SK112897A3

SK112897A3 - Chemokine receptors 88-2b(ckr-3) and 88c and their antibodies

Info

Publication number: SK112897A3
Application number: SK1128-97A
Authority: SK
Inventors: Patrick W Gray; Vicki L Schweickart; Carol J Raport
Original assignee: Icos Corp
Priority date: 1995-12-20
Filing date: 1996-12-20
Publication date: 1998-07-08
Also published as: US20080032336A1; PL192071B1; EP1642975A2; EP0811063A2; EP0811063B1; NO327506B1; NO20052202L; EP0811063B2; DK0811063T3; DE69635406T3; EP0811063B9; JP2001029089A; JP3288384B2; US6797811B1; HUP9801127A2; EP1642975A3; CA2213331A1; DK1870465T3; ES2255716T3; NO973800L

Description

Oblasť techniky t

Vynález sa všeobecne týka transdukčných dráh signálu a predovšetkým sa týka chemokínových receptorov, nukleových kyselín kódujúcich chemokínové receptory, ligandov chemok í nových receptorov, modulátorov aktivity chemokínových receptorov, protilátok rozoznávajúcich chemokíny a chemokínové receptory,

s p ôsobov i d e n t i f i k á c ie	ligandov	a modulátorov c	: h e m o k í n o v ý c h
r e c e p t o rov, s p ô s o b o v	produkcie	chemok ínových	receptorov
a spôsobov produkcie	protilátok	rozoznávajúcich	chemokínové
receptory.
Doteraiší stav techniky

Nedávny pokrok v molekulárnej biológii viedol k poznaniu, že transdukčné dráhy signálu majú ústrednú úlohu v biologických procesoch. Tieto dráhy zahrnujú centrálny prostriedok, pomocou ktorého Jednotlivé bunky viacbunkového organizmu komunikujú a tým koordinujú biologické procesy C pozri model,' ktorý Je uvedený v tabuľke I publikácie Springer, Celí 76= 301 až 314 ¢1994)). Jedna vetva transdukčných dráh signálu, ktorá Je definovaná intracelulárnou participáciou proteínov viažucich guanínový nukleoid (G-proteínov), ovplyvňuje široký rozsah biologických procesov.

Všeobecná diskusia G-proteínových transdukčných dráh signálu Je uvedená v publikácii Leujin, Genes V 319 až 348 C1994). Podlá tejto diskusie zahrnujú tieto dráhy prinajmenšom tieto zložky: extracelulárny signál (napríklad neurotransmitery, peptidové hormóny, organické molekuly, svetlo alebo odoranty), receptor rozoznávajúci signál, (receptor kopulovaný s G-proteínom, prehľad pozri publikácia Probst et al., DNA and Celí Biology 11: 1 až 20 ¢1992), ktorý Je takisto známy pod označením GPR alebo GPCR) a intracelulárny heterotrimérny proteín viažúci GTP alebo G-proteín. Tieto dráhy sa stali predmetom záujmu predovšetkým s ohľadom na úlohu, ktorú výkázUjÚ pri regulácii pohybu bielych krviniek či leukocytov.

Leukocyty zahrnujú skupinu pohyblivých krviniek niekoľkých typov, to znamená granulocyty C teda n e u t r o f i 1 y, ti a z o f i 1 y y m f o c y t y a m o n o c y t y .

Keď sú tieto bunky mobílizované a aktivované, zúčastňujú sa

P r e; d o v č e t k ý m na obrán e tela pred cudzou hmotou. Táto úloha Je komplikovaná rozmanitosťou normálnych a patologických procesov, na ktorých sa leukocyty zúčastňujú. Leukocyty sa napríklad zúčastňujú na normálnej odpovedi na infekciu, ktorou Je zápal. Leukocyty sa tiež zúčastňujú na rôznych patologických zápaloch. Prehľad pozri

Schall et al., Curr. Opin. Immunol. 6: 865 až 873 C1994). Každý z týchto procesov môže okrem toho zahrnovať Jedinečné príspevky, pokiaľ ide: o stupeň, druh a trvanie, od každého typu leukocytových buniek.

Pri štúdii týchto imunitných reakcií sa vedci zo začiatku sústredili na signály pôsobiace na leukocyty, keďže sa domnievali, že na to, aby bola vyvolaná akákoľvek forma odpovede, Je potrebný signál. Prehľad členov dôležitej , skupiny leukocytových signálov, totiž peptidových signálov, Je uvedený v publikácii Murphy, Ann. Rev. Immunol. 12: 593-633 C1994). Jeden typ peptidového signálu zahrnuje chemokíny (chemo-atrakťantové cvtokíny), ktoré sú v publikácii Oppenheim et al., Ann. Rev. Immunol. 9: 617-648 C1991) označované názvom interkíny. Rastúci počet chemokínov, ktoré boli identifikované a podrobené genetickým a biochemickým analýzam, Je okrem vyššie uvedenej citácie Oppenheim et al.. dokumentovaný tiež citáciou Baggiolini et al., Advances in Immunol. 55: 97 až 179 (1994).

Ma základe porovnávania aminokyselinových sekvencii známych chemokínov bola vytvorená klasifikačná schéma rozdeľujúca chemokíny do dvoch skupín: d - skupina Je charakterizovaná prítomnosťou jedinej aminokyseliny oddeľujúcej prvé dva cysteíny (CXS; N-koniec ako referenčný) a a - skupina Je charakterizovaná susedstvom dvoch cysteínových zvyškov (CC); pozri vyššie uvedená publikácia Baggiolini et al. Medzi chemokínmi a konkrétnymi typmi leukocytových buniek odpovedajúcich na tieto signály boli zistené korelácie. Schall et al. (pozri, vyššie uvedená citácia) oznámili, že chemokíny CXC obvykle ovplyvňujú neutrofily a chemokíny CC majú tendenciu ovplyvňovať monocyty, lymfocyty, bazofily a eozinofily. Baggiolini et al. napríklad vo vyššie uvedenej citácii uvádzajú, že RAMTES, čo Je CC chemokín, pôsobí ako cheinoatrak tant pre monocyty, lymfocyty (to znamená pamäťové T bunky), bazofily a eozinofily, ale nie pre neutrofily, pričom indukuje uvoľňovanie histamínu z bazofilov.

Cocchi et al.. v publikácii Science, 270: 1811 až 1815 C1995) nedávno ukázali, že chemokíny sú supresory proliferácie HIÚ. Cocchi. et al. demonštrovali, že RAMTES, I*IIP—loc a ľlIP-l.e> potláčajú infekciu HIV-1, HIV-2 a STV bunkovej línie CD4* označenej Pl*ll a primárnych Jednojadrových buniek periférnej krvi, človeka.

Nedávno sa však pozornosť presunula na bunkové receptory viažúce chemokíny, keďže sa zdá, že extracelulárne chemokíny kontaktujú bunky bez diskriminácie a preto iin chýba špecificita, ktorá Je potrebná pre reguláciu Jednotlivých typov leukocytových buniek.

ľlurphy uvádza vo vyššie uvedenej citácii, že trieda chemokínových receptorov patrí do nadtriedy GPCR. Typická štruktúra chemokínového receptora zahrnuje extracelulárnu doménu viažúcu chemokíny, ktorá Je umiestená v blízkosti N-konca, po ktorej nasleduje sedem v odstupe usporiadaných oblastí prevažne hydrofóbriych aminokyselín, ktoré sú schopné vytvárať cŕ-helixy rozprestierajúce sa v membráne. Medzi ď-helikálnymi doménami sú vždy prítomné hydrofilné domény a to buď v intra- alebo v extracelulárnych priestoroch. Tieto znaky dodávajú chemokínovému receptoru uloženému v membráne hadovitú konformáciu. Tretia intracelulárna slučka obvykle interaguje s G-proteínmi. Ďalej Murphy vo vyššie citovanej publikácii uvádza, že intracelulárny karboxylový koniec Je takisto schopný interakcie s G-proteínmi.

Prvými, chemokínovými réčéptormi, ktoré boli, analyzované technikami molekulárneho klonovania, boli dva neutrofilné receptory pre ľudský IL8, čo je CXC chemokin. Klonovanie: týchto dvoch receptorov pre I.L8 oznámili Holmes et al., Science 253: 178 až 1280 C1991) a Murphy et al., Science 253= 1.280 až 1283 (1991) . cDNA kódujúce: tieto receptory boli. analyzované C Lee et al., J. Biol. Chem. 267 = 10283 až '16287 <1992) a zistilo sa, že: medzi, kódovanými receptormi existuje 77% identita aminokyselinovej sekvencie, pričom každý z týchto receptorov vykazuje znaky triedy receptora kopulovaného s G-proteínom. Jeden z týchto receptorov Je: špecifický pre IL-8, zatiaľ čo druhý sa viaže: a signalizuje: v odpovedi na IL-8, gro/MGSA a NAP—2. Genetická manipulácia génov kódujúcich receptory IL-8 prispela k nášmu porozumeniu biologickým úlohám týchto receptorov. Tak napríklad Cacalano et al. (Science 265= 682 až 684 (1994)) oznámili, že delécia IL-8 receptorového homológu myši vedie k plelotrofickému fenotypu zahrnujúcemu lýmfadenopatiu a splenomegáliu. Okrem toho štúdia mutácii s chybným zmyslom popísaná v publikácii. Leong et al., J. Biol. Chem. 269= 19343 až 19348 C1994) odhalila aminokyseliny receptora IL-8, ktoré sú rozhodujúce: pre; väzbu IL-8. Na základe: pokusov s výmenou domén (Murphy, 'vyššie: popísaná citácia) bol urobený predpoklad, že determinantom väzbovej špecificity Je: amino-termiriálna extracelulárna doména.

Tiež bolo identifikovaných a klonovaných. niekoľko receptorov CC chemokínov. CCCKR1 viaže: ako ľlIP-lcŕ, tak aj RANTES a vyvoláva intracelulárny tok vápenatých iónov v odpovedi na obidva Ugandy. Charo et al. CProc. Mati. Acad. Sci USA 91= 2752 až 2756 (1994)) oznámili, že: ďalší CC chemokínový receptor, ľlCP-Rl. CCCCKR2) Je: kódovaný Jediným génom produkujúcim dve: varianty zostrihu, ktoré sa od seba líšia svojimi karboxy-terminálnymi doménami. Tento receptor sa viaže a odpovedá na MCP-3 okrem NCP-1.

Tiež bol identifikovaný promiskuitný receptor, ktorý viaže: ako CXC, tak aj CC chemokíny. Tento receptor bol pôvodne zistený na červených krvinkách a Horuk et al. C Science 261= 1.182 až 1184 C1993)) uvádzajú, že viaže IL-8, NAP-2, GROcŕ, RANTES a MCP1.

Chemokínový receptor erytrocytov má približne 25% identitu s inými chemokínovými receptormi a zrejme pomáha regulovať hladinu cirkulujúcich chemokínov alebo napomáha pri orientácii chemokínov na ich ciele. Ukázalo sa tiež, že chemokínový receptor erytrocytov nielen že viaže chemokíny, ale Je tiež receptorom Plasmodium vivax, ktorý Je hlavnou príčinou malárie: (rovnaká citácia). Tiež pre ďalší receptor kopulováný ku G-proteínu, ktorý Je blízko príbuzný chemokínovým receptorom, totiž pre receptor faktora aktivácie krvných doštičiek, bolo zistenú, že; pôsobí ako receptor ľudského patogénu, baktérie: Streptococcus pneumoniae (Condell et al., Náture 377: 435 až 438 ¢1995)).

Okrem cicavčích chemokínových receptorov boli tiež identifikované dva vírusové hoinológy chemokínových receptorov. Ahuja et al. C J. Biol. Chem. 268: 20691 až 20694 ¢1993)) popisujú génový produkt z Herpesvírusu saimiri, ktorý má približne 30% identitu s receptormi IL-8 a viaže: CXC chemokíny. Neote et al. Uľell, 72: 415 až 425 ¢1993)) uvádzajú, že: ľudský cytomegalovírus obsahuje gén, kódujúci receptor, ktorý má približne: 30% identitu s CC chemokínovými r eceptormi a viaže: l*IIP—lcí, NlP-le, a RANTES. Tieto vírusoúé receptory môžu ovplyvňovať· normálnu úlohu

chemokínov a vírusom.	poskytovať s e: 1 e: k t í v n u	patologickú	výhodu	pred
S ohľadom	na veľkú rozmanitosť	chemokínov a	ich aktivít
e x i t u ..j ú m n o h é	r e: c e: p t o r y c h e:m o k í n o v .	Receptory,	ktoré	boli

charakterizované, predstavujú zlomok z celkového úhrnu chemokínových receptorov. Pretrváva teda potreba identifikovať ďalšie: chemokí nové receptory. Ak budú tieto nové receptory k sa prostriedkom pre vývoj terapeutických modulátorov funkcie:

chemokínov alebo chemokínových receptorov. Ma vynálezu Je:

možné predpokladať, že: takéto modulátory budú užitočné ako terapeutické činidlá pre: liečenie aterosklerózy reumatoidnej artritídy ako protinádorové prostriedky a liečivá na liečenie: astmy, vírusových infekcií a iných zápalových chorôb. Alternatívne sa takéto terapeutická užitočnosť predpokladá pokiaľ ide o fragmenty alebo varianty takýchto chemokínových receptorov alebo protilátky rozoznávajúce tieto receptory.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu sú purifikované a izolované nukleové kyseliny kódujúce chemokínové receptory, ktoré sa zúčastňujú na pohybe leukocytov. Polynukleotidy podlá vynálezu (a to ako kódujúce, tak aj Dekódujúce reťazce) zahrnujú genómové a RNA a tiež úplne alebo čiastočne syntetické nukleové kyseliny.

Prednostnými polynukleotidmi podlá vynálezu sú DNA kódujúce chemokínový r eceptor 88-2B, ktorá Je

ID NO:3

DNA kódujúca chemokínový receptor 88C

ID N0:l a

DNA ktoré hybridizujú k týmto DNA pri štandardných stri n ge n t n ý c h hybridizačných podmienkach alebo ktoré by takto hybridizovali, k e b y n e e x i s t o v a 1 a r e d u n d a n c i a g e n e t i c k é h o kódu.

t r i n g e n t n ý c h hybridizačný c ti možné uviesť tieto podmienky: hybridizácia pri.

°C v 5X SSC

20m 1*1 formamide a

P r ein ý v a n i e p r i použitím 0, 2X SSC. Odborníkom tieto podmienky menia s ohľadom v tomto obore Je zrejmé na dĺžku a obsah CC nukleotidu v že sa ekvenciách, ktoré majú byť hybridizované

Pre tanovenie presných hybridizačných podmienok existujú v tomto obore štandardné postupy (pozri odstavce 9.47 až 9.51 príručky Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

Do rozsahu vynálezu tiež patria polynukleotidy kódujúce domény 88-2B alebo 88C, napríklad polynukleotidy kódujúce Jednu alebo viac extracelulárnych domén buď samotného proteínu alebo iného Jeho biologicky účinného fragmentu. Extracelulárne domény 88-2B zodpovedajú SEQ ID NO:3 a SEQ ID NO:4 v prípade aminokyselinových zvyškov v pozíciách 1-36, 93-107, 171-196 a 263-284. Extracelulárne: domény 88-2B sú kódované polynukleotidovými sekvenciami zodpovedajúcimi SEQ ID

NO: 3 v nukleotidových polohách 362-469, 638-682, 872-949 a 1148-1213.

Extracelulárne domény 88-C zodpovedajú SEQ ID NOsi a SEO ID MO:2 v prípade aminokyselinových zvyškov v pozíciách 1-32, 89-112, 166-191 a 259-280. Extracelulárne domény 88-C sú kódované polynukleotidovými sekvenciaml zodpovedajúcimi SEO ID N0:l v nukleotidových polohách 55-150, 319—390, 550—627 a 829—894.

Do rozsahu vynálezu tiež patria polynukleotidy kódujúce intracelulárne domény týchto chemokínových receptorov. Intracelulárne domény 88-28 zodpovedajú SEO ID NO:3 a SED ID NO: 4 v prípade aminokyselinových zvyškov v pozíciách 60-71, 131-151, 219-240 a 306-355. Tieto domény súk ódované po1ynu k 1 e o t i dovými sekvenciaml. zodpovedajúcimi SEO ID NO: 3 v nukleotidových polohách 539-574, 752-814, 1016-1081 a 1277-1426. Intracelulárne: domény 88—C zodpovedajú SEQ ID N0:l a SEO ID NO:2 v prípade aminokyselinových zvyškov v pozíciách 56-67, 125-145, 213-235 a 301-352. Intracelulárne domény 88-C sú kódované polynukleotidovými sekvenciaml zodpovedajúcimi SEQ ID N0:l v nukleotidových polohách 220-255, 427-489, 691-759 a 955-11.10.

P e p t i d y z o d p o v e d a. J ú c e J e d n e. j extra c e1u1ármym a1ebo intrace1u1árnym vypestované proti týmto peptidom sú alebo viacerým týmto doménam alebo protilátky považované za modulátory aktivít r e c e ptor a,

P r e d o v š e t k ý m v ä z b o v e ..j aktivity týchto receptorov k ligandu a G-proteínu.

Nukleotidové sekvencie podlá vynálezu sa tiež môžu používať pre konštrukciu oligonukleotidov pre použitie: ako značených prób s cielom izolácie genómových DNA kódujúcich 88-2B alebo 88C pri stringeritných hybridizačných podmienkach (to znamená pri použití metódy analýzy Southern a reťazovej reakcie; vyvolanej polymerázou - PCR). Tieto oligonukleotidové próby Je možné okrem toho používať pri detekcii konkrétnych alel génov kódujúcich 88-28 alebo 88C, čo umožní diagnózu a génovú terapiu chorobných stavov, ktoré sú s týmito špecifickými alelami spojené. Okrem toho Je; možné tieto oligonukleotidy použiť na pozmenenie genetiky chemokínového receptora s cielom umožnenia identifikácie: modulátorov chemokínového receptora. Tieto nukleotidové sekvencie

Je tiež možné použiť pre konštrukciu kódujúcich genetických prvkov pre použitie pri výskume alebo pozmeňovaní genetiky a expresie 88-28 alebo 880.

Predmetom vynálezu sú ďalej tiež biologické repliky C to znamená kópie izolovaných DMA zhotovené in vivo alebo in vitro) a RNA transkripty DNA podlá vynálezu. Ďalej od rozsahu vynálezu tiež patria autonómne sa replikujúce rekombinantné konštrukty, ako sú plazmidové, vírusové chromozomálne C napríklad ÚAC) nukleokyselinové vektory, ktoré majú efektívne zabudované polynukleotidy 88-2B alebo 880 a predovšetkým vektory, v ktorých DNA efektívne kódujúca receptor 88-2B alebo 880 operatívne pripojená k jednej alebo väčšiemu počtu endogénnych alebo heterológnych sekvencií riadiacich expresiu.

Receptory

88-2B a 880 môžu byť produkované prírodnou, r e k om b i n a n t n o u alebo yntetickou cestou. Pre expresiu c h em o k í n o v ý c h a 880 Je možné používať alebo eukaryotické), ktoré sú t r a n s f o r m o v a n é a 1 e b o t r a n s f e k o y a n é

P o1ynuk1eotidmi pod1a vynálezu pôužitím štandardných metód. Okrem intaktných génových produktov

88-2B alebo 880 patria do rozsahu vynálezu tiež biologicky účinné z aminokyselinovej sekvencie 88-2B (SEQ ID alebo 880 CSEQ

ID NO:2). Génový produkt 88-2B alebo 880 alebo

Jeho biologicky účinný fragment produkovaný v eukaryotickej bunke môže byť posttranslačne modifikovaný (napríklad vytvorením disulfidovej väzby, glykozyláciou, fosforyláciou, myristoyláciou.

palmitoyláciou, acetyláciou atď). Do rozsahu vynálezu patria ďalej génové produkty 88-2B a 880 alebo ich biologicky účinné fragmenty v monomérnych.

homomultimérnych alebo heteromultlmérnych konformáciách.

Jedným zo špecifických aspektov tohoto vynálezu sú protilátkové produkty, ktoré sú schopné sa špecificky viazať na chemokínové receptory 88-2B alebo 880.

Tieto protilátkové produkty sa vytvárajú štandardnými postupmi tohoto oboru použitím rekombinantných receptorov 88-2B alebo 88C, syntetických peptidov alebo peptidových fragmentov receptorov 88-2B alebo 88C;

hostiteľských buniek exprimuJúcich na svojom povrchu 88—2B alebo

88(ľ. alebo receptorov

88-2B alebo 880 purifikovaných z prírodných zdrojov, ako imunogénov.

Protilátkové produkty môžu zahrnovať m o n o k 1 o n á 1 n e p r o t i 1 á t k y alebo polyklonálne protilátky z akéhokoľvek zdroja a akéhokoľvek subtypu. Patria sem ďalej tiež monomérne, homomultimérne alebo heteromultimérne protilátky a ich fragmenty. Do rozsahu tohoto aspektu vynálezu patria tiež CDR-štepené protilátky, humanizované protilátky a iné modifikované protilátkové: produkty, ktoré si zachovávajú svoju schopnosť Špecificky sa viazať na chemokínový receptor.

Do rozsahu vynálezu tiež patrí použitie protilátkových produktov pre detekciu génových produktov 88-2B alebo 88C, ich analógov alebo biologicky účinných fragmentov. Tak napríklad sa protilátkové produkty môžu používať pri diagnostických postupoch, ktorých účelom Je odhaliť korelácie medzi expresiou 88-2B alebo SSC a rôznymi normálnymi alebo patologickými stavmi. Okrem toho sa protilátkové produkty môžu používať pri i diagnostikovaní tkanivových špecifických variácií pri expresii SS-2B alebo SSC, ich analógov alebo biologicky účinných fragmentov. Protilátkové produkty, ktoré sú špecifické pre chemokínové receptory 88-2B a SSC, môžu tiež pôsobiť ako modulátory aktivít receptora. Podlá iného aspektu sú protilátky voči receptorom 88-2B alebo SSC užitočné pre terapeutické ciele.

Predmetom vynálezu sú tiež stanovenia ligandov, ktoré sú schopné interagovať s receptormi chemokínov podlá tohoto vynálezu. Tieto stanovenia môžu zahrnovať priamu detekciu aktivity chemokínového receptora, napríklad monitorovanie značeného Ugandu k receptoru. Okrem toho sa takéto stanovenia môžu použiť na nepriame stanovenie Interakcie Ugandu s chemokínovým receptorom. Pod označením ligand”, ako sa používa v tomto popise, sa rozumejú molekuly, ktoré sú agónistami a antagonistami 88-2B alebo SSC, a iné molekuly, ktoré sa viažu k týmto receptorom.

Priama detekcia Ugandu viažúceho sa k chemokínovému receptoru sa môže: uskutočňovať pomocou nasledujúceho postupu. Skúšané zlúčeniny C to znamená predpokladané ligandy) sa detegovatelne označia (napríklad rádioaktívnym izotopom Jódu). Detegovatelne označené skúšané zlúčeniny sa potom uvedú do styku s membránovými prípravkami obsahujúcimi chemokínový receptor podlá vynálezu. Membrány sa prednostne pripravujú z hostiteľských buniek exprimujúcich chemokínové receptory podľa vynálezu z rekombinantných vektorov. Po inkubačnej perióde, pri ktorej sa umožní styk medzi cheniok í novými receptormi uloženými v membráne a detegovatelne značenými skúšanými zlúčeninami, sa membránová látka zhromaždí na filtri. pomocou vákuovej filtrácie. Detegovatelná značka zachytená na filtri sa kvantifikuje. Kvantifikácia rádioaktívneho značiaceho činidla sa napríklad môžu uskutočňovať pomocou kvapalinovej scintilačnej spektrof otonietrie. Pri použití tejto techniky sa identifikujú Ugandy viažúce sa k chemokínovým receptorom. S cieľom potvrdenia identifikácie ligandu sa detegovatelne označená zlúčenina exponuje membránovému prípravku obsahujúcemu chemokínový receptor za prítomnosti , J zvyšujúcich sa množstiev skúšanej zlúčeniny, v neoznačenom stave. Postupné znižovanie koncentrácie značiaceho činidla pripojeného k filtru pri pridávaní zvyšujúcich sa množstiev neoznačenej skúšanej zlúčeniny potvrdzuje identifikáciu ligandu.

Agonistami sú ligandy ktoré sa viažu k receptoru a v y v o 1 á v a .J ú i n t r a c e 1 u 1 á r n u transdukciu signálu, zatiaľ čo antagonistami sú ligandy ktoré sa viažu k receptoru, ale i n t r a c e 1 u 1 á r n u t r a n s d u k c i u ignálu nevyvolávajú. Stanovenie, pomocou ktorého sa zisťuJe či určitý ligand Je agonistom alebo antagonistom, sa napríklad môže uskutočňovať pomocou stanovenia transdukčných dráh signálu kopulovaných k proteinu G. Aktivácia týchto dráh sa môže stanoviť meraním intracelulárneho toku vápenatých iónov, stanovením aktivity fosfolipázy C alebo adenylyl cyklázy a tiež inými spôsobmi (pozri príklady 5 a 6).

Ako Je to podrobnejšie diskutované v ďalej uvedených príkladoch, chemokíny, ktoré šá viäžú ria receptor 88C, zahrnujú RANTES, MIP-Icé a MIP-a, zatiaľ čo chemokíny, ktoré sa viažu na receptor 88-28 zahrnujú RANTES.

Podlá iného aspektu zahrnuje vynález tiež modulátory interakcie medzi receptormi 88C. a 88-2B a ich llgandmi.

I

Modulátory funkcie chemokínových receptorov Je možné identifikovať použitím stanovení, ktoré sa podobajú stanoveniam používaným na identifikáciu ligandov. Membránový prípravok obsahujúci chemokínový receptor sa exponuje konštantnému a známemu množstvu detegovateľne značeného funkčného ligandu. Okrem toho sa tiež chemokínový receptor viazaný k membráne exponuje zvyšujúcemu sa množstvu skúšanej zlúčeniny, pre ktorú sa predpokladá modulačná účinnosť na tento chemokínový receptor. Ak úroveň značiaceho činidla pripojeného k filtru koreluje s množstvom skúšanej zlúčeniny, Je táto zlúčenina modulátorom aktivity chemokínového receptora. Ak sa úroveň značiaceho činidla pripojeného k membráne zvyšuje so zvyšujúcim sa množstvom skúšanej zlúčeniny, bol identifikovaný ak t i vát or. Ak sa oproti, tomu úroveň značiaceho > činidla pripojeného .k filtru mení s množstvom skúšanej zlúčeniny nepriamo úmerne, bol identifikovaný inhibítor aktivity chemokínového receptora. Takéto skúšanie modulátorov väzby k receptoru umožňuje uskutočniť rýchly screening mnohých potenciálnych modulátorov, keďže pri rovnakej reakcii Je možné súčasne skúšať skupiny mnohých potenciálnych modulátorov.

Nepriame stanovenia väzby k receptoru zahrnujú merania koncentrácie či úrovne aktivity akejkoľvek zložky, ktorá sa vyskytuje v relevantnej dráhe signálu. Aktivácia chemokínového receptora Je často spojená s intracelulárnym tokom vápenatých iónov. Bunky exprimujúce chemokínové receptory Je možné ofarbiť farbivom, ktoré Je citlivé na vápnik. Po aktivácii exprimovaného receptora sa tok vápenatých iónov stane vďaka farbivu spektrofotometricky detegovateľným. Alternatívne Je možné delegovať tok vápenatých iónov mikroskopicky. Pri použití ktorejkoľvek z týchto techník Je možné uskutočňovať paralelné stanovenie pri prítomnosti a neprítomnosti potenciálnych ligandov. Tak napríklad pri použití mikroskopického stanovenia toku vápenatých iónov bol CC chemokín RANTES identifikovaný ako ligand chemokínového receptora 88-2B. Odborníkom v tomto obore Je zrejmé, že tieto stanovenia sú tiež užitočné pri identifikácii a monitorovaní purifikácie modulátorov aktivity receptora. Aktivátory a inhibítory receptora budú podlá svojej povahy pri týchto stanoveniach aktivovať alebo inhibovať interakciu receptorov s ich ligandmi.

Asociácia chemokínových receptorov s G proteínmi poskytuje alternatívne možnosť stanovenia aktivity receptora na základe monitorovania aktivít G proteínu. Tak napríklad GTP hydrolýzu, Co Je charakteristická aktivita G proteínov, Je možné monitorovať použitím ³²P-značeného GTP;

proteiny tiež ovplyvňujú mnohé iné molekuly prostredníctvom svojej účasti v transdukčných dráhach signálu.

Tak napríklad G proteínové efektorové molekuly zahrnujú adenylyl cyklázu fosfolipázu C iónové kanály a

Stanovenia zamerané na ktorékoľvek z týchto efektorov, použiť na aktivity c h e m ok ínov ého receptora indukovanej väzbou Ugandu v hostiteľskej bunke, ktorá exprimuje chemokínový

Je predmetom záujmu a Je uvedená do •styku príslušným ligandom. Jednou z metód, pomocou ktorej Je možné zisťovať aktivitu chemokínových receptorov, Je napríklad meranie aktivity fosfolipázy C. Pri tomto stanovení sa deteguje rádioizotopom značených inositolfosfátov hostiteľskými bunkami chemokínový receptor za prítomnosti.

agonistu.

Detekcia aktivity fosfolipázy môže vyžadovať kotransfekciu s DNA kódujúcou exogénny G protein. Ak Je požadovaná kotransfekcia, môže sa toto stanovenie uskutočňovať tak, že sa kotransfekcii podrobí chimérická DMA G proteínu, napríklad Gqi5 (Conklin et al., Náture 363= 274 až 276 (1993)) s DNA 88-2B alebo BBC a deteguje sa produkcia fosfoinositolu, kecľ sa kotransfekovaná bunka exponuje agonistovi receptora 88-2B alebo 88C. Odborníkom v tomto obore Je zrejmé, že stanovenie zamerané na G proteínové efektorové molekuly sú tiež užitočné pri. identifikácii a monitorovaní purifikácie modulátorov aktivity receptorov. Aktivátory a inhibítory receptora budú pri týchto stanoveniach podlá svojej povahy aktivovať alebo inhibovať interakciu receptorov so svojimi ligandmi.

Chemokíny sú spájané s mnohými zápalovými chorobami, ako Je psoriasis, arthritis, pľúcna fibróza a ateroskleréza C pozri.

Baggiolini et al., vyššie uvedená citácia). Inhibítory pôsobenia chemokínov môžu byť užitočné pri liečení týchto chorôb. Ako Jeden z príkladov Je možné uviesť, že Broaddus et al. C J. of Immunol.. 152: 2960-2967 ¢1994)) popisujú protilátku proti IL-8, ktorá Je schopná inhibovať mobilizáciu neutrofilov pri pleuritíde indukovanej endotoxínom, čo Je model zápalu pľúc králika. Tiež sa predpokladá, že ligand alebo modulátor väzby k receptoru BBC alebo aktivácia tohoto receptora by mohli byť užitočné pri. liečení infekcie HIV a chorobných stavov majúcich vzťah k HIV .

Modulátory chemokínovej väzby k špecifickým receptorom podlá tohoto vynálezu môžu zahrnovať protilátky zamerané na chemokíny alebo receptor, biologické alebo chemické malé molekuly alebo syntetické peptidy zodpovedajúce fragmentom tohoto chemokínu alebo receptora.

Vynález sa tiež vzťahuje na podávanie prostriedkov o bs a hu. j ú c i c h modulátory

88-2B alebo cieľom m o n i t o r o v a n i. a alebo i e č e n i a n o r m á 1. n y c h alebo

P a t o 1. o g i c k ý c h im u n i t n ý c h reakcií a vírusových infekcií, vrátane

HIV—2 a SIV. V tomto ohľade

Je vynález predovšetkým zameraný na zmierňovanie zápalových odpovedí, abnormálnych hematopoetických procesov a vírusových infekcií. Pritom sa modulátory chemokínových receptorov 88-2B alebo 88C podávajú vo farmaceutický vhodných množstvách. Do rozsahu vynálezu patria ďalej tiež farmaceutický vhodné prostriedky slúžiace na dodávanie týchto účinných látok liečeným subjektom. Okrem účinných látok môžu takéto prostriedky obsahovať nosiče, riedidlá a iné liečivá. Účinné látky a prostriedky Je možné podávať rôznymi cestami: intravenózne, subkutánne, intraperitoneálne, intramuskulárne, orálne, análne C to znamená prostredníctvom čapíkov) alebo pulmonálne C to znamená prostredníctvom inhalátorov, rozprašovačov, rozhmlievačov atď.).

Informácia o sekvencii DNA podlá vynálezu umožňuje podlá iného aspektu vyvinúť hlodavce, ktoré neexprimujú funkčný chemokínový receptor 886 alebo 88-28, alebo ktoré exprimujú variant tohoto receptora. Pri tomto vývoji Je možné použiť techniky homológnej rekombinácie alebo stratégie knockout C pozri napríklad Kapecchi, Science, 244: 1288 až 1292 ¢1989)).

Alternatívne Je možné použiť dobre známe laboratórne techniky (. ľlanipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Brigid Hohan, Frank Costantini a Elizabeth Lacy, eds. ¢1986) Cold Spring Harbor Laboratory ^SBN 0-87969-175-1) vyvinúť transgénne myši exprimujúce klonovaný receptor 88-2B alebo 886. Takéto hlodavce sú užitočné ako modely pre štúdium aktivít receptorov 886 alebo 88-2B in vivo.

Iné aspekty a výhody vynálezu budú odborníkom v tomto obore i zrejmé na základe cľqlej uvedených príkladov realizácie., Tieto príklady maJú výlučne ilustratívny charakter a rozsah vynálezu v žiadnom ohlade neobmedzujú.

Príklady realizácie vynálezu

V príklade 1 Je popísaná izolácia genómových DNA kódujúcich chemokínové receptory 88-2B a 886. V príklade 2 Je popísaná izolácia a sekvenovanie cDNA kódujúcich chemokínový receptor 88-2B a 886 človeka a 886. opice makak (rod macaca) . V príklade 3 sú popísané analýzy Northern, ktoré ukazujú profily expresie receptorov 88-2B a 886 v rôznych tkanivách. V príklade 4 sú uvedené podrobnosti vzťahujúce sa na rekombinantnú expresiu receptorov 88-2B a 886. V príklade 5 sú popísané stanovenia s tokom vápenatých iónov, stanovenia s hydrolýzou fosfoinositolu a väzbové stanovenia ukazujúce aktivitu receptorov 88-2B a 886 v odpovedi na rôzne potenciálne ligandy. Experimenty popisujúce úlohu receptorov 88—2B a 886 ako ko-receptorov pre HIV sú uvedené u príkladoch 6 a 7. Príprava á čbárákterizácia monoklonálnych a polyklonálnych protilátok, ktoré sú imunoreaktívne s receptorom 88C, sú popísané v príklade 8. 9 príklade 9 sú popísané ďalšie stanovenia určené na identifikáciu ligandov alebo modulátorov 88-2B alebo 88C.

Príklad 1

Parciálne genómové klony kódujúce nové gény chemokínových receptorov podlá vynálezu boli izolované pomocou reakcie PCR založenej na konzervovaných sekvenciách vyskytujúcich sa v predtým identifikovaných génoch s prihliadnutím k skutočnosti, že sa gény týchto chemokínových receptorov v ľudskom genóme zhlukujú. Genómová DNA bola amplifikovaná štandardnými metódami PCR pri použití degenerovaných oligonukleotidových primérov.

Ako templáty pre PCR amplifikácie boli použité členy pochádzajúce z obchodne dostupného zdroja rekombinantnej genómovej DNA človeka klonovanej do kvasinkových umelých chromozómov (YAC) (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL, YAC Librarý Pools, katalógové ’ číslo 9501.1 B) . Do vektora Je možné umiestiť inserty s veľkosťou 500 až 1000 kb párov. Najprv boli podrobené screeningu skupiny DNA YAC klonu. Pri screeningu bolo použité PCR s primármi špecifickými pre gén kódujúci CCCKR1.

Primér antikóduJúceho reťazca, antikódujúcemu reťazcu CCCKR1) .je:

znázornený (ktorý zodpovedá

Primér je: zložený zo sekvencie

5’-CGTAAGCTTAGAGAAGCCGGG ATGGGAA-3', kde podrhnuté nukleotidy predstavujú translačný štart kodón pre CCC.KR1.

Primárom kódujúceho reťazca j e C C C KR - 3' ( č o z o d p o v e d á kódujúcemu reťazcu CC.CKR1) a jeho sekvencia Je uvedená v SEQ ID

MO: 16. Sekvencia CCCKR-3', 5'-GC.CTCTAGAGTCAGAGAC CAGCAGA-3', obsahuje reverzný komplet translačného stop kodónu CCCKR1 (podčiarknuté). Skupiny DNA YAC klonu poskytujúce detegovatelné

PCR produkty (to znamená DNA pásy pri elektroforéze: na géle) identifikujú vhodné podskupiny

YAC klonov na základe identifikačnej schémy Proprietary Identítication Schéma (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL, USA). PCR reakcia sa začne inkubáciou pri 94 °C počas 4 minút. Amplifikácie sekvencii sa uskutočňujú použitím 33 cyklov denaturácie pri 94 °C počas jednej minúty, teplotnej hybridizácie pri 55 °C počas jednej minúty a predlžovaní pri 72 °C počas dvoch minút.

Podskupiny DNA YAC klonu boli potom podrobené druhému kolu PCR reakcií uskutočňovaných pri. rovnakých podmienkach a pri použití rovnakých primérov, aké boli použité v prvom kole reakcií PCR. Výsledky screeningu týchto podskupín poskytli možnosť identifikovať Jednotlivé klony schopné podporovať PCR reakcie s CCCKR - špecifickými primármi. Jeden kloň, označený šifrou 881F10, obsahoval 640 kb ľudskej genómovej DMA z chromozómu 3p21, vrátane génov pre CCCKR'l a CCCKR2, ako bolo zistené PCR a hybridizáciou. Prekrývajúci YAC kloň, 941A7, obsahoval 700 kb ľudskej genómovej DNA a tiež obsahoval, gény pre CCCKR1 a CCCKR2. V dôsledku toho boli uskutočnené ďalšie mapovacie štúdie použitím týchto dvoch YAC klonov. Pomocou analýz sa zistilo, že gény pre CCCKR1 a CCCKR2 boli umiestené približne v lOOkb vzájomnej oblasti. · '

Tesná blízkosť génov CCCKR1 a CCCKR2 ukázala, že tiy 1 CCCKR'l a CCCKR2 mohli byť pripojené nové príbuzné gény. Pri použití DNA z kvasinky obsahujúcej YAC klony 881F10 a 941A7, ako templáty, boli uskutočnené PCR reakcie pre amplifikáciu akýchkoľvek

P r i p o. J e n ý c h r e c e p t o rových génov.

Ako PCR priméry boli skon št ruova n é oligodeoxyribonukleotidy.

T ieto oligonukleotidy zodpovedajú oblastiam kódujúcim druhú intracelulárnu slučku a šiestu transmembránovú doménu CC chemokínových receptorov, ako Je možné dedukovať z porovnaní do zákrytu umiestených sekvencii CCCKR'l, CCCKR2 a V28. V28 bolo použité, keďže ide o osirotený receptor vykazujúci vlastnosti chemokínového receptora. V28 bol tiež zamapovaný do ľudského chromozómu 3 (Raport e t al., Gene 1.63: 295 až 299 (1995)) . Zaujímavé Je tiež, že dva varianty zostrihu C.CC.KR2, CCCKR2A a CCCKR2B, sú identické v druhej intracelulárneJ slučke a oblasti šiestej transmembránovej domény, ktoré sa používajú pre analýzu. 5'-primár označený šifrou V28degf2 obsahuje vnútorné miesto BamHI C pozri ďalej); Jeho sekvencie je uvedená v SEQ ID MO:5. Sekvenčia priméru V28degf2 zodpovedá DNA kódujúcej oblasť druhej intracelulárnej slučky kanonickej receptorov?

j štruktúry (pozri al., vyššie uvedená citácia). 3'primér označený názvom obsahuje vnútorné miesto HindlII (pozri ďalej); Jeho zodpovedá

Je uvedená v SEQ T.D

NO: 6. Sekvenčia t r a n sm em b r á n o v ú priméru V28degr2 doménu k anonicke j receptorovej štruktúry.

Amplifikovaná PCR DNA bola potom štiepená BamHI a HindlII s cieľom vytvorenia fragmentov s približnou dĺžkou 390 bp, čo Je veľkosť, ktorá Je konzistentná s veľkosťou fragmentu predvídanou na základe prehliadky kanonickej sekvencie. Po štiepení endonukleázou boli PCR fragmenty klonované do plazmidu pBluescrlpt CStrategene Inc., LaJolla, CA, USA). Celkovo 54 klemovaných fragmentov sa podrobilo automatizovanej analýze nukleotidovej sekvencie. Okrem sekvencií génov CCCKR1 a CCCKR2 boli identifikované sekvencie dvoch nových génov chemoki.nových receptorov podľa tohoto vynálezu. lieto dva gény chemokíriových receptorov boli označené 88-2B a 88C.

Na zamapovanie relatívnych

CCCKR1 a CCCKR2 polôh génov kódujúcich receptory bolo použité mapovanie pomocou reštrikčnej endonukleázy a hybridizácie. lieto štyri gény sú spolu tesne spojené, keďže gén pre 88C .je: umiestený približne 18 kbp od génu CCCKR2 na ľudskom chromozóme 3p21.

Príklad 2 cDNA 88-2B a 88C s plnou dĺžkou boli izolované z cDNA makrofágovej knižnice: postupom, ktorý Je možné krátko popísať takto: Najprv sa z mRNA ľudského makrofágu skonštruuje v pRc/CľlV (Invitrogen Corp., San Diego, CA, USA) cDNA knižnica popísaná v publikácii TJoelker et al., Náture 374: 549 až 553 (1995). Vzniknutá cDNA knižnica sa podrobí screeningu na prítomnosť cDNA klonu 88-2B a 88C pomocou PCR pri použili Jedinečných dvojíc primérov zodpovedajúcich 88-2B alebo 88C. PCR reakcia sa začne denaturáciou pri 94 °C počas 4 minút. Amplifikácie polynukleotidov sa uskutočňujú pri použití. 33 cyklov PCR pri týchto podmienkach: denaturácia pri 94 °C počas jednej minúty, teplotná hybridizácia pri 55 °C počas jednej minúty a predlžovanie: pri. 72 °C počas dvoch minút.

Ako prvý primár, ktorý Je: Špecifický pre: gén kódujúci 88-2B, sa použije primér 88-2B-fl, ktorý Je: charakterizovaný v SEQ ID NO:11. Tento primér zodpovedá antikódujúcemu reťazcu sekvencie SEQ ID NO:3 v nukleotidových pozíciách 844 až 863. Ako druhý primér, ktorý Je špecifický pre: gén kódujúci 88-2B, sa použije: primér 88-2B-rl, ktorý Je charakterizovaný v SEQ ID NO:12. Tento primér zodpovedá kódujúcemu reťazcu sekvencie: SEQ ID NO:3 v nukleotidových pozíciách 1023 až 1042. Podobne: sa ako prvý primér, ktorý Je špecifický pre gén kódujúci 88C, použije: primér 88C-F1, ktorý Je charakterizovaný v SEQ ID NO:13. Tento primér zodpovedá antikódujúcemu reťazcu sekvencie: SEQ ID NO:1 v nukleotidových pozíciách 453 až 471. Ako druhý primér, ktorý Je: špecifický pre: gén kódujúci 886, sa použije: primér 88C-r3, ktorý Je charakterizovaný v SEQ ID NO:14. Tento primér zodpovedá kódujúcemu reťazcu sekvencie: SEQ ID N0:l v nukleotidových pozíciách 744 až 763.

Pri screeningu bol identifikovaný kloň 777, čo Je cDNA kloň 88-2B. Kloň 777 obsahoval DNA insert s dĺžkou 191.5 bp s obsahom úplnej dĺžky kódujúcej sekvencie 88-2B, čo bolo zistené na základe: týchto kritérií:

kloň obsahoval dlhý otvorený čítací rámec začínajúci ATG kodónom, zahrnoval

Kozákovu sekvenciu a vnútri, otvoreného čítacieho rámca bol proti smeru expresie umiestený stop kodón. Sekvencia DNA insertu klonu 777 Je: uvedená v SEQ ID MO:3 a Jeho dedukovaná aminokyselinová sekvencia Je uvedená v SEQ ID N0:4. Transkript 88-2B bol v makrofágovej cDNA knižnici pomerne: riedky. Z celkového odhadovaného počtu klonov 3x10** boli počas screeningu tejto knižnice identifikované len tri kTony 88-2B.

Pri screeningu cDNA klonov kódujúcich chemokínový receptor

88C boli identifikované klony 101 a 134, ktoré zrejme obsahovali úplnú kódujúcu oblasť

880, vrátane predpokladaného iniciačného však neobsahovali prídavnú 5' ekveneiu ktorá

Je potvrdenie totožnosti iniciačného kodónu.

Transkript

880 bol v makrof ágovej knižnici pomerne: hojne zastúpený.

Pri screeningu tejto knižnice bolo odhadom zistené že sa tento transkript vyskytuje: raz za každých 3000 transkriptov (z celkového počtu približne 3xlO^Ä klonov v knižnici).

RAČE PCR CRapid Amplification of cDNA Ends) bolo použité na predĺženie existujúcich sekvencii klonu 88C s delom umožnenia presnej charakterizácie 5' konca cDNA SSC. Ľudská slezinná cDNA pripravená pre: 5'-ACE bola zakúpená od firmy Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, CA, USA a bola použitá podlá doporučenia výrobcu. cDNA bola pripravená pre 5'-RAČE ligáciu k o t e: v n e .j s e-; k v e n c i e k b' koncom cDNA fragmentov. Kotevná sekvencia

Je-: k omplementárna ku kotevnému priméru od firmy Clontech

L a b o r a t o r i e s Tne.,

Palo Alto, . CA,

USA. Polynukleotidový duplex k o t e v n e J s e k v e n c 1 e kotevný prlmér obsahuje - miesto EcoRI. Ako tepmlátová DNA bola zvolená cDNA z ludskej sleziny, kecľže bloty

Northern ukázali, že SSC Je exprimovaný v tomto tkanive

PCR reakcia sa začne denaturáciou pri 94 °C počas 4 minút.

Amplifikácie sekvencii sa uskutočňujú pri použití 35 cyklov teplotnej hybridizácie pri 60 °C počas sekúnd a predlžovaní pri 72 °C počas dvoch minút. Prvé kolo

PCR bolo uskutočnené pri použití reakčnej zmesi obsahujúcej vždy ul kotevného priméru a 1 ul priméru 88c-r4 (lOOng/ul) v celkovom reakčnom objeme 50 ul. SSC-špecifický primér, primér 88c-r4

C 5'-GATAAGCCTCACAGCCCTGTG-3’) Je charakterizovaný v SEQ ID NO: 7.

Sekvencia priméru 88c-r4 zodpovedá kódujúcemu reťazcu sekvencie SEQ ID NOsl v nukleotidových pozíciách 745 až 765. Druhé kolo PCR bolo uskutočnené pri použití reakčnej zmesi obsahujúcej 1 ul prvej PCR reakčnej zmesi, 1 ul kotevného priméru a 1 ul priméru SSC-rlb C100ng/ul) obsahujúceho sekvenciu '-GCTAAGCTTGATGACTATCTTTAATGTC-3', ktorá Je charakterizovaná v SEQ ID MC)·. 8. Sek venčia priméru 88C-rlb obsahuje vnútorné klonovacie miesto HindlII C podčiarknuté) . Sek venčia 3’ miesta HindlII zodpovedá kódujúcemu reťazcu SEQ ID N0:l v nukleotidových pozíciách 636 až 654. Výsledný PCR produkt bol štiepený EcoRI a HindlII a frakcionizovaný na 1% agarózovom géle. Približne 700bp fragment bol izolovaný a klonovaný do pBluescri.pt. Klony s najväčšími insertmi. boli sek venované. Alternatívne bol intaktný PCR produkt ligovaný do vektora pCR pri použití obchodne dostupného klonovacieho kitu TA CInvitrogen Corpl, San Diego, CA, USA) pre nasledujúce stanovenie nukleotidovej sekvencie.

cDNA 88-2B a 88C boli sekvenované pri použití kitu PRISľl‘^R>

Ready Reaction DyeDeoxy^{c Α}’

Terminátor Cycle Seguencing Kít

Blosystems 373A DNA

Sequencer.

Insert klonu 777 poskytol d v o. J r e ť a z c o v ý templát pre ekvenčné reakcie použité pre stanovenie cDNA 88-2C.

Bola stanovená sekvencia celého insertu klonu 777 a táto sekvencia Je uvedená ako sekvencia 88—2B cDNA.

aminokyseli.nová sekvencia Je

SEQ ID NO:3. Táto sekvencia má dĺžku

Dedukovaná potom charakterizovaný v

1915 bp, vrátane 361 bp pozíciách 1 až

DNA C zodpoveda júcej SEQ

361), kódujúcej oblasti

ID NO:3

1065 bp v nukleotidových

C zodpovedajúcej

SEQ ID MO:3 v nukleotidových pozíciách 362 až 1462) a 489 bp

3'-nepreloženeJ

ID NO:3 v nukleotidových pozíciách

1427 až 1915). 88-2B genómová

DNA, ktorá Je popísaná v príklade vyššie, zodpovedá

SEQ ID

NO:3 v nukleotidových pozíciách

746 až 1128. 88C cDNA sekvencia a dedukovaná sekvencia Je charakterizovaná v SEQ

ID N0:l. 88C predstavuje kompozit sekvencií získaných z

RACE-PCR cDMA klonu 134 a klonu 101. RACE-PCR cDNA sa použilo ako sekvenčný templát pre stanovenie nukleotidov

ID N0:l, vrátane jedinečnej identifikácie 9 bp cDNA sekvencie v

SEQ ID N0:l, nukleotidovej polohy 1 až 9.

Sekvencia získaná pomocou RACE-PCR cDNA potvrdila polohu prvého metionínového kodónu v nukleotidových polohách 5b až 57 v

N0:l a potvrdila záver, že kloň 134 a kloň 101 obsahuje kópie

obsahoval 45 bp kódujúcej oblasti 88C s úplnou dĺžkou. Kloň 134

5’-nepreloženej cDNA C zodpovedajúcich SEQ TD NOrl v nukleotidových pozíciách 10 až 54) 1056 bp 880 kódujúcej oblasti C zodpovedajúcich SEQ ID NOsl v nukleotidových pozíciách 55 až 1110) a 492 bp 3'-nepreloženej cDNA (zodpovedajúcich SEQ ID NO:1 v nukleotidových pozíciách 1111 až 1602).

Kloň 101 obsahoval 25 bp 5'-nepreloženej cDNA (zodpovedajúcich SEQ ID NOsl v nukleotidových pozíciách 30 až 54) 1056 bp 88C kódujúcej oblasti. (zodpovedajúcich SEQ ID NOsl v nukleotidových pozíciách 55 až 1110) a 2273 bp 3'-nepreloženej cDNA (zodpovedajúcich SEQ ID NOsl v nukleotidových pozíciách 1111 až 3383). 88C genómová DNA popísaná v príklade 1 zodpovedá SEQ ID NOsl v nukleotidových pozíciách 424 až 809.

Dedukovaná aminokyselinové sekvencie 88-28 a 880 vykazujú profily hydrofobicity, ktoré sú charakteristické pre GPCR a obsahujú sedem hydrofóbnych domén zodpovedá Júcich transmembránovým doménam GPCR. Porovnanie sekvencie s inými GPCR takisto ukázalo stupeň identity. Významné Je, že dedukované sekvencie aminokyselín ako 88-2B, tak aj SSC vykazujú najvyššiu identitu so sekvenciami chemokínových receptorov. Výsledky porovnávaní aminokyselinových sekvencií sú uvedené v tabuľke 1.

Tabulka 1

R e cep t o r y c h e m o k í n u	88-2B	88C.
IL-8RA .	30 %	30 %
I1-8RB	31 %	30 %
CCCKR1	62 %	54 %
CCCKR2A	46 %	66 %
CCCKR2B	50 %	72 %
88-2B	100 %	50 %
88-C	50 %	100 %

Tabuľka 1 ukazuje, že 88^2b sä najviac podobá CCKR1 C 62% identita na úrovni aminokyselín) a BBC sa najviac podobá CCCKR2 C72% identita na úrovni aminokyselín).

D e d u k o v a n á a m i n o k y s e 1 i n o v á ekvenčia vykazuje intracelulárnu a extracelulárnu doménu charakteristickú pre

GPCR.

domény

88-2B aminokyselinovým sekvenciám uvedeným v SEQ v aminokyselinových zvyškoch 1 až 36, 93 až

107

171 až 196 a 263 až domény

88-2B kódované polynukleotidovými sekvenciami zodpovedajúcimi

SEQ ID NO: 3 nukleotidových pozíciách 362 až 469, 638 až 682

1148 až 1213. Extracelulárne domény 88C zahrnujú aminokyselinové a SEQ ID

Extracelulárne

88C sú kódované

P o 1 y n u k 1 e o t i d o v ý m i sekvenciami zodpovedajúcimi SEQ ID N0:l v a 829 až 894. Intracelulárne domény 88-2B zahrnujú aminokyseliny až

71, 131 až 151 až 355 zo SEQ ID NO:3 a S >EQ ID

MO: 4.

Tieto domény ú kódované

P o1ynuk1e otidovýml sek venciami ktoré zodpovedajú SEO ID NO:3 v nukleotidových pozíciách 539 až

574

752 až 814, 1016 až 1081 a 1277 až 1426.

Intracelulárne domény 880 zahrnujú aminokyselinové zvyšky 56 až

67, 125 až 1.45, zo SEQ ID N0:l a SEQ ID NO:2.

domény

88C sú kódované

P o 1 y f ί u k 1 e o t i. d o v ý m i s e k v e n clami z o d f· o v e d a J ú c i m i sekveneii

SEO

ID

N0:l v nukleotidových pozíciách 220 až

489

691 až 759 a

955 až 1110.

Okrem toho bola tiež pomocou PCR amplifikovaná 88C DNA makaka C rod macaca) pri použití primérov zodpovedajúcich 5' a 3' lemujúcim oblastiam ľudskej 88C cDMA. 5' primér zodpovedal oblasti bezprostredne predchádzajúcej C proti smeru expresie) a obsahujúcej iniciačný Met kodón. 3' primér bol komplementárny vzhľadom na oblasti bezprostredne nasledu júce C v smere expresie) za terminačným kodónom. Priméry obsahovali reštrikčné miesta pre klonovanie do expresných vektorov. 5'primér mal túto sekvenciu

GACAAGCTTCACAGGGTGGAACAAGATG (pričom miesto HindlII Je podčiarknuté) (SEQ ID NO: 17) a 3'primér mal sekvenciu GTCTCTAGACCACTTGAGTCCGTGTCA (pričom miesto Xbal Je podčiarknuté) (SEO ID NO-.18). Použité podmienky PCR amplifikácie zahrnovali 8 minút pri 94 °C a potom 40 cyklov s 94 °C (počas 1 minúty), 55 °C C počas 45 sekúnd) a 72 °C (počas jednej minúty). Amplifikované produkty boli klonované do miest HindlII a Xbal. pcDNA3 a získaný kloň bol sekvenovaný. Úplná dĺžka cDNA makaka a dedukovanej aminokyselinovej sekvencie sú charakterizované v SEQ ID NO:19 a SEQ ID NO:20. Mukleotidová sekvencia 88C makaka Je z 98 % identická z ľudskou 88C sekvenciou. Dedukovaná aminokyselinová sekvencia Je identická z 97 %.

P r í k 1. a d 3 mRMA expresné profily 88-28 a 88C boli stanovené analýzami

Northern blot.

Bloty Northern obsahujúce imobilizovanú poly A^’RNA z rôznych ľudských tkanív holi zakúpené od firmy.Clontech Laboratories, Inc., Palo · Alto, . CA, USA. Skúšania boli podrobené · predovšetkým tkanivá srdca, mozgu, placenty, pľúc, pečene, kostrového svalstva, obličiek, podžalúdkovej žľazy, sleziny, týmusu, predstojnice, semenníkov, tenkého čreva, hrubého čreva a leukocyty periférnej krvi.

Z cDNA klonu 478 sa vytvorí próba špecifická pre nukleotidové sekvencie 88-2B. cDNA insert v klone 478 obsahuje sekvencie zodpovedajúce SEQ ID NO:3 v nukleotidových pozíciách 641 až 1915. Aby sa vytvorila próba, kloň 478 sa štiepi a DNA fragment insertu sa po elektroforéze na géle izoluje. Izolovaný fragment insertu sa potom označí rádioizotopom pri použití ^3sP-značených nukleotidov pomocou techniky známej v tomto obore.

Z cDNA klonu 493 sa vytvorí próba špecifická pre nukleotidové sekvencie 88C. cDNA insert v klone 493 obsahuje sekvenciu zodpovedajúcu SEQ ID NO:3 v nukleotidových pozíciách ľ .

421 až 1359. Pre vytvorenie próby ša v tomto prípade použijú konvenčné techniky pri použití ^32!P-značených nukleotidov.

Bloty Morthern skúšané pomocou prób 88-2B .javia 1, 8 k b mRNA v leukocytoch periférnej krvi. Bloty Morthern 880. Javia približne: 4 kb mRNA v niekoľkých ľudských tkanivách. Silný signál Je zrejmý pri skúšaní tkaniva sleziny alebo týmusu a menej intenzívne signály sa získajú pri analýze; mRNA z leukocytov periférnej krvi a tkaniva tenkého čreva. Relatívne slabý signál pre: 880 bol delegovaný v tkanivách pľúc a vaječníkov.

Analýzou Northern Blot bola tiež zisťovaná expresia 880. v ľudských T-bunkách a hematopoetických bunkových líniách. Hladina 880 v T-bunkách CD4·*· a CD8* bola veľmi vysoká. Transkript bol prítomný v relatívne: vysokej koncentrácii v myeloidných bunkových líniách THP1 a HL-60 a tiež bol zistený v bunkovej línii B Jijoye. Okrem toho bola táto cDNA pomerne: hojným transkriptom v ľudskej makrofágovej cDNA knižnici (na základe: PCR amplifikácie: subfrakcií z knižnice).

Príklad 4 .

cDNA 88-2B a 880 boli exprimované rekombinantnými metódami v cicavčích bunkách.

Pre experimenty s transientnou transfekciou bol 880 subklonovaný do expresného vektora cicavčej bunky pBJl CIshi, K. et al., J. Biol. Chem. 270: 16435 až 16440 C1995)). Konštrukt zahrnoval sekvencie kódujúce prolaktínovú signálnu sekvenciu pre účinnú expresiu na povrchu bunky a epitop FLAG pri amínovom konci 880 pre: umožnenie detekcie exprimovaného proteínu. Epitop FLAG sa skladá zo sekvencie: DYKDDDD . Bunky COS-7 boli transientne transfekované expresným plazmidom 880 pri použití Lipofectamine CLife Technology, Inc., Grand Island, NY, USA) podľa inštrukcií výrobcu. Použitý postup Je možné stručne popísať takto·. Bunkami sa zaočkujú 24-Jamkové misky pri hustote 4x10^ buniek na Jamku a kultúry sa nechajú rásť cez noc. Potom sa bunky premyjú PBS a do každej Jamky sa pridá C), 3 mg DNA v zmesi s 1, 5 jjl lipofectamine v 0, 25 ml Opti-I*IEI*I. Po 5 hodinách pri. 37 ^C,C sa médium nahradí médiom obsahujúcim 10 % fatálneho teľacieho séra. Kvantitatívnym stanovením ELISA bolo potvrdené, že 880 bol exprimovaný na povrchu transientne transfokovaných buniek (ľ.OS-7. Pri stanovení ELISA bola použitá protilátka ľll, ktorá Je špecifická pre epitop FLAG (Eastman Co., Neu Haven, CT, IJSA).

Receptor 880 značený sekvenciou FLAG bol tiež stabilne transfekovaný do buniek HEK-293, čo Je bunková línia ľudských embryonálnych obličiek, pri použití transfakčného činidla DOTAP CN-Ľ1-C (2, 3-dioleoyloxy) propyl]-N, N, N-trimetylamóniummetylsulf át, Boehringer ľlannheim, Inc., Indianopolis C IN, USA) podľa doporučenia výrobcu. Stabilné línie boli podrobené selekcii na prítomnosť liečiva G418. Transfekované bunky HEK-293 boli podrobené skúšaniu na expresiu 880 na povrchu buniek pomocou testu ELISA pri použití protilátky ΓΙ1 voči epitopu FLAG. Pri tomto stanovení sa zistilo, že receptor 880. značený epitopom FLAG hol exprimovaný na bunkovom povrchu stabilne transformovaných buniek HEK-293.

I cDNA 88-2B a 880 boli tiež použité s cielom získania stabilných transfektantov HEK-293. cDNA receptora 88-2B bola klonovaná za cytomegalovírusový promótor v pRc/CNV (Invitrogen Oorp., San Diego, CA, USA) pri použití, stratégie opierajúcej sa o PCR. Ako templát pre PCR reakciu bol použitý insert cDNA do kloriu 777. Pre PCR bol použitý , primér 88-2B-3 (obsahujúci vnútorné miesto Xbal) a 88-2B-5 (obsahujúci vnútorné miesto HindlII). Nukleotidová sekvencia priméru 88-2B-3 je uvedená v SEQ ID NO:9 a nukleotidová sekvencia priméru 88-2B-5 Je uvedená v SEQ ID NO:10. Oblasť 1104bp cDNA bola amplifikovaná. Po amplifikácii bola DNA štiepená Xbal a HindlII klonovaná do podobne: štiepeného pRc/CMV. Výsledný plazmid obsahujúci 18bp 5'-nepreloženú sekvenciu, celú kódujúcu oblasť 88-2B a 3bp 3'-nepreloženej sekvencie bol označený 777XP2. Pred transfekciou buniek HEK-293 nebol insert cDNA s úplnou dĺžkou v klone 134 ďalej modifikovaný pre sekvenciu 880.

Aby boli vytvorené stabilne transformované bunkové línie, boli rekombinantné klony pRc/CI*lV transf ekované do buniek HEK-293, čo Je bunková línia ľudských embryonálnych obličiek, pri použití, transfekčného činidla DOTAP CN-C1-C(2, 3-dioleoyloxy)— propyl]-M, N, N-trimetylamóniummetylsulfát, Boehringer ľlarinheim, Inc.., Indianopolis C IN, USA) podľa doporučenia výrobcu. Stabilné línie boli podrobené selekcii na prítomnosť liečiva G418. Ma identifikáciu stabilných línií exprimujúcich najvyššiu koncentráciu 88-2B a 886 mRMA boli použité štandardné postupy screeningu (to znamená analýzy Northern Blot).

Príklad 5

A. Stanovenie s tokom vápenatých iónov

S cieľom analýzy expresie polypeptidu bolo použité funkčné stanovenie aktivity chemokínového receptora. Spoločným znakom signalizácie prostredníctvom známych chemokínových receptorov Je, že transdukcia signálu Je spojená s uvoľňovaním intracelulárnych vápenatých iónov. Preto bola meraná intracelulárna koncentrácia vápenatých iónov v transfekovaných bunkách HEK-293 s cieľom zistenia, či receptory 88-2B alebo 886 odpovedajú na niektorý zo známych chemokínov.

Bunky HEK-293 stabilne transfekované 88-2B, 886 (bez sekvencie epitopu FLAG) alebo kontrolnou kódujúcou oblasťou (kódujúcou IL8R alebo C.C6KR2, pozri ďalej), ako to bolo popísané vyššie, boli nechané rásť v bankách T75 až do konfluencie približne 90 % v l*IEI*l + 10% séra. Potom boli bunky premyté, zozbierané versenom (0, 6mľlEDTA, lOmM hydrogenfosforečnan dvoj sodný, 0, 141*1 chlorid sodný, 3ml*l chlorid draselný a lml*l glukóza) a inkubované v ΓΙΕΙΊ + 10% séra luM Fura-2 Al*l (ľlolecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA) počas 30 minút pri teplote miestnosti. FURA-2 Al*l Je farbivo citlivé voči vápenatým iónom. Bunky boli resuspendované v Dulbeccovom roztoku chloridu sodného pufrovanom fosforečnanom obsahujúcim 0, 9mt*l chlorid vápenatý a

O, 5mM chlorid horečnatý CD-PBS) na kohceKtráciu asi 10⁷ buniek/ml a zmeny fluorescencie boli monitorované použitím fluorescenčného spektrofotometra CHitachi Model F-401CJ). Približne 10^A buniek bolo suspendovaných u 1,8 ml D-PBS v kyvete udržiavanej pri 37 °C. Excitačná vlnová dĺžka bola alterovaná medzi 340 a 380 nm v štvorsekundových intervaloch. Emisná vlnová dĺžka bola 510 nm. Skúšané zmesi boli dávkované do kyvety vstupom pre: injekčnú ihlu; maximálny tok vápenatých iónov bol ^!nameraný po prídavku iónomycínu.

Pozitívne: odpovede: boli pozorované v bunkách exprimujúcich T.L-8RA po stimulácii IL-8 a tiež, keď bol C.CCKR2 stimulovaný MCP-1 alebo MCP-3. Bunky HEK-293 exprimujúce 88-2B alebo 88C však nevykazovali intracelulárny tok vápenatých iónov po expozícii ktorémukoľvek z nasledujúcich chemokínov; MCP-1, MCP-2, MCP-3, MIP-lcí, MIP-la, IĽ8, MAP-2, gro/MGSA, IP-10, ENA-78 alebo PF-4 CPeprotech, Inc., Rocky Hill, M J, USA).

Pri použití citlivejších stanovení bola sledovaná odpoveď toku vápenatých iónov na , RANTES mikroskopicky v bunkách ofarbených farbivom FURA-2 AM exprimujúcich 88-2B. Pri tomto stanovení boli použité bunky a reakčné činidlá pripravené pomocou vyššie: popísaných spôsobov. RANTES CRegulted on Activation, Normál T__Expressed and Secreted) Je CC chemokín, ktorý bol identifikovaný ako chemoatraktant a aktivátor eozinofilov (pozri Neote: et al., vyššie uvedená citácia). Tento chemokín tiež sprostredkúva uvoľňovanie histamínu v bazofiloch a ukázalo sa, že pôsobí ako chemoatraktant pre pamäťové T bunky in vitro. Predpokladá sa, že modulácia aktivít receptora 88-2B by mohla byť užitočná pri modulácii aktivácie leukocytov.

Receptor 88C značený sekvenciou FLAG bol exprimovaný v bunkách HEK-293 a skúšaný na interakcie chemokínov pomocou stanovenia toku vápenatých iónov. Expresia 88C na povrchu buniek bol potvrdená testom ELISA a analýzou FACScan pri použití protilátky M_x. Všetky chemokíny zo súboru zahrnujúceho RANTES, ΜΙΡ-lcc a MIP-le> indukovali tok vápenatých iónov v bunkách transf ©kovaných 88C, ak boli tieto chemokíny pridané v kone e n t r á c i i 10 0 n 1*1.

Stanovenia s tokom vápenatých iónov môžu byť tiež usporiadané tak, aby bolo možné s ich pomocou identifikovať modulátory väzby chemokínových receptorov. Vyššie popísaná fluorimetrické alebo mikroskopické stanovenia sa v tomto prípade uskutočňujú za prítomnosti skúšaných zlúčenín. Ak za prítomnosti skúšanej zlúčeniny tok vápenatých iónov vzrastie, Je zlúčenina aktivátorom väzby chemokínu k receptoru. Oproti tomu znížený tok vápenatých iónov ukazuje, že skúšaná zlúčenina Je inhibítorom väzby chemokínu k receptoru.

B. Hydrolýza fosfoinositolu

Ďalšie skúšanie ligandov alebo modulátorov zahrnuje sledovanie aktivity fosfolipázy C, ktoré Je popísané v publikácii Hung et al., J. Biol. Chem. 116: 827 až 832 (1992). Stručne Je možné túto skúšku popísať takto: Najprv sa hostiteľské bunky exprimujúce chemokínový receptor 24 hodín plnia ³H-inositolom. Potom sa k bunkám, pridajú skúšané zlúčeniny C to znamená potenciálne ligandy) a bunky sa 15 minút inkubujú pri 37 °C. Ďalej sa bunky exponujú 20mN kyseline mravčej, aby sa rozpustili a extrahovali hydrolyzované metabolity metabolizmu fosfoinositolu C to znamená produkty hydrolýzy vyvolanej pôsobením fosfolipázy C). Extrakt sa podrobí chromatografii na anexovej živici pri použití stĺpca anexu AGlx8 vo formiátovej forme. Inositolfosfáty sa eluujú 21*1 mravčanom amónnym/0, 11*1 kyselinou mravčou a ³H asociovaný so zlúčeninami sa stanoví kvapalinovou scintilačnou spektroskopiou, Stanovenie s fosfolipázou C Je tiež možné využiť pri identifikácii modulátorov aktivity chemokínového receptora. Stanovenie sa v tomto prípade uskutočňuje vyššie popísaným spôsobom, ale pri pridaní potenciálneho modulátora. Zvýšená hladina detegovatelnej značky ukazuje, že modulátor Je aktivátorom, zatiaľ čo znížená hladina ukazuje, že modulátor Je inhibítorom aktivity chemokínového receptora.

Stanovenie s fosfolipázou C bolo uskutočnené s cieľom identifikácie chemokínových ligandov receptora 88C. s charakteristickou sekvenciou FLAG. Približne 24 hodin po transfekcii sa bunky COS-7 exprimujúce 880 počas 20 až 24 hodín označia pôsobením myoC2-³H]inositolu Clj.iCi/ml) v médiu neobsahujúcom inositol s obsahom 10% dialyzovaného fetálneho teľacieho séra. Označené bunky sa premyjú DľIEľl bez inositolu s obsahom chloridu lítneho ClOmľl) a 1 hodinu inkubujú pri 37 °C s DľIEľl bez inositolu s obsahom chloridu lítneho ClOmľl) a jedného z nasledujúcich chemokínov: RANTES, ľlCP-1, ľlIP—loí, ľlIP—1β, 1L8 alebo myšacieho ľlCP-1 homológu JE. Tvorba inositolfosfátu sa stanovuje spôsobom popísaným v predchádzajúcom odstavci. Po inkubácii s cheniokínmi sa médium odsaje a bunky sa podrobia lýze pridaním 0,75 ml ľadovo chladnej 20mľl kyseliny mravčej ¢30 min). Frakcie supernatantu sa nanesú na stĺpce AG1-X8 Davex ¢(310^0, Hercules, CA, IJSA) a hneď potom sa na stĺpec pridajú 3 ml 50mľl roztoku hydroxidu amónneho. Po premytí 4 ml 40mľl mravčanu amónneho nasledovala elúcia 2ľl mravčanom amónnym. Kvantifikácia inositolfosfátov bola uskutočnená spočítaním i?,-rozpadov .

I

Keďže, sa ukázalo že niektoré chemokínové receptory, ako sú

IL8RA a TL8RB, vyžadujú kotransfekciu s exogénnym G proteínom pred tým ako Je signalizácia detegovateľná v bunkách COS-7, receptor

88C bol koexprimovaný chimerickým G proteínom Gqi5 ¢ Conklin e t al.

Náture proteín ktorý obsahuje zostrih piatich karboxy-terminálnych aminokyselín Gi ¢ktoré sa viažu k receptoru) na Go!C| .

Kotransfekciou s významne zosilnia signalizácie CCCKR1 a

CCKR2B. Kotransfekcia s Gqi5 ukázala, že receptor 88C poskytoval dobrý signál v odpovedi na RANTES, ľlIP-la a ľlIP-Ιοί, ale nie v odpovedi na ľlCP-1, IL-8 alebo myšací ľlCP-1 homológ JE. Z kriviek závislosti odpovede od dávky boli zistené tieto hodnoty EC_SO: RANTES-lnľl; ľlIP-la-6nľl a ľlIP-lo:-22nľl.

Receptor 88C Je prvý klonovaný ľudský receptor poskytujúci signalizačnú odpoveď na ľlIP-le. V porovnaní s inými CC chemokínmi vykazuje ľlIP-le> Jasný jedinečný profil bunkovej aktivácie. Zdá sa, že aktivuje T-bunky, ale nie monocyty (Baggiolini et al., vyššie uvedená citácia), čo Je konzistentné so stimulačnými štúdiami receptora. Tak napríklad l*IIP—la sa síce viaže k CCCKR1, ale neindukuje vápnikový tok, (Neote et al., vyššie uvedená citácia) . Oproti tomu ΝΙΡ-lcŕ a RANTES sa viažu k CCCKR1 a CCCKR5 a vyvolávajú ich signalizáciu (RANTES tiež vyvoláva aktiváciu CCCKR3) . Zdá sa teda, že ΙΊΙΡ-1β Je podstatne selektívne J ší ako iné chemokíny triedy chemokínov CC. Takáto selektivita Je terapeuticky významná, keďže Je možné stimulovať špecifickú prospešnú aktivitu (ako Je potlačenie infekcie HIV) bez stimulácie mnohých leukocytových populácií majúcich za následok všeobecné protizápalové aktivity.

C. Väzbové stanovenia

Inú skúšku interakcie medzi receptorom a chemokínmi predstavuje modifikácia väzbového stanovenia, ktorá Je popísaná v publikácii Ernst et al., J. Immunol. 152: 3541 až 3549 (1994). NlP-la bol označený Bolton-Hunterovým činidlom (dijodid, NEN, Wilmington, DE, USA) podlá inštrukcií výrobcu. Nekonjugovaný Jodid bol oddelený od značeného proteínu elúciou zo stĺpca PD-10 (Pharmacia) ekvilibrovaného s PBS a BSA (10 g/1). Špecifická aktivita bola obvykle 2200 Ci/mmol. Rovnovážna väzba bola uskutočnená pridaním ^1Ľ5I-značeného ligandu samotného alebo v zmesi so stonásobným nadbytkom neznačeného ligandu k 5x10^ buniek HEK-293 transfekovaných receptorom BBC s charakteristickou sekvenciou epitopu FLAG v polypropylénových skúmavkách v celkovom objeme 300 jjI (SOmM HEPES, pH 7,4, lmM chlorid vápenatý a chlorid horečnatý 0, 5% BSA) . Inkubácia za trepania s frekvenciou otáčania trepačky 150 min“¹ prebiehala 90 minút pri 27 °C. Bunky boli zhromaždené pomocou zariadenia Skatron Celí Harvester (Skatron Inštrumente Inc., Šterling, VA, USA) na filtroch zo sklenených vláken, ktoré boli dopredu namáčané v 0, 3% polyetylénimíne a 0,2% BSA. Po premytí boli filtre vybrané a naviazaný ligand bol kvantiťikovaný spočítaním gama emisií. Kompetitívna väzba značeného ligandu s neznačeným ligandom bola stanovená inkubáciou 5xl0⁵ transfekovaných buniek (pozri vyššie) s 1, 5nl*l rádioizotopom značeným ligandom a uvedenými koncentráciami neznačeného ligandu. Vzorky boli zhromaždené, premyté a spočítané vyššie uvedeným spôsobom. Dáta boli analyzované pri použití programu na preloženie krivky Prism (GraphPad Inc., San Diego, CA, USA) a iteračného nelineárneho represného programu, LIGAND CPIT220).

Pri rovnovážnych väzbových stanoveniach viazal receptor 88C rádioizotopom značený l*IIP-la špecifickým a saturovateľným pôsobom. Analýza týchto väzbových dát Scatchardovou metódou poskytla hodnotu disociačnej konštanty (Kd) 1, 6nl*l. Kompetitívne väzbové stanovenia pri použití značeného ľlIP-le> ukázali, že existuje vysoká afinita (IC_SO = 7, 4nl*l), RANTES

C ICso

6, 9nľl)

CICso = 7, 4nl*i) čo Je konzistentné so ignalizačnými dátami získanými pri použití transientne transfekovaných buniek COS-7, pozri vyššie uvedený odstavec B).

P r í k 1 a d 6

Ako už bolo ukázané, chemokíny ΙΊΙΡ-Ιαί, ľlIP—1e> a RANTES inhibujú replikáciu HIV-1 a Hl‘V-2 v jednojadrových bunkách periférnej krvi človeka a bunkách PNI (Cocchi ·et al., vyššie uvedená citácia). S ohľadom na toto zistenie a výsledky uvedené v príklade 5 sa podlá vynálezu predpokladá, že aktivácia receptora 88C alebo väzba ligandu k tomuto receptoru môže mať ochrannú úlohu pri infekcii HIV.

Nedávno bolo oznámené, že osirotený receptor kopulovaný s G proteínom, fuzín, môže pôsobiť ako ko-receptor pre vstup HIV. Fuzín/CXCR4 v kombinácii s CD4, primárnym receptorom HIV, zrejme uľahčuje infekciu HIV kultivovaných T buniek (Feng et al., Science 272: 872 až 877 (1996)). Vzhľadom na homológiu fuzínu s chemokínovými receptormi, vzhľadom na profil väzby receptora 88C l< chemokínom a tiež vzhľadom na to, že receptor BBC Je konštitutívne exprimovaný v T bunkách a hojne exprimovaný v makrofágoch, Je pravdepodobné, že sa receptor BBC zúčastňuje na vírusových infekciách vrátane infekcie HIV.

Funkcia 886 a 88-2B, ako ko-receptorov pre HIV, bola stanovená tak, že boli transfekované bunky exprimujúce CD4 pomocou 88C alebo 88—2B a ko—transfekované bunky boli vystavené provokácii HIV. Infikované bunky boli len bunky exprimujúce ako CD4, tak aj funkčný ko-receptor pre HIV. Infekciu HIV Je možné určiť niekoľkými metódami. Obchodne dostupné sú kity ELISA, pomocou ktorých sa zisťuje expresia HIV antigénov, napríklad Coulter HIV-1 p^a4 Antigén Assay (IJS patent č. 4 886 742), Coulter Corp., 11800 SW 147th Ave., ľliami, FL 33196, USA. Alternatívne môžu byť vytvorené skúšobné bunky pre: expresiu reportérového génu, ako Je LACZ pripojený k LTR promótora HIV (Kiinpton et al., J. Virol., 66: 2232 až 2239 (1992)). Pri tejto metóde sa bunky infikované HIV detegujú kolorimetrickým stanovením.

Receptor 88C bol transientne: transfekovaný do mačacej bunkovej línie CCC (Clapham et al., 181: 703 až 715 (1991)), ktorá bola stabilne transformovaná pre: expresiu ľudského CD4 (CCC-CD4). Tieto bunky sú normálne rezistentné voči infekcii akýmkoľvek kmeňom HIV—1, keďže: endogénne neexprimujú receptor 886. Pri týchto experimentoch boli bunky CCC/CD4 tr ansientne: transfekované receptordm 886 klonovaným do expresného vektora pcDNAS.l (Invitrogen Corp., San Diego, CA, USA) pri použití lipofectamínu (Gibco BRL, Gaithersburg, ľlD, USA). Dva dni po transfekcii boli bunky vystavené provokácii HIV. Po 4 dňoch inkubácie boli bunky fixované a ofarbené na p24 antigén, ako mierka infekcie HIV.

Schopnosť exprimovať receptor 886 urobila tieto bunky susceptibilnými pre infekciu niekoľkými kmeňmi HIV-1. Tieto kmene: zahrnovali štyri primárne izoláty HIV-1 neindukujúce syncýcium (ΙΊ23, ESO, SL-2 a SF-162), ktoré, ako sa ukázalo, používajú ako ko-receptor len 886, ale nie: fuzín. Niekoľko primárnych kmeňov HIV-1 indukujúcich syncýcium (2006, 1*113, 2028 a 2076) používalo buď 886 alebo fuzín, ako ko-receptor. Tiež dva zavedené klonálne vírusy HIV-1 (GlJN-1 a 89.6) používali ako ko-receptor buď 886 alebo fuzín.

Bolo oznámené, že niektoré kmene HIV-2 môžu infikovať určité CD4 - negatívne bunkové línie, čo ukazuje na priamu interakciu HIV-2 s iným receptorom, ako Je CD4 (Clapham et al., J. Virol., 66= 3531 až 3537 (1932)). Pokiaľ ide o niektoré kmene HIV-2, Je táto infekcia uľahčená prítomnosťou rozpusteného CD4 (sCD4). Keďže 88-2B má vysokú sekvenčnú podobnosť s inými chemokínovými receptormi, ktoré pôsobia ako ko-receptory HIV (totiž s 88C a fuzínom), zdá sa pravdepodobné, že receptor 88-2B bude ko-receptorom HIV-2. IJloha receptora 88-2B, ako ko-receptora HIV-2, bola demonštrovaná použitím kmeňa HIV-2 ROD/B. Mačacie bunky CCC, ktoré endogénne neexprimujú CD4, boli transfekované 88-2B. Pri týchto experimentoch boli bunky transfekované pri použití pcDNAS.l obsahujúceho 88-2B pomocou lipofectamínu a infikované po ďalších 48 hodinách HIV-2. Tri dni po infekcii bola pre bunky pomocou imunofarbenia zisťovaná prítomnosť obalových glykoproteínov HIV-2. Prítomnosť sCD4 počas provokácie HIV-2_ROD/_Bzvýšila infekciu týchto buniek desaťnásobne. Vstup HIV—2 do buniek transfokovaných 88-2B bolo možné blokovať prítomnosťou 400 až 800 ng/ml eotaxínu, Jedného z ligandov 88-2B. Základná úroveň infekčnosti buniek CCC/88-2B (bez rozpustného CD4) bola rovnaká ako v prípade CCC buniek, ktoré neboli transfekované 88-2B.

Úloha receptorov 88-2B a 88C ako ko-receptorov HIV bola potvrdená tak, že boli pripravené bunkové línie stabilne transformované pre expresiu 88C alebo 88-2B a tieto bunkové línie boli vystavené provokácii rôznymi kmeňmi HIV a SIV. Dosiahnuté výsledky sú uvedené v príklade 7.

Alternatívne Je možné úlohu receptora 88C a 88—2B ako ko-receptora demonštrovať experimentálnym postupom, ktorý nevyžaduje použitie živého vírusu. Pri tejto metóde sa bunkové línie koexprimujú receptormi 88C alebo 88-2B, CD4 a reportérový gén LACZ zmieša s bunkovou líniou ko-exprimujúcou obalový glykoproteín (EMV) HIV reportérového génu (Nussbaum Bunky exprimujúce funkčný

a transkripčný	faktor	konštruktu
e t al., 1994, J.	Virol.,	68: 5411).
ko-receptor HIV	budú	fuzionovať

s bunkami exprimujúcimi ENV a tým umožnia expresiu reportérového •génu. Pri tejto metóde ukazuje deitekcia produktu reportérového génu kolorimetrickým stanovením, že receptor 88C. alebo 88—2B •Funguje ako ko-receptor pre HIV.

Mechanizmus, akým chemokíny inhibujú vírusovú infekciu, nebol doteraz objasnený. Jedným z možných mechanizmov Je aktivácia receptora väzbou chemokínu. Väzba chemokínu vedie k transdukciám signálu v bunke, ktoré robia bunku rezistentnou voči vírusovej infekcii a/alebo replikácii vírusu v bunke. Podobne, ako Je to pri indukcii interferónom, môže dôjsť k deferenciácii bunky tak, že Je bunka rezistentná voči vírusovej infekcii alebo že sa ustanoví antivírusový stav. Alternatívny druhý mechanizmus zahrnuje priamu interferenciu so vstupom vírusu do bunky blokovaním prístupu obalových glykoproteínov vírusu ku ko-receptora, ktoré Je spôsobené väzbou chemokínu. Aby bola potlačená infekcia HIV pôsobením chemokínu, nie Je: podía tohoto mechanizmu nutná signalizácia G proteínu.

S cieľom rozlíšenia medzi týmito dvoma mechanizmami, ktorými môžu receptory 88C alebo 88-2B fungovať ako ko—receptory vírusovej infekcie: a infekcie: HIV, sa väzba chemokínu k receptoru oddelí od transdukcie signálu a stanoví sa účinok chemokínu na potlačenie vírusovej infekcie.

Väzbu ligandu Je: možné oddeliť od -transdukcie signálu prídavkom zlúčenín inhibujúcich signalizáciu sprostredkovanú G-proteínom. Tieto zlúčeniny zahrnujú napríklad toxín Čierneho kašľa a cholerový toxín. Okrem toho Je možné tiež inými zlúčeninami, ako wortmanninom, inhibovať ďalej umiestené (v smere? expresie) efektorové polypeptidy. Ak by sa signalizácia G-proteínu zúčastňovala na potláčaní vírusovej infekcie, prídavok takýchto látok by bránil potláčaniu vírusovej infekcie: použitým chemokínom. Alternatívne: Je možné pozmeniť alebo vypustiť kľúčové zvyšky receptorových domén receptora 88C alebo 88-2B, ktoré sú potrebné po kopulácii G-proteínu, čím dôjde k pozmeneniu alebo likvidácii kopulácie; G-proteínu, bez toho, aby bola ovplyvnená väzba chemokínu.

Pri týchto podmienkach, ak nie vírusovú infekciu alebo infekciu prostredníctvom G-proteínu nutná infekcie alebo infekcie HIV. Ak potlačiť vírusovú infekciu, potom G-proteínu nie Je pre chemokínové nutná a ochranné účinky ehe zablokovania dostupnosti receptora sú chemokíny schopné potlačiť HIV, potom Je signalizácia pre potlačenie vírusovej sú však chemokíny schopné signalizácia prostredníctvom potlačenie,vírusovej infekcie lokínov môžu. byť dôsledkom re vírus pôsobením chemokínu.

Iný prístup zahrnuje použitie protilátok zameraných proti receptoru 88C alebo 88-2B. Protilátky, ktoré sa viažu k 88C alebo 88-2B, pre ktoré .je: možné demonštrovať, že nevyvolávajú signalizáciu prostredníctvom G-proteínu, môžu blokovať prístup k väzbovému miestu receptora pre chemokín alebo vírus. Ak za prítomnosti protilátok voči receptoru 88C alebo 88-28 dôjde k potlačeniu vírusovej infekcie, potom mechanizmus protektívnych účinkov chemokínov spočíva v blokovaní prístupu vírusu k Jeho receptoru. Feng et al. oznámili, že protilátky voči amínovéinu koncu fuzínového receptora potláčajú infekciu HIV CFeng eti al., 1996). P r í k 1 a d 7

Bunkové línie boli stabilne transformované receptorom 88C alebo 88-2B, aby bolo možné ďalej vymedziť úlohu týchto receptorov pri infekcii HIV. V publikácii Kimpton a Emerman Detection of Replication—Competent and Pseudotyped Human Immunodeficiency Vírus wtih a Sensitive Celí Line on the Basis of Activation of an Integrated Beta-Galactosidase Gene, J. Virol., 66(5): 3026-3031 C1992) bola nedávno popísaná indikátorová bunková línia, tu označovaná ako Hela-I*1AGI. Bunky Hela-ľlAGI sú bunky Hela, ktoré boli stabilne transformované tak, aby exprimovali CD4 a integrovaný HIV-1 LTR poháňajúci expresiu v Jadre umiesteného génu e.-galaktozidázy. Integrácia provírusu HIV do bunky vedie k produkcii vírusového transaktivátora, Tat, ktorý potom obracia expresiu β-galaktozidázového génu. Počet buniek, ktoré sa pozitívne farbia pomocou X-gal na a-galaktozidázovú aktivitu in situ, Je priamo úmerný počtu infikovaných buniek.

Tieto bunky adaptované izoláty

HIV-1, ale len malú časť primárnych izolátov (pozri Kimpton a vyššie uvedená citácia) a nie sú schopné detegovať väčšinu izolátov SIV (Chackériari et al.

of a CD4-Expressing ňacaque Celí that can

Detect Vírus After

A Single Replication Cycle and can be infected by Diverse Simian Immunodeficiency Virus Isolates, Virology

213(2): 6499-6505 (1995)). Okrem toho Harington and Geballe (Co-Factor Requirement for Human Immunodeficiency Virus Type 1 Entry into a CD4-Expressing Human Celí Line, J. Virol., 67 ·. 5939-5947 (1993)) popísali bunkovú líniu, založenú na bunkách U373, ktorá bola vytvorená tak, aby exprimovala CD4 a rovnaký LTR-B-galaktozidázový konštrukt. Ako už bolo ukázané, táto bunková línia, tu označovaná ako U373-MAGI, nemôže byť infikovaná žiadnym kmeňom HIV (1*1- alebo T-tropickým), ale susceptibilita k infekcii jej môže byť dodaná fúziou s bunkami Hela (Harrington a Geballe, vyššie uvedená citácia). i

S cieľom konštrukcie indikátorových bunkových línií, ktoré by boli schopné detegovať makrofágové vírusy (Cľl) alebo tropické vírusy T-buniek (I-tropické), bola DNA kódujúca epitopom značený receptor SSC alebo 88-2B transfekovaná do buniek Hela-ľlAGI alebo U373-NAGI prostredníctvom infekcie retrovírusovým vektorom. Tak boli vytvorené bunkové línie Hela-ľlAGI-88C a U373-MAGI-88C. Expresia týchto ko-receptorov na povrchu buniek bola demonštrovaná imunofarbením živých buniek pri použití protilátky anti-FLAG 1*11 a RT-PCR.

Gény BBC a 88-2B použité pre konštrukciu Hela-ľ1AGI-88C a IJ373-I*IAGI-88C zahrnovali sekvencie kódujúce protilátkový signálny peptid nasledované epitopom FLAG (pozri príklad 4). Tento gén bol vložený do retrovírusového vektora pBabe-Puro Cľlorgenstern and Land, Nucleic Acids Research, 18(12): 3587-3596 (1990)). Vektory s vysokým titrom retrovírusu pseudotypované proteínom VSV-G boli zhotovené transientnou transFekciou popísanou v publikácii Barts et al., J. Virol., 70; 2324 až 2331 (1996) a boli použité pre infekciu buniek Hela-MAGI a U373-MAGI. Bunky rezistentné voči 0,6 Lig/ml puromycínu (Hela) alebo 1 ug/ml puromycínu (U373) boli spojené. Každá skupina obsahovala prinajmenšom 1 000 nezávislých transdukčných príhod. Ma vytvorenie buniek Hela-MAGI-88C boli použité skoré pasáže (pasáže 2) zásobnej vzorky pôvodných buniek Hela-MAFI (pozri Kimpton a Emerman, vyššie uvedená citácia).

Infekcia indikátorových bunkových línií použitých HIV bola uskutočnená v 12-Jamkových miskách pri použití desaťnásobného sériového riedenia 300 j_il vírusu za prítomnosti DEAE-Dextran (30 jjg/ml) spôsobom popísaným vo vyššie uvedenej citácii Kimpton a Emerman.

Všetky kmene HIV-1 a SIV_Itiaboli získané od NIH AIDS Reference and Reagent Program. Molekulárne klony primárneho HIV-2₇3is« (Gao et al., Genetic Diversity of Human Immunodeficiency Virus Type 2 s Evidence for Distinct Sequence Subtypes with Differences in Virus Biology, J. Virol.., 68(11): 7433-7477 (1.992)) a SIVcmPbJ1.9 (Dewhurst et al., Sequence, Analysis and Acute Pathogenicity of Molecularly Cloned SIV_sm„,-PBJ14, Náture, 345: 636-640 (1990)) boli získané od B. Hahna (OAB). Všetky ďalšie SIV_mi-,._s izoláty boli získané od Júlie OverbaughoveJ (Univerzita štátu Ulashington, Seattle, USA). Zásobné vzorky klonovaných provírusov boli získané transientnou transfekciou buniek 293. Iné vírusové zásobné vzorky boli získané pasážovaním vírusu v JednoJadrových bunkách periférnej krvi alebo v bunkách CEMx’174 (v prípade zásobných vzoriek SIV) . Zásobné vzorky vírusu boli normalizované pri použití ELISA p24³“'³(Coulter Immunology) alebo p27^oe'^s (Coulter Immunology) pre HIV-1 a HIV-2/SIV, s použitím štandardov poskytovaných výrobcom.

Bunky U373-MAGI—88C a U373—MAGI (kontrolné) boli infikované T-tropickým kmeňom HIV-1 (HIV_LOI) a M-tropickým kmeňom (Ηΐν_γυ_^.) a tiež SIV izolátom, SIV_MAC239, vždy pri použití limitného zriedenia. Infekčnosť bola zmeraná spočítaním modrých buniek a vyjadrená ako počet modrých buniek vztiahnutý na Jamku a Jednotku objemu vírusovej vzorky (tabuľka 2).

Tabuľka 2

Kmeň vírusu' titer v bunkovej línii (ItJ/ml)¹³

	U373-MAGI	IJ373-MAGI-88C
HIV—1\|_οι	< 100	< 100
HIV-lvw-2	< 100	2, 2 xl0^Ä
SIV_mac239	1, 2 x 10³	4 x 10^s

Vírusy získané transfekciou molekulárnych klonov do buniek 239 ItJ — Jednotky infekcie; počet IU na mililiter predstavuje počet modrých buniek na Jamku vynásobený zriedením supernatantu vírusu a normalizovaný na 1 ml konečného objemu

Dva dni po infekcii boli bunky fixované a ofarbené pomocou X-gal po stanovení aktivity a-galaktozidázy. Bunky NAGI pochádzajúce z buniek LI373 boli farbené 120 minút pri 37 °C a bunky 1*1 AGI pochádzajúce: z buniek Hela boli farbené 50 minút pri 37 °C. Farbenie neinfikovaných buniek (pozadie) nikdy neposkytovalo viac ako asi 3 modré bunky v Jamke. Spočítané boli len tmavomodré bunky, pričom syncýcium s niekoľkými Jadrami bolo počítané ako Jediná infikovaná bunka. Titer -infekcie predstavuje počet modrých buniek v Jamke vynásobený zriedením vírusu a normalizovaný na 1 ml. Titer infekcie pre bunky HIV_Yl_,__s v prípade buniek U373-ľlAGI-88C bol 2χ10^ώ. Oproti tomu titru HIV-1|__OI pre rovnaké bunky bol nižší ako 100. Specificita konkrétneho kmeňa HIV pre receptor 88C sa teda zmenila o štyri stupne.

Napriek tomu, že infekcia SIV_M«c239 sa zvýšila pre bunky U373-MAGI-88C na 4xlO^s, úplne Jasne boli infikované aj bunky U373-MAGI (tabuľka 2).

Ďalej bola analyzovaná séria primárnych neklonovaných kmeňov

HIV a klonovaných ľl-tropických kmeňov HIV—1 na svoju schopnosť infikovať indikátorové bunkové línie exprimujúce receptor 88C.

Ako bolo popísané vyššie, bunky Hela-MAGI a Hela-I*1AGI-88C boli infikované limitným zriedením rôznych kmeňov HIV. Dva klonované Π-tropické vírusy, HIV-_JR__CSF a HIV_VIJ__Ľ infikovali bunky Hela-HAGI-SSC, ale nie bunky Hela-HAGI, čo ukazuje, že obidva tieto kmene používajú receptor 88C ako ko-receptor C pozri tabuľka 3, poznámka c) . ý schopnosti týchto dvoch vírusových kmeňov infikovať bunky Hela-HAGI-88C bola však pozorovaná veľká rozdielnosť, 6, 2xlO^s IU/ml, v prípade HIV_yu_₂ a 1, 2x10'* T.U/ml, v prípade HIV_jr__Csf. Infekčnosť vírusovej vzorky (pozri tabuľka 3) Je definovaná ako počet infekčných Jednotiek, vztiahnutý na fyzikálnu časticu C tu reprezentované množstvom vírusového Jadrového proteínu). Okrem toho bolo pozorované, že infekčnosť týchto dvoch klonovaných vírusových kmeňov sa líšila viac ako päťdesiatnásobne u nezávisle pripravených zásobných vírusov.

Variabilita iníekčnosti primárnych virálnych izolátov bola ďalej skúšaná analýzou súboru dvanástich rôznych neklonovaných zásobných vírusov pochádzajúcich z troch rôznych kladov (pozri tabuľka 3). Boli použité tri klady A C primárne izoláty), tri izoláty kladov E a tri ďalšie izoláty kladov B, pochádzajúce z geograficky odlišných oblastí. V prípade použitia všetkých deviatich kmeňov bolo možné primárne kmene HIV detegovať pre bunky Hela-I*IAGI-88C, ale nie pre bunky Hela-HAGI (tabuľka 3). Účinnosť infekcie však kolísala v rozmedzí od piatich infekčných Jednotiek na ng p24^sas do viac ako 100 infekčných Jednotiek na ng p24^3ô!3 (pozri tabuľka 3). Tieto výsledky ukazujú, že absolútna infekčnosť ľl-tropických kmeňov sa značne mení a závisí od kladu. Hypotéza, ktorá môže vysvetliť tento rozpor, môže zahrnovať afinitu slučky V3 každého kmeňa vírusu k 880 po väzbe CD4 (Trkola et al., Náture 384(6605): 184 až 187 (1996); Hu et al.. Náture 384(6605): 179 až 183 (1996)).

T a ti u ľ k ä 3

Kmeň	i vírusu®	Subtyp vírusu C zem pôvodu)¹³	Titer (IlJ/ml) Hela-ľlAGI-88C^c	P2 /\| s 9 (ng/ml)	Infek- čnost^d
HIV-	1Y e—s	B CIJSA)	6, 2 x 10⁵	2 200	281
HIV-	1.J K-CSF	B C USA)	12 000	2 800	4, 2
HIV-	1tHO2O	E (Thajsko)	4 133	93	44
HIV-	1tHo21	E (Thajsko)	4 967	52	96
HIV-	1tHO22	E (Thajsko)	200	15	13
HIV-	1uS66O	B (USA)	2 367	127	19
HIV-	llJOOS 1	A (Uganda)	1 633	71	23
HIV-	1R Ul O O <ϊ>	A (Rwanda)	3 333	158	21
HIV-	Iruiosí·	A (Ruanda)	739	143	5, 2
HIV-	1uS727	B (USA)	14 067	289	49
HIV-	ÍUSO56	B (USA)	5 833	284	21
HIV-	l\|_Cl I	B (Francúzsko)	2, 8 x 10³	167	1 600

·=' Kmene HIV-l_Yl.,__a a HIV-1_JR__CSF boli získané transfekciou molekulárnych, klonov. Všetky ostatné kmene boli skúšané v podobe surových supernatantov ,neklonovaných ‘ vírusových zásobných vzoriek pochádzajúcich z infikovaných heterológnych mononukleárnych buniek periférnej krvi ¹³ Klady sú označované spôsobom navrhnutým pre en v gén v publikácii ľlyers et al., 1995; Krajina pôvodu označuje krajinu, kde sídlil HIV - pozitívny Jednotlivec, ktorému bola odobraná krv pre izoláciu vírusu (Morld Health Organization Viral Isolate Progam)

Hodnota titra v Jednotkách IlJ/ml Je definovaná ako počet modrých buniek vztiahnutý na Jamku vynásobený zriedením supernatantu a normalizovaný na konečný objem 1 ml. Pri skúšaní na bunkách Hela-ľlAGI bez 880 vykázali všetky vírusy, s výnimkou HlV-lum, titer nižší ako 10 IlJ/ml. Kmeň HIV ,_»ι, čo Je T-tropický kmeň, vykázal titer 2, 8 x 10^s v prípade buniek Hela—MAGI s receptorom aj bez receptora 880.

Infekčnosť Je definovaná ako počet infekčných Jednotiek (IU) vztiahnutý na ng P24^3Ä!3 (hodnota uvedená v tretom stĺpci vydelená hodnotou uvedenou v štvrtom stĺpci).

Tiet bola zisťovaná schopnosť buniek Hela-ľlAGI-88C delegovať HIV-2 a iné kmene SIV. Bolo oznámené, že HIý-2_ROtd používa ako receptor fuzín a to aj zá neprítomnosti CD4 (Endres et al., Celí 87(4): 745 až 756 (1996)). Kmeň HIV-2_Rod Je schopný infikovať bunky Hela-MAGI, Jeho infekčnosť v bunkách Hela-I*1AGI_88C Je však zvýšená prinajmenšom desaťkrát (pozri tabuľka 4). Bunky Hela endogénne exprimujú fuzín. Molekulárny kloň HIV-2_Ro<=i Je teda dvojnásobne tropický a Je schopný používať receptor BBC ako Jeden z ko—receptorov, okrem CXCR4. Podobne aj primárny kmeň ΗΙΨ”2₇₃₁2α infikuje bunky Hela—MAGI-88C a nie bunky Hela-MAGI, čo ukazuje, že tak ako primárny kmeň HIV-1 používa ako receptor 88C.

Tabuľka 4
Kmeň vírusu“'	Citácia	Titer (IlJ/inl) Hela-MAGI^b	Titer (IlJ/ml) Hela-MAGI- -88C	Infekčnosť*· na Hela-MAGI 88C_C
HIV-2_Roo9	Guyader et al., 1987	967	5 900	13
HIV-2₇₃₁«	Gao et al., 1994	< 30	6 500	17
SIV_m«_c239	Naidu et al., 1988	< 30	29 900	90
SIV_MtM^cl8	Overbaugh et al., 1991	< 30	15 700	19
SIV_mme170	Rudensey et al., 1995	< 30	19 700	27
SIV_SMPbJ1.9	Deuhurst et al.,	< 30	776	MD·²¹

1990

SIV«_sm9063

1995

Hirsch et al., < 30 ^a Zásobné vzorky HIV-2 a kmene SIV_SMPbJ1.9 a SIV»_sm9063 boli, skúšané priamo potom transfekciou molekulárnych klonov do buniek 293. Všetky ostatné kmene pochádzali z transfekcie molekulárnych klonov a potom boli amplifikované v bunkách CEI*lxl74

Hodnota titra v Jednotkách 10/ml Je definovaná ako počet modrých buniek vztiahnutý na Jamku vynásobený zriedením vírusového supernatantu a normalizovaný na konečný objem 1 ml.

Všetky vírusy v tomto paneli boli, tiež negatívne na

Hela-ľlAGI-88-2B

Infekčnosť Je definovaná ako počet infekčných Jednotiek (IU) C v prípade buniek exprimuJúcich receptor 880 vztiahnuté na ng

P27^3í* ³ podľa stanovenia ELISA

ND = nestanovené ₍ I

Žiadny zo skúšaných kmeňov SIV neinfikoval bunky Hela--NAGI (tabuľka 4) a žiadny neinfikoval bunky Hela-I*IAGI exprimujúce receptor 88-2B. To ukazuje, že alternatívny ko-receptor používaný SIV v bunkách 1.1373 nie Je exprimovaný v bunkách Hela a neide o receptor 88-2B. Všetky skúšané kmene SIV do určitej miery infikovali bunky Hela-I*1AGI-88C (tabuľka 3), čo ukazuje, že všetky skúšané kmene SIV používajú aspoň receptor 88C ako Jeden zo svojich ko-receptorov.

Klasifikácia N-tropických a T-tropických kmeňov HIV bola v minulosti často korelovaná siným označením, totiž neindukujúce syncýcium CNSI) a indukujúce syncýcium (SI). Skúšanie pri použití tu popísaných bunkových línií Je citlivé na tvorbu syncýcia. Infikované bunky môžu vytvárať veľké a malé ohniská infekcie obsahujúce väčší počet Jadier (Kimpton a Emerman, vyššie uvedená citácia).

Experimenty uskutočnené pri použití niekoľkých rôznych kmeňov vírusov a buniek U373-I*IAGI-88C alebo Hela-I*IAGI-88C ukazujú, že označovanie SI/MSI nemá opodstatnenie, keďže všetky kmene vírusov vytvorili syncýcia, ak bol prítomný správny ko-receptor. Tieto experimenty ukazujú, že tvorba syncýcia Je skôr známkou prítomnosti vhodného ko-receptora na infikovanej bunke, ako známkou tropizmu. Infekcia buniek Hela-I*IAGI-88C kmeňmi SIV (ktoré boli v literatúre popísané ako kmene nevytvárajúce syncýcium), predovšetkým kmeňmi SI.V_M«c239, SIVmneCÍS a SIV_Mme170, bola v skutočnosti pozoruhodná, keďže veľkosť syncýcia indukovaného v monovrstve bola oveľa väčšia ako veľkosť indukovaná akýmkoľvek iným kmeňom Hľý.

Príklad

Boli, pripravené myšacie monoklonálne protilátky, ktoré špecificky rozpoznávajú receptor 88C. Tieto protilátky boli vytvorené imunizáciou myší peptidom, ktorý zodpovedá dvadsiatim aminoterminálnym aminokyselinám receptora 88C. Peptid bol konjugovaný ,ku KLH (Keyhole Limpet Cyanin) podľa inštrukcií výrobcu (Pierce, Imject Maleimide Activated KLH) emulgovanému v úplnom Freundovom adjuvans a injekčné podaný piatim myšiam. Dve ďalšie injekcie konjugovaného peptidu adjuvans boli podané v intervaloch 3 v neúplnom Freundovom týždňov. Desať dní po záverečnej injekcii bolo sérum každej z týchto piatich myší skúšané na imunoreaktivitu s vyššie popísaným dvadsaťaminokyselinovým peptidom pomocou skúšky

ELISA. Okrem toho bola imunoreaktivita séra skúšaná vzhľadom na intaktný receptor

88C exprimovaný na povrch buniek 293 pri použití metódy

FACS

Celí Sorting). Myši s najlepšou aktivitou proti 88C boli vybrané pre fúziu slezinných buniek a produkciu monoklonálnych protilátok pri použití štandardných laboratórnych metód. Bolo získaných celkom päť monoklonálnych bunkových línií (227K, 22.7M, 227M, 227P, 227R), ktoré produkovali pr otilátky rozoznávajúce vyššie uvedený peptid pri skúške ELISA a 88C proteín na bunkách 293 pri skúške FACS. Každá protilátka bola reaktívna len s bunkami. 293 exprimujúcimi 88C, ale nie s bunkami 293 exprimujúcimi blízko príbuzný receptor MCP CCCCKR-2). Každá z týchto protilátok tiež rozpoznávala 88C transientne exprimovaný v bunkách COS.

Tiež boli vytvorené králičie polyklonálne protilátky proti

88C. Dvom králikom amínoterminálny peptid ímunizované štyrmi bol injekčné podaný konjugovaný popísaný vyššie. Králiky boli cľalej prídavnými injekciami konjugovaného aminoterminálneho peptidu.

Sérum z každého králika C2337J a

2.407J) bolo skúšané metódou hACS na bunkách 293exprimuJúcich 880.

Tieto séra špecificky rozpoznávali 880 na povrchu buniek 293.

Pät anti-880 monoklonálnych protilátok bolo skúšaných na schopnosť blokovať infekciu buniek vírusom STV (vírus imunodeficiencie ľudoopov), ktorý Je blízko príbuzný vírusu HIV (Lehner et al., Náture Medicíne, 2: 767 (1996)). Bunky ľudoopov 004^1, ktoré sú normálne susceptibilné voči infekcii SIV, boli inkubované s klonom SIV_mac32HJ5 za prítomnosti supernataritov anti-880 monoklonálnej protilátky zriedených v pomere 1:5. Infekcia SIV bola’ meraná pomocou stanovenia aktivity reverznej transkriptázy (RT) deviaty deň pri použití detekcie RT a kvantifikácie pri použití kitu [Juan-T-RT Assay Kit, Amersham, Arlington Heights, ÍL, USA. Štyri protilátky boli schopné blokovať infekciu SIV; protilátka 227K vykazovala blokačnú účinnosť 53 %, protilátka 227M 59 %, protilátka 227N 47 % a protilátka 227P 81 %. Protilátka 227R neblokovala infekciu SIV.

Päť monoklonálnych protilátok vypestovaných proti ľudskému 88C amínoterminálnemu peptidu bolo tiež skúšaných na reaktivitu voči receptoru 88C z makaka CSEQ ID MO:X) (ktorý vykazuje dva aminokyselinové rozdiely v porovnaní s ľudským receptorom 88C v aminoterminálnej peptidovej oblasti). KóduJúce oblasti receptora 88C z človek a makaka (rod Macaca) boli klonované do expresného vektora pcDNA3 (Invitrogen). Tieto expresné plazmidy boli použité pre transfekciu COS pri použití DEAA. Prázdny vektor bol použitý ako negatívna kontrola. Tri dni po transfekcii boli bunky zozbierané a inkubované s piatimi anti-88C monoklonálnymi protilátkami a pripravené pre FACS. Výsledky ukázali, že štyri z piatich protilátok (227K, 227M, 227N a 227P) rozpoznali receptor

88C z opice makak a Jedna (227R) nie. Všetkých päť protilátok rozpoznalo ľudský receptor 888 a žiadna nereagovala skrížené s bunkami transfekovanými samotným vektorom.

Príklad 9

Ma identifikáciu ligandov a modulátorov chemokínových receptorov podľa vynálezu sa môžu použiť aj ďalšie metódy.

V jednej realizácii zahrnuje vynález priame stanovenie ligandov. Detegovatelne označené skúšané zlúčeniny sa exponujú membránovým prípravkom obsahujúcim chemokínové receptory vo funkčnej konformácil. Tak napríklad bunky HEK-293 alebo bunky z tkanivovej kultúry sa transfekujú expresným vehikulom kódujúcim chemokínový receptor. Z transfekovaných buniek exprimujúcich chemokínovy receptor sa potom sa potom exponuje skúšaným značeným rádioizotopom Jódu podmienkach (napríklad 10 naviazanými skúšanými zlúčen vyrobí, membránový prípravok, ktorý zlúčeninám (napríklad chemokínom) ^12SI a inkubuje ' sa pri vhodných minút pri. 37 °C) . Membrány s nami sa potom zhromaždia na filtri pomocou vákuovej filtrácie a premytím sa zbavia skúšanej zlúčeniny. Rádioaktivita spojená s naviazanou skúšanou zlúčeninou sa potom kvantifikuje tak, že sa filtre podrobia kvapalinovej scintilačnej spektrofotometrii. Specificitu väzby skúšanej zlúčeniny Je možné potvrdiť tak, že sa stanovenie opakuje za prítomnosti rastúcich množstiev neznačenej skúšanej zlúčeniny a zaznamenáva sa úroveň súťaže o väzbu k receptoru. Pomocou týchto väzbových stanovení Je možné tiež identifikovať modulátory väzby chemokínu k receptoru. Vyššie popísané väzbové stanovenie sa môže uskutočňovať s nasledujúcimi modifikáciami. Okrem detegovatelne značenej skúšanej zlúčeniny sa membránovému prípravku exponuje potenciálny modulátor. Zvýšenie koncentrácie značiaceho činidla asociovaného k membráne ukazuje, že potenciálny modulátor Je aktivátorom a zníženie koncentrácie značiaceho činidla asociovaného k membráne. ukazuje väzby chemokínu k receptoru.

že modulátor Je inhibítorom ŕ

pre

Podlá inej realizácie vynález zafír n u. J e n e priam e stanovenia identifikáciu recepturových využívajú k o p u 1 á c i e c h em okí n o v ý c h r e c e: p t; o r o v ku G proteínom.

Ako Je to uvedené v prehľade publikovanom v Linder et al., Sci.

Am., 267:

až 65 (1992) počas t r a n s d u k c i e s i g n á 1 u i n t e r a g u, j e:

aktivovaný receptor s G proteínom a tým dochádza k aktivácii G proteínu.

protein

Je aktivovaný výmenou

GDP za GTP. K deaktivácii proteínu dochádza nasleduj úcou hydrolýzou proteínu aktivity G monitoruje uvoľňovanie ^3S-P z [ gama-^3:2P]-GTP

Stanovenie

Je možné napríklad uskutočňovať takto: 5xlO^x buniek HEK-293 nesúcich plazmid podľa vynálezu sa . Rastové médium sa doplní 5 mCi/ml pôsobiť počas hodín aby došlo k rovnomernému značeniu n u k 1 e: o t i d o v ý c h skupín. Bunky sa premyjú izotonickým pufrom nízkym obsahom fosforečnanu. Jeden alikvotný diel premytých buniek sa exponuje skúšanej zlúčenine zatial čo druhý alikvot buniek sa spracuje podobne, ale bez expozície skúšanej zlúčenine

Po inkubačnej perióde (napríklad 10 minút) sa bunky peletizujú podrobia sa lýze a nukleotldové zlúčeniny sa ťrakcionizujú použitím c fi r o mat o g r a f i e vrstve s vyvíjaním 11*1 chloridom lítnym.

GDP sa identifikuje súčasným vyvíjaním známych

Značený GTP a GDP sa potom kvanitiťikuje a u t o r á d i o g r a f i c kými technikami ktoré sú známe v tomto obore.

Relatívne vysoké koncentrácie identifikujú skúšané zlúčeniny ako Ugandy.

Tento typ stanovenia s hydrolýzou

GTP sa tiež môže použiť na identifikáciu modulátorov väzby chemokínu k receptoru. Vyššie uvedené stanovenie sa uskutočňuje za prítomnosti potenciálneho modulátora. Intenzívnejší signál ktorý Je dôsledkom relatívneho zvýšenia hydrolýzy GTP produkujúce ^3S:P-značený GDP, ukazuje relatívne zvýšenie aktivity receptora.

Intenzívnejší signál teda identifikuje potenciálny modulátor ako aktivátor. Naopak, znížený relatívny signál ³²P-značeného GDP ukazujúci na nižšiu aktivitu receptora, identifikuje potenciálny modulátor ako inhibítor väzby chemokínu k receptoru.

Stanovovať Je tiež možné aktivity efektorových molekúl G proteínu (napríklad adenylyl. cyklázy, fosfolipázy C, iónových kanálov a fosfodiesteráz). Skúšanie aktivít týchto efektorových molekúl bolo už predtým popísané. Tak napríklad adenylyl. cykláza, ktorá katalyzuje syntézu cyklického adenozínmonofosfátu (cANP), Je aktivovaná G proteínmi. Ligand viažúci sa k chemokínovému receptoru, ktorý aktivuje G proteín, čo má za následok aktiváciu adenylyl cyklázy, Je možné delegovať monitorovaním hladiny cAľlP v rekombinantných hostiteľských bunkách podľa vynálezu. Pri použití, vhodných kontrolných mechanizmov, čo Je v tomto obore samozrejmé, Je možné zvýšenú úroveň intracelulárneho c.AI*IP pripísať zvýšeniu aktivity receptora, ktoré Je indukované ligandom a tak Je: ligand identifikovaný. Opäť pri použití kontrolných mechanizmov, ktoré sú tomto obore zrejmé, relatívne: zníženie: koncentrácie cAľlP nepriamo identifikuje inhibítor aktivity receptora. Koncentráciu cAI*IP Je možné merať obchodne: dostupnou enzýmovou imunoeseJou. Tak napríklad súprava BioTrak Kit (Amersham, nc., Arlington Heights, TL, USA) obsahuje reakčné činidlá pre: kompetitívnu imunoeseJ. Keď sa tento kit použije: podľa doporučenia výrobcu, usporiada sa reakcia zahrnujúca konkurenciu neznačeného cANP s cANP konjugovaným ku chrenovej peroxidáze. Neznačený cANP Je napríklad možné získať z aktivovaných buniek exprimujúcich chemokínové receptory podľa vynálezu. Tieto dva zlúčeniny súťažia o väzbu k imobilizovanej anti-cANP protilátke. Po konkurenčnej reakcii sa imobilizovaný konjugát chrenová peroxidáza-cANP kvantif ikuje stanovením enzýmu pri použití substrátu tetrametylbenzidín/peroxid vodíka (Jednonádobový substrát), pričom detekcia farebných reakčných produktov sa uskutočňuje pri 450 nm. Výsledky predstavujú základ pre výpočet úrovne neznačeného cANP pri použití techník, ktoré sú v tomto obore známe. Okrem identifikácie llgandov viažúcich sa k chemokínovým receptorom sa stanovenie cANP môže tiež použiť pri identifikácii modulátorov väzby chemokínu k receptoru. Pri použití rekombinantných hostiteľských buniek podlá vynálezu sa stanovenia uskutočňujú vyššie popísaným spôsobom.

pričom sa však pridá potenciálny modulátor aktivity chemokínového receptora. Pri použití kontrolných mechanizmov, ktoré sú v tomto obore samozrejmé, odráža relatívne zvýšenie alebo zníženie hladiny intracelulárneho cAMP aktiváciu alebo inhibíciu aktivity adenylyl cyklázy. Úroveň aktivity adenylyl cyklázy potom odráža relatívnu aktivitu chemokínového receptora, ktorý Je predmetom záujmu. Relatívne zvýšená hladina aktivita chemokínového receptora identifikuje skúšanú zlúčeninu ako aktivátor a relatívne znížená hladina aktivity chemokínového receptora identifikuje potenciálny modulátor ako inhibítor aktivity chemokínového receptora.

Vynález bol podrobne popísaný na svojich špecifických realizáciách. Je však zrejmé, že do Jeho rozsahu patria aj všetky obmeny a modifikácie, ktoré sú zrejmé odborníkom v tomto obore, pre rozsah ochrany sú rozhodujúce pripojené patentové nároky.

ZOZNAM SEKVENCII

Cl) VŠEOBECNÉ INFORMÁCIE:

C i) PRIHLASOVATEĽ: ICOS Corporation
	22021 20th Avenue, S.E., Bothell, WA 98021, U . S . A .
C ii)	NÁZOV	VYNÁLEZU:	Chemokínové receptory 88-2B CCKR
			a SSC a ich protilátky
C iii)	POČET	SEKVENCII	n 20
Civ)	ADRES	A PRE KÔRE	iŠPONDENCIU:
	C A)	ADRESÁT:	Cermák-Hočejš-Vrba, Advokátna
		•	patentová kancelár
	CB)	ULICA:	Národní 32,
	CC)	MESTO =	110 00 Praha 1,
	CD)	ZEM:	Česká republika
	CE)	TELEFAX:	C 004202) 24 214 187

C v) STROJOVO ČITATEĽNÁ FORMA:

C A) TYP MÉDIA: Floppy disk

C B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilný

CC) OPERAČNÝ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS

CD) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Verzia #1.30

C vi) DÁTA O SÚČASNEJ PRIHLÁŠKE:

C A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY: PV 2610-97

C B) DÁTOM PODANIA: 15.8.1997

CC) ZATRIEDENIE:

C vili) INFORMÁCIE O ZÁSTUPCOVÍ:

C A)	MENO: GOWSHALL, Jori V.
CB)	ADRESA: Forrester Ketley & Co.
CC)	ULICA: 52 Bounds Green Road
CD)	MESTO: Londýn
CE)	KRAJINA: Velká Británia
CF)	PSČ CZIP): Nll 2EY

Cix) TELEKOMUNIKAČNÉ INFORMÁCIE:

C A)	TELEFÓN: C0181) 889 6622
CB)	TELEFAX: C 0181) 881 1088
C 2) INFORMÁCIE	0 SEQ ID N0:l:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 3383 bázových párov

C B) TYP: nukleová kyselina

CC) TYP REŤAZCA: Jednoduchý

CD) TOPOLÓGIA: lineárna

Cii) TYP MOLEKULY: cDMA · .

Cix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

C A) MENO/KLÚČ: CDS

C B) UMIESTENIE: 55..1110

Cix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK·.

C A) MENO/KLÚČ: misc_feature

C B) INÉ INFORMÁCIE: /= polynukleotidová a aminokyselinová sekvencia 88C

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEO ID N0:l:

AGAAGAGCTG AGACATCCGT TCCCCTACAA GAAACTCTCC CCGGGTGGAA CAAG ATG

Mat

;at tat

CAA GTG

TCA Ser

AGT CCA

ATC íle

TAT Tyr 10

GAC Asp

ATC íle

AAT TAT TAT

ACA Thr

TCG Ser

105

\Sp

Tyr

Gin

Val 5

Ser

Pro

Asn Tyr

Tyr 15

3AG

CCC

TGC

CAA

AAA

ATC

AAT

GTG

AAG

CAA

ATC

GCA

GCC

CGC

CTC

CTG

153

31u

Pro

Cys

Gin

Lys

íle

Asn

Val

Lys

Gin

íle

Ala

Arg

Leu

20

25

30

ľCT

CCG

CTC

TAC

TCA

CTG

GTG

TTC

ATC

TTT

GGT

TTT

GTG

GGC

AAC

ATG

201

’ro

Pro

Leu

Tyr

Ser

Leu

Val

Phe

íle

Phe

Gly

Phe

Val

Gly

Asn

Met

35

40

45

:tg

GTC

ATC

CTC

ATC

CTG

ATA

AAC

TGC

AAA

AGG

CTG

AAG

AGC

ATG

ACT

249

□eu

Val

íle

Leu

íle

Leu

íle

Asn

Cys

Lys

Arg

Leu

Lys

Ser

Met

Thr

5Ό

55

60

65

3AC

ATC

TAC

CTG

CTC

AAC

CTG

GCC

ATC

TCT

GAC

CTG

TTT

TTC

CTT

2 97

ksp

íle

Tyr

Leu

Asn

Leu

Ala

íle

Ser

Asp

Leu

Phe

Leu

70

75

80

\CT

GTC

CCC

TTC

TGG

GCT

CAC

TAT

GCT

GCC

CAG

TGG

GAC

TTT

GGA

345

•ľhr

Val

Pro

Phe

Trp

Ala

His

Tyr

Ala

Gin

Trp

Asp

Phe

Gly

85

90

95

\AT

ACA

ATG

TGT

CAA

CTC

TTG

ACA

GGG

CTC

TAT

TTT

ATA

GGC

TTC

393

Xsn

Thr

Met

Cys

Gin

Leu

Thr

Gly

Leu

Tyr

Phe

íle

Gly

Phe

100

•

105

110

ľCT

GGA

ATC

TTC

ATC

CTC

CTG

ACA

ATC

GAT

AGG

TAC

CTG

GCT

441

Ser

Gly

íle

Phe

íle

Leu

Thr

íle

Asp

Arg

Tyr

Leu

Ala

115

120

125

3TC

GTC

CAT

GCT

GTG

TTT

GCT

TTA

AAA

GCC

AGG

ACG

GTC

ACC

TTT

GGG

489

/al

Val

His

Ala

Val

Phe

Ala

Leu

Lys

Ala

Arg

Thr

Val.

Thr

Phe

Gly

30

135

140

145

:-tg

GTG

ACA

AGT

GTG

ATC

ACT

TGG

GTG

GCT

GTG

TTT

GCG

TCT

CTC

537

/al

Val

Thr

Ser

Val

íle

Thr

Trp

Val

Ala

Val

Phe

Ala

Ser

Leu

150

155

160

:ca

GGA

ATC

TTT

ACC

AGA

TCT

CAA

AAA

GAA

GGT

CTT

CAT

TAC

ACC

585

?ro

Gly

íle

Phe

Thr

Arg

Ser

Gin

Lys

Glu

Gly

Leu

His

Tyr

Thr

165

170

175

TGC

AGC

TCT

CAT

TTT

CCA

TAC

AGT

CAG

TAT

CAA

TTC

TGG

AAG

AAT

TTC

633

Gys

Ser

His

Phe

Pro

Tyr

Ser

Gin

Tyr

Gin

Phe

Trp

Lys

Asn

Phe

180

185

190

GAG

ACA

TTA

AAG

ATA

GTC

ATC

TTG

GGG

CTG

GTC

CTG

CCG

CTG

CTT

GTC

681

Gin

Thr

Leu

Lys

íle

Val

íle

Leu

Gly

Leu

Val

Leu

Pro

Leu

Val

195

200

205

ATG

GTC

ATC

TGC

TAC

TCG

GGA

ATC

CTA

AAA

ACT

CTG

CTT

CGG

TGT

CGA

729

Met

Val

íle

Cys

Tyr

Ser

Gly

íle

Leu

Lys

Thr

Leu

Arg

Cys

Arg

210

215

220

225

.AAT

GAG

AAG

AGG

CAC

AGG

GCT

GTG

AGG

CTT

ATC

TTC

ACC

ATC

ATG

777

.Asn

Glu

Lys

Arg

His

Arg

Ala

Val

Arg

Leu

íle

Phe

Thr

íle

Met

230

235

240

le Val Tyr Phe Leu Phe Trp Ala Pro Tyr Asn íle Val Leu Leu Leu

245 250255

AC ACC TTC CAG GAA TTC TTT GGC CTG AAT AAT TGC AGT AGC TCT AAC8 73 sn Thr Phe Gin Glu Phe Phe Gly Leu Asn Asn Cys Ser Ser SerAsn

260 265270

GG TTG GAC CAA GCT ATG CAG GTG ACA GAG ACT CTT GGG ATG ACG CAC921 rg Leu Asp Gin Ala Met Gin Val Thr Glu Thr Leu Gly Met ThrHis

275 280285

GC TGC ATC AAC CCC ATC ATC TAT GCC TTT GTC GGG GAG AAG TTC AGA96 9 ys Cys íle Asn Pro íle íle Tyr Ala Phe Val Gly Glu Lys PheArg

295 300305

AČ TAC CTC TTA GTC TTC TTC CAA AAG CAC ATT GCC AAA CGC TTC TGC1017 sn Tyr Leu Leu Val Phe Phe Gin Lys His íle Ala Lys Arg PheCys

310 315320

AA TGC TGT TCT ATT TTC CAG CAA GAG GCT CCC GAG CGA GCA AGC TCA106 5 ys Cys Cys Ser íle Phe Gin Gin Glu Ala Pro Glu Arg Ala SerSer

325 330335

TT TAC ACC CGA TCC ACT GGG GAG CAG GAA ATA TCT GTG GGC TTG1110 al Tyr Thr Arg Ser Thr Gly Glu Gin Glu íle Ser Val Gly Leu

340 345350

GACACGGAC TCAAGTGGGC TGGTGACCCA GTCAGAGTTG TGCACATGGC TTAGTTTTCA1170

ACACAGCCT GGGCTGGGGG TGGGGTGGGA GAGGTCTTTT TTAAAAGGAA GTTACTGTTA123 0 ’AGAGGGTCT AAGATTCATC CATTTATTTG GCATCTGTTT AAAGTAGATT AGATCTTTTA12 90 .GCCCATCAA TTATAGAAAG CCAAATCAAA ATATGTTGAT GAAAAATAGC AACCTTTTTA135 0 ’CTCCCCTTC ACATGCATCA AGTTATTGAC AAACTCTCCC TTCACTCCGA AAGTTCCTTA1410 ’GTATATTTA AAAGAAAGCC TCAGAGAATT GCTGATTCTT GAGTTTAGTG ATCTGAACAG1470

AAT ACC AAA ATTATTTCAG AAATGTACAA CTTTTTACCT AGTACAAGGC AACATATAGG153 0 «

'TGTAAATGT GTTTAAAACA GGTCTTTGTC TTGCTATGGG GAGAAAAGAC ATGAATATGA1590 ’TAGTAAAGA AATGACACTT TTCATGTGTG ATTTCCCCTC CAAGGTATGG TTAATAAGTT1650

CACTGACTT AGAACCAGGC GAGAGACTTG TGGCCTGGGA GAGCTGGGGA AGCTTCTTAA1710 ľTGAGAAGGA ATTTGAGTTG GATCATCTAT TGCTGGCAAA GACAGAAGCC TCACTGCAAG1770

ACTGCATGG GCAAGCTTGG CTGTAGAAGG AGACAGAGCT GGTTGGGAAG ACATGGGGAG1830

ÍAAGGACAAG GCTAGATCAT GAAGAACCTT GACGGCATTG CTCCGTCTAA GTCATGAGCT18 90

LAGCAGGGAG ATCCTGGTTG GTGTTGCAGA AGGTTTACTC TGTGGCCAAA GGAGGGTCAG1950

1AAGGATGAG CATTTAGGGC AAGGAGACCA CCAACAGCCC TCAGGTCAGG GTGAGGATGG2010 ľCTCTGCTAA GCTCAAGGCG TGAGGATGGG AAGGAGGGAG GTATTCGTAA GGATGGGAAG207 0

SAGGGAGGTA TTCGTGCAGC ATATGAGGAT GCAGAGTCAG CAGAACTGGG GTGGATTTGG213 0

7TTGGAAGTG AGGGTCAGAG AGGAGTCAGA GAGAATCCCT AGTCTTCAAG CAGATTGGAG2190

TGGATTGGT	GTAAAAGGAT	GGGTCTGGTT	TGCAGAGCTT	GAACACAGTC	TCACCCAGAC	2310
CCAGGCTGT	CTTTCACTGA	ATGCTTCTGA	CTTCATAGAT	TTCCTTCCCA	TCCCAGCTGA	2370
ATACTGAGG	GGTCTCCAGG	AGGAGACTAG	ATTTATGAAT	ACACGAGGTA	TGAGGTCTAG	2430
AACATACTT	CAGCTCACAC	ATGAGATCTA	GGTGAGGATT	GATTACCTAG	TAGTCATTTC	2490
TGGGŤTGTT	GGGAGGATTC	TATGAGGCAA	CCACAGGCAG	CATTTAGCAC	ATACTACACA	2550
TCAATAAGC	ATCAAACTCT	TAGTTACTCA	TTCAGGGATA	GCACTGAGCA	AAGCATTGAG	2610
AAAGGGGTC	CCATATAGGT	GAGGGAAGCC	TGAAAAACTA	AGATGCTGCC	TGCCCAGTGC	2670
CACAAGTGT	AGGTATCATT	TTCTGCATTT	AACCGTCAAT	AGGCAAAGGG	GGGAAGGGAC	2730
TATTCATTT	GGAAATAAGC	TGCCTTGAGC	CTTAAAACCC	ACAAAAGTAC	AATTTACCAG	2790
CTCCGTATT	TCAGACTGAA	TGGGGGTGGG	GGGGGCGCCT	TAGGTACTTA	TTCCAGATGC	2850
TTCTCCAGA	CAAACCAGAA	GCAACAGAAA	AAATCGTCTC	TCCCTCCCTT	TGAAATGAAT	2910
TACCCCTTA	GTGTTTGGGT	ATATTCATTT	CAAAGGGAGA	GAGAGAGGTT	TTTTTCTGTT	2970
TTTCTCATA	TGATTGTGCA	CATACTTGAG	ACTGTTTTGA	ATTTGGGGGA	TGGCTAAAAC	3030
ATCATAGTA	CAGGTAAGGT	GAGGGAATAG	TAAGTGGTGA	GAACTACTCA	GGGAATGAAG	3090
TGTCAGAAT	AATAAGAGGT	GCTACTGACT	TTCTCAGCCT	CTGAATATGA	ACGGTGAGČA	3150
’TGTGGCTGT	CAGCAGGAAG	CAACGAAGGG	AAATGTCTTT	CCTTTTGCTC	TTAAGTTGTG	3210
:agagtgcaa	CAGTAGCATA	GGACCCTACC	CTCTGGGCCA	AGTCAAAGAC	ATTCTGACAT	3270
.'TTAGTATTT	GCATATTCTT	ATGTATGTGA	AAGTTACAAA	TTGCTTGAAA	GAAAATATGC	3330
.TCTAATAAA	AAACACCTTC	TAAAATAAAA	ΑΆΑΑΑΑΑΑΑΑ	ΑΑΑΑΑΑΆΆΆΑ	AAA	3383

2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:2:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 352 aminokyselín

C B) TYP: aminokyselina

CD) TOPOLÓGIA: lineárna

Cii) TYP MOLEKULY: proteín

Cix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) MENO/KLÚČ: misc_feature

C B) INÉ INFORMÁCIE: /= aminokyselinová sekvencia 88C

Cxi)

POPIS SEKVENCIE:

SEQ

ID

NO: 2

!et

Asp

Tyr

Gin

Val

Ser

Pro

íle

Tyr

Asp

íle

Asn

Tyr

Thr

1

5

10

15

jer

Glu

Pro

Cys

Gin

Lys

íle

Asn

Val

Lys

Gin

íle

Ala

Arg

Leu

20

25

30

j°U

Pro

Leu

Tyr

Ser

Leu

Val

Phe

íle

Phe

Gly

Phe

Val

Gly

Asn

35

40

45

55 60

'hr 65

Asp

íle

Tyr Leu

Leu 70

Asn

Leu Ala

íle

Ser 75

Asp

Leu

Phe

Leu 80

,eu

Thr

Val

Pro

Phe

Trp

Ala

His

Tyr

Ala

Gin

Trp

Asp

Phe

85

90

95

’iy

Asn

Thr

Met

Cys

Gin

Leu

Thr

Gly

Leu

Tyr

Phe

íle

Gly

Phe

100

105

110

’he

Ser

Gly

íle

Phe

íle

Leu

Thr

íle

Asp

Arg

Tyr

Leu

115

120

125

í.l*a

Val

His

Ala

Val

Phe

Ala

Leu

Lys

Ala

Arg

Thr

Val

Thr

Phe

130

135

140

íly

Val

Thr

Ser

Val

íle

Thr

Trp

Val

Ala

Val

Phe

Ala

Ser

.45

150

155

160

ľeu

Pro

Gly

íle

Phe

Thr

Arg

Ser

Gin

Lys

Glu

Gly

Leu

His

Tyr

165

170

175

ľhr

Cys

Ser

His

Phe

Pro

Tyr

Ser

Gin

Tyr

Gin

Phe

Trp

Lys

Asn

180

185

190

’he

Gin

Thr

Leu

Lys

íle

Val

íle

Leu

Gly

Leu

Val

Leu

Pro

Leu

195

200

205

Zal

Met

Val

íle

Cys

Tyr

Ser

Gly

íle

Leu

Lys

Thr

Leu

Leú

Arg

Cys

210

215

220

^rg

Asn

Glu

Lys

Arg

His

Arg

Ala

Val

Arg

Leu

íle

Phe

Thr

íle

’25

230

235

240

-let

íle

Val

Tyr

Phe

Leu

Phe

Trp

Ala

Pro

Tyr

Asn

íle

Val

Leu

245

250

-

255

jSu

Asn

Thr

Phe

Gin

Glu

Phe

Gly

Leu

Asn

Cys

Ser

260

265

270

λ s n

Arg

Leu

Asp

Gin

Ala

Met

Gin

Val

Thr

Glu

Thr

Leu

Gly

Met

Thr

275

280

285

lis

Cys

íle

Asn

Pro

íle

Tyr

Ala

Phe

Val

Gly

Glu

Lys

Phe

290

295

300

Xrg

Asn

Tyr

Leu

Val

Phe

Gin

Lys

His

íle

Ala

Lys

Arg

Phe

305

310

315

320

ľys

Lys

Cys

Ser

íle

Phe

Gin

Glu

Ala

Pro

Glu

Arg

Ala

Ser

325

330

335

Ser

Val

Tyr

Thr

Arg

Ser

Thr

Gly

Glu

Gin

Glu

íle

Ser

Val

Gly

Leu

340

345

350

2) INFORMÁCIE O SEQ ID N0;3 = (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE;

C A) DĹŽKA; 1915 bazových párov

C B) TYP; nukleová kyselina

CC) TYP REŤAZCA: Jednoduchý (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

C A) MENO/KLÚČ: CDS

C B) UMIESTENIE: 362..1.426 (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) MENO/KLÚČ: misc_feature

C B) INÉ INFORMÁCIE: /=''polynukleotidová a aminokyseline) vá sekvencia 88-2B

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEO ID MO:3:

.TAATAATGA	TTATTATATT	GTTATCATTA	TCTAGCCTGT	TTTTTCCTGT	TTTGTATTTC	60
TCCTTTAAA	TGCTTTCAGA	AATCTGTATC	CCCATTCTTC	ACCACCACCC	CACAACATTT	120
T-GCTTCTTT	TCCCATGCCG	GGTCATGCTA	ACTTTGAAAG	CTTCAGCTCT	TTCCTTCCTC	180
ATCCTTTTC	CTGGCACCTC	TGATATGCCT	TTTGAAATTC	ATGTTAAAGA	ATCCCTAGGC	240
GCTATCACA	TGTGGCATCT	TTGTTGAGŤA	CATGAATAAA	TCAACTGGTG	TGTTTTACGA	300
.GGATGATTA	TGCTTCATTG	TGGGATTGTA	TTTTTCTTCT	TCTATCACAG	GGAGAAGTGA	360

406

ATG ACA ACC TCA CTA GAT ACA GTT GAG ACC TTT GGT ACC ACA TCC

Met Thr Thr Ser Leu Asp Thr Val Glu Thr Phe Gly Thr Thr Ser 15 10 15

’AC ’yr

TAT GAT

GAC Asp

GTG GGC

CTG CTC TGŤ GAA

AAA Lys

GCT GAT ACC AGA

GCA Ala

454

Tyr

Asp

Val 20

Gly

Leu

Cys

Glu 25

Ala

Asp

Thr

Arg 30

:tg

ATG

GCC

CAG

TTT

GTG

CCC

CCG

CTG

TAC

TCC

CTG

GTG

TTC

ACT

GTG

502

.eu

Met

Ala

Gin

Phe

Val

Pro

Leu

Tyr

Ser

Leu

Val

Phe

Thr

Val

35

40

45

;gc

CTC

TTG

GGC

AAT

GTG

ATG

ATC

CTC

ATA'

AAA

TAC

AGG

550

':1y

Leu

dy

Asn

Val

Met

íle

Leu

íle

Lys

Tyr Arg

t

50

55

60

.GG

CTC

CGA

ATT

ATG

ACC

AAC

ATC

TAC

CTG

CTC

AAC

CTG

GCC

ATT

TCG

598

Leu

Arg

íle

Met

Thr

Asn

íle

Tyr

Leu

Asn

Leu

Ala

íle

Ser

65

70

75

!AC

CTG

CTC

TTC

CTC

GTC

ACC

ČTT

CCA

TTC

TGG

ATC

CAC

TAT

GTC

AGG

646

>.sp

Leu

Phe

Leu

Val

Thr

Leu

Pro

Phe

Trp

íle

His

Tyr

Val

Arg

80

85

90

95

•GG

CAT

AAC

TGG

GTT

TTT

GGC

CAT

GGC

ATG

TGT

AAG

CTC

TCA

GGG

694

)ly

His

Asn

Trp

Val

Phe

Gly

His

Gly

Met

Cys

Lys

Leu

Ser

Gly

100

105

110

ľTT

TAT

CAC

ACA

GGC

TTG

TAC

AGC

GAG

ATC

TTT

TTC

ATA

ATC

CTG

742

>he

Tyr

His

Thr

Gly

Leu

Tyr

Ser

Glu

íle

Phe

íle

Leu

115

120

125

íCA

ATC

GAC

AGG

TAC

CTG

GCC

ATT

GTC

CAT

GCT

GTG

TTT

GCC

CTT

CGA

7 9 J

ľhr

íle

Asp

Arg

Tyr

Leu

Ala

íle

Val

His

Ala

Val

Phe

Ala

Leu

Arg

130

135

140

3CC

CGG

ACT

GTC

ACT

TTT

GGT

GTC

ATC

ACC

AGC

ATC

GTC

ACC

TGG

GGC

83 í

-.la

Arg

Thr

Val

Thr

Phe

Gly

Val

íle

Thr

Ser

íle

Val

Thr

TrD

Glv

TG

GCA

GTG

CTA

GCA

GCT

CTT

CCT

GAA

TTT

ATC

TTC

TAT

GAG ACT

GAA

88 6

eu

Ala

Val

Leu

Ala

Leu

Pro

Glu

Phe

íle

Phe

Tyr

Glu Thr

Glu

60

165

170

175

AG

TTG

TTT

GAA

GAG

ACT

CTT

TGC

AGT

GCT

CTT

TAC

CCA

GAG GAT

ACA

934

lu

Leu

Phe

Glu

Thr

Leu

Cys

Ser

Ala

Leu

Tyr

Pro

Glu Asp

Thr

180

185

190

TA

TAT

AGC

TGG

AGG

CAT

TTC

CAC

ACT

CTG

AGA

ATG

ACC

ATC TTC

TGT

982

al

Tyr

Ser

Trp

Arg

His

Phe

His

Thr

Leu

Arg

Met

Thr

íle Phe

Cys

195

200

205

TC

GTT

CTC

CCT

CTG

CTC

GTT

ATG

GCC

ATC

TGC

TAC

ACA

GGA ATC

ATC

1030

eu

Val

Leu

Pro

Leu

Val

Met

Ala

íle

Cys

Tyr

Thr

Gly íle

íle

210

215

220

ÁA

ACG

CTG

AGG

TGC

CCC

AGT

AAA

AAG

TAC

AAG

GCC ATC

CGG

1078

ys

Thr

Leu

Arg

Cys

Pro

Ser

Lys

Tyr

Lys

Ala íle

Arg

225

230

235

TC

ATT

TTT

GTC

ATC

ATG

GCG

GTG

TTT

TTC

ATT

TTC

TGG

ACA CCC

TAC

1126

eu

íle

Phe

Val

íle

Met

Ala

Val

Phe

íle

Phe

Trp

Thr Pro

Tyr

40

245

250

255

AT

GTG

GCT

ATC

CTT

CTC

TCT

TCC

TAT

CAA

TCC

ATC

TTA

TTT GGA

AAT

1174

sn

Val

Ala

íle

Leu

Ser

Tyr

Gin

Ser

íle

Leu

Phe Gly

Asn

260

265

270

i

•AC

TGT

GAG

CGG

AGC

AAG

CAT

CTG

GAC

CTG

GTC

ATG

CTG

GTG'ACA

GAG

. 1222

.sp

Cys

Glu

Arg

Ser

Lys

His

Leu

Asp

Leu

Val

Met

Leu

Val Thr

Glu

275

280

285

•TG

ATC

GCC

TAC

TCC

CAC

TGC

ATG

AAC

CCG

GTG

ATC

TAC GCC

TTT

1270

al

íle

Ala

Tyr

Ser

His

Cys

Met

Asn

Pro

Val

íle

Tyr Ala

Phe

290

295

300

TT

GGA

GAG

AGG

TTC

CGG

AAG

TAC

CTG

CGC

CAC

TTC

CAC AGG

CAC

1318

al

Gly

Glu

Arg

Phe

Arg

Lys

Tyr

Leu

Arg

His

Phe

His Arg

His

•

305

310

315

TG

CTC

ATG

CAC

CTG

GGC

AGA

TAC

ATC

CCA

TTC

CTT

CCT

AGT GAG

AAG

1366

.éu

Leu

Met

His

Leu

Gly

Arg

Tyr

íle

Pro

Phe

Leu

Pro

Ser Glu

Lys

20

325

330

335

.'TG

GAA

AGA

ACC

AGC

TCT

GTC

TCT

CCA

TCC

ACA

GCA

GAG

CCG GAA

CTC

1414

.eu

Glu

Arg

Thr

Ser

Val

Ser

Pro

Ser

Thr

Ala

Glu

Pro Glu

Leu

340

345

350

’CT ATT GTG TTT TAGGTCAGAT GCAGAAAATT GCCTAAAGAG GAAGGACCAA 14 6 6 !er íle Val Phe

355

JGAGATGAAG CAAACACATT AAGCCTTCCA ľCAGTGCAAC ACTGAAGCTC TTGAAGACAC iCATGTACCC TAAGGTCATT ACCACAGGCC ľTAAAAAGCA GAGCTTTGCT TCTCTCTCTA --ATGTTAGAT AGTTACTATA TGCCGCTACA

CACTCACCTC TAAAACAGTC CTTCAAACTT152

TGAAATATAC ACACAGCAGT AGCAGTAGAT158

AGGGGCTGGG CAGCGTACTC ATCATCAACC164

AAATGAGTTA CCTACATTTT AATGCACCTG17C

AAAAGGTAAA ACTTTTTATA TTTTATACAT176 ’TTTATTTTC TAATGTGCCT AGTTCTTTCC CTGCTTAATG AAAAGCTTGT TTTTTCAGTG

GAATAAATA ATCGTAAGCA ACAAAAAAA

2) INFORMÁCIE O SED ID NO-.4 = (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 355 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina

CD) TOPOLÓGIA: lineárna

Cii) TYP MOLEKULY: proteín

Cix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

C A) MENO/KLÚČ: misc_feature

C B) INÉ INFORMÁCIE: /= aminokyselinová sekvencia

88-2B (xi) POPIS SEKVENCIE: SEO ID MO:4:

1886

1915

íet 1

Thr

Thr Ser Leu Asp Thr Val Glu Thr Phe Gly Thr Thr

Ser 15

Tyr

5

10

'yr

Asp

Val

Gly

Leu

Cys

Glu

Lys

Ala

Asp

Thr

Arg

Ala

Leu

20

25

30

!et

Ala

Gin

Phe

Val

Pro

Leu

Tyr

Ser

Leu

Val

Phe

Thr

Val

Gly

35

40

45

,eu

Leu

Gly

Asn

Val

Val .Val

Met

íle

Leu

íle, Lys

Tyr

Arg Arg

50

55

60

j£U

Arg

íle

Met

Thr

Asn

íle

Tyr

Leu

Asn

Leu

Ala

íle

Ser

Asp

65

70

75

80

,eu

Leu

Phe

Leu

Val

Thr

Leu

Pro

Phe

Trp

íle

His

Tyr

Val

Arg

Gly

85

90

95

lis

Asn

Trp

Val

Phe

Gly

His

Gly

Met

Cys

Lys

Leu

Ser

Gly

Phe

•

100

105

110

ľyr

His

Thr

Gly

Leu

Tyr

Ser

Glu

íle

Phe

íle

Leu

Thr

«·

115

120

125

: le

Asp

Arg

Tyr

Leu

Ala

íle

Val

His

Ala

Val

Phe

Ala

Leu

Arg

Ala

130

135

140

Thr

Val

Thr

Phe

Gly

Val

íle

Thr

Ser

íle

Val

Thr

Trp

Gly

Leu

.4 5

150

155

160

kla

Val

Leu

Ala

Leu

Pro

Glu

Phe

íle

Phe

Tyr

Glu

Thr

Glu

165

170

175

jSU

Phe

Glu

Thr

Leu

Cys

Ser

Ala

Leu

Tyr

Pro

Glu

Asp

Thr

Val

180

185

190

ľyr

Ser

Trp

Arg

His

Phe

His

Thr

Leu

Arg

Met

Thr

íle

Phe

Cys

Leu

195

200

205

/al

Leu

Pro

Leu

Val

Met

Ala

íle

Cys

Tyr

Thr

Gly

íle

Lys

210

215

220

ľhr

Leu

T.OU

Arcr

Cvc

Prn

Par

Tárc

T AZC

T Are

TS/v“

T.i/e·

7\ Ί ->

-r Ί ~

T — - -

le

Phe

Val

íle

Met 245

Ala

Val

Phe

íle 250

Phe

Trp

Thr

Pro Tyr 255

Asn

‘al

Ala

íle

Leu

Ser

Tyr

Gin

Ser

íle

Leu

Phe

Gly

Asn

Asp

260

265

270

:ys

Glu

Arg

Ser

Lys

His

Leu

Asp

Leu

Val

Met

Leu

Val

Thr

Glu

Val

275

280

285

Zle

Ala

Tyr

Ser

His

Cys

Met

Asn

Pro

Val

íle

Tyr

Ala

Phe

Val

290

295

300

31y

Glu

Arg

Phe

Arg

Lys

Tyr

Leu

Arg

His

Phe

His

Arg

His

Leu

305

310

315

320

Leu

Met

His

Leu

Gly

Arg

Tyr

íle

Pro

Phe

Leu

Pro

Ser

Glu

Lys

Leu

325

330

335

Glu

Arg

Thr

Ser

Val

Ser

Pro

Ser

Thr

Ala

Glu

Pro

Glu

Leu

Ser

340

345

350

íle Val Phe

355

C2) INFORMÁCIE O SEO ID NO:5 =

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 34 bazových párov

C B) TYP: nukleová kyselina

CC) TYP REŤAZCA: Jednoduchý

CD) TOPOLÓGIA: lineárna

Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

C A) MENO/KLÚČ: misc_feature C B) INÉ INFORMÁCIE: /=V28degf2

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEO ID MO:5:

GACGGATCCA TYGAYAGRTA CCTGGCYATY GTCC

C 2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 6:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA; 32 bazových párov

C B) TYP: nukleová kyselina

CC) TYP REŤAZCA: Jednoduchý

CD) TOPOLÓGIA: lineárna

Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

C A) MENO/KLÚC: Tnisc_f eature (B) INÉ INFORMÁCIE: /=V28degr2 (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:6:

GCTAAGCTTT TRTAGGGDGT CCAYAAGAGY AA 32

C 2) INFORMÁCIE O SEO ID NO:7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 bazových párov (B) TYP: nukleová kyselina

CC) TYP REŤAZCA: Jednoduchý

CD) TOPOLÓGIA: lineárna

Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

C A) MENO/KLÚČ: misc_feature

C B) INÉ INFORMÁCIE: /=88c-r4

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEO ID N0=7=

GATAAGCCTC ACAGCCCTGT G 21

C 2) INFORMÁCIE O SEO ID NO:8:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 28 bázových párov

C B) TYP: nukleová kyselina

CC) TYP REŤAZCA: Jednoduchý

CD) TOPOLÓGIA: lineárna

Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

C A) MENO/KLÚČ: misc_feature

C B) INÉ INFORMÁCIE: ^•'SSc-rlb

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEO ID M0:8:

GCTAAGCTTG ATGACTATCT TTAATGTC 28

C 2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:9:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 27 bázových párov

C B) TYP: nukleová kyselina

CC) TYP REŤAZCA: Jednoduchý

CD) TOPOLÓGIA: lineárna

Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

C A) MENO/KLÚČ: misc_feature

C B) INÉ INFORMÁCIE: /=^,'B8-2B-3

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:9:

. CCCTCTAGAC TAAAACACAA TAGAGAG 27

C 2) INFORMÁCIE 0 SEQ ID NO:10:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 30 bázových párov

C B) TYP: nukleová kyselina.

CC) TYP REŤAZCA: jednoduchý

CD) TOPOLÓGIA: lineárna

Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

C A) MENO/KLÚC: misc_feature

C B) INÉ INFORMÁCIE: /=88-2B-5·'

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID MO:10:

GCTAAGCTTA TCACAGGGAG AAGTGAAATG ³⁰

C2) INFORMÁCIE 0 SEO ID NO:11:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 20 bázových párov

C B) TYP: nukleová kyselina

CC) TYP REŤAZCA: Jednoduchý

CD) TOPOLÓGIA: lineárna

Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

C A) MENO/KLÚČ: misc_feature

C B) INÉ INFORMÁCIE.- /=88-2B-f 1

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:11:

AGTGCTAGCA GCTCTTCCTG 20

C 2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO = 12:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 20 bázových párov

C B) TYP: nukleová kyselina

CC) TYP REŤAZCA: Jednoduchý

CD) TOPOLÓGIA: lineárna

Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

C A) MENO/KLÚČ: misc.feature

C B) INÉ INFORMÁCIE: /=88-2B-f1

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:12:

CAGCAGCGTT TTGATGATTC 20

C 2) INFORMÁCIE O SEQ ID MO:13,

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE

C A) DĹŽKA: 19 bázových párov

C B) TYP: nukleová kyselina

CC) TYP REŤAZCA: Jednoduchý

CD) TOPOLÓGIA: lineárna

Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

C A) MENO/KLIJČ : misc_feature

C B) INÉ INFORMÁCIE: /=88C-fl

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SED ID NO:13:

TGTGTTTGCT TTAAAAGCC 19

C 2) INFORMÁCIE O SEQ ID MO:14:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 1.7 bázových párov

C B) TYP: nukleová kyselina

CC) TYP REŤAZCA: Jednoduchý

CD) TOPOLÓGIA: lineárna

Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

C A) MENO/KLÚČ: misc_feature

C B) INÉ INFORMÁCIE: /='·880-γ3

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:14:

TAAGCCTCAC AGCCCTG

C 2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:15:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 28 bázových párov

C B) TYP: nukleová kyselina

CC) TYP REŤAZCA: Jednoduchý

CD) TOPOLÓGIA: lineárna

Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

C A) MENO/KLÚČ: misc-ťeature

C B) INÉ INFORMÁCIE: /=CCCKR1 ¢2)-5 Primár

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:15:

CGTAAGCTTA GAGAAGCCGG GATGGGAA

C 2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:16:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 25 bázových párov

C B) TYP: nukleová kyselina

CC) TYP REŤAZCA: jednoduchý

CD) TOPOLÓGIA: lineárna

Cii) TYP MOLEKULY-- DNA

Civ) KÓDUJÚCA: ÁNO

Cix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

C A) MENO/KLIJČ: misc_f eature

C B) INÉ INFORMÁCIE: /=CCCKR-3 Primár

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID MO:16:

i

GCCTCTAGAG TCAGAGACCA GCAGA

C2) INFORMÁCIE O SEQ ID MO:17:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 28 bázových párov

C B) TYP: nukleová kyselina

CC) TYP REŤAZCA: Jednoduchý

CD) TOPOLÓGIA: lineárna

Cii) TYP MOLEKULY: DNA C«genómová)

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:17:

GACAAGCTTC ACAGGGTGGA ACAAGATG

C2) INFORMÁCIE O SEQ ID MO:18:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 27 bázových párov

C B) TYP: nukleová kyselina

CC) TYP REŤAZCA: Jednoduchý

CD) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genómová) (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:18:

GTCTCTAGAC CACTTGAGTC CGTGTCA (2) INFORMÁCIE O SEQ ID MO:19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA; 1059 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP REŤAZCA: Jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) MENO/KLÚČ: CDS (B) UMIESTENIE: 1..1056 (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:19:

ATG GAC TAT

CAA GTG TCA AGT

CCA ACC TAT GAC

ATC GAT

TAT TAT

ACA Thr

48

Met 1

Asp

Tyr

Gin Val ' 5

Ser

Pro Thr

Tyr 10

Asp

íle

Asp

Tyr

Tyr 15

TCG

GAA

CCC

TGC

CAA

AAA

ATC

AAT

GTG

AAA

CAA

ATC

GCA

GCC

CGC

CTC

96

Ser

Glu

Pro

Cys

Gin

Lys

íle

Asn

Val

Lys

Gin

íle

Ala

Arg

Leu

20

25

30

CTG

CCT

CCG

CTC

TAC

TCA

CTG

GTG

TTC

ATC

TTT

GGT

TTT

GTG

GGC

AAC

144

Leu

Pro

Leu

Tyr

Ser

Leu

Val

Phe

íle

Phe

Gly

Phe

Val

Gly

Asn

35

40

45

ATA

CTG

GTC

CTC

ATC

CTG

ATA

AAC

TGC

AAA

AGG

CTG

AAA

AGC

ATG

192

íle

Leu

Val

Leu

íle

Leu

íle

Asn

Cys

Lys

Arg

Leu

Lys

Ser

Met

50

55

60

ACT

GAC

ATC

TAC

CTG

CTC

AAC

CTG

GCC

ATC

TCT

GAC

CTG

CTT

TTC

CTT

240

Thr

Asp

íle

Tyr

Leu

Asn

Leu

Ala

íle

Ser

Asp

Leu

Phe

Leu

65

70

75

80

CTT

ACT

GTC

CCC

TTC

TGG

GCT

CAC

TAT

GCT

GCC

CAG

TGG

GAC

TTT

28 =

Leu

Thr

Val

Pro

Phe

Trp

Ala

His

Tyr

Ala

Gin

Trp

Asp

Phe

85

90

95

GGA

AAT

ACA

ATG

TGT

CAA

CTC

TTG

ACA

GGG

CTC

TAT

TTT

ATA

GGC

TTC

336

31y	Asn	Thr	Met 100	Cys	Gin	Leu	Leu	Thr 105
PTC	TCT	GGA	ATC	TTC	TTC	ATC	ATC	CTC
Phe	Ser	Gly 115	íle	Phe	Phe	íle	íle 120	Leu
3CT	ATC	GTC	CAT	GCT	GTG	TTT	GCT	TTA
kla	íle 130	Val	His	Ala	Val	Phe 135	Ala	Leu
3GG	GTG	GTG	ACA	AGT	GTG	ATC	ACT	TGG
31y 45	Val	Val	Thr	Ser	Val 150	íle	Thr	Trp
:tc	CCA	GGA	ATC	ATC	TTT	ACC	AGA	TCT
jeu	Pro	Gly	íle	íle 165	Phe	Thr	Arg	Ser
\CC	TGC	AGC	TCT	CAT	TTT	CCA	TAC	AGT
Thr	Cys	Ser	Ser 180	His	Phe	Pro	Tyr	Ser 185
CTT	CAG	ACA	TTA	AAG	ATG	GTC	ATC	TTG
Phe	Gin	Thr 195	Leu	Lys	Met	Val	íle 200	Leu
3TC	ATG	GTC	ATC	TGC	TAC	TCG	GGA	ATC
/al	Met 210	Val	íle	Cys	Tyr	Ser 215.	Gly	íle
OGA	AAC	GAG	AAG	AAG	AGG	CAC	AGG	GCT
krg 225	Asn	Glu	Lys	Lys	Arg 230	His	Arg	Ala
ATG	ATT	GTT	TAT	TTT	CTC	TTG	TGG	GCT
-let	íle	Val	Tyr	Phe 245	Leu	Leu	Trp	Ala
OTG	AAC	ACC	TTC	CAG	GAA	TTC	TTT	GGC
Leu	Asn	Thr	Phe 260	Gin	Glu	Phe	Phe	Gly 265
.AAC	AGG	TTG	GAC	CAA	GCC	ATG	CAG	GTG
Asn	Arg	Leu 275	Asp	Gin	Ala	Met	Gin 280	Val
CAC	TGC	TGC	ATC	AAC	CCC	ATC	ATC	TAT
His	Cys 290	Cys	íle	Asn	Pro	íle 295	íle	Tyr
.AGA	AAC	TAC	CTC	TTA	GTC	TTC	TTC	CAA
Arg 305	Asn	Tyr	Leu	Leu	Val 310	Phe	Phe	Gin
TGC	AAA	TGC	TGT	TCC	ATT	TTC	CAG	CAA
Cys	Lys	Cys	Cys	Ser 325	íle	Phe	Gin	Gin
TCA	GTT	TAC	ACC	CGA	TCC	ACT	GGG	GAG
Ser	Val	Tyr	Thr 340	Arg	Ser	Thr	Gly	Glu 345

Gly Leu Tyr Phe íle Gly Phe

110

CTG ACA ATC GAT AGG TAC CTG3 84

Leu Thr íle Asp Arg Tyr Leu

125

AAA GCC AGG ACA GTC ACC TTT4 3 2

Lys Ala Arg Thr Val Thr Phe

140

GTG GTG GCT GTG TTT GCC TCT4 80

Val Val Ala Val Phe Ala Ser

155160

CAG AGA GAA GGT CTT CAT TAC52 8

Gin Arg Glu Gly Leu His Tyr

170175

CAG TAT CAA TTC TGG AAG AAT57 6

Gin Tyr Gin Phe Trp Lys Asn

190

GGG CTG GTC CTG CCG CTG CTT6 24

Gly Leu Val Leu Pro Leu Leu

205

CTG AAA ACT CTG CTT CGG TGT672

Leu Lys Thr Leu Leu Arg Cys

220

GTG AGG CTT ATC TTC ACC ATC720

Val Arg Leu íle Phe Thr íle

235240

CCC TAC AAC ATT GTC CTT CTC76 8

Pro Tyr Asn íle -.Val Leu Leu

250255

CTG AAT AAT TGC AGT AGC TCT816

Leu Asn Asn Cys Ser Ser Ser

270

ACA GAG ACT CTT GGG ATG ACA864

Thr Glu Thr Leu Gly Met Thr

285

GCC TTT GTC GGG GAG AAG TTC912

Ala Phe Val Gly Glu Lys Phe

300

AAG CAC ATT GCC AAA CGC TTC96 0

Lys His íle Ala Lys Arg Phe

315320

GAG GCT CCC GAG CG.A GCA AGT1008

Glu Ala Pro Glu Arg Ala Ser

330335

CAG GAA ATA TCT GTG GGC TTG 10 5 6

Gin Glu íle Ser Val. Gly Leu

350

C 2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:20 = (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 352 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina CD) TOPOLÓGIA: lineárna

Cii) TYP MOLEKULY: proteín

Cxi) POPIS SEKVENCIE-. SEO ID NO: 20:

let .1

Asp

Tyr Gin

Val 5

Ser

Ser Pro Thr

Tyr Asp 10

íle

Asp Tyr Tyr 15

Thr

Ser

Glu

Pro

Cys

Gin

Lys

íle

Asn

Val

Lys

Gin

íle

Ala

Arg

Leu

•

20

25

30

,eu

Pro

Leu

Tyr

Ser

Leu

Val

Phe

íle

Phe

Gly

Phe

Val

Gly

Asn

35

40

45

ľle

Leu

Val

Leu

íle

Leu

íle

Asn

Cys

Lys

Arg

Leu

Lys

Ser

Met

50

55

60

ľ'nr

Asp

íle

Tyr

Leu

Asn

Leu

Ala

íle

Ser

Asp

Leu

Phe

Leu

65

70

75

80

_,eu

Thr

Val

Pro

Phe

Trp

Ala

His

Tyr

Ala

Gin

Trp

Asp

Phe

85

90

95

31y

Asn

Thr

Met

Cys

Gin

Leu

Thr

Gly

Leu

Tyr

Phe

íle

Gly

Phe

100

105

110

Phe

Ser

Gly

íle

Phe

íle

Leu

Thr

íle

Asp

^: Arg

Tyr

Leu

115

120

125

'-.la

íle

Val

His

Ala

Val

Phe

Ala

Leu

Lys

Ala

Arg

Thr

Val

Thr

Phe

130

135

140

31y

Val

Thr

Ser

Val

íle

Thr

Trp

Val

Ala

Val

Phe

Ala

Ser

L45

150

155

160

□eu

Pro

Gly

íle

Phe

Thr

Arg

Ser

Gin

Arg

Glu

Gly

Leu

His

Tyr

165

170

175

ľhr

Cys

Ser

His

Phe

Pro

Tyr

Ser

Gin

Tyr

Gin

Phe

Trp

Lys

Asn

180

185

190

?he

Gin

Thr

Leu

Lys

Met

Val

íle

Leu

Gly

Leu

Val

Leu

Pro

Leu

195

200

205

Val

Met

Val

íle

Cys

Tyr

Ser

Gly

íle

Leu

Lys

Thr

Leu

Arg

Cys

210

215

220

Arg

Asn

Glu

Lys

Arg

His

Arg

Ala

Val

Arg

Leu

íle

Phe

Thr

íle

225

230

235

240

Met

íle

Val

Tyr

Phe

Leu

Trp

Ala

Pro

Tyr

Asn

íle

Val

Leu

245

250

255

sn

Arg

Leu Asp 275

Gin

Ala

Met

Gin Val 280

Thr

Glu

Thr Leu 285

Gly

Met

Thr

is

Cys

íle

Asn

Pro

íle

Tyr

Ala

Phe

Val

Gly

Glu

Lys

Phe

290

295

300

rg

Asn

Tyr

Leu

Val

Phe

Gin

Lys

His

íle

Ala

Lys

Arg

Phe

05

310

315

320

ys

Lys

Cys

Ser

íle

Phe

Gin

Glu

Ala

Pro

Glu

Arg

Ala

Ser

325

330

335

ar

Val

Tyr

Thr

Arg

Ser

Thr

Gly

Glu

Gin

Glu

íle

Ser

Val

Gly

Leu

340

345

350

?i/ 7 7^-??

Claims

1. Purifikovaný a izolovaný polynukleotid kódu. j úci aminokyselinovú sekvenciu chemokínového receptora 88-28 uvedenú v SEQ ID NO:4.

2 . Polynukleotid podía nároku 1, ktorým Je DNA. 3. Polynukleotid podía nároku 2, ktorým Je genómová DNA. 4. Polynukleotid podía nároku 2, ktorým Je genómová cDNA.

b. Polynukleotid podía nároku 1, ktorým je úplne alebo čiastočne chemicky syntetizovaná DNA.

6. RNA transkript polynukleotidu podía nároku 2.

7. cDNA podía nároku 4 zahrnujúca DNA zo sekvencií SEQ ID NO: 3.

8. Biologicky funkčný DNA vektor obsahujúci DNA podía nároku

2.

9. Vektor podía nároku 8, kde DNA Je operatívne pripojená k sekvencii riadiacej expresiu DNA.

10. Hostiteľská bunka stabilne transformovaná alebo transfekovaná DNA podía nároku 1 spôsobom umožňujúcim expresiu tejto DNA.

11. Spôsob produkcie polypeptidu 88-2B, vyznačuj ú c i sa t ý m, že zahrnuje stupeň pestovania hostitelskej bunky podía nároku 10 vo vhodnom živnom.médiu a stupeň izolácie tohoto polypeptidu z bunky alebo média.

12. Polynukleotid kódujúci polypeptid 88-28, ktorý hybrídizuje pri stringentných hybridizačných podmienkach k polynukleotidu zo sekvencií SEQ ID MO:3.

13. Purifikovaný a izolovaný polypeptid zahrnujúci aminokyselinovú sekvenciu chemokínového receptora 88-2B uvedenú v SEQ ID MO:4.

14. Protilátkový produkt, ktorý špecificky viaže polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu 88-2B uvedenú v SEQ ID NO:4.

15. Hybridóm produkujúci protilátkový produkt podlá nároku 14.

16. Purifikovaný a izolovaný polynukleotid kódujúci aminokyselinovú sekvenciu chemokínového receptora 88C uvedenú v SEQ ID MO:2.

17. Polynukleotid podľa nároku 16, ktorým 18. P o 1. y n u k 1 e o t i d podľa nároku 17, ktorým 19. P o 1 y n u k 1 e o t i. d podľa nároku 17, ktorým

.J e

DNA.

genómová DNA.

cDNA.

20.

Polynukleotid podľa nároku 16, ktorým j e ú plne ale b o čiastočne chemicky syntetizovaná DNA.

21. RNA transkript polynukleotidu podlá nároku 17.

22. cDNA podľa nároku 19 zahrnujúca DNA zo sekvencií SEQ ID NO: 1 .

23. Biologicky funkčný DNA vektor obsahujúci DNA podlá nároku 17.

24. Vektor podľa nároku 23, kde DNA Je operatívne pripojená k sekvencií riadiacej expresiu DNA.

25. Hostiteľská bunka stabilne transformovaná alebo transfekovaná DNA podlá nároku 16 spôsobom umožňujúcim expresiu tejto DNA.

26. Spôsob produkcie polypeptidu E)8C, v y z n a č u J ú c i. sa t ý m, že zahrnuje stupeň pestovania hostiteľskej bunky podľa nároku 25 vo vhodnom živnom médiu a stupeň izolácie tohoto polypeptidu z bunky alebo média.

27. Polynukleotid kódujúci polypeptid 88C, ktorý hybridizuje pri stringentných hybridizačných podmienkach k polynukleotidu so sekvenciou SEQ ID NChl.

28. Purifikovaný a izolovaný polypeptid zahrnujúci aminokyselinovú sekvenciu chemokínového receptora 88C uvedenú v SEQ ID NO:2.

29. Protilátkový produkt, ktorý špecificky viaže polypeptid

I obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu 88C uvedenú v SEQ ID MO:2.

30. Hybridóm produkujúci protilátkový produkt podľa nároku

29.

31. H y b r i d om á 1 n a bunková línia 227K. w 32. Hybridomálna bunková línia 2271*1. K 33. Hybridomálna bunková línia 227N. 34. Hybridomálna bunková línia 227P. 35. Hybridomálna bunková línia 227R.

36. Purifikovaný a izolovaný polynukleotid kódujúci aminokyselinovú sekvenciu chemokínového receptora 88C makaka uvedenú v SEQ ID NO:20.

37. Polynukleotid podľa nároku 36, ktorým Je DNA. 38. Polynukleotid podľa nároku 37, ktorým Je genómová DNA. 39. Polynukleotid podľa nároku 37, ktorým Je: cDNA. 40. Polynukleo ti< :l podľa nároku 36, ktorým Je úplne : alebo

čiastočne chemicky syntetizovaná DNA.

41. RNA transkript polynukleotidu podlá nároku 37.

42. cDNA podlá nároku 39 zahrnujúca DNA zo sekvencii SEQ ID N0:l.

43. Biologicky funkčný DNA vektor obsahujúci. DNA podlá nároku 37.

44. Vektor podlá nároku 43, kde DNA Je operatívne pripojená k sekvencii riadiacej expresiu DNA.

45. Hostiteľská bunka stabilne transformovaná alebo transfekovaná DNA podlá nároku 36 spôsobom umožňujúcim expresiu tejto DNA.

46. Spôsob produkcie: polypeptidu BBC makaka, v y z n a č u J ú c i sa t ý m, že zahrnuje: stupeň pestovania hostiteľskej bunky podľa nároku 45 vo vhodnom živnom médiu a stupeň izolácie: tohoto polypeptidu z bunky alebo média.

47. Polynukleotid kódujúci polypeptid BBC, ktorý hybridizuje pri stringentných hybridizačných podmienkach k polynukleotidu so sekvenciou SEQ ID NO:19.

48. Purifikovaný a izolovaný polypeptid zahrnujúci aminokyselinovú sekvenciu chemoklnového receptora BBC makaka uvedenú v SEQ ID NQ:20.

49. Protilátkový produkt, ktorý špecificky viaže: polypeptid obsahujúci aniinokyselinovú sekvenciu SSC uvedenú v SEQ ID NO s 20.

50. Hybridóm produkujúci protilátkový produkt podľa nároku 49.