HUT69984A - Improved process for production of reproductive hormones - Google Patents

Description

Javított reproduktív hormon termelési eljárás

Washington University, ST. LOUIS, Missouri,

AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK

Feltaláló: BŐIMÉ Irving, ST. LOUIS, Missouri,

AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK

A bejelentés napja: 1993. 04. 30.

Elsőbbsége: 1992. 04. 30. (07/876,794)

AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK

A nemzetközi bejelentés száma: PCT/US93/04051

A nemzetközi közzététel száma: WO 93/21947

A találmány tárgya eljárás olyan glikozilezési mintázattal rendelkező humán reproduktív hormonok előállítására, amely glikozilezési mintázat sokkal közelebb áll a természetes mintázathoz mint az, amit általában transzformált sejtekkel elő lehet állítani. Pontosabban, a találmány tárgya rekombináns hormonok • 9 előállítása olyan körülmények között, amelyek hatékony termelést és szekréciót eredményez, és amely szabályozza a fehérje glikozilezési mintázatát.

A humán reproduktív funkciókat részben heterodimer humán glikoprotein hormonok egy családja szabályozza, amelyeknek van egy közös alegységük, de a hormon-specifikus -alegységükben eltérnek. A találmány vonatkozik a follikuluszt serkentő hormonra (FSH), a luteinizáló hormonra (LH), a tirotropinra vagy tiroidserkentő hormonra (TSH) és a humán korion gonadotropinra. Mindegyik esetben az -alegység egy 92 aminosavból álló glikoprotein, amelynek két kanonikus glikozilezési helye van az 52-es és 78-as pozícióban található aszparaginoknál. A -alegységek is glikoproteinek; a mind a négy hormon -láncánál megtalálható N-kapcsolt glikozilezés mellett a humán CG négy mucinszerű O-kapcsolt oligoszacharidot is tartalmaz, a csak erre a hormonra jellemző C-terminális meghosszabbításhoz kapcsolva. Az O-kapcsolt glikozilezés látszólag nem kötődik a szekrécióhoz és a hormon térszerkezetének kialakulásához [Matzuk, M.M. és munkatársai, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 6354-6358 (1987)].

A genomiális és cDNS kiónokat a humán -láncnak megfelelően állítjuk elő [Boothby, M. és munkatársai, Journal of Biological Chemistry, 256, 5121-5127 (1981); Fiddes, J.C. és munkatársai, J.Mol. App. Génét., 1, 3-18 (1981)]. A -alegységek cDNS és/vagy genomiális szekvenciáit is előállították. A CG-nél a -t kódoló DNS-t Fiddes és munkatársai [Natúré, 286, 684-687 (1980)], valamint Policastro P. és munkatársai írják le [Journal of Biological Chemistry, 258, 11492-11499 (1983)]. A luteinizáló hormonra ezt a leírást Boorstein, W.R. és munkatársai közük [Na-

tűre, 300, 419-422 (1982)] ; a TSH-ra pedig Hayashizaki, Y. és munkatársai [FEBS Lett., 188, 394-400 (1985)], valamint Whitfield, G.K. és munkatársai [Frontiers in Thyroidology, Medeiros-Nato, G. és munkatársai (eds), 173-176, Plenum Press, NY (1986)] . Ezeket a DNS szekvenciákat rekombináns technikával expresszálták, és biológiailag aktív anyagot termeltek.

Az FSH- láncot kódoló genomiális szekvenciát használjuk egy olyan rekombináns expressziós vektor készítésére, amely a teljes -láncot kódoló szekvenciát tartalmazza (WO 86/04589 PCT bejelentés, publikálva 1986. augusztus 14.). Emellett a humán FSH- genomiális kiónokat mások előállították [Watkins, P.C. és munkatársai, 6, 205-212 (1987); Jameson, J.L. és munkatársai,

Mól. Endocrinol., 2, 806-815 (1988); Jameson, J.L. és munkatársai, J. Clin. Endocrinol. Metab., 64, 319-327 (1986); Glaser, T.

és munkatársai, Natúré, 321, 882-887 (1986)]. A WO 90/09800 számú PCT bejelentésben a humán FSH aranyhörcsög petesejtekben való expresszióját írják le. A szarvasmarha -FSH gént előállították még Maurer, R.A. és munkatársai közlése alapján [DNA, 5, 363-369 (1986)] , valamint Kim, K.E. és munkatársai közlése alapján [DNA, 7, 227-333 (1988)].

Az előzőkben említett WO 90/09800 számú PCT bejelentés számos expressziós rendszert ír le a humán reprodukciós hormonokra, beleértve az és alegységeiket is. Emellett ebben a bejelentésben az és alegység számos muteinjét is leírják, amelyek jól használhatók a megváltozott szekréciós jellemzőik és glikozilezési mintázatuk miatt. Azonban az előzőkben ismertetett PCT bejelentésben ismertetett expressziós rendszer a rágcsáló sejtekre és az aranyhörcsög petefészek sejtekre korlátozódik. A

jelen bejelentésben az előzőkben említett bejelentésben ismertetett típusú expressziós rendszerek használatát írjuk le, olyan sejtekben, amelyek szekréciós granulumokat tartalmaznak, különösen hipofízis eredetű sejtekben. Ennek eredménye a alegységek vagy a heterodimerek érett formája, olyan glikozilezési mintázattal, amely analóg a természetes alakjukkal, valamint a sejtek fokozott képessége a hormonok szekretálására.

A találmány tárgyát olyan tenyészetek képezik, amelyek képesek a humán gonadotropinok különböző formáit szekretálni, beleértve a -alegységeiket, a hormonok muteinjeit és alegységeit, amelyeknek a glikozilezési mintázata hasonlít a természetes úton előállított anyagokéhoz, és amelyek képesek a tápközegbe szekretálódni. A tápközegbe való szekréció nagyon leegyszerűsíti a termelt hormon tisztítási eljárását, és a természetes anyagot utánozó glikozilezés lehetővé teszi, hogy pontosabban megjósoljuk az anyag in vivő körülmények között való viselkedését, tekintettel arra, hogy sok adat halmozódott fel a természetes anyagokkal kapcsolatban.

Tehát a találmány tárgya eljárás humán reproduktív hormonok (gonadotropinok) vagy -alegységeik előállítására rekombináns módszerrel, ami abban áll, hogy állati szövetből származó, szekréciós granulumokat tartalmazó sejteket szaporítunk, amelyeket egy olyan szekréciós vektorral transzformáltunk, amely képes az említett humán reproduktív hormont, illetve annak -alegységét kódoló DNS expresszálására, olyan körülmények között, amely körülmények között az említett expressziót befolyásolni lehet, és a hormont vagy az alegységét a tenyészet felülúszójából kinyerjük. A találmány tárgyai továbbá ezeknek a találmány szerinti

eljárásban használható, transzformált sejteknek a tenyészetei.

Az alábbiakban röviden megadjuk a mellékelt ábrák leírását.

Az 1. ábrán egy diagram látható, amely a humán -alegység minigén készítését mutatja be, valamint az expresszióhoz használt vektorokat.

A 2. ábrán az FSH -alegység meghosszabbított formája készítésének diagramja látható.

A 3. ábrán a 35S-ciszteinnel jelzett LH- alegység és a 35SO4-gyel jelzett vagy 35S-ciszteinnel jelzett LH dimer rekombináns felülúszó gélen való futtatásának fényképe látható.

A 4. ábrán az A panel a szulfáttal jelzett LH-t expresszáló sejtek lizátumainak és tápközegének szekretagóg jelenlétében vagy távollétében való futtatásáról készült fénykép látható; a B panel az Endo F-fel való kezelés eredményeit mutatja.

A találmány szövegében a humán -alegység, a humán FSH,

LH, TSH és CF- alegységek jelentése megfelel a szokványos meghatározásuknak, és azokra a fehérjékre vonatkozik, amelyeknek az aminosav szekvenciája a szakirodalomban önmagában ismert, illetve ezeknek allélvariánsaira, a mesterségesen előállított mutánsaira, amelyek megtartják a természetes fehérje aktivitását, függetlenül a mutatott glikozilezési mintázattól, vagy azokra a mutánsaira, amelyek a természetes formával legalább 90%-os homológiát mutatnak. A humán reproduktív hormonok vagy gonadotropinok és ezek alegysége kifejezés erre a négy heterodimerre (vagy muteinjeikre) és alegységeikre vonatkozik.

Ezeknek a fehérjéknek vagy alegységeknek a natív formái azok, amelyeknek aminosav szekvenciáját humán szövetből izolálták, és ezekkel az önmagukban ismert szekvenciákkal vagy allélvariánsaikkal rendelkeznek.

Ezeknek a fehérjéknek a mutein formái azok, amelyeknek az aminosav szekvenciájában előre elhatározott változtatások vannak, amelyeket például helyspecifikus mutagenezissel vagy egyéb rekombináns manipulációval hoztak létre, vagy amelyeket szintetikus úton állítottunk elő. Ezek a változtatások olyan aminosav szekvenciákat eredményeznek, amelyekben az alegység biológiai aktivitása megmarad, és/vagy amelyekben az alegység legalább 90%-os homológiát mutat a természetes formával.

Például az -alegységnek a különböző heterodimerek antagonistáiban használt, előnyben részesített muteinje a 88-92-es pozíciójú aminosavakban változott meg.

Az FSH- vagy LH- különösen előnyös muteinje például egy meghosszabbított FSH- vagy LH-, amelyben a hCG C-terminális peptidjét (CTP) tartalmazó aminosav szekvenciát az FSH- vagy az LH- C-terminálisához fuzionáltatjuk. A továbbiakban a CTP rövidítés a CG- peptid C-terminálisán levő, más rokon hormonokkal való összehasonlítás alapján extra szekvenciára vonatkozik. A hatékony CTP hossza a többi -alegységgel való összehasonlítás alapján enyhén változhat, de durván a CG 112-118-as aminosavjától a C-terminálison levő 145-ös csoportig terjed. A CTP pontos hossza a készített konstrukciókban a leírásból világos lesz.

Az itt ismertetett fúziókban a természetes CTP használható, vagy annak egy variánsa. A variáns alatt a 112-118-tól a 145-ös aminosavakig terjedő peptidcsoportok konzervatív analóg

ja értendő, azaz az a szekvencia, amelyben szekvenciának körülbelül 1-5 aminosavja változott meg, anélkül, hogy a tulajdonságai jelentős mértékben változtak volna. Ez a variáció gyakran egyszerűen olyan mutációból származik, amelynek az volt a célja, hogy megfelelő restrikciós hasítási helyet kapjunk.

Jóllehet azt felismerték, hogy a glikozilezési mintázatnak jelentős hatása van az aktivitásra, mind minőségi, mind menynyiségi szempontból, az egyszerűség miatt az FSH, LH, TSH és CG -alegységek a peptidekre jellemző aminosav szekvenciára vonatkoznak, csakúgy mint az -alegység. Ha csak a -láncra hivatkozunk, akkor a kifejezés például FSH-; ha a heterodimerre hivatkozunk, akkor csak az egyszerű FSH rövidítést használjuk. A szövegösszefüggésből világos lesz, hogy a glikozilezési mintázatot miként érinti például a rekombináns expresszió gazdasejt, vagy a glikozilezési helyek megváltoztatása. A specifikált glikozilezési mintázattal rendelkező glikoprotein formákat megemlítjük.

A továbbiakban az -alegység minigén szakkifejezést a WO 90/09800 számú PCT bejelentésben, a pM2/CG vagy pM2/ készítésének leírásánál közük. Ezt a minigént az jellemzi, hogy csak egy intron szekvenciát tartalmaz, azaz a III-as és IV-es exonok közöttit, az összes többi intront eltávolították belőle. Az adott, ismertetett konstrukcióban az N- terminális kódoló szekvenciákat, amelyek a ΙΙ-es exonból és a III-as exon egy részéből származnak, cDNS-ből visszük be, és közvetlenül egy Xbal restrikciós hasítási helyen keresztül visszük be a III-as exon kódoló szekvenciájába, és így az I-es és ΙΙ-es, valamint a ΙΙ-es és

III- as exonok közötti intronok hiányoznak. Azonban a III-as és

IV- es exonok közötti intronok, valamint a kódoló szekvencia 3'

szignáljai megmaradnak. A keletkező minigén kényelmesen beépíthető egy BamHl/BglII fragment formájában. Egy ezzel összehasonlítható minigén készítésének természetesen egyéb módszerei is lehetségesek, és a definíció nem korlátozódik az adott konstrukcióra, amelyben a kódoló szekvenciát egy Xbal hasítási helyen keresztül ligáijuk. Azonban a gén készítésének ez egy egyszerű, kényelmes módja, és más megközelítési módoknak, azaz például a gén szintetikus vagy részben szintetikus úton való előállításának nincs különös előnyük. A definíció az alegységnek azokra a kódoló szekvenciáira is vonatkozik, amelyek egy intront megtartanak, azaz például a III-as és IV-es exon közötti intront, de a többit nem.

Egy transzformált rekombináns gazdasejt, azaz egy olyan sejt, amelyet egy, a találmány szerinti rekombináns expressziós rendszerrel transzformáltunk, jelentése egy olyan gazdasejt, amelyet úgy változtattunk meg, hogy tartalmazza ezt az expressziós rendszert, a bejuttatásához bármely egyszerű eszközt alkalmazva, beleértve a transzfekciót, virális fertőzést, stb. A transzformált szakkifejezés olyan sejtekre vonatkozik, amelyek tartalmazzák ezt az expressziós rendszert, függetlenül attól, hogy a rendszer integrálódott-e a kromoszómába, vagy extrakromoszómális. A transzformált sejtek az expressziós rendszer szempontjából lehetnek stabilak, vagy nem. Röviden, a rekombináns gazdasejtek, a találmány szerinti expressziós rendszerrel transzformálva olyan sejteket jelentenek, amelyek ezt az expressziós rendszert tartalmazzák, annak eredményeképpen, hogy abból a célból manipuláltuk őket, hogy tartalmazzák ezt a rendszert, mert természetes állapotukban nem tartalmazzák, függetle ··· ····

nül ennek a beépítésnek a módjától.

Az expressziós rendszerek szakkifejezés egy olyan DNS szekvenciára vonatkozik, amely egy expresszálandó kódoló szekvenciát tartalmaz, valamint azokat a kísérő kontroll DNS szekvenciákat, amelyek ahhoz szükségesek, hogy a kódoló szekvencia expressziója lehetséges legyen. Tipikus esetben ezek közé a kontroll szekvenciák közé tartozik egy promoter, terminációt szabályozó szekvenciák, és néhány esetben egy operátor vagy más mechanizmus az expresszió szabályozására. Azok a kontroll szekvenciák, amelyeket úgy terveztek meg, hogy egy bizonyos megcélzott rekombináns gazdasejtben működjenek, és ennek következtében a gazdasejtet úgy kell megválasztani, hogy kompatibilis legyen a megkonstruált expressziós rendszer kontroll szekvenciáival.

A továbbiakban a sejtek, sejttenyészetek és sejtvonalak szakkifejezéseket mint egymással lecserélhető szakkifejezéseket használjuk, anélkül, hogy különös figyelmet szentelnénk a jelentésbeli minimális különbségeknek. Azokban az esetekben, amelyekben a megkülönböztetés lényeges, az világos lesz a szövegösszefüggésből

Bizonyos sejtekről ismert, hogy sűrű szekréciós granulómákat tartalmaznak, és a fehérjéket egy szabályozott bioszintézis úton expresszálják, amelyet bizonyos anyagokkal, például forskolinnal lehet stimulálni. Ezek a sejtek vagy sejtvonalak, amelyek a megfelelő állati szövetekből származnak, a találmány gazdasejtjei. Az ilyen sejtek közé tartoznak a hormonrendszer szekréciós komponenseinek sejtjei, azaz a hipofízis, a -szigetsejtek és az mellékvesekéreg sejtjei. A találmány szerinti eljárásban különösen előnyösek a hipofízis eredetű sejtek.

Az előző paragrafussal összhangban, a hipofízis eredetű sejtek szakkifejezés az olyan sejtekre vagy sejtvonalakra vonatkozik, amelyek állati eredetű hipofízis szövetből származnak, főleg emlős fajokból, de leginkább emberi vagy rágcsáló hipofízisből. Ilyen például a GH3 rágcsáló sejt, amelyet Taisjan, J. publikált [Methods in Enzymology, 58, .527 (1979)] . Azonban a hipofízisből származó más sejtvonalak is ismertek, és nyilvános gyűjteményekből megszerezhetők.

A szekréciós granulómákat tartalmazó sejtek a CHO sejtekkel szemben olyan körülményeket biztosítanak, amelyek jobban hasonlítanak a hipofízis sejtekre. Ennek eredménye olyan glikozilezési mintázat, amely sokkal inkább hasonlít a természetes formákra, és fokozza a szekretálandó fehérjék szekréciós hatékonyságát. A gonadotropin termelés az ilyen sejtekben, amelyek a fehérjéknek a szekretálását egy szabályozott bioszintézis úton biztosító sűrű szekréciós granulómákat tartalmaznak, ezeknek az anyagoknak a szekretált formájának a termelődését eredményezi, olyan glikozilezési mintázattal, amely hasonlít a természetes hormonokban vagy alegységekben talált glikozilezési mintázathoz. Pontosabban, a hormonoknak vagy alegységeknek, úgymint az LH-nak ezeknek a formái, amelyek a szulfát formában bejuttatott jelzett ként megtartják, akkor teszik ezt, amikor ezekben a sejtekben termelődnek, jelezve ezzel, hogy szulfátéit glikozilezési egységek vannak jelen ezekben a formákban. A jelzett SO4-2 nem épül be a CHO vagy rágcsáló C127 sejtekben termelődött LH-ba.

Míg az FSH normális körülmények között szialilezve van, az LH -alegysége normális körülmények között szulfátéivá van. Az N-kapcsolt oligoszacharidok szialilezéséről már régebben felis • · merték, hogy megvédi a keringő gonadotropinokat attól, hogy a májban levő aszialoglikoprotein receptorok hatására kiürüljenek a keringésből. Ezzel szemben, az LH-n levő szulfát a hormon gyors kiürülését okozza; a szulfátéit szarvasmarha LH-nak 4-5-ször gyorsabb a metabolikus kiürülése a megfelelő szialilezett rekombináns szarvasmarha LH-val összehasonlítva. A szulfátéit LH a keringésből annak következtében ürül ki, hogy a máj epiteliális sejtek felszínén levő specifikus receptorokhoz kötődik, amelyek felismernek egy specifikus szulfátéit triszacharidot az lekapcsolt glikozilezésben. A deszulfatált LH a receptor kötésben és az MA10 sejtekben való jeltovábbításban hasonlóképpen viselkedik mint a szulfátéit LH, de magas in vivő dózisokra van szükség az ovuláció serkentéséhez, feltehetőleg azért, mert a keringési felezési időt a szulfatálás megváltoztatja. Az a vélemény alakult ki, hogy az emberi vagy állati reprodukció során az LH klinikai alkalmazásához a hormon szulfátéit formájára lesz szükség.

Expressziós vektorok

Ahhoz, hogy a találmány szerinti szekréciós sejtekben való felhasználásra alkalmas expressziós vektorokat készítsünk, egy egyszerű konstrukciót, amelyet az -alegység minigén reprezentál, az előzőkben említett PCT bejelentés alapján reprodukáljuk, az 1. ábra szerint. Amint az ezen az ábrán látható, és az előzőkben említett bejelentésben részletesebben el van magyarázva, az -alegységet kódoló szekvenciát egy minigén formájában állítjuk elő, amelyben a II-III-as exonok által kódolt peptid részeit a IV-es exonhoz fuzionáltatjuk, de attól elválasztva. Ezt a konstrukciót ligáijuk a pM2 gazdavektorba, az 1. ábrán látható • ·

- 12 hosszú ismétlődő szakasz kontrollja alatt, így kapjuk a pM2/CG vagy pM2 plazmidokat, amelyek egy további inszerciós pontot tartalmaznak egy újabb kódoló DNS beépítéséhez. Amint az még az 1. ábráról leolvasható, a pM2 gazdavektorban levő BamHI hasítási hely használható arra, hogy a humán reproduktív fehérjék -alegységét is beépítsük, hogy ezeket az alegységek önmagukban expreszszálódjanak, valamint egy külön expressziós vektort készítsünk az és alegységek egyszerre történő előállításához, a mindkét vektorral transzformált sejtek által.

Tehát a -alegységeket önmagukban elő lehet állítani oly módon, hogy a kódoló DNS-t a pM2-be ligáijuk, a bemutatott módon, vagy a heterodimert úgy állíthatjuk elő, hogy a pM2-t, amely a -alegységet kódoló DNS-t tartalmazza, együtt transzformáljuk a pM2/CG-val. A heterodimer előállítása az előnyös. A heterodimert elő lehet állítani egyetlen vektorról is, amelyben a inszertet a pM2/ BamHI hasítási helyére ligáltuk, oly módon, hogy az EcoRI restrikciós enzimmel emésztett pM2-t EcoRI restrikciós enzimmel emésztett módosított pM2/CG-ba ligáljuk.

Az említett konstrukciók természetesen csupán bemutatják azokat az expressziós vektorokat vagy rendszereket, amelyek arra a célra konstruálhatok, hogy a megfelelő heterodimer hormonok -alegységeit előállítsuk. Más kontroll szekvenciák lehetnek például a különböző promoterek, ezek ligálhatók a humán -alegységek vagy minigének kódoló szekvenciáihoz, hogy ezzel vezéreljük az expressziót. A kontroll szekvenciák számos változata ismert a szakterületen, és a alegységeket vagy az minigént (vagy más -kódoló konstrukciókat) kódoló szekvenciák ligálási módszerei is természetesen ismertek. A megfelelő emlős promoterek közé tartóz««·« ···♦ ·· nak az SV40 korai és késői promoterjei vagy más virális promoterek, azaz azok, amelyek poliómából, adenovírus 2-ből, szarvasmarha papillóma vírusból vagy madár szarkóma vírusból származnak. A megfelelő virális vagy emlős fokozó szekvenciák is használhatók.

Amint azt az előzőekben ismertettük, a különböző humán reproduktív hormonokat, beleértve a -alegységeiket is, kódoló gének előállítását már leírták. A gének természetes forrásaikból állíthatók elő, a szakirodalomban ismertetett módon, illetve a géneket részben vagy egészben meg lehet szintetizálni, a már leírt standard szilárd fázisú oligonukleotid szintézis technikák alkalmazásával [Nambiar, K.P. és munkatársai, Science, 223, 1299 (19

Jaye, E. és munkatársai, Journal of Biological Chemistry, 259, 6311 (1984)]. Ezek a technikák már bárki számára elérhetők, kereskedelmi forgalomban vannak. Az nyilvánvaló, természetesen, hogy nem csak a specifikus természetes nukleotid szekvenciák használhatók, hanem természetesen azok a nukleotid szekvenciák is, amelyekben az ezeknek megfelelő degenerált kodonon is megtalálhatók, valamint az alléi formák is.

Amint azt az előzőekben említett PCT bejelentésben még leírják, a különböző hormonok muteinjei is előállíthatok, amelyeknek agonista vagy antagonista aktivitásuk van. Ezeket a mutein-kódoló szekvenciákat beépíthetjük a megfelelő gazdavektorokba, hasonló módon, mint amit a természetes formáknál leírtunk. Különösen érdekesek azok a muteinek, amelyekben az LH, TSH vagy FSH -alegységeit meghosszabbítjuk a gonadotropin hormonok természetes C-terminális peptidjével. Egy ilyen humán FSH konstrukciót a 2. ábrán mutatunk be. Emellett több mint egy CTP egység használható a -láncok meghosszabbítására.

.: —:··;:.··:·*>

.:. .. . .. ···

- 14 Transzformáció és sejttenyészet

Általában a kiválasztott expressziós vektort vagy vektorokat transzfektáljuk, vagy más módon transzformáljuk a találmány szerinti gazdasejtekbe, azokhoz az eljárásokhoz hasonló eljárásokat alkalmazva, amelyeket általában emlős sejteket használnak. A transzformációhoz használt technikák lényegében azok, amelyeket az aranyhörcsög petefészek sejteknél használnak, és a sikeres transzformánsok szelektálására alkalmas marker rendszerek is lényegében azonosak. A transzformált sejtek sejttenyésztési körülményeit módosítani lehet, mivel az széles körben elfogadott, hogy a kiválasztott gazdasejt vonal, amely a szabályozott szekréciós granulumokat tartalmazza, igényeihez alkalmazkodni kell; azonban a tenyésztési körülmények lényegében azonosak a CHO sejteknél használt körülményekkel.

A transzfekció és a tenyésztés egy illusztratív megközelítésénél a -alegységet kódoló gént a pM2 plazmádba illesztjük be, majd egyedül, vagy a pM3/CG plazmáddal együtt a találmány szerinti eljárásnak megfelelő sejtekbe transzfektáljuk, amelyek szabályozott szekréciós granulómákat tartalmaznak, vagy kontrollként aranyhörcsög petefészek sejtekbe [Matzuk, M.M. és munkatársai, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 6354-6358 (1987), Matzuk, M.M. és munkatársai, J. Cell. Bioi., 106, 1049-1059 (1988)] . A sikeres transzformánsokat 0,25 g/ml G418-on szelektáljuk, az expressziót pedig a metabolikusan jelzett sejtekkel végzett immunprecipi-tációval mutathatjuk ki, a monomerés dimer-szekretáló sejtvonalak kiválasztása céljából.

Mind a stabilan transzfektált gazdasejteket,amelyek szabályozott szekréciós granulumokat tartalmaznak, mind a stabi15 • · · ϊ .

• · ‘ * · -1·· · ·· ··· lan transzfektált CHO sejtvonalakat az 1-es táptalajban tartjuk fenn (Ham féle F10 táptalaj, amelyet 15% lószérummal és 2,5% borjúmagzat savóval, 100 E/ml penicillinnel, 100 seg/ml sztreptomicinnel, 2 mmol/1 glutaminnal és 0,125 mg/ml G418-cal) nedvesített levegőjű, 5% CO2-t tartalmazó atmoszférájú inkubátorban.

Mind a találmány szerinti sejteket, mind a CHO sejteket 300,000-350,000 sejt per luk sűrűségben 12 lukas lemezekre szélesztjük 1 ml F-10 táptalajban, amely 15% lószérumot és 2,5% borjúmagzat szérumot tartalmaz, majd 3-4 naponként újra szélesztjük. A folytonos jelzéshez a sejteket kétszer mossuk ciszteinmentes 2-es táptalajjal (1-es táptalaj, amely 5% dializált borjúszérumot tartalmaz), majd 6 óra hosszat jelezzük 1 ml cisztein-mentes 2-es táptalajban, amely 20 Ci/ml jelzett ciszteint tartalmaz. A pulzusjelzéses kísérletekhez a sejteket kétszer mossuk és 1,5 óra hosszat előinkubáljuk cisztein-mentes 2-es táptalajban, majd 20 percig jelezzük cisztein-mentes 2-es táptalajban, amely 100 Ci/ml jelzett ciszteint tartalmaz, majd kétszer mossuk 2-es táptalajjal, amely 1 mmol/1 jelzetlen cisztein tartalmaz, és inkubáljuk a jelzetlen táptalajban.

A 35S-jelzett szulfát beépítésével végzett jelzési kísérleteket hasonlóképpen hajtjuk végre.

Részletesebben kifejtve, a közeget és a sejtlizátumokat Corless, C.L. és munkatársai módszerével [J. Cell Bioi., 104, 1173-1181 (1987)] készítjük, immunprecipitáljuk és kezeljük, illetve Matzuk módszerével [Matzuk, M.M. és munkatársai, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 6354-6358 (1987)]. A CG-, LH-, FSH- és TSH-, valamint az -alegység elleni antiszérumokat standard módszerekkel állítjuk elő; a CG- elleni ·«* *·«· • · • ·

4« ·· ··<

• · « * · ·« «·

- 16 antiszérum teljes keresztreakciót ad az LH-val, és az LH- kimutatására is használható. Az immunprecipitátumok SDS géleken való jellemzéséhez 15%-os SDS poli(akril)-amid géleket áztatunk 10 percre 1 mol/1 nátrium-szalicilát oldatba, majd előre villantott filmre autoradiografáljuk és szkenneljük ha szükséges, egy LKB Ultrascan XL lézer denzitométerrel.

Expresszié CHO sejtekben

Kontrollként a humán FSH CHO sejtekben való előállításának eredményeit úgy vizsgáljuk meg, hogy ciszteinnel végzünk jelzéseket. Az előzőkben ismertetett expressziós^rendszereket, amelyeket a pM2-be inszertált humán FSH--ra írtunk le, az FSH-egyedül való expresszálása céljából, vagy a pM2/-ba, azzal a céllal, hogy egymás után expresszáljuk az -alegységgel, CHO sejtekbe transzfektáljuk, majd stabil kiónokat, amelyekről igazoltuk, hogy expresszálják a -alegységet vagy a dimert folyamatosan 35S-ciszteinnel jeleztük 6 óra hosszat. A szekretált FSH mennyisége körülbelül 1 mg/106 sejt /24 óra, 1 liter táptalajban inkubálva.

A táptalajba szekretált fehérjéket, valamint a sejtlizátumokból származó fehérjéket immunprecipitáljuk a megfelelő antiszérummal, és SDS-PAGE segítségével elválasztjuk. A kapott eredmények hasonlítanak azokhoz, amelyeket a hasonló, a humán CG-t expresszáló transzformánsokkal kaptunk.

A hatórás jelzéssel kapott gélek azt mutatják, hogy az -alegység távollétében az FSH- a lizátumban marad, míg ha az -alegység jelen van, akkor dimer keletkezik, és hatékonyan szekretálódik a táptalajba.

A

Ha a sejteket 20 percig impulzus-jelezzük 35S-ciszteinnel, majd jelzetlen ciszteinnel 12 óra hosszat inkubálva leállítjuk a jelzést, akkor a keletkező CG -alegységének a lizátumban való fél-életideje, és a CG- megjelenése a táptalajban azonos, körülbelül 2 óra, és majdnem az összes szekretált -alegység kinyerhető. Egy alacsonyabb molekulasúlyú is jelen van a táptalajban, feltehetően annak következtében, hogy különbség van a CG- 2-es Asn-kapcsolt glikozilezési helyén a glikozilezés mértékében, és ez csak erre a -alegységre jellemző. Az FSH-egyedül sokkal kisebb hatékonysággal szekretálódik, és csakúgy, mint a CG-, eltűnik a sejtlizátumokból körülbelül 5 óra elteltével; kevesebb mint 20% nyerhető ki a táptalajból 12 óra elteltével.

Az LH és TSH -alegységéhez hasonlóan az FSH- egyedül nem szekretálódik a megfelelő hatékonysággal, és lassan lebomlik intracellulárisan. Azonban az -alegység jelenléte stabilizálja, és fokozza a -alegység szekrécióját az FSH-hoz. A lizátumokból való eltűnés fél-életideje körülbelül 90 perc, és 90% kinyerhető a táptalajból 12 óra elteltével. Ez a viselkedés hasonlít ahhoz, amit a TSH-nál tapasztaltunk, de eltér attól, amit mind a CG-nél mind az LH-nál tapasztaltunk.

Az előző eredményekből látható, hogy a szekrécióval kapcsolatos nehézségeket akkor tapasztaljuk, ha csak a -alegységeket kódoló géneket expresszáljuk CHO sejtekben; néhány esetben ezt a szekréciós képességet csökkenti egy -alegységet kódoló vektor jelenléte. Általában azonban úgy tűnik, hogy a CHO sejtek nem szekretálják hatékonyan a kiválasztott -alegységet vagy a megfelelő humán reproduktív hormonokat.

Egy másik nehézség, amely a 35S forrásként szulfát jelzést használó kísérletekből nyilvánvaló, az az, hogy az LH-alegység vagy az LH heterodimer esetében, amelyekről ismert, hogy természetes állapotukban szulfátéit glikozilezést tartalmaznak, a jelzés beépülése nem játszódik le a CHO sejtekben. Tehát, legalábbis az LH és a heterodimer -részének esetében, amely szintén tartalmaz szulfátéit glikozilezést,a CHO sejtek nem képesek reprodukálni a glikozilezés natív mintázatát. Tehát azt igazoltuk, hogy ha a cisztein helyett jelzett szulfátot használunk a radioaktivitás forrásaként, akkor a jelzés nem jelenik meg a CHO sejtek által előállított LH dimerjében, illetve -alegységében.

Expresszió hipofízis sejtekben

Az előzőkben ismertetett expressziós vektorokat, beleértve azokat, amelyek az LH-, a CG- vagy FSH- -alegységeit, az -alegységgel vagy e nélkül kódolják, és azokat,amelyek az -alegységet ugyanazon, vagy egy másik vektoron kódolják, patkány GH3 hipofízis sejtvonalba transzformáljuk. Az egyensúlyi jelzés után, amelyet vagy szulfáttal (LH esetében) vagy cisztein-eredetű (minden formára) 35S-sel értünk el, az LH, FSH és hCG érett formáit, amelyek processzált oligoszacharidokat tartalmaznak, a sejtekben tartjuk, majd forskolinnal serkentjük a kiszabadulásukat. Ezeknek a hormonoknak a -alegységeinek legnagyobb részéről kiderült, hogy Endo H érzékenyek, és így az ER-ben maradnak, de az Endo H rezisztens frakció,amely az érett forma, a szabályozott szekréciós bioszintézis utat célozza meg, olyan hatékonysággal, amely összehasonlítható a dimer és a -alegység között.

A 3. ábrán láthatók a GH3 sejtekkel kapott eredmények, amelyeket pM2/-val transzformáltunk, amely vektorba az LH- alegységet kódoló szekvenciát egy másik BamHI hasítási helyre építettük be. Az 1-es és 2-es sávok azokból a GH3 sejtekből származó kontrollokat mutatják, amelyeket csak a pM2/CG vektorral transzformáltunk; amint az az eredményekből nyilvánvaló, az -alegységet leginkább a sejtekben magukban találjuk meg (C) és nem a felülúszóban (S). Másrészt viszont a 3-as és 4-es sávok azokat az eredményeket mutatják, amelyeket az előzőkben leírt módszerrel jelzett heterodimer immunprecipitálásával kapunk, ciszteint vagy szulfátot használva, és a sejt anyagát megvizsgálva. Amint ezekből az eredményekből látható, nagy mennyiségű heterodimer szekretálódik a táptalajba, és mind az mind a alegység képes felvenni a jelzést a 35S szulfátból.

Egy további kísérletben az LH-t expresszáló sejteket 16 óra hosszat [35S]O4-gyel jelzünk, és ezzel lehetővé tesszük a jelzett hormonok felhalmozódását a tároló granulumokban. Hogy csökkentsük a konstitutív szekréció által okozott hátteret (azaz annak az anyagnak a mennyiségét, amely nem a szabályozott bioszintézis út sűrűmagvú granulumain keresztül szekretálódik), a jelzést követően a sejteket kétszer 2 órás időtartamig radioaktív jelzést nem tartalmazó anyaggal kezeljük (I-es és ΙΙ-es jelzés a 4. ábrán). A harmadik kiürítés (chase) (III) kezdetekor 20 mol/1 szekretagóg forskolint (adenilát-cikláz aktivátor) adunk a lukakhoz két párhuzamosban; egy párhuzamos sorozatot a szekretagóg nélkül inkubálunk. A táptalajokat (M) és a sejtkivonatokat (L) a harmadik kiürítés után anti- szérummal kicsapjuk, és SDS-PAGE-val elemezzük.

Htt ·· **

- 20 A 4. ábra A paneljén az 1 sáv a táptalajt jelenti az első kiürítés után. Ez a sáv azt mutatja, hogy az LH és alegységeket [35S]O4-gyel jeleztük. Ez a kiindulási pool feltehetőleg egy gyorsan szekretált, nem tárolt pool. 4 óra (II. kiürítés) és 6 óra (III. kiürítés) elteltével a konstitutív pool kifogy, mivel több anyag nincs jelen a táptalajban (az A panel 2. és 3. sávjai). Azonban az LH-nak még van egy poolja a sejtekben, amint az az A panelen látható az 5. sávban, amely azoknak a sejteknek a lizátumát mutatja, amely sejteket nem kezeltünk forskolinnal. Ezt a poolt a szekretegóg szabadítja ki a táptalajba, amint az a 4. ábra A panelján látható. A 6. sáv azt mutatja, hogy az intracelluláris pool lefogy a forskolin kezelés után.

Annak igazolására, hogy a radioaktív szulfát beépül az N-kapcsolt oligoszacharidokba, immunprecipitált [35S]O4-gyel jelzett LH-t kezelünk endoglikozidáz F-fel, amelyről tudott, hogy eltávolítja a komplex N-kapcsolt oligoszacharidokat. Ennek a kezelésnek az eredményeit a 4. ábra B paneljében az 1-es és 2-es sávban láthatjuk. Endo F-fel való emésztés hatására a radioaktivitás mind az mind a alegységekből eltűnik. A 3-as és 4-es sávok a kontrollok, amelyek azt mutatják, hogy ez nem az inkubálás során fellépő proteáz aktivitás következménye. Ezek a sávok a 35S-ciszteinnel való jelzés után a táptalajba szekretált LH Endo F kezelése utáni eredményeket mutatják. A 35S-ciszteinnel jelzett LH alegységek az Endo F emésztés után egyetlen csíkká olvadnak össze, amely megfelel a deglikozilezett fehérjének.

Ezek az adatok azt mutatják, hogy: (1) Az LH a GH3 sejtekben tárolódik, és ennek felszabadulását szekretagóg stimulálja (az ilyen tárolás és felszabadulás nem figyelhető meg CHO sejtek21 ben, függetlenül attól, hogy S04-gyel vagy ciszteinnel vannak jelezve), (2) Az LH N-kapcsolt oligoszacharidjai szulfátéivá vannak, ha GH3 sejtekben termelődnek.

Ezeknek a hormonoknak a -alegységeinek az összeállása és a dimerek szekréciója sokszorosára növekszik azzal szemben, ami a CHO sejtekben tapasztalható. Az LH dimerben az oligoszacharid szintén szulfátéivá van; az FSH azonban in vivő szialilezve van, és így nem vesz fel jelzést a S04 csoportból.

Igazoltuk, hogy a humán korion gonadotropin teljes deglikozilezése olyan hormont eredményez, amely megtartja azt a képességét, hogy a receptorhoz kötődik, de már nem képes kiváltani annak a sejtnek a normális biológiai válaszát, amely a receptort hordozza. A teljes deglikozilezés hasonló hatásait kapjuk a többi reproduktív hormonokkal, azaz az LH-val és az FSH-val. Ennek megfelelően a glikozilezési mintázatnak a -alegységekben fellépő változása alternatív tulajdonságokat eredményezhet. A találmány szerinti eljárással előállított hormonok és alegységek glikozilezése azonban sokkal jobban megközelíti a természetes formák glikozilezését.

Alkalmazás és adagolás

A jelen találmány szerinti hormonokat és egyéb gyógyszereket a beadáshoz a szakterületen jártas szakember számára ismert módszerekkel formulázzuk. A tipikus kiszerelési és adagolási módokat a Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA legutolsó kiadásában ismertetjük. Ezek a kiszerelési módok a szisztémás beadási módokra jellemzőek, azaz az injekciózásra, de az orális vagy topikális kiszerelési módok is *··· ···* • · « · • 4 ·

4· · használhatók .

A kiszerelés, a beadagolás módja és a dózisszint megválasztása függ az adott hormontól vagy fehérjétől, és a megfelelő indikációhoz optimalizálható, az általában elfogadott technikák alkalmazásával.

Claims (8)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Javított eljárás egy humán gonadotropin rekombináns módszerrel való előállítására, azzal jellemezve, hogy szabályozott szekréciós granulómákat tartalmazó állati szövetből származó sejteket tenyésztünk, amely sejteket egy olyan expressziós rendszerrel transzformáltunk, amely képes egy, az említett gonadotropint vagy annak -alegységét expresszálni, olyan körülmények között, amelyek között az említett kódoló DNS expresszálódik, majd az említett gonadotropint vagy annak -alegységét kinyerjük a tenyésztő táptalajból.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett sejtek hipofízis szövetből származnak.
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett hipofízis sejtek GH3 sejtek.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gonadotropin az LH.
5. 5. Egy humán gonadotropint szekretálni képes sejttenyészet, azzal jellemezve, hogy az említett tenyészet olyan sejteket tartalmaz, amely sejtek szabályozott szekréciós granulumokat tartalmaznak és állati szövetből származnak, és a sejteket egy olyan expressziós rendszerrel transzformáltuk, amely expressziós rendszer képes az említett gonadotropint vagy annak -alegységét kódoló DNS-t expresszálni.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti tenyészet, azzal jellemezve, hogy az említett sejtek hipofízis szövetből származnak.

   ···: ···: .··. .··· * · ί ! »· • Λ · · · · ♦ · · ·· ···
7. 7. Α 6. igénypont szerinti tenyészet, azzal jellemezve, hogy az említett hipofízis sejtek GH3 sejtek.
8. 8. Az 5. igénypont szerinti tenyészet, azzal jellemezve, hogy a gonadotropin az LH.

   A meghatalmazott ifi. Szentpéteri Ádám «isbadalmi ügyvivő |