunky boli spracované dvakrát v 2 hod. intervaloch pred stimuláciou (označené I a II na obr. 4). Na začiatku tretieho spracovania (III) bolo pridané 20 μΜ forskolinu, ako látky stimulujúcej sekréciu (adenylatcyklaza aktivátor), pre zdvojnásobenie jamiek, paralelný set bol inkubovaný bez látky stimulujúcej sekréciu. Média (M) a bunečné extrakty (L) po tretom spracovaní boli zrážané anti-β sérom a analyzované na SDS -PAGE.
Na obr. 4A dráha 1 predstavuje médium pri spracovaní I. Táto dráha ukazuje, že LH a a β podjednotky sú značené [ S]O4. Tento počiatočný pool je pravdepodobne rýchle sekretovaný, neuchovávaný pool. Po 4 hodinách (II) a 6 hodinách (III) spracovania je konštitutívny pool vyčerpaný, pretože žiadny ďalší materiál nie je v médiu prítomný (dráhy 2 a 3 na obr. 4A). Avšak je tu ešte pool LH v bunke, ako je znázornené na obr. 4A, dráha 5, ktorý predstavuje lyzát buniek neošetrených forskolinom. Tento pool je uvoľňovaný látkou stimulujúcou sekréciu do média, ako je uvedené na obr. 4A, dráha 4. Dráha 6 ukazuje, že intracelulárny pool je vyčerpaný po ošetrení forskolinom.
bácie. Tieto dráhy sekretovaného do 35,
Pre demonštráciu toho, že rádioaktívny sulfát bol inkorporovaný do N-pripojených oligosacharidov, imunoprecipitovaný [35S]O4 značený LH bol spracovaný s endoglykosidásou F, o ktorej je známe, že odstraňuje komplex N-pripojených oligosacharidov. Výsledky tohoto ošetrenia sú uvedené na obr. 4B, dráhy 1 a 2. Po štiepení pomocou Endo F rádioaktivita vymizne z a i β podjednotiek. Dráhy 3 a 4 sú kontroly pre znázornenie, že toto nie je spôsobené aktivitou proteázy počas inkuukazujú výsledky Endo F spracovania LH - t s média po značení JJS-cysternom.
S-cysteínom značené LH podjednotky sa zložia do jedného pásu zodpovedajúceho deglykosylovanému proteínu po Endo F štiepení .
Tieto údaje ukazujú, že: 1) LH je uchovaný v GH3 bunkách a jeho uvoľnenie je stimulované látkou stimulujúcou sekréciu (také uchovávanie a uvolňovanie nie je zistené v CHO bunkách značených S04 alebo cysteínom), 2) N-pripojené oligosacharidy LH sú sulfátované, ak sú produkované v GH3 bunkách.
Zostava β podjednotiek týchto hormónov a sekrécia dimérov je mnohonásobne zvýšená oproti sekrécii v CHO bunkách. Oligosacharid v LH dimére je tiež sulfátovaný, FSH je normálne sialylovaný in vivo a tak neprijíma značenie z S04.
Bolo demonštrované, že kompletná deglykosylácia ľudského chorionického gonadotropínu vedie k hormónu, ktorý si zachováva jeho schopnosť viazať sa k receptoru, ale už nie je schopný vyvolať bežnú biologickú odozvu bunky, na ktorej sa vytvorí receptor. Podobné účinky kompletnej deglykosylácie sa získajú s dalšími rozmnožovacími hormónmi LH a FSH. V súlade s tým zmena v glykosylačnom usporiadaní v β podjednotkách môže viesť k alternatívnym vlastnostiam. Glykosylácia hormónov a podjednotiek produkovaných metódou podlá vynálezu, ich približuje prirodzeným formám.
Využiteľnosť a podanie
Hormóny a iné farmaceutiká podľa predloženého vynálezu sú formulované pre podanie s použitím metód všeobecne v odbore známych. Typické formulácie a spôsoby podania sú opísané v Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, posledné vydanie. Tieto prípravky sú typické pre systémové podanie, ako je injekčné, ale môžu byt využité aj orálne alebo topické prípravky.
Voľba formulácie, spôsob podania a hladina dávky sú závislé na jednotlivom proteíne a môžu byť optima1izované pre príslušnú indikáciu pri použití všeobecných rozpoznávacích techník.
Claims (8)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Spôsob zlepšenej rekombinantnej produkcie ľudského glykoproteínu vybraného zo skupiny zahŕňajúcej hCG, FSH, LH a TSH, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kultiváciu buniek získaných zo živočíšneho tkaniva, ktoré obsahujú regulované sekrečné granule, kde tieto bunky boli transformované expresným systémom schopným expresie DNA, kódujúcej uvedený gonadotropín alebo jeho β podjednotku za podmienok, keď je uvedená kódujúca DNA exprimovaná a získania glykoproteínu alebo jeho β podjednotky z kultivačného média .
- 2. Spôsob podía nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedené bunky sú získané z hypofyzárneho tkaniva.
- 3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že uvedené hypof yzárne bunky sú GH3 bunky.
- 4. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že gonadotropínom je LH alebo FSH.
- 5. Bunečná kultúra schopná sekrécie ľudského glykoproteínu vybraného zo skupiny zahŕňajúcej hCG, FSH, LH a TSH, kde bunečná kultúra obsahuje bunky, ktoré obsahujú regulované sekrečné granule a získané zo živočíšneho tkaniva, kde tieto bunky boli transformované expresným systémom schopným expresie DNA, kódujúcej uvedený glykoproteín alebo jeho β podjednotku.
- 6. Kultúra podľa nároku 5, kde uvedené bunky sú získané z hypofyzárneho tkaniva.
- 7. Kultúra podľa nároku 6, kde uvedenými hypofyzárnymi bunkami sú GH3 bunky.J V·-.,.
- 8. Kultúra podlá nároku 5, kde gonadotropínom je LH alebo FSH.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/876,794 US5985611A (en) | 1992-04-30 | 1992-04-30 | Recombinant production of gonadotropins in secretory cells |
| PCT/US1993/004051 WO1993021947A1 (en) | 1992-04-30 | 1993-04-30 | Improved production of reproductive hormones |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK130894A3 true SK130894A3 (en) | 1995-07-11 |
Family
ID=25368600
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1308-94A SK130894A3 (en) | 1992-04-30 | 1993-04-30 | Improved production of reproductive hormones |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5985611A (sk) |
| EP (1) | EP0644774A4 (sk) |
| JP (1) | JPH07506968A (sk) |
| AU (1) | AU681849B2 (sk) |
| CA (1) | CA2118320A1 (sk) |
| CZ (1) | CZ284885B6 (sk) |
| FI (1) | FI945037A (sk) |
| HU (1) | HUT69984A (sk) |
| NZ (1) | NZ252484A (sk) |
| SK (1) | SK130894A3 (sk) |
| WO (1) | WO1993021947A1 (sk) |
| ZA (1) | ZA933070B (sk) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2710845B1 (fr) * | 1993-10-08 | 1996-03-29 | Lafon Labor | Composition destinée à l'immunothérapie d'un cancer sécrétant l'hCG ou des fragments d'hCG. |
| US7081446B2 (en) * | 2002-01-31 | 2006-07-25 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Long-acting follicle stimulating hormone analogues and uses thereof |
| US7173113B2 (en) * | 2002-01-31 | 2007-02-06 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Long-acting hormone and growth factor compositions and uses thereof |
| DE602004030546D1 (de) | 2003-03-04 | 2011-01-27 | Aspenbio Pharma Inc | LH zur Verwendung der Erhaltung einer oder mehreren Schwangerschaften durch Induktion der Bildung des sekundären Gelbkörpers. |
| JP4412989B2 (ja) * | 2003-12-15 | 2010-02-10 | 株式会社日立製作所 | 複数の記憶システムを有するデータ処理システム |
| WO2014159813A1 (en) | 2013-03-13 | 2014-10-02 | Moderna Therapeutics, Inc. | Long-lived polynucleotide molecules |
| BR112021022860A2 (pt) | 2019-05-16 | 2022-01-18 | Ceva Sante Animale | Composições e métodos para aumentar o desempenho da reprodução em mamíferos não humanos com uso de hormônio luteinizante recombinante |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4828987A (en) * | 1984-05-14 | 1989-05-09 | Merck & Co., Inc. | Avian retrovirus-bovine growth hormone DNA |
| CA2053864C (en) * | 1989-02-21 | 2001-11-20 | Irving Boime | Modified forms of reproductive hormones |
-
1992
- 1992-04-30 US US07/876,794 patent/US5985611A/en not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-04-30 JP JP5519520A patent/JPH07506968A/ja active Pending
- 1993-04-30 EP EP93910915A patent/EP0644774A4/en not_active Ceased
- 1993-04-30 HU HU9403094A patent/HUT69984A/hu unknown
- 1993-04-30 ZA ZA933070A patent/ZA933070B/xx unknown
- 1993-04-30 NZ NZ252484A patent/NZ252484A/en unknown
- 1993-04-30 AU AU42241/93A patent/AU681849B2/en not_active Ceased
- 1993-04-30 SK SK1308-94A patent/SK130894A3/sk unknown
- 1993-04-30 WO PCT/US1993/004051 patent/WO1993021947A1/en not_active Application Discontinuation
- 1993-04-30 CZ CZ942662A patent/CZ284885B6/cs unknown
- 1993-04-30 CA CA002118320A patent/CA2118320A1/en not_active Abandoned
-
1994
- 1994-10-26 FI FI945037A patent/FI945037A/fi not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI945037A (fi) | 1994-12-21 |
| HU9403094D0 (en) | 1994-12-28 |
| NZ252484A (en) | 1996-06-25 |
| ZA933070B (en) | 1994-05-03 |
| AU681849B2 (en) | 1997-09-11 |
| AU4224193A (en) | 1993-11-29 |
| CZ284885B6 (cs) | 1999-03-17 |
| US5985611A (en) | 1999-11-16 |
| FI945037A0 (fi) | 1994-10-26 |
| HUT69984A (en) | 1995-09-28 |
| EP0644774A4 (en) | 1997-03-12 |
| JPH07506968A (ja) | 1995-08-03 |
| WO1993021947A1 (en) | 1993-11-11 |
| EP0644774A1 (en) | 1995-03-29 |
| CA2118320A1 (en) | 1993-11-11 |
| CZ266294A3 (cs) | 1998-11-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Furuhashi et al. | Fusing the carboxy-terminal peptide of the chorionic gonadotropin (CG) beta-subunit to the common alpha-subunit: retention of O-linked glycosylation and enhanced in vivo bioactivity of chimeric human CG. | |
| Sugahara et al. | Biosynthesis of a biologically active single peptide chain containing the human common alpha and chorionic gonadotropin beta subunits in tandem. | |
| Fares et al. | Design of a long-acting follitropin agonist by fusing the C-terminal sequence of the chorionic gonadotropin beta subunit to the follitropin beta subunit. | |
| AU687053B2 (en) | Modified protein and peptide pharmaceuticals | |
| Matzuk et al. | The glycoprotein α-subunit is critical for secretion and stability of the human thyrotropin β-subunit | |
| JPH04503606A (ja) | 改変型生殖ホルモン | |
| Joshi et al. | Recombinant thyrotropin containing a beta-subunit chimera with the human chorionic gonadotropin-beta carboxy-terminus is biologically active, with a prolonged plasma half-life: role of carbohydrate in bioactivity and metabolic clearance | |
| US20080207543A1 (en) | Modified pituitary gland development in offspring from expectant mother animals treated with growth hormone releasing hormone therapy | |
| JP2003517294A (ja) | 超高活性ブタ成長ホルモン放出ホルモン類似体 | |
| US20230357345A1 (en) | Glycoprotein Hormone Long-Acting Superagonists | |
| SK130894A3 (en) | Improved production of reproductive hormones | |
| MXPA03005236A (es) | Administracion de secuencia de acido nucleico a un animal hembra para mejorar el crecimiento en la progenie. | |
| Buommino et al. | Sodium butyrate/retinoic acid costimulation induces apoptosis-independent growth arrest and cell differentiation in normal and ras-transformed seminal vesicle epithelial cells unresponsive to retinoic acid | |
| Van De Wiel et al. | High-level expression of biologically active recombinant bovine follicle stimulating hormone in a baculovirus system | |
| AU2014346859A1 (en) | Glycoprotein hormone long-acting superagonists | |
| US7270968B2 (en) | PTH analogs for renal osteodystrophy and related uses | |
| Faigle et al. | Antigen presentation and lysosomal membrane traffic in the Chediak—Higashi syndrome | |
| Farhadi-Jou | Department of Neurology and Neurosurgery |