NO327506B1 - Renset og isolert polynukleotid, RNA-transkript, biologisk funksjonell DNA-vektor, vertscelle, fremgangsmate for fremstilling av et 88C-polypeptid, polynukleotid som koder for et 88C-polypeptid, renset og isolert polypeptid, antistoffprodukt, hybridom, hybridomcellelinje, biologisk funksjonell DNA-vektor, fremgangsmate for fremstilling av makak-88C-polypeptid, antistoffprodukt, fremgangsmate for a screene etter en modulator av HIV-infeksjon, fremgangsmate for a pavise HIV-infeksjon i celler og fremgangsmate for identifisering av en ligand som er i stand til a pavirke kjemokinreseptoren 88C. - Google Patents

Abstract

2005-05-04 173353-HJ Sammendrag Polynukleotider som koder for kjemokinreseptorene 88C og materialer og fremgangsmåter for rekombinant produksjon av disse to kjemokinreseptorer. Analyser ved anvendelse av polynukleotidene som letter identifikasjon av ligander og modulatorer av kjemokinreseptorene er også beskrevet. Reseptorfragmenter, ligander, modulatorer og antistoffer er anvendelige ved påvisning og behandling av sykdomstilstander forbundet med kjemokinreseptorene, slik som aterosklerose, reumatoid artritt, tumorvekstundertrykkelse, astma, virusinfeksjon, AIDS og andre inflammatoriske tilstander.

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår generelt signaltrans-duksjonsreaksjonsveier. Nærmere bestemt angår oppfinnelsen renset og isolert polynukleotid, RNA-transkript, biologisk funksjonell DNA-vektor, vertscelle, fremgangsmåte for fremstilling av et 88C-polypeptid, polynukleotid som koder for et 88c-polypeptid, renset og isolert polypeptid, antistoffprodukt, hybridom, hybridomcellelinje, biologisk funksjonell DNA-vektor, fremgangsmåte for fremstilling av makak-88C-polypeptid, antistoffprodukt, fremgangsmåte for å screene etter en modulator av HIV-infeksjon, fremgangsmåte for å

påvise HIV-infeksjon i celler og fremgangsmåte for identifisering av en ligand som er i stand til å påvirke kjemokineseptoren 88C.

Oppfinnelsens bakgrunn

Nylige fremskritt i molekylærbiologi har ført til en erkjennelse av den sentrale rolle for signaltransduksjons-reaksjonsveier i biologiske prosesser. Disse reaksjonsveier omfatter en sentral måte som individuelle celler i en fler-cellet organisme kommuniserer på og derved koordinerer biologiske prosesser. Se Springer, Cell 76:301-314 (1994), tabell I for en modell. Én forgrening av signaltransduksjonsreaksjons-veier, definert av den intracellulære deltakelse av guanin-nukleotidbindingsproteiner (G-proteiner), påvirker et bredt omfang av biologiske prosesser.

Lewin, GENES V 319-348 (1994) diskuterer generelt G-proteinsignaltransduksjonsreaksjonsveier som involverer, på et minimum, de følgende komponenter: et ekstracellulært signal (f.eks. neurotransmitter, peptidhormoner, organiske molekyler, lys eller odoranter), en signalgjenkjennelsesreseptor (G-proteinkoblet reseptor, beskrevet i Probst et al., DNA and Cell Biology 11:1-20 [1992] og også kjent som GPR eller GPCR), og et intracellulært, heterotrimert GTP-bindingsprotein, eller G-protein. Nærmere bestemt har disse reaksjonsveier tiltrukket seg interesse på grunn av deres rolle i trafikkregulering av hvite blodceller eller leukocytter.

Leukocytter omfatter en gruppe av mobile blodcelle-typer, inkludert granulocytter (dvs. nøytrofiler, basofiler og eosinofiler), lymfocytter og monocytter. Når de er mobilisert og aktivert er disse celler primært involvert i kroppens forsvar mot fremmed materiale. Denne oppgave er komplisert på grunn av mangfoldigheten av de normale patologiske prosesser som leukocytter deltar i. Leukocytter virker f.eks. i den normale inflammatoriske respons på infeksjon. Leukocytter er også involvert i mange forskjellige patologiske inflamma-sjoner. For en oppsummering se Schall et al., Curr. Opin. Immunol. 6:865-873 (1994). Hver av disse prosesser kan dessuten involvere unike bidrag, i grad, type og varighet, fra hver av leukocyttcelletypene.

Ved studering av disse immunreaksjoner konsentrerte forskere seg innledningsvis om signalene som virker på leukocytter, under det resonnement at et signal ville være nød-vendig for å utløse enhver form for respons. Murphy, Ann. Rev. Immunol. 12:593-633 (1994) gir en oversikt over medlemmer av en viktig gruppe av leukocyttsignaler, peptidsignalene. Én type peptidsignal omfatter kjemokinene (kjemotiltrekkende cytokiner), betegnet interkriner i Oppenheim et al., Ann. Rev. Immunol. 9:617-648 (1991). I tillegg til Oppenheim et al., dokumenterer Baggiolini et al., Advances in Immunol. 55:97-17 9

(1994) det voksende antall kjemokiner som er blitt identifisert og underkastet genetiske og biokjemiske analyser.

Sammenligninger mellom aminosyresekvensene for de kjente kjemokiner har ført til et klassifikasjonsskjema som deler kjemokiner i to grupper: a-gruppen kjennetegnet ved en enkel aminosyre som atskiller de første to cysteiner (CXC; N-terminalen som referanse) , og (i-gruppen hvor disse cysteiner ligger ved siden av hverandre (CC). Se Baggiolini et al., supra. Det er funnet sammenhenger mellom kjemokinene og de spesielle leukocyttcelletyper som reagerer på disse signaler. Schall et al., supra, har rapportert at CXC-kjemokinene generelt påvirker nøytrofiler; CC-kjemokinene har en tendens til å påvirke monocytter, lymfocytter, basofiler og eosinofiler. Baggiolini et al., supra, beskriver f.eks. at RANTES, et CC-kjemokin, virker som et kjemisk tiltrekningsmiddel for monocytter, lymfocytter (dvs. hukommelses-T-celler), basofiler og eosinofiler, men ikke for nøytrofiler, mens de induserer frigivelsen av histamin fra basofiler.

Kjemokiner er nylig vist av Cocchi, et al., Science, 270: 1811-1815 (1995) til å være undertrykker av HIV-proli-ferasjon. Cocchi et al. viste at RANTES, MIP-la og MIP-ip undertrykte HIV-1-, HIV-2- og SIV-infeksjon av en CD<4+->cellelinje betegnet PM1 og av primære, humane, perifere mononukleære blodceller.

I den senere tid har imidlertid oppmerksomheten blitt rettet mot de cellulære reseptorer som binder kjemokinene, fordi de ekstracellulære kjemokiner synes å komme tilfeldig i kontakt med celler og derfor mangler den nødvendige spesifi-sitet for å regulere de individuelle leukocyttcelletyper.

Murphy, supra, rapporterte at GPCR-superfamilien av reseptorer inkluderer kjemokinreseptorfamilien. Den typiske kjemokinreseptorstruktur inkluderer et ekstracellulært kjemokinbindingsdomene lokalisert nær N-terminalen, etterfulgt av syv spredte områder med hovedsakelig hydrofobe aminosyrer som er i stand til å danne membranomspennende a-helikser. Mellom hvert av de a-heliksformede domener er det alternativt lokalisert hydrofile domener i de intra- eller ekstracellulære rom. Disse trekk gir den membraninnleirede kjemokinreseptor en serpentinkonformasjon. Den tredje intracellulære løkke reagerer typisk med G-proteiner. Murphy, supra, anførte dessuten at den intracellulære karboksylterminal også er i stand til å reagere med G-proteiner.

De første kjemokinreseptorer som ble analysert ved hjelp av molekylære kloningsteknikker var de to nøytrofil-reseptorer for humant IL-8, et CXC-kjemokin. Holmes et al., Science 253:178-1280 (1991) og Murphy et al., Science 253:1280-1283 (1991), rapporterte kloning av disse to reseptorer for IL-8. Lee et al., J. Biol. Chem. 267:16283-16287

(1992), analyserte cDNA som koder for disse reseptorer og fant 77 % aminosyreidentitet mellom de kodete reseptorer hvor hver reseptor viser karakteristiske trekk for den G-proteinkoblede reseptorfamilie. Én av disse reseptorer er spesifikk for IL-8, mens den andre binder og signaliserer som respons på IL-8, gro/MGSA og NAP-2. Genetisk manipulasjon av disse gener som koder for IL-8-reseptorer har bidratt til vår forståelse av disse reseptorers biologiske roller. Cacalano et al., Science 265:682-684 (1994) rapporterte f.eks. at delesjon av IL-8-reseptorhomologen hos mus førte til en pleiotropisk fenotype som involverer lymfadenopati og splenomegali. En undersøkelse av missens-mutasjoner beskrevet i Leong et al., J. Biol. Chem. 269:19343-19348 (1994) avslørte dessuten aminosyrer i IL-8-reseptoren som var kritiske for IL-8-binding. Domeneutbytt-ingseksperimenter diskutert i Murphy, supra, impliserte det aminoterminale ekstracellulære domene som en determinant for bindingsspesifisitet.

Flere reseptorer for CC-kjemokiner er også blitt identifisert og klonet. CCCKRl binder både MIP-la og RANTES og forårsaker intracellulær strøm av kalsiumioner som respons på begge ligander. Charo et al., Proe Nati. Acad. Sei. (USA) 91:2752-2756 (1994) rapporterte at en annen CC-kjemokinreseptor, MCP-R1 (CCCKR2), kodes for av et enkelt gen som produserer to spleisingsvarianter som har forskjellige karboksylterminaldomener. Denne reseptor bindes til, og reagerer på, MCP-3 i tillegg til MCP-1.

En uensartet reseptor som binder CXC- og CC-kjemokiner er også blitt identifisert. Denne reseptor ble opprinne-lig identifisert på røde blodceller og Horuk et al., Science 261:1182-1184 (1993) rapporterer at den binder IL-8, NAP-2, GROa, RANTES og MCP-1. Erytrocytt-kjemokinreseptoren deler ca.

25 % identitet med andre kjemokinreseptorer og kan hjelpe til å regulere sirkulerende nivåer av kjemokiner, eller medvirke

til fremvisning til kjemokiner for deres mål. I tillegg til å binde kjemokiner er erytrocytt-kjemokinreseptoren også vist å være reseptoren for plasmodium vivax, en hovedårsak til malaria (id.). En annen G-proteinkoblet reseptor som er nært beslektet med kjemokinreseptorer, blodplateaktiveringsfaktor-reseptoren, er også vist å være reseptoren for et humant patogen, bakterien Streptococcus pneumoniae (Cundell et al., Nature 377:435-438 (1995)).

I tillegg til pattedyrkjemokinreseptorene er det blitt identifisert to viruskjemokinreseptorhomologer. Ahuja et al., J. Biol. Chem. 268:20691-20694 (1993) beskriver et gen-med IL-8-reseptorene og binder CXC-kjemokiner. Neote et al., Cell, 72:415-425 (1993) rapporterer at humant cytomegalovirus inneholder et gen som koder for en reseptor som deler ca. 30 % identitet med CC-kjemokinreseptorene som binder MIP-la, MIP-ip, MCP-1 og RANTES. Disse virusreseptorer kan påvirke kjemo-kiners normale rolle og tilveiebringe en selektiv patologisk fordel for viruser.

På grunn av kjemokinenes brede mangfoldighet finnes det utallige reseptorer for kjemokinene. Reseptorene som er blitt karakterisert representerer kun en brøkdel av det totale antall kjemokinreseptorer. Det foreligger således et behov i teknikken for identifikasjon av ytterligere kjemokinreseptorer. Tilgjengeligheten av disse nye reseptorer vil tilveiebringe verktøy for utvikling av terapeutiske modulatorer av kjemokinfunksjon eller kjemokinreseptorfunksjon. Slike modulatorer betraktes ved foreliggende oppfinnelse som anvendelige som terapeutiske midler for behandling av aterosklerose, reumatoid artritt, tumorvekstundertrykkelse, astma, virusinfeksjoner og andre inflammatoriske tilstander. Alternativt betraktes fragmenter eller varianter av kjemokinreseptorene, eller antistoffer som gjenkjenner disse reseptorer, som terapeutiske midler.

Combadiere C. et al:"Cloning and functional expression of a human eosinophil CC Chemokine Receptor", Journal of Biological Chemistry, vol 270,no 27,14. juli 1995, s. 16491-16494 gjør kjent kjemokinreseptoren 88-2B (CKR-3).

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse omfatter et renset og isolert polynukleotid, kjennetegnet ved at det koder for aminosyresekvensen til kjemokinreseptor 88C vist i SEKY.ID NR: 2.

Oppfinnelsen omfatter også et RNA-transkript, kjennetegnet ved at det er et transkript av polynukleotidet ifølge foreliggende oppfinnelse.

Videre omfatter oppfinnelsen en biologisk funksjonell DNA-vektor, kjennetegnet ved at den omfatter DNA ifølge foreliggende oppfinnelse.

Også omfattet av oppfinnelsen er en vertscelle,

Lfølge foreliggende oppfinnelse på en måte som tillater ittrykking av nevnte DNA.

Videre omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av et 88C-polypeptid, kjennetegnet ved at den Dmfatter trinnene med å dyrke en vertscelle ifølge foreliggende oppfinnelsei et hensiktsmessig næringsmedium og isolere nevnte polypeptid fra nevnte celle eller medium.

Oppfinnelsen omfatter videre et polynukleotid som koder for et 88C-polypeptid, kjennetegnet ved at nevnte polynukleotid under de følgende, stringente hybridiseringsbetingelser hybridiserer med komplementet til polynukleotidet ifølge SEKV.ID. NR.l, hybridisering ved 42 °C i 50 % formamid, 20 mM natriumfosfat, pH 6,8 og vasking i 0,2X SSC ved 55 °C.

Omfattet av oppfinnelsen er også et renset og isolert polypeptid, kjennetegnet ved at det består av aminosyresekvensen til kjemokinreseptoren 88C som fremlagt i SEKV.ID. NR.2 .

Oppfinnelsen omfatter også et antistoffprodukt, kjennetegnet ved at det spesifikt binder et polypeptid som består av aminosyresekvensen til 88C som fremlagt i SEKV.ID. NR. 2 .

Videre omfattet av oppfinnelsen er et hybridom, kjennetegnet ved at det produserer et antistoffprodukt ifølge foreliggende oppfinnelse.

Oppfinnelsen omfatter også en hybridomcellelinje, kjennetegnet ved at den er cellelinjen 227K.

Omfattet av oppfinnelsen er også en hybridomcellelinje, kjennetegnet ved at den er cellelinjen 227M.

Videre omfatter oppfinnelsen en hybridomcellelinje, kjennetegnet ved at den er cellelinjen 227N.

Oppfinnelsen omfatter videre en hybridomcellelinje, kjennetegnet ved at den er cellelinjen 227P.

Oppfinnelsen omfatter også en hybridomcellelinje, kjennetegnet ved at den er cellelinjen 227R.

Videre omfattet av oppfinnelsen er et renset og isolert polynukleotid, kjennetegnet ved at det koder for aminosyresekvensen makak-kjemokinreseptoren 88C som fremlagt i

SEKV.ID. NR:20.

Oppfinnelsen omfatter videre et RNA-transkript, kjennetegnet ved at det er et transkript av polynukleotidet ifølge foreliggende oppfinnelse.

Videre omfatter oppfinnelsen en biologisk funksjonell DNA-vektor, kjennetegnet ved at den omfatter et DNA ifølge foreliggende oppfinnelse.

Oppfinnelsen omfatter også en vertscelle, kjennetegnet ved at den er stabilt transformert eller transfektert med et DNA ifølge foreliggende oppfinnelse på en måte som tillater uttrykking av nevnte DNA.

Omfattet av oppfinnelsen er også en fremgangsmåte for fremstilling av makak-88C-polypeptid, kjennetegnet ved at den omfatter trinnene med å dyrke en vertscelle ifølge foreliggende oppfinnelse i et hensiktsmessig næringsmedium og isolere nevnte polypeptid fra nevnte celle eller medium.

Oppfinnelsen omfatter videre et polynukleotid som koder for et 88C-polypeptid, kjennetegnet ved at nevnte polynukleotid ved de følgende, stringente hybridiseringsbetingelser hybridiserer til komplementet til polynukleotidet ifølge SEKV.ID. NR.19, hybridisering ved 42 °C i 50 % formamid, 20 mM natriumfosfat, pH 6,8 og vasking i 0,2X SSC ved 55 °C.

Også omfattet av oppfinnelsen er et renset og isolert polypeptid, kjennetegnet ved at det består av aminosyresekvensen til makak-kjemokinreseptoren 88C som fremlagt i SEKV.ID. NR.20.

Oppfinnelsen omfatter også et antistoffprodukt, kjennetegnet ved at det spesifikt binder et polypeptid som består av aminosyresekvensen til 88C som fremlagt i SEKV.ID. NR.20.

Videre omfatter oppfinnelsen et hybridom, kjennetegnet ved at det produserer et antistoffprodukt ifølge foreliggende oppfinnelse.

Oppfinnelsen omfatter videre en fremgangsmåte for å screene etter en modulator av HIV-infeksjon, kjennetegnet ved at den omfatter trinnene: (a) å bringe et første preparat som inneholder en mammalsk 88C-reseptor i kontakt med et annet preparat som inneholder et membranprotein fra humant immunsviktvirus (HIV)i nærvær og fravær av en forbindelse, (b) å måle påvirkningen den mammalske 88C-reseptoren har på HIV-membranproteinet i nærvær og fravær av forbindelsen, og (c) å screene etter en modulator av HIV-infeksjon, der redusert eller økt påvirkning av den mammalske 88C-reseptoren på HIV i nærvær av forbindelsen kontra i fravær av forbindelsen tyder på hvorvidt forbindelsen er en modulator av HIV-infeksjon.

Oppfinnelsen omfatter også en fremgangsmåte for å påvise HIV-infeksjon i celler, kjennetegnet ved at den omfatter trinnene: (a) å bringe en celle som har blitt rekombinant modifisert til 88C i kontakt med HIV, og

(b) å påvise HIV-infeksjon i cellen.

Oppfinnelsen omfatter en fremgangsmåte for identifisering av en ligand som er i stand til å påvirke kjemokinreseptoren 88C, som er kjennetegnet ved aminosyresekvensen ifølge SEKV.ID. NR.2, eller et biologisk aktivt fragment derav, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter trinnene: (a) å tilveiebringe en vertscelle som uttrykker nevnte reseptor eller et biologisk aktivt fragment derav, eller et membranpreparat som omfatter nevnte reseptor eller et biologisk fragment derav, (b) å kontakte og inkubere nevnte reseptor eller nevnte fragment derav med en ligand, og (c) å identifisere tilstedeværelsen av en ligand som spesifikt påvirker nevnte reseptor eller nevnte fragment derav.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer rensede og isolerte nukleinsyrer som koder for kjemokinreseptorer involvert i leukocyttrafikkering. Polynukleotider ifølge foreliggende oppfinnelse (både sens- og antisens-tråder derav) inkluderer genomiske DNA, cDNA og RNA, så vel som fullstendig eller delvis syntetiske nukleinsyrer. Foretrukne polynukleotider ifølge oppfinnelsen inkluderer DNA som koder for kjemokinreseptor 88C som er vist i SEKV.ID NR: 1 og DNA som hybridiserer til disse DNA under standard stringente hybridiseringsbetingelser, eller som ville hybridisere hvis det ikke var for den genetiske kodes overflødighet. Et eksempel på stringente hybridiseringsbetingelser er som følger: Hybridisering ved 42 °C i 50 % formamid, 5X SSC, 20 mM natriumfosfat, pH 6,8, og vask i 0,2X SSC ved 55 °C. Det er forstått av fagfolk at det forekommer variasjoner i disse betingelser basert på lengden og GC-nukleotidinnholdet av sekvensene som skal hybridiseres. Formler som er standard i teknikken er egnede for bestemmelse av nøyaktige hybridiseringsbetingelser. Se Sambrook et al., §§ 9.47-9.51 i Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989). Foreliggende oppfinnelse angår også polynukleotider som koder for domener av 88-2B eller 88C, f.eks. polynukleotider som koder for ett eller flere ekstracellulære domener av enten protein eller andre biologisk aktive fragmenter derav. 88-2B-ekstracellulære domener tilsvarer SEKV.ID NR: 3 og SEKV.ID NR: 4 ved aminosyrerester 1-36, 93-107, 171-196 og 263-284. De ekstracellulære domener av 88-2B kodes for av polynukleotidsekvenser som tilsvarer SEKV.ID NR: 3 ved nukleotider 362-469, 638-682, 872-949 og 1148-1213. Ekstracellulære domener av 88C tilsvarer SEKV.ID NR: 1 og SEKV.ID NR: 2 ved aminosyrerester 1-32, 89-112, 166-191 og 259-280. De 88C-ekstracellulære domener kodes for av polynukleotidsekvenser som tilsvarer SEKV.ID NR: 1 ved nukleotider 55-150, 319-390, 550-627 og 829-894. Det beskrives også polynukleotider som koder for intracellulær domener av disse kjemokinreseptorer. De intracellulære domener av 88-2B inkluderer aminosyrer 60-71, 131-151, 219-240 og 306-355 av SEKV.ID NR: 3 og SEKV.ID NR: 4. Disse domener kodes for av polynukleotidsekvenser som tilsvarer SEKV.ID NR: 3, hhv. ved nukleotider 539-574, 752-814, 1016-1081 og 1277-1426. De 88C-intracellulære domener inkluderer aminosyrerester 56-67, 125-145, 213-235 og 301-352 av SEKV.ID NR: 1 og SEKV.ID NR: 2. De intracellulære domener av 88C kodes for av polynukleotidsekvenser som tilsvarer SEKV.ID NR: 1 ved nukleotider 220-255,

427-489, 691-759 og 955-1110. Peptider som tilsvarer ett eller flere av de ekstracellulære eller intracellulære domener, eller antistoffer mot disse peptider, betraktes som modulatorer av reseptoraktiviteter, spesielt ligand- og G-proteinbindingsaktiviteter av reseptorene.

Nukleotidsekvensene som beskrevet heri kan også anvendes for å utforme oligonukleotider for anvendelse som merkede prober for å isolere genomiske DNA som koder for 88-2B eller 88C under stringente hybridiseringsbetingelser (dvs. ved hjelp av Southern analyser og polymerasekjedereaksjons-metoder). Disse oligonukleotidprober kan dessuten anvendes for å påvise spesielle alleler av genene som koder for 88-2B eller 88C, hvilket letter både diagnose og genterapibehandlinger av sykdomstilstander forbundet med spesielle alleler. Disse oligonukleotider kan dessuten anvendes for å endre kjemokin-reseptorgenetikk og letter identifikasjon av kjemokinreseptor-modulatorer. Nukleotidsekvensene kan også anvendes for å utforme antisens-genetiske elementer for anvendelse ved utforsking eller endring av genetikk og ekspresjon av 88-2B eller 88C. Det beskrives også biologiske etterligninger (dvs. kopier av isolerte DNA fremstilt in vivo eller in vitro) og RNA-transkripsjoner av DNA som beskrevet heri. Autonomt replikerende rekombinante konstruksjoner, slik som plasmid-, virus- og kromosomale (f.eks. YAC) nukleinsyrevektorer som effektivt inkorporerer 88-2B- eller 88C-polynukleotider, og spesielt vektorer hvori DNA som effektivt koder for 88-2B eller 88C er operativt bundet til én eller flere endogene eller heterologe ekspresjonskontrollsekvenser, tilveiebringes også.

88C-reseptorene kan produseres naturlig, rekombinant eller syntetisk. Vertsceller (prokaryote eller eukaryote) transformert eller transfektert med polynukleotider som beskrevet heri ved standard metoder, kan anvendes for å utvikle 88C-kjemokinreseptoren. Foruten det intakte 88C-genprodukter angår foreliggende oppfinnelse også biologisk aktive fragmenter av 88C, analoger av 88C og syntetiske peptider avledet fra aminosyresekvensene av 88C, vist i SEKV.ID NR: 2. 88C-genprodukter eller et biologisk aktivt

fragment av det ene eller andre genprodukt, når det produseres i en eukaryot celle, kan modifiseres etter translasjon (f.eks. via disulfidbindingsdannelse, glykosylering, fosforylering, myristoylering, palmitoylering, acetylering etc.). Oppfinnelsen angår dessuten 88C-genproduktene eller biologisk aktive fragmenter derav, i monomere, homomultimere eller heteromultimere konformasjoner.

Et aspekt angår nærmere bestemt antistoffprodukter som er i stand til spesifikk binding til 88C-kjemokinreseptorene. Antistoffproduktene frembringes ved hjelp av metoder standard i teknikken ved anvendelse av rekombinante 88C-reseptorer, syntetiske peptider eller peptidfragmenter av 88C-reseptorer, vertsceller som uttrykker 88C på deres overflater eller 88C-reseptorer renset fra naturlige kilder som immunogener. Antistoffproduktene kan inkludere monoklonale antistoffer eller polyklonale antistoffer av enhver opprin-nelse eller undertype. Det beskrives dessuten monomere, homomultimere og heteromultimere antistoffer og fragmenter derav. Oppfinnelsen beskriver dessuten CDR-kodede antistoffer, "humaniserte" antistoffer og andre modifiserte antistoffprodukter som bibeholder evnen til spesifikk binding av en kjemokinreseptor.

Det beskrives også anvendelse av antistoffprodukter for påvisning av 88C-genproduktene, analoger eller biologisk aktive fragmenter derav. Antistoffprodukter kan f.eks. anvendes i diagnostiske prosedyrer utformet for å avsløre korrelasjoner mellom ekspresjonen av 88C, og forskjellige normale eller patologiske tilstander. Antistoffprodukter kan dessuten anvendes for å diagnostisere vevsspesifikke variasjoner ved ekspresjon av 88C, deres analoger eller biologisk aktive fragmenter derav. Antistoffprodukter som er spesifikke for 88C-kjemokinreseptorene kan også virke som modulatorer av reseptoraktivitet. I et annet aspekt er antistoffer mot 88C-reseptorer anvendelige for terapeutiske formål.

Analyser for ligander som er i stand til å reagere med kjemokinreseptorene som beskrevet heri tilveiebringes også. Disse analyser kan innbefatte direkte påvisning av kjemokinreseptoraktivitet, f.eks. ved undersøkelse av bindingen av en merket ligand til reseptoren. Disse analyser kan dessuten anvendes for indirekte undersøkelse av ligandinterak-sjon med kjemokinreseptoren. Som anvendt heri omfatter betegnelsen "ligand" molekyler som er agonister og antagonister av 88-2B eller 88C, og andre molekyler som bindes til reseptorene.

Direkte påvisning av ligandbinding til en kjemokinreseptor kan oppnås ved anvendelse av den følgende analyse. Testforbindelser (dvs. antatte ligander) merkes påvisbart (f.eks. radiojoderes). De påvisbart merkede testforbindelser bringes deretter i kontakt med membranpreparater som inneholder en kjemokinreseptor som beskrevet heri. Membranene fremstilles fortrinnsvis fra vertsceller som uttrykker kjemokinreseptorer som beskrevet heri fra rekombinante vektorer. Etter en inkubasjonsperiode for å lette kontakt mellom de membraninnleirede kjemokinreseptorer og de påvisbart merkede testforbindelser, oppsamles membranmaterialet på filtere ved anvendelse av vakuumfiltrering. Den påvisbare markør på filtrene kvantifiseres deretter. Radiomarkør kvantifiseres f.eks. ved anvendelse av væskescintillasjonsspektrofotometri. Ved anvendelse av denne teknikk identifiseres ligander som bindes til kjemokinreseptorer. For å bekrefte identifiseringen av en ligand utsettes en påvisbart merket testforbindelse for et membranpreparat som fremviser en kjemokinreseptor i nærvær av økende mengder av testforbindelsen i en umerket tilstand. En progressiv reduksjon av nivået av filterassosiert markør når det tilsettes økende mengder umerket testforbindelse, bekrefter identifikasjonen av denne ligand.

Agonister er ligander som bindes til reseptoren og utløser intracellulær signaltransduksjon, og antagonister er ligander som bindes til reseptoren, men som ikke utløser intracellulær signaltransduksjon. Bestemmelsen av hvorvidt en spesiell ligand er en agonist eller en antagonist kan f.eks. bestemmes ved analysering av G-proteinkoblede signaltransduk-sjonsreaksjonsveier. Aktivering av disse reaksjonsveier kan bestemmes ved å måle intracellulær Ca<++->fluks, fosfolipase C-aktivitet eller adenylylsyklaseaktivitet, i tillegg til andre analyser (se eksempler 5 og 6).

Som diskutert i detalj i eksemplene heri inkluderer kjemokiner som bindes til 88C-reseptoren RANTES, MIP-la og MIP-1|3, og kjemokiner som bindes til 88-2B-reseptoren inkluderer RANTES.

I et annet aspekt beskrives spesielt modulatorer av interaksjonen mellom 88C-reseptorene og deres ligander. Modulatorer av kjemokinreseptorfunksjon kan identifiseres ved anvendelse av lignende analyser som de anvendte for identifisering av ligander. Membranpreparater som inneholder en kjemokinreseptor utsettes for en konstant og kjent mengde av en påvisbart merket funksjonell ligand. Den membranmodne kjemokinreseptor utsettes dessuten også for en økende mengde av en testforbindelse som mistenkes for å modulere aktiviteten av denne kjemokinreseptor. Dersom nivåene av filterassosiert markør samsvarer med mengden av testforbindelse, så er denne forbindelse en modulator av aktiviteten av kjemokinreseptoren. Dersom nivået av filterassosiert markør med økende mengde av testforbindelsen er en aktivator identifisert. I motsetning til dette, dersom nivået av filterassosiert markør varierer omvendt proporsjonalt med mengden av testforbindelse, er en inhibitor av kjemokinreseptoraktivitet identifisert. Testing for modulatorer av reseptorbinding på denne måte tillater hurtig screening av mange mulige modulatorer, fordi forråd som inneholder mange potensielle modulatorer kan testes samtidig i den samme reaksjon.

De indirekte analyser rettet på reseptorbinding involverer målinger av konsentrasjonen eller nivået av aktivitet av enhver av komponentene funnet i den relevante signaltransduksjonsreaksjonsvei. Kjemokinreseptoraktivering er ofte forbundet med en intracellulær Ca<++->fluks. Celler som uttrykker kjemokinreseptorer kan fylles med et kalsiumsensitivt fargestoff. Ved aktivering av den uttrykte reseptor ville en Ca<++->fluks gjøres spektrofotometrisk påviselig av fargestoffet. Alternativt kunne Ca<++->fluksen påvises mikroskopisk. Parallelle analyser ved anvendelse av enten den ene eller den andre teknikk, kan utføres i nærvær og fravær av antatte ligander. Ved anvendelse av den mikroskopiske analyse rettet på Ca<++->fluks, ble f.eks. RANTES, et CC-kjemokin, identifisert som en ligand av 88-2B-kjemokinreseptoren. Fagfolk vil anerkjenne at disse analyser også er anvendelige for identifikasjon og overvåkning av rensning av modulatorer av reseptoraktivitet. Reseptoraktivatorer og inhibitorer vil hhv. aktivere eller inhibere interaksjonen av reseptorene med deres ligander i disse analyser.

Assosiasjonen av kjemokinreseptorer med G-proteiner gir alternativt muligheten til å bestemme reseptoraktivitet ved å undersøke G-proteinaktivitet. En karakteristisk aktivitet av G-proteiner, GTP-hydrolyse, kan f.eks. undersøkes ved anvendelse av <32>P-merket GTP.

G-proteiner påvirker også mange forskjellige andre molekyler gjennom deres deltakelse i signaltransduksjonsreak-sjonsveier. G-proteineffektormolekyler inkluderer f.eks. adenylylsyklase, fosfolipase C, ionekanaler og fosfodiester-aser. Analyser fokusert på enhver av disse effektorer kan anvendes for å undersøke kjemokinreseptoraktivitet indusert av ligandbinding i en vertscelle som både uttrykker kjemokinreseptoren av interesse og som er brakt i kontakt med en egnet ligand. En metode for påvisning av aktiviteten av kjemokinreseptorer involverer f.eks. måling av fosfolipase C-aktivitet. I denne analyse påvises produksjonen av radio-merkede inositolfosfater av vertsceller som uttrykker en kjemokinreseptor i nærvær av en agonist. Påvisningen av fosfolipaseaktivitet kan fordre kotransfeksjon med DNA som koder for et eksogent G-protein. Når kotransfeksjon er nød-vendig kan denne analyse utføres ved kotransfeksjon av kimært G-protein-DNA, f.eks. Gqi5 (Conklin, et al., Nature 363:274-276 (1993)), med 88-2B- eller 88C-DNA, og påvisning av fosfo-inositolproduksjon når den kotransfekterte celle utsettes for en agonist av 88-2B- eller 88C-reseptoren. Fagfolk vil anerkjenne at analyser fokusert på G-proteineffektormolekyler også er anvendelige for identifikasjon og overvåkning av rensing av modulatorer av reseptoraktivitet. Reseptoraktivatorer og inhibitorer vil hhv. aktivere eller inhibere interaksjonen av reseptorene med deres ligander i disse

analyser.

Kjemokiner er blitt forbundet med mange inflammatoriske sykdommer, slik som psoriasis, artritt, lungefibrose og aterosklerose. Se Baggiolini et al., supra. Inhibitorer av kjemokinvirkning kan være anvendelige for behandling av disse tilstander. I et eksempel beskriver Broaddus et al., J. of Immunol. 152:2960-2967 (1994) et antistoff mot IL-8 som kan inhibere nøytrofilrekruttering ved endotoksinindusert pleuritt, en modell for akutt inflammasjon i kaninlunge. Det antas også at ligand- eller modulatorbinding til, eller aktivering av, 88C-reseptoren, kan være anvendelig ved behandling av HIV-infeksjon og HIV-beslektede sykdomstilstander. Modulatorer av kjemokinbinding til spesifikke reseptorer, som er betraktet ved foreliggende oppfinnelse, kan inkludere antistoffer rettet mot et kjemokin eller en reseptor, biologiske eller kjemiske små molekyler eller syntetiske peptider som

tilsvarer fragmenter av kjemokinet eller reseptoren.

Administrering av preparater som inneholder 88C-modulatorer til pattedyrindivider, for formålet å undersøke eller gjenopprette normale eller patologiske immunreaksjoner, og virusinfeksjoner som inkluderer infeksjon av retroviruser, slik som HIV-1, HIV-2 og SIV, er betraktet. Nærmere bestemt beskrives forminsking av inflammatoriske responser, unormale hematopoetiske prosesser og virusinfeksjoner, ved utlevering av en farmasøytisk akseptabel mengde 88C-kjemokinreseptor-modulatorer. Det beskrives dessuten utlevering av disse aktive stoffer i farmasøytisk akseptable preparater som omfatter bærere, fortynningsmidler eller medikamenter. Det beskrives også forskjellige administreringsveier. De aktive stoffer kan f.eks. administreres på de følgende måter: Intravenøst, subkutant, intraperitonealt, intramuskulært, oralt, analt (dvs. via suppositoriumformuleringer) eller pulmonalt (dvs. via inhalatorer, atomisører, forstøvere etc).

I et annet aspekt muliggjør DNA-sekvensinformasjonen ) tilveiebrakt heri utvikling, ved homologe rekombinasjons-eller "knockout"-strategier [se f.eks. Kapecchi. Science, 244:1288-1292 (1989)], på gnagere som ikke uttrykker en funksjonell 88C-kjemokinreseptor, eller som uttrykker en variant av reseptoren. Alternativt kan transgene mus som uttrykker en klonet 88C-reseptor frembringes ved hjelp av velkjente laboratorieteknikker (Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Brigid Hohan, Frank Costantini og Elizabeth Lacy, red. (1986) Cold Spring Harbor Laboratory ISBN 0-87969-175-1). Slike gnagere er anvendelige som modeller for undersøkelse av aktivitetene av 88C-reseptorer in vivo.

Andre aspekter og fordeler ved foreliggende oppfinnelse vil fremgå for fagfolk ved vurdering av de etterfølg-ende eksempler.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen. Eksempel 1 beskriver isolering av genomiske DNA som koder for 88-2B- og 88C-kjemokinreseptorene. Eksempel 2 viser isolering og sekvensering av cDNA som koder for humant 88-2B og 88C og makak-88C. Eksempel 3 tilveiebringer en beskrivelse av Northern-analyser som viser ekspresjonsmønstrene for 88-2B- og 88C-reseptorene i forskjellige vev. Eksempel 4 beskriver i detalj den rekombinante ekspresjon av 88-2B- og 88C-reseptorene. Eksempel 5 beskriver Ca<++->fluksanalyser, fosfoinositol-hydrolyseanalyser og bindingsanalyser for 88-2B- og 88C-reseptoraktivitet som respons på forskjellige potensielle ligander. Eksperimenter som beskriver rollen til 88C og 88-2B som koreseptorer for HIV er vist i eksempel 6 og 7. Fremstilling og karakterisering av monoklonale og polyklonale antistoffer som immunreagerer med 88C er beskrevet i eksempel 8. Eksempel 9 beskriver ytterligere analyser utformet for å identifisere 88-2B- eller 88C-ligander eller modulatorer.

Eksempel 1

Partielle genomiske kloner som koder for de nye kjemokinreseptorgener ifølge foreliggende oppfinnelse ble isolert ved hjelp av PCR basert på konserverte sekvenser funnet i tidligere identifiserte gener og basert på en gruppering av disse kjemokinreseptorgener i det humane genom. Det genomiske DNA ble amplifisert ved hjelp av standard PCR-metoder ved anvendelse av degenererte oligonukleotidprimere.

Templater for PCR-amplifikasjoner var medlemmer av en kommersielt tilgjengelig kilde for rekombinant, humant, genomisk DNA klonet i kunstige gjærkromosomer (dvs. YAC). (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL, YAC Library Pools, katalog nr. 95011 B). En YAC-vektor kan romme innføyelser på 500-1 000 kilobasepar. Innledningsvis ble forråd av YAC-klon-DNA screenet ved hjelp av PCR ved anvendelse av primere spesifikke for genet som koder for CCCKR1. Nærmere bestemt er CCCKR(2)-5', sens-trådprimeren (tilsvarende sens-tråden av CCCKR1), vist i SEKV.ID NR: 15. Primer CCCKR(2)-5' bestod av sekvensen 5'-CGTAAGCTTAGAGAAGCCGGGATGGGAA-3', hvori de understrekede nukleotider er startkodonet for CCCKRl. Antisens-trådprimeren var CCCKR-3' (tilsvarende antisens-tråden av CCCKRl) og dens sekvens er vist i SEKV.ID NR: 16. Sekvensen av CCCKR-3', 5'-GCCTCTAGAGTCAGAGACCAGCAGA-3<1>, inneholder det reverse komple-ment av CCCKRl-translasjonsstoppkodonet (understreket). Forråd av YAC-klon-DNA som gir påvisbare PCR-produkter (dvs. DNA-bånd ved gelelektroforese) identifiserte egnede underforråd av YAC-kloner, basert på et navnebeskyttet identifikasjonsskjema.

(Research Genetics, Inc., Huntsville, AL). PRC-reaksjoner ble startet med en inkubasjon ved 94 °C i 4 minutter. Sekvens-amplifikasjoner ble oppnådd ved anvendelse av 33 sykluser med denaturering ved 94 °C i 1 minutt, annealering ved 55 °C i 1 minutt og utvidelse ved 72 °C i 2 minutter.

Underforrådene av YAC-klon-DNA ble deretter underkastet en andre runde med PCR-reaksjoner ved anvendelse av betingelsene og primerene som ble anvendt i den første runde med PCR. Resultater fra screeninger av underforrådene identifiserte individuelle kloner som er i stand til å understøtte PCR-reaksjoner med de CCCKR-spesifikke primere. Én klon, 8881F10, inneholdt 640 kb med humant genomisk DNA fra kromosom 3p21, inkludert genene for CCCKRl og CCCKR2, som bestemt ved hjelp PCR og hybridisering. En overlappende YAC-klon, 941A7, inneholdt 7 00 kb med humant genomisk DNA og inneholdt også genene for CCCKRl og CCCKR2. Ytterligere kartleggingsundersøk-elser ble derfor utført ved anvendelse av disse to YAC-kloner. Southern-analyser avslørte at CCCKRl og CCCKR2 var lokalisert i en avstand fra hverandre på ca. 100 kb.

Det nære naboskap mellom CCCKRl- og CCCKR2-genene antydet at nye beslektede gener kunne være bundet til CCCKRl og CCCKR2. Ved anvendelse av DNA fra gjær inneholdende YAC-kloner 881F10 og 941A7 som templater, ble PCR-reaksjoner ut-ført for å amplifisere eventuelt bundne reseptorgener. Degenererte oligodeoksyribonukleotider ble utformet som PCR-primere. Disse oligonukleotider tilsvarer områder som koder for den andre intracellulære løkke og det sjette transmembrandomene av CC-kjemokinreseptorer, som utledet fra linjeopp-stilte sekvenssammenligninger mellom CCCKRl, CCCKR2 og V28. V28 ble anvendt fordi den er en "foreldreløs" reseptor som oppviser kjennetegnene til en kjemokinreseptor; V28 er også blitt kartlagt til humant kromosom 3. Raport et al., Gene 163:295-299 (1995). Det skal videre anføres at de to spleisingsvarianter av CCCKR2, CCCKR2A og CCCKR2B, er identiske i de andre intracellulære løkke- og sjette transmembrandomene-områder anvendt i analysen. 5'-primeren, betegnet V28degf2, inneholder et internt BambHI-sete (se nedenfor); dens sekvens er vist i SEKV.ID NR: 5. Sekvensen av primer V28degf2 tilsvarer DNA som koder for det andre intracellulære løkkeområde av den anerkjente reseptorstruktur. Se Probst et al., supra. 3'-primeren, betegnet V28degr2, inneholder et internt Hindlll-sete (se nedenfor); dens sekvens er vist i SEKV.ID NR: 6. Sekvensen av primer V28degr2 tilsvarer DNA som koder for det sjette transmembrandomene av den anerkjente reseptorstruktur.

Amplifisert PCR DNA ble deretter spaltet med BamHI og Hind III for å danne fragmenter på ca. 390 bp, overensstemmende med fragmentstørrelsen forutsagt fra undersøkelse av den anerkjente sekvens. Etter endonukleasespalting ble disse PCR-fragmenter klonet i pBluescript (Stratagene Inc., LaJoll, CA). Totalt 54 klonede fragmenter ble underkastet automatisert nukleotidsekvensanalyser. I tillegg til sekvenser fra CCCKRl og CCCKR2, ble sekvenser fra de to nye kjemokinreseptorgener ifølge foreliggende oppfinnelse identifisert. Disse to nye kjemokinreseptorgener ble betegnet 88-2B og 88C.

Restriksjonsendonukleasekartlegging og hybridisering ble anvendt for å kartlegge de relative posisjoner av gener som koder for reseptorene 88C, 88-2B, CCCKRl og CCCKR2. Disse fire gener er nært forbundet med hverandre, fordi genet for 88C er ca. 18 KBP fra CCCKR2-genet på humant kromosom 3p21.

Eksempel 2

Uforkortede 88-2B- og 88C-CDNA ble isolert fra et makrofag-cDNA-bibliotek ved hjelp av den følgende prosedyre. Et cDNA-bibliotek, beskrevet i Tjoelker et al., Nature 374:549-553 (1995), ble først konstruert i pRc/CMV (Invitrogen Corp., San Diego, CA) fra humant makrofag-mRNA. cDNA-biblioteket ble screenet for tilstedeværelse av 88-2B og 88C-CDNA-kloner ved hjelp av PCR ved anvendelse av unike primerpar som tilsvarer 88-2B eller 88C. PCR-protokollen involverte en innledende denaturering ved 94 °C i 4 minutter. Polynukleotider ble deretter amplifisert ved anvendelse av 33 sykluser med PCR under de følgende betingelser: Denaturering ved 94 °C i 1 minutt, annealering ved 55 °C i 1 minutt og utvidelse ved

72 °C i 2 minutter. Den første primer spesifikk for 88-2B var

primer 88-2B-fl, vist i SEKV.ID NR: 11. Den tilsvarer sens-tråden av SEKV.ID NR: 3 med nukleotider 844-863. Den andre PCR-primer spesifikk for genet som koder for 88-2B var primer 88-2B-rl, vist i SEKV.ID NR: 12; 88-2B-rl-sekvensen tilsvarer antisens-tråden av SEKV.ID NR: 3 med nukleotider 1023-1042. Sekvensen av den første primer forgrenet som koder for 88C, primer 88C-fl, er likeledes vist i SEKV.ID NR: 13 og tilsvarer sens-tråden av SEKV.ID NR: 1 med nukleotider 453-471. Den andre primer spesifikk for genet som koder for 88C er primer 88C-r3, vist i SEKV.ID NR: 14; sekvensen av 88C-r3 tilsvarer antisens-tråden av SEKV.ID NR: 1 med nukleotider 744-763.

Screeningen identifiserte klon 777, en cDNA-klon av 88-2B. Klon 777 inneholdt en DNA-innføyelse på 1915 basepar, inkludert den uforkortede kodingssekvens av 88-2B som bestemt ved følgende kriterier: Klonen inneholdt en lang åpen avles-ningsramme som startet med et ATG-kodon, oppviste en Kozak-sekvens og hadde et i-ramme stoppkodon oppstrøms. DNA og de

i utledete aminosyresekvenser av innføyelsen av klon 777 er vist i hhv. SEKV.ID NR: 3 og SEKV.ID NR: 4. 88-2B-transkripsjon var forholdsvis sjelden i makrofag-cDNA-biblioteket. Under bibliotekscreeningen ble kun tre 88-2B-kloner identifisert fra

et beregnet antall på 3 000 000 kloner.

Screening for cDNA-kloner som koder for 88C-kjemokinreseptoren identifiserte kloner 101 og 134 som syntes å inne-holde hele 88C-kodingsområdet, inkludert et antatt startkodon. Disse kloner manglet imidlertid den ytterligere 5'-sekvens som var nødvendig for å bekrefte identiteten av startkodonet. 88C-transkripsjonen var forholdsvis tallrik i makrofag cDNA-biblioteket. Under bibliotekscreeningen ble det beregnet at 88C var til stede i et antall på 1 pr. 3 000 transkripsjoner (i totalt ca. 3 000 000 kloner i biblioteket).

RACE PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends) ble ut-ført for å utvide eksisterende 88C-klonsekvenser og derved lette den nøyaktige karakterisering av 5'-enden av 88C cDNA. Human milt 5'-RACE-ferdig cDNA ble innkjøpt fra Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, og anvendt i overensstemmelse med fabrikantens anbefalinger. cDNA var blitt gjort "5'-RACE-ferdig" ved å ligere en ankersekvens til 5'-endene av cDNA-fragmentene. Ankersekvensen er komplementær med en ankerprimer levert av Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA. Ankersekvens-ankerprimer-dupleks-polynukleotidet inneholder et EcoRI-sete. Humant milt-cDNA ble valgt som templat-DNA fordi Northern-blots hadde avslørt at 88C ble uttrykt i dette vev. PCR-reaksjonene ble startet ved denaturering av prøve ved 94 °C i 4 minutter. Sekvenser ble deretter amplifisert ved anvendelse av 35 sykluser som involverte denaturering ved 94 °C i 1 minutt, annealering ved 60 °C i 45 sekunder og utvidelse ved 72 °C i 2 minutter. Den første runde med PCR ble utført på reaksjonsblandinger inneholdende 2 ul av det 5'-RACE-ferdige milt-cDNA, 1 ul av ankerprimeren og 1 ul av primer 88C-r4 (100 ng/ul) i et totalt reaksjonsvolum på 50 ul. Den 88C-spesifikke primer, primer 88C-r4 (5'-GATAAGCCTCACAGCC-CTGTG-3') , er vist i SEKV.ID NR: 7. Sekvensen av primer 88C-r4 tilsvarer antisens-tråden av SEKV.ID NR: 1 med nukleotider

745-765. En andre runde med PCR ble utført på reaksjonsblandinger som inkluderte 1 ul av den første PCR-reaksjon med 1 ul ankerprimer og 1 pl primer 88C-rlb (100 ng/ul) inneholdende den følgende sekvens (5'-GCTAAGCTTGATGACTATCTTTAATGTC-3') og vist i SEKV.ID NR: 8. Sekvensen av primer 88C-rlb inneholder

et internt Hindlll-kloningssete (understreket). Sekvensen 3' av Hindlll-setet tilsvarer antisens-tråden av SEKV.ID NR: 1, med nukleotider 636-654. Det resulterende PCR-produkt ble spaltet med Ecol og Hindlll og fraksjonert på en 1 % agarose-gel. Det ca. 700 bp-fragment ble isolert og klonet i pBluescript. Kloner med de største innføyelser ble sekvensert. Alternativt ble det intakte PCR-produkt ligert i vektor pCR ved anvendelse av et kommersielt TA-kloningssett (Invitrogen Corp., Sand Diego, CA) for etterfølgende nukleotidsekvens-bestemmelser.

88-2B- og 88C-CDNA ble sekvensert ved anvendelse av

"PRISM" "Readey Reaction DyeDeoxy" terminatorsyklussekvenser-ingssett (Perking Eimer Corp., Foster City, CA) og et Applied Biosystems 373A DNA-sekvenseringsapparat. Innføyelsen av klon 777 tilveiebrakte det dobbelttrådete templat for sekvenser-ingsreaksjoner anvendt for å bestemme 88-2B-cDNA-sekvensen. Sekvensen av hele innføyelsen av klon 777 ble bestemt og er vist som den 88-2B-cDNA-sekvens og den utledete aminosyre-sekvens i SEKV.ID NR: 3. Sekvensen har en lengde på 1915 bp, inkludert 361 bp med 5'-utranslatert DNA (tilsvarende SEKV.ID NR: 3 med nukleotider 1-361), et kodingsområde på 1065 bp (tilsvarende SEKV.ID NR: 3 med nukleotider 362-1426), og 489 bp med 3<1->utranslatert DNA (tilsvarende SEKV.ID NR: 3 med nukleotider 1427-1915. Det 88-2B-genomiske DNA, beskrevet i eksempel 1 ovenfor, tilsvarer SEKV.ID NR: 3 med nukleotider 746-1128. 88C-cDNA-sekvensen, og den utledete aminosyre-sekvens, er vist i SEKV.ID NR: 1. 88C-cDNA-sekvensen er en sammensetning av sekvenser erholdt fra RACE-PCR-cDNA, klon 134 og klon 101. RACE-PCR-cDNA ble anvendt som et sekvenserings-templat for å bestemme nukleotider 1-654 i SEKV.ID NR: 1, inkludert den unike identifikasjon av 9 bp med 5<1->utranslatert cDNA-sekvens i SEKV.ID NR: 1 med nukleotider 1-9. Sekvensen erholdt fra RACE-PCR-cDNA bekreftet posisjonen av det første metioninkodon med nukleotider 55-57 i SEKV.ID NR: 1, og under-støttet konklusjonen om at klon 134 og klon 101 inneholdt uforkortede kopier av 88C-kodingsområdet. Klon 134 inneholdt 45 bp med 5'-utranslatert cDNA (tilsvarende SEKV.ID NR: 1 med nukleotider 10-54), det 1056 bp 88C-kodingsområde (tilsvarende

SEKV.ID NR: 1 med nukleotider 55-1110), og 492 bp med 3'-utranslatert cDNA (tilsvarende SEKV.ID NR: 1 med nukleotider 1111-1602). Klon 101 inneholdt 25 bp med 5'-utranslatert cDNA (tilsvarende SEKV.ID NR: 1 med nukleotider 30-54), det 1056 bp 88C-kodingsområde (tilsvarende SEKV.ID NR: 1 med nukleotider 55-1110), og 2273 bp med 3'-utranslatert cDNA (tilsvarende SEKV.ID NR: 1 med nukleotider 1111-3383). Det 88C-genomiske DNA beskrevet i eksempel 1 ovenfor tilsvarer SEKV.ID NR: 1 med nukleotider 424-809.

De utledete aminosyresekvenser av 88-2B og 88C av-slørte hydrofobitetsprofiler karakteristiske for GPCR, inkludert 7 hydrofobe domener som tilsvarer GPCR-transmembran-domener. Sekvenssammenligninger med andre GPCR avslørte også en grad av identitet. Det er betydningsfullt at de utledete aminosyresekvenser av både 88-2B og 88C hadde høyest identitet med sekvensene av kjemokinreseptoren. Tabell 1 viser resultatene fra disse aminosyresekvenssammenligninger.

Tabell 1

Kjemokinreseptorer 88-2B 88C IL-8RA 30 % 30 % IL-8RB 31 % 30 % CCCKRl 62 % 54 % CCCKR2A 46 % 66 % CCCKR2B 50 % 72 % 88-2B 100 % 50 %

88C 50 % 100 %

Tabell 1 viser at 88-2B er mest likt CCCKRl (62 % identisk på aminosyrenivået) og 88C er mest likt CCCKR2 (72 % identisk på aminosyrenivået).

De utledete aminosyresekvenser for 88-2B og 88C av-slører også de intracellulære og ekstracellulære domener som er karakteristiske for GPCR. De 88-2B-ekstracellulære domener tilsvarer aminosyresekvensen vist i SEKV.ID NR: 3 og SEKV.ID NR: 4, med aminosyrerester 1-36, 93-107, 171-196 og 263-284. De ekstracellulære domener av 88-2B kodes for av polynukleotidsekvenser som tilsvarer SEKV.ID NR: 3 med nukleotider 362-469, 638-682, 872-949 og 1148-1213. Ekstracellulære domener av 88C inkluderer aminosyrerester 1-32, 89-112, 166-191 og 259-280 i SEKV.ID NR: 1 og SEKV.ID NR: 2. De 88C-ekstracellulære domener kodes for av polynukleotidsekvenser som tilsvarer SEKV.ID NR: 1 med nukleotider 55-150, 319-390, 550-627 og 829-894. De intracellulære domener av 88-2B inkluderer aminosyrer 60-71, 131-151, 219-240 og 306-355 av SEKV.ID NR: 3 og SEKV.ID NR: 4. Disse domener kodes for av polynukleotidsekvenser som tilsvarer SEKV.ID NR: 3, hhv. med nukleotider 539-574, 752-814, 1016-1081 og 1277-1426. De 88C-intracellulære domener influerer aminosyrerester 56-67, 125-145, 213-235 og 301-352 av SEKV.ID NR: 1 og SEKV.ID NR: 2. De intracellulære domener av 88C kodes for av polynukleotidsekvenser som tilsvarer SEKV.ID NR: 1 med nukleotider 220-255, 427-489, 691-759 og 955-1110.

Et makak-88C-DNA ble dessuten amplifisert ved hjelp av PCR fra makak-genomisk DNA ved anvendelse av primere som tilsvarer 5'- og 3'-flankerende områder av det humane 88C cDNA. 5'-primeren tilsvarte området umiddelbart oppstrøms for, og inkludert, det innledende Met-kodon. 3'-primeren var komplementær med området umiddelbart nedstrøms for terminer-ingskodonet. Primerene inkluderte restriksjonsseter for kloning i ekspresjonsvektorer. Sekvensen av 5'-primeren var GAC-AAGCTTCACAGGGTGGAACAAGATG (med Hindlll-setet understreket)

(SEKV.ID NR: 17), og sekvensen av 3'-primeren var GTC TCTAGACC-ACTTGAGTCCGTGTCA (med Xbal-setet understreket) (SEKV.ID NR: 18). Betingelsene for PCR-amplifiseringen var 94 °C i

8 minutter, etterfulgt av 40 sykluser ved 94 °C i 1 minutt,

55 °C i 45 sekunder og 72 °C i 1 minutt. De amplifiserte produkter ble klonet i Hindlll og Xbal-setene av pcDNA3 og en klon ble erholdt og sekvensert. Det uforkortede makak-cDNA og de utledete aminosyresekvenser er hhv. vist i SEKV.ID NR: 19 og 20. Nukleotidsekvensen av makak-88C er 98 % identisk med den humane 88C-sekvens. De utledete aminosyresekvenser er 97 % identiske.

Eksempel 3

mRNA-ekspresjonsmønstrene for 88-2B og 88C ble bestemt ved hjelp av Northern blot-analyser.

Norther-blots inneholdende immobilisert poly A<+> RNA fra forskjellige humane vev ble innkjøpt fra Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA. Nærmere bestemt ble de følgende vev undersøkt: Hjerte, hjerne, placenta, lunge, lever, skjelettmuskel, nyrer, pankreas, milt, thymus, prostata, testikkel, ovarie, tynntarm, tykktarm og perifere blodleukocytter.

En probe spesifikk for 88-2B-nukleotidsekvenser ble dannet fra cDNA klon 478. cDNA-innføyelsen i klon 478 inneholder en sekvens som tilsvarer SEKV.ID NR: 3 med nukleotider 641-1915. For å danne en probe ble klon 478 spaltet og det innføyde DNA-fragment ble isolert etter gelelektroforese. Det isolerte innføyde fragment ble deretter radiomerket med 32P-merkede nukleotider ved anvendelse av kjente teknikker.

En probe spesifikk for 88C-nukleotidsekvenser ble dannet ved å isolere og radiomerke det innføyde DNA-fragment funnet i klon 493. Det innføyde fragment fra klon 4 93 inneholder en sekvens som tilsvarer SEKV.ID NR: 1 med nukleotider 421-1359. Konvensjonelle teknikker som involverer <32>P-merkede nukleotider ble også her anvendt for å danne proben.

Northern blots probet med 88-2B avslørte et ca.

1,8 kb mRNA i perifere blodleukocytter. 88C Northern blots viste et ca. 4 kb mRNA i flere humane vev, inkludert et sterkt signal når milt- eller thymusvev ble probet, og et mindre intenst signal når mRNA fra perifere blodleukocytter og tynntarm ble analysert. Et forholdsvis svakt signal for 88C ble påvist i lungevev og ovarievev.

Ekspresjonen av 88C i humane T-celler og i hematopoetiske cellelinjer ble også bestemt ved hjelp av Northern blot-analyse. Nivåer av 88C i CD4<+-> og CD8<+->T-celler var svært høye. Transkripsjonen var til stede i forhold til høye nivåer i myeloidcellelinjer THP1 og HL-60 og ble også funnet i B-cellelinjen Jijoye. cDNA var dessuten en forholdsvis tallrik transkripsjon i et humant makrofag-cDNA-bibliotek, basert på

PCR-amplifikasjon av biblioteksubfraksjoner.

Eksempel 4

88-2B- og 88C-CDNA ble uttrykt ved hjelp av rekombinante metoder i pattedyrceller.

For kortvarige transfeksjonseksperimenter ble 88C subklonet i pattedyrcelleekspresjonsvektoren pBJl (Ishi, K. et al., J. Biol. Chem. 270:16435-16440 (1995)). Konstruksjonen inkluderte sekvenser som koder for en prolaktinsignalsekvens for effektiv celleoverflateekspresjon og en FLAG-epitop ved aminoterminalen av 88C, for å lette påvisning av det uttrykte protein. FLAG-epitopen består av sekvensen "DYKDDDD". COS-7-celler ble kortvarig transfektert med 88C-ekspresjonsplasmidet ved anvendelse av Lipofectamin (Life Technology, Inc., Grand Island, NY) etter fabrikantens instruksjoner. Kort beskrevet ble celler utsådd i 24-brønners plater med en tetthet på 4 x IO<4> celler pr. brønn og dyrket over natten. Cellene ble deretter vasket med PBS, og 0,3 mg DNA blandet med 1,5 ul lipofektamin i 0,25 ml Opti-MEM ble tilsatt til hver brønn. Etter 5 timer ved 37 °C ble mediet erstattet med medium inneholdende 10 % FCS. Kvantitativ ELISA bekreftet at 88C ble uttrykt på celleoverflaten i kortvarig transfekterte COS-7-celler ved anvendelse av Ml-antistoffet spesifikt for FLAG-epitopen (Eastman Co., New Haven, CT).

Den FLAG-merkede 88C-reseptor ble også stabilt transfektert i HEK-293-celler, en human embryotisk nyrecellelinje, ved anvendelse av transfeksjonsreagens DOTAP (N-[1-[ (2,3-di-oleoyloksy)propyl]-N,N,N-trimetylammoniummetylsulfat, Boehringer-Mannheim, Inc., Indianapolis, IN) i overensstemmelse med fabrikantens anbefalinger. Stabile linjer ble utvalgt i nærvær av legemidlet G418. De transfekterte HEK293-celler ble evaluert for ekspresjon av 88C på celleoverflaten ved hjelp av ELISA, under anvendelse av Ml-antistoffet mot FLAG-epitopen. ELISA viste at 88C merket med FLAG-epitopen ble uttrykt på celleoverflaten av stabilt transformerte HEK-293-celler.

88-2B- og 88C-cDNA ble anvendt for å danne stabile HEK-293-transfektanter. 88-2B-reseptor-cDNA ble klonet bak

cytomegaloviruspromoteren i pRc/CMV (Invitrogen Corp., San Diego, CA) ved anvendelse av en PCR-basert strategi. Templatet for PCR-reaksjonen var cDNA-innføyelsen i klon 777. PCR-primerene var 88-2B-3 (inneholdende et intert Xbal-sete) og 88-2B-5 (inneholdende et internt Hindlll-sete). Nukleotidsekvensen av primer 88-2B-3 er vist i SEKV.ID NR: 9; nukleotidsekvensen av primer 88-2B-5 er vist i SEKV.ID NR: 10. Et 1104 bp-område av cDNA ble amplifisert. Etter amplifisering ble DNA spaltet med Xbal og Hindlll og klonet i likeledes spaltede pRc/CMV. Det resulterende plasmid ble betegnet 777XP2 som inneholder 18 bp med 5'-utranslatert sekvens, hele kodingsområdet av 88-2B og 3 bp av 3'-utranslatert sekvens. For 88C-sekvensen ble den uforkortede cDNA-innføyelsen i klon 134 ikke ytterligere modifisert før transfeksjon av HEK-293-celler.

For å danne stabilt transformerte cellelinjer ble de pRc/CMV-rekombinante kloner transfektert ved anvendelse av transfeksjonsreagens DOTAP (N-[1-[(2,3-dioleoyloksy)propyl]-N,N,N-trimetylammoniummetylsulfat, Boehringer-Mannheim, Inc., Indianapolis, IN) i overensstemmelse med fabrikantens anbefalinger, i HEK-293-celler, en human embryonisk nyrecellelinje. Stabile linjer ble utvalgt i nærvær av legemidlet G418. Standard screeningsprosedyrer (dvs. Northern blot-analyser) ble utført for å identifisere stabile cellelinjer som uttrykker de høyeste nivåer av 88-2B- og 88C-mRNA.

Eksempel 5

A. Ca++- f luksanalyser

For å analysere polypeptidekspresjon ble det anvendt en funksjonell analyse for kjemokinreseptoraktivitet. Et vanlig trekk ved signalisering gjennom de kjente kjemokinreseptorer er at signaltransduksjon er forbundet med frigivelsen av intracellulære kalsiumkationer. Ca<++->konsentrasjon i de transfekterte HEK-293-celler ble derfor analysert for å bestemme hvorvidt 88-2B- eller 88C-reseptorene reagerte på noen av de kjente kjemokiner.

HEK-293-celler, stabilt transfektert med 88-2B, 88C (uten FLAG-epitopsekvensen), eller et kontrollkodingsområde

(som koder for IL8R eller CCCKR2, se nedenfor) som beskrevet ovenfor, ble dyrket i T75-flasker til ca. 90 % konfluens i MEM + 10 % serum. Celler ble deretter vasket, innhøstet med versen (0,6 mM EDTA, 10 itiM Na2HP04, 0,14 M NaCl, 3 mM KC1 og 1 mM glukose), og inkubert i MEM + 10 % serum + 1 uM Fura-2 AM (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) i 30 minutter ved rom-temperatur. Fura-2 AM er et Ca<++->sensitivt fargestoff. Cellene ble resuspendert i Dulbeccos fosfatbufret saltløsning inneholdende 0,9 mM CaCl2 og 0,5 mM MgCl2 (D-PBS) til en konsentrasjon på ca. IO<7> celler/ml, og endringer i fluorescens ble undersøkt ved hjelp av et fluorescensspektrofotometer (Hitachi modell F-4010). Ca. IO<6> celler ble suspendert i 1,8 ml D-PBS i en kyvette opprettholdt ved 37 °C. Eksitasjonsbølgelengde alternerte mellom 340 og 380 nm med 4 sekunders mellomrom; emisjonsbølgelengden var 510 nm. Testpreparater ble tilsatt til kyvetten via en injeksjonsåpning; maksimal Ca<++->fluks ble målt ved tilsetning av ionomycin.

Positive responser ble observert i celler som uttrykker IL-8RA når de stimuleres med IL-8, og også når CCCKR2 ble stimulert med MCP-1 eller MCP-3. HEK-293-celler som uttrykker enten 88-2B eller 88C viste imidlertid ingen fluks i intracellulær Ca<++->konsentrasjon når de ble utsatt for ethvert av de følgende kjemokiner: MCP-1, MCP-2, MCP-3, MIP-la, MIP-1(5, IL8, NAP-2, gro/MGSA, IP-10, ENA-78 eller PF-4.

(Peprotech, Inc., Rocky Hill, NJ).

Ved anvendelse av en mer sensitiv analyse ble det mikroskopisk observert en Ca<++->fluksrespons på RANTES i Fura-2 AM-fylte celler som uttrykker 88-2B. Analysen involverte celler og reagenser fremstilt som beskrevet ovenfor. RANTES (Regular on Activation, Normal T Expressed and Secreted) er et CC-kjemokin som er blitt identifisert som et kjemisk tiltrekningsmiddel og en aktivator av eosinofiler. Se Neote et al., supra. Dette kjemokin formidler også frigivelsen av histamin ved hjelp av basofiler og har blitt vist å virke som et kjemisk tiltrekningsmiddel for hukommelses-T-celler in vitro. Modulering av 88-2B-reseptoraktiviteter anses derfor for å være anvendelig ved modulering av leukocyttaktivering. FLAG-merket 88C-reseptor ble uttrykt i HEK-293-celler og testet for kjemokininteraksjoner i Ca<++->fluksanalysen. Celleoverflateekspresjon av 88C ble bekreftet ved ELISA og ved FACScananalyse ved anvendelse av Ml-antistoffet. Kjemokinene RANTES, MIP-la og MIP-ip induserte alle en Ca<++->fluks i 88C-transfekterte celler når de ble tilsatt i en konsentrasjon på 100 nM.

Ca<++->fluksanalyser kan også utformes for å identifisere modulatorer av kjemokinreseptorbinding. De foregående fluorometriske eller mikroskopiske analyser utføres i nærvær av testforbindelser. Dersom Ca<++->fluks økes i nærvær av en testforbindelse, så er denne forbindelse en aktivator av kjemokinreseptorbinding. I motsetning til dette identifiserer en redusert Ca<++->fluks testforbindelsen som en inhibitor av kj emokinreseptorbinding.

B. Fosfoinositolhydrolyse

En annen analyse for ligander eller modulatorer involverer undersøkelse av fosfolipase C-aktivitet som beskrevet i Hung et al., J. Biol. Chem. 116:827-832 (1992). Først fylles vertsceller som uttrykker en kjemokinreseptor med <3>H-inositol i 24 timer. Testforbindelser (dvs. potensielle ligander) tilsettes deretter til cellene og inkuberes ved 37 °C i 15 minutter. Cellene utsettes deretter for 20 mia maursyre for å oppløse og ekstrahere hydrolyserte metabolitter av fosfoinositolmetabolisme (dvs. produkter av fosfolipase C-for-midlet hydrolyse). Ekstraktet underkastes anionbytter-kromatografi ved anvendelse av en AG1X8 anionbytterkolonne (formiatform). Inositolfosfater elueres med 2 M ammoniumformiat/0,1 M maursyre og <3>H assosiert med forbindelsene bestemmes ved anvendelse av væskescintillasjonsspektrofotometri. Fosfolipase C-analysen kan også utnyttes for å identifisere modulatorer av kjemokinreseptoraktivitet. Den ovennevnte analyse utføres som beskrevet, men med tilsetning av en potensiell modulator. Forhøyede nivåer av påvisbar markør vil indikere at modulatoren er en aktivator; reduserte nivåer av markør vil indikere at modulatoren er en inhibitor av kjemokinreseptoraktivitet .

Fosfolipase C-analysen ble utført for å identifisere kjemokinligander av den FLAG-merkede 88C-reseptor. Ca. 24 timer etter transfeksjon ble C0S-7-celler som uttrykker 88C merket i 20-24 timer med myo-[2-3H] inositol (1 uCi/ml) i inositolfritt medium inneholdende 10 % dialysert FCS. Merkede celler ble vasket med inositolfritt DMEM inneholdende 10 mM LiCl og inkubert ved 37 °C i én time med inositolfritt DMEM inneholdende 10 mM LiCl og én av de følgende kjemokiner: RANTES, MIP-ipf MIP-la, MCP-1, IL-8 eller muse-MCP-l-homologen JE. Dannelse av inositolfosfat (IP) ble analysert som beskrevet i det foregående avsnitt. Etter inkubasjon med kjemokiner ble mediet suget bort og cellene ble lysert ved tilsetning av 0,75 ml iskald 20 mM maursyre (30 minutter). Super-natantfraksjoner ble applisert på AG1-X8 Dowex-kolonner (Biorad, Hercules, CA), etterfulgt av umiddelbar tilsetning av 3 ml 50 mM NH4OH. Kolonnene ble deretter vasket med 4 ml 40 mM

ammoniumformiat, etterfulgt av eluering av 2 M ammoniumformiat. Totalt innhold av inositolfosfater ble kvantifisert ved telling av (5-emisjoner.

Fordi det er blitt vist at noen kjemokinreseptorer, slik som IL8RA og IL8RB, fordrer kotransfeksjon med et eksogent G-protein før signalisering kan påvises COS-7-celler, ble 88C-reseptoren uttrykt sammen med det kimære G-protein Gqi5 (Conklin, et al., Nature 363:274-276, (1993)). Gqi5 er et G-protein som har de karboksylterminale 5 aminosyrer av Gi (som bindes til reseptoren) spleiset til Gaq. Kotransfeksjon med Gqi5 gir betydelig potensiering av signalisering ved hjelp av CCCKRl og CCCKR2B. Kotransfeksjon med Gqi5 avslørte at 88C signaliserte godt som respons på RANTES, MIP-1(3 og MIP-la, men ikke som respons på MCP-1, IL-8 eller muse-MCP-l-homologen JE. Dose-responskurve avslørte ECso-verdier på 1 nM for RANTES, 6 nM for MIP-10 og 22 nM for MIP-la.

88C er den første klonede humane reseptor med en signaliseringsrespons på MIP-1(5. Sammenlignet med andre CC-kjemokiner har MIP-ip klart et unikt cellulært aktiverings-mønster. Det synes å aktivere T-celler, men ikke monocytter (Baggiolini et al., supra), hvilket er overensstemmende med reseptorstimuleringsundersøkelser. Selv om MIP-ip bindes til CCCKRl induserer det ikke kalsiumfluks (Neote et al., supra).

I motsetning til dette vil MIP-la og RANTES bindes til, og forårsake signalisering i CCCKRl og CCCKR5 (RANTES forårsaker også aktivering av CCCKR3). MIP-1B synes således å være langt mer selektiv enn andre kjemokiner av CC-kjemokinfamilien. En slik selektivitet har terapeutisk betydning fordi en spesifikk fordelaktig aktivitet kan stimuleres (slik som undertrykkelse av HIV-infeksjon) uten å stimulere multiple leukocyttpopula-sjoner som fører til generelle proinflammatoriske aktiviteter.

C. Bindingsanalyser

En annen analyse for reseptorinteraksjon med kjemokiner var en modifikasjon av bindingsanalysen beskrevet av Ernst et al., J. Immunol. 152:3541-3549 (1994). MIP-1(3 ble merket ved anvendelse av Bolton og Hunter-reagenset (dijodid, NEN, Wilmington, DE), i overensstemmelse med fabrikantens instruksjoner. Ukonjugert jodid ble separert fra merket protein ved eluering ved anvendelse av en PD-10-kolonne (Pharmacia) ekvilibrert med PBS og BSA (1 % vekt/volum). Den spesifikke aktivitet var typisk 2 200 Ci/mol. Likevektsbinding ble utført ved tilsetning av <125>I-merket ligand med eller uten 100 ganges overskudd av umerket ligand, til 5 x IO<5> HEK-293-celler transfektert med 88C merket med FLAG-epitopen i poly-propylenrør, i et totalt volum på 300 ul (50 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM CaCl2, MgCl2, 0,5 % BSA) og inkubasjon i 90 minutter ved

27 °C under omrøring ved 150 rpm. Cellene ble innsamlet ved anvendelse av en Skatron-celleinnhøster (Skatron Instruments Inc., Sterling, VA) på glassfiberfiltere som på forhånd var

neddyppet i 0,3 % polyetylenimin og 0,2 % BSA. Etter vask ble filtrene fjernet og bundet ligand ble kvantifisert ved å telle y-emisjoner. Ligandbinding ved konkurranse med umerket ligand ble bestemt ved inkubasjon av 5 x IO<5> transfekterte celler (som ovenfor) med 1,5 mM radiomerket ligand og de angitte konsentrasjoner av umerket ligand. Prøvene ble innsamlet, vasket og tellet som ovenfor. Dataene ble analysert ved anvendelse av kurvetilpasningsprogrammet Prism (GraphPad Inc., San Diego, CA) og det iterative, ikke-lineære regressjonsprogram, LIGAND (PM220).

I likevektsbindingsanalyser bandt 88C-reseptor radiomerket MIP-1|3 på en spesifikk og metningsbar måte. Analyse av disse bindingsdata ved hjelp av metoden ifølge Scatchard av-slørte en dissosiasjonskonstant (Kd) på 1,6 nM. Konkurranse-bindingsanalyser ved anvendelse av merket MIP-1(3 avslørte høy-affinitetsbinding av MIP-lp (IC50 = 7,4 nM) , RANTES (IC50 =

6,9 nM) og MIP-la (IC50 = 7,4 nM) , som var overensstemmende med signaliseringsdataene erholdt i kortvarig transfekterte C0S-7-celler som diskutert i kapittel B ovenfor.

Eksempel 6

Kjemokinene MIP-la, MIP-1B og RANTES har blitt vist å inhibere replikasjon av HIV-1 og HIV-2 i humane, perifere, mononukleære blodceller og PMl-celler (Cocchi et al., supra). I betraktning av dette funn og i betraktning av resultatene beskrevet i eksempel 5, antas det ifølge foreliggende oppfinnelse at aktivering av, eller ligandbinding til, 88C-reseptoren kan tilveiebringe en beskyttende rolle ved HIV-infeksjon.

Det er nylig blitt rapportert at den "foreldreløse" G-proteinkoblede reseptor, fusin, kan virke som en koreseptor for inntreden av HIV. Fusin/CXCR4 i kombinasjon med CD4, den primære HIV-reseptor, understøtter tilsynelatende HIV-infeksjon av dyrkede T-celler (Feng, et al., Science 272:872-877

(1996)). Basert på homologien av fusin med kjemokinreseptorer og kjemokinbindingsprofilen for 88C, og fordi 88C uttrykkes konstitutivt i T-celler og uttrykkes rikelig i makrofager, vil 88C sannsynligvis være involvert i virus- og HIV-infeksjon.

Funksjonen av 88C og 88-2B som koreseptorer for HIV ble bestemt ved transfeksjon av celler som uttrykker CD4 med 88C eller 88-2B og utfordring av de kotransfekterte celler med HIV. Kun celler som uttrykker både CD4 og en funksjonell koreseptor for HIV blir infisert. HIV-infeksjon kan bestemmes ved hjelp av flere metoder. ELISA som tester for ekspresjon av HIV-antigener er kommersielt tilgjengelige, f.eks. Coulter HIV-1 p24-antigenanalyse (US patent nr. 4 886 742), Coulter Corp., 11800 SW 147th Ave., Miami, FL 33196. Alternativt kan testcellene konstrueres for å uttrykke et rapportørgen, slik som LACZ bundet til HIV LTR-promoteren [Kimpton et al., J. Virol. 66:2232-2239 (1992)]. Ved denne metode påvises celler som er infisert med HIV ved hjelp av en kolorimetrisk analyse. 88C ble kortvarig transfektert i en kattecellelinje, CCC [Clapham, et al., 181:703-715 (1991)], som var blitt stabilt transformert for å uttrykke humant CD4 (CCC-CD4). Disse celler er vanligvis resistente mot infeksjon av enhver stamme av HIV-1 fordi de ikke uttrykker 88C endogent. I disse eksperimenter ble CCC/CD4-celler kortvarig transfektert med 88C klonet i ekspresjonsvektoren pcDNA3.1 (Invitrogen Corp., San Diego, CA) ved anvendelse av lipofektamin (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). To dager etter transfeksjon ble cellene utfordret med HIV. Etter fire dagers inkubasjon ble cellene fiksert og farget for p24-antigen som et mål på HIV-infeksjon. 88C-ekspresjon av disse celler gjorde dem mottakelige for infeksjon av flere stammer av HIV-1. Disse stammer inkluderte fire primære ikke-syncytiuminduserende HIV-l-isolater (M23, E80, SL-2 og SF-162) som ble vist å anvende kun 88C som en koreseptor, men ikke fusin. Flere primære syncytiuminduserende stammer av HIV-1 (2006, M13, 2028 og 2076) anvendte enten 88C eller fusin som en koreseptor. To etablerte klonale HIV-1-viruser (GUN-1 og 89.6) anvendte også enten 88C eller fusin som koreseptor.

Det er rapportert at noen stammer av HIV-2 kan infisere visse CD4-negative cellelinjer, hvilket således impliserer en direkte interaksjon av HIV-2 med en reseptor foruten CD4 [Clapham, et al., J. Virol. 66:3531-3537 (1992)]. For noen stammer av HIV-2 gjøres denne infeksjon lettere ved tilstedeværelse av oppløselig CD4 (sCD4). Fordi 88-2B deler høy sekvenslikhet med andre kjemokinreseptorer som virker som HIV-koreseptorer (nemlig 88C og fusin), ble 88-2B betraktet å være en sannsynlig HIV-2-koreseptor. Rollen til 88-2B som en HIV-2-koreseptor ble vist ved anvendelse av HIV-2 stamme ROD/B. Katte-CCC-celler som ikke uttrykker CD4 endogent ble transfektert med 88-2B. I disse eksperimenter ble celler transfektert med pcDNA3.1 inneholdende 88-2B ved anvendelse av lipofektamin, og infisert med HIV-2 4 8 timer senere. 3 dager etter infeksjon ble cellene immunfarget for tilstedeværelse av HIV-2-kappeglykoproteiner. Tilstedeværelsen av sCD4 under HIV-2R0D/B-utfordringen ga en 10 gangers økning av infeksjonen av disse celler. Intregningen av HIV-2 i de 88-2B-transfekterte celler kunne blokkeres ved tilstedeværelse av 400-800 ng/ml eotaksin, én av ligandene for 88-2B. Basislinjeinfektivtets-nivåer av CCC/88-2B (uten noe oppløselig CD4) var ekvivalente med CCC-celler som ikke var transfektert med 88-2B.

Rollen til 888-2B og 88C som koreseptorer for HIV ble bekreftet ved å preparere og utfordre cellelinjer som var stabilt transformert for å uttrykke 88C eller 88-2B, med forskjellige stammer av HIV og SIV. Disse resultater er beskrevet i eksempel 7.

Koreseptorrollen til 88C og 88-2B kan alternativt demonstreres ved hjelp av en eksperimentell metode som ikke fordrer anvendelse av levende virus. Ved denne metode blandes cellelinjer som samtidig uttrykker 88C eller 88-2B, CD4 og et LACZ-rapportørgen, med en cellelinje som samtidig uttrykker HIV-kappeglykoproteiner (ENV) og en transkripsjonsfaktor for rapportørkonstruksjonen (Nussbaum, et al., 1994 J. Virol. 68:5411). Celler som uttrykker en funksjonell koreseptor for HIV vil fusjonere med de ENV-uttrykkende celler og derved til-late ekspresjon av rapportørgenet. Ved denne metode indikerer påvisning av rapportørgenproduktet ved kolorimetrisk analyse at 88C eller 88-2B funksjonerer som en koreseptor for HIV.

Mekanismen ved hvilken kjemokiner inhiberer virusinfeksjon er enda ikke belyst. En mulig mekanisme involverer aktivering av reseptoren ved binding av et kjemokin. Bindingen av kjemokinet fører til signaltransduksjonshendelser i cellen som gjør cellen resistent mot virusinfeksjon og/eller for-hindrer replikasjon av viruset i cellen. På samme måte som interferoninduksjon kan cellen differensiere slik at den er resistent mot virusinfeksjon, eller det etableres en anti-virustilstand. Alternativt involverer en andre mekanisme direkte forstyrrelse av virusinntregning i celler ved å blokkere adgang av viruskappeglukoproteiner til koreseptoren ved kjemokinbinding. I denne mekanisme kreves ikke G-protein-signalering for kjemokinundertrykkelse av HIV-infeksjon.

For å skjelne mellom to mekanismer ved hvilke 88C eller 88-2B kan virke som koreseptorer for virus- eller HIV-infeksjon, frakobles kjemokinbinding til reseptoren fra signaltransduksjon og effekten av kjemokinet på undertrykkelse av virusinfeksjon bestemmes.

Ligandbinding kan frakobles fra signaltransduksjon ved tilsetning av forbindelser som inhiberer G-protein-formidlet signalisering. Disse forbindelser inkluderer f.eks. pertussistoksin og koleratoksin. Nedstrøms effektorpoly-peptider kan dessuten inhiberes ved hjelp av andre forbindelser, slik som urtemannin. Dersom G-proteinsignalisering er involvert i undertrykkelse av virusinfeksjon, vil tilsetning av slike forbindelser forhindre undertrykkelse av virusinfeksjon av kjemokinet. Alternativt kan nøkkelrester eller reseptordomener av 88C- eller 88-2B-reseptoren fordret for G-proteinkobling, endres eller deleteres, slik at G-protein-kobling endres eller ødelegges, men at kjemokinbinding ikke blir påvirket.

Under disse betingelser, dersom kjemokiner ikke er i stand til å undertrykke virus- eller HIV-infeksjon, så er signalisering gjennom et G-protein nødvendig for undertrykkelse av virus- eller HIV-infeksjon. Dersom kjemokiner imidlertid er i stand til å undertrykke virusinfeksjon, så er G-proteinsignalisering ikke påkrevet for kjemokinundertrykkelse av virusinfeksjon, og de beskyttende effekter av kjemokiner kan skyldes at kjemokinet blokkerer tilgjengeligheten av reseptoren for viruset.

En annen metode involverer anvendelse av antistoffer rettet mot 88C eller 88-2B. Antistoffer som bindes til 88C eller 88-2B og som kan vises ikke å utløse G-proteinsignalisering, kan blokkere adgang til reseptorens kjemokin- eller virusbindingssete. Dersom virusinfeksjon undertrykkes i nærvær av antistoffer mot 88C eller 88-2B, så er mekanismen for de beskyttende effekter av kjemokiner, blokkering av virusadgang til dens reseptor. Feng, et al., rapporterte at antistoffer mot aminoterminalen av fusinreseptoren undertrykte HIV-infeksjon (Feng, et al., 1996).

Eksempel 7

Cellelinjer ble stabilt transformert med 88C eller 88-2B for ytterligere å skildre rollen til 88C og 88-2B ved HIV-infeksjon. Kimpton og Emerman, "Detection of Replication-Competent and Pseudotyped Human Immunodeficiency Virus with a Sensivite Cell Line on the Basis of Activation of an Integrated Beta-Galactosidase Gene," J. Virol, 66 (5):3026-3031

(1992) var tidligere beskrevet en indikatorcellelinje, heri

identifisert som HeLa-MAGI-celler. HeLa-MAGI-celler er HeLa-celler som er blitt stabilt transformert for både å uttrykke CD4 og integrert HIV-1 LTR som styrer ekspresjon av et kjerne-lokalisert B-galaktosidasegen. Integrasjon av en HIV-provirus i cellene fører til produksjon av virustransaktivatoren, Tat, som deretter åpner for ekspresjon av B-galaktosidasegenet.

Antallet celler som farger positivt med X-gal for B-galaktosidaseaktivitet in situ, er direkte proporsjonal med antallet infiserte celler.

Disse HeLa-MAGI-celler kan påvise laboratorietil-passede isolater av HIV-1, men kun et mindretall av primære isolater [Kimpton og Emerman, supra], og kan ikke påvise de fleste HIV-isolater [Chackerian et al., "Characterization of a CD4-Expressing Macaque Cell Line that can be infected by Diverse Simian Immunodeficiency Virus Isolates." Virology, 213(2):6499-6505 (1995)].

Harrington og Geballe, "Co-Factor Requirement of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Entry into a CD4-Expres-sing Human Cell Line, J. Viol., 67:5939-5947 (1993) har dessuten beskrevet en cellelinje basert på U373-celler som var blitt konstruert til å uttrykke CD4 og den samme LTR-B-galaktosidasekonstruksjon. Det var tidligere vist at denne cellelinje, heri identifisert som U373-MAGI, ikke kunne infiseres med noen HIV (M eller T-tropisk) stamme av HIV, men kunne gjøres mottakelig for infeksjon ved fusjon med HeLa-celler [Harrington og Geballe, supra].

For å konstruere indikatorcellelinjer som kunne påvise enten makrofag- eller T-celle-tropiske viruser, ble DNA som koder for epitopmerket 88C eller 88-2B transfektert i HeLa-MAGI- eller U373-MAGI-celler ved infeksjon med en retro-virusvektor for å danne hhv. HeLa-MAGI-88C- eller U373-MAGI-88C-cellelinjer. Ekspresjon av koreseptorene på celleoverflaten ble demonstrert ved immunfarging av levende celler ved anvendelse av anti-FLAG Ml-antistoffet og ved hjelp av RT-PCR.

88C- og 88-2B-genene anvendt for å konstruere HeLa-MAGI-88C og U373-MAGI-88C, inkluderte sekvenser som koder for prolaktinsignalpeptidet etterfulgt av en FLAG-epitop, som beskrevet i eksempel 4. Dette gen ble innføyet i retrovirus-vektoren pBabe-Puro [Morgenstern og Land Nucleic Acids Research, 18(12):3587-3596 (1990)]. Retrovirusvektorforråd med høyt titer pseudotypebestemt med VSV-G-proteinet, ble fremstilt med kortvarig transfeksjon som beskrevet i Bartx et al., J. Virol. 70:2324-2331 (1996), og anvendt for å infisere HeLa-MAGI- og U373-MAGI-celler. Celler resistente mot 0,6 ug/ml puromycin (HeLa) eller 1 ug/ml puromycin (U373) ble sammen-slått. Hver samling inneholdt minst 1 000 uavhengige transduk-sjonstilfeller. En tidlig passasje (passasje 2) forråd av de opprinnelige HeLa-MAGI-celler [Kimpton og Emerman, supra] ble anvendt for på danne HeLa-MAGI-88C-celler.

Infeksjoner av indikatorcellelinjene med HIV ble ut-ført på 12 brønners plater med 10 gangers seriefortynninger av 300 ul virus i nærvær av 30 ug/ml DEAE-dekstran som beskrevet [Kimpton og Emerman, supra].

Alle HIV-l-stammer og SVImac239 ble erholdt fra NIH AIDS referanse- og reagensprogram. Molekylære kloner av primært HIV-273i2a [Gao et al., "Genetic Diversity of Human Immunodeficiency Virus Type 2: Evidence of Distinct Sequence Subtypes with Differences in Virus Biology," J. Virol., 68(11):7433-7447 (1992)] og SIVsmPbjl.9 [Dewhurst et al., "Sequence Analysis and Acute Pathogenicity of Molecularly Cloned SIVsinm-PBj 14, " Nature, 345:636-640 (1990)] ble erholdt fra B. Hahn (UAB) . Alle andre SlV^-isolater ble erholdt fra Julie Overbaugh (U. Washington, Seattle). Forråd av klonede proviruser ble dannet ved kortvarig transfeksjon av 293-celler. Andre virusforråd ble dannet ved passering av virus i humane, perifere, mononukleære blodceller eller i CEMxl74-celler (for SIV-forråd). Virusforråd ble normalisert ved hjelp av ELISA eller p24<gag> (Coulter-immunologi) eller p27<gag> (Coulter immunologi) for hhv. HIV-1 og HIV-2/SIV, ved anvendelse av standarder tilveiebrakt av fabrikanten.

U373-MAGI-88C-celler og U373-MAGI-celler (kontroller) ble infisert med begrensende fortynninger av en T-tropisk stamme av HIV-1 (HIVLA1) , en M-tropisk stamme (HIVyo-2) , og et SIV-isolat, SIVmac239. Infektivitet ble målt ved å telle antallet blå celler pr. brønn pr. volum av virus (tabell 2).

To dager etter infeksjon ble celler fiksert og farget for B-galaktosidaseaktivitet med X-gal. De U373-avledede MAGI-celler ble farget i 120 minutter ved 37 °C og de HeLa-avledede MAGI-celler ble farget i 50 minutter ved 37 °C. Bakgrunns-farging av ikke-infiserte celler overskred aldri mer enn ca. tre blå celler pr. brønn. Kun mørkeblå celler ble tellet og syncytium med flere kjerner ble tellet som en enkel infisert celle. De infeksiøse titer er antallet blå celler pr. brønn multiplisert med fortynningen av virus og normalisert til 1 ml. Titeret for HIVYU-2 på U373-MAGI-88C-celler var 2 x IO<6>. I motsetning til dette var titeret for HIV-lLflI lavere enn 100 på U373-MAGI-88C. Spesifisiteten av en spesiell HIV-stamme for 88C varierte således med en størrelsesorden på 4.

Selv om SIVMAC239-infeksjon var økt til 4 x IO<5> i U373-MAGI-88C, infiserte den også tydelig U373-MAGI-celler

(tabell 2).

En serie av primære uklonede HIV-stammer og klonede M-tropiske stammer av HIV-1 ble deretter analysert for deres evne til å infisere indikatorcellelinjer som uttrykker 88C.

Som beskrevet ovenfor be HeLa-MAGI- og HeLa-MAGI-88C-celler infisert med begrensende fortynninger av forskjellige HIV-stammer. De to klonede M-tropiske viruser, HIVjr_Csf og HIVyo-2, infiserte begge HeLa-MAGI-88C-, men ikke HeLa-MAGI-celler, hvilket viser at begge stammer anvender 88C som en koreseptor (tabell 3, se anmerkning c). Det ble imidlertid observert en stor uensartethet i disse to virusstammers evne til å infisere HeLa-MAGI-88C-celler, 6,2 x IO<5> IU/ml for HIVYU.2 og 1,2 x IO<4> for HIVjr-Csf- Infektiviteten av virusforråd (tabell 3) er antallet infeksiøse enheter pr. fysisk partikkel (representert her ved mengden av viruskjerneprotein). Det ble dessuten observert at infektiviteten av disse to klonede virusstammer avvek fra hverandre med en størrelsesorden på over 50 ganger i virusforråd som var fremstilt uavhengig av hverandre.

Variabiliteten av infektiviteten av primære virus-isolater ble videre undersøkt ved å analyserer en samling av 12 forskjellige uklonede virusforråd fra tre forskjellige "clades" (tabell 3). Tre "clade" A-primære isolater, tre "clade" E-isolater og tre ytterligere "clade" B-isolater fra geografisk forskjellige opprinnelser ble benyttet. Med alle 9 stammer kunne den primære stamme av HIV påvises på HeLa-MAGI-88C-celler, men ikke på HeLa-MAGI-celler (tabell 3). Infek-sjonens virkningsfullhet varierte imidlertid fra fem infek-siøse enheter pr. ng p24<9ag> til over 100 infeksiøse enheter pr. ng p24<gag> (tabell 3). Disse resultater indikerer at absolutt infektivitet av M-tropiske stammer varierer betydelig og er uavhengig av "clade". En hypotese som kan forklare denne uoverensstemmelse kan involvere affiniteten av V3-løkken av hver virusstamme for 88C etter CD4-binding [Trkola et al., Nature, 384(6605):184-187 (1996); Wu et al., Nature, 384(6605):179-183 (1996)].

HeLa-MAGI-88C-cellenes evne til å påvise HIV-2 og andre SIV-stammer ble også bestemt. HIV-2ROd er blitt rapportert til å anvende fusin som en reseptor, selv i fravær av CD4 [Endres et al., Cell, 87 (4) : 745-756 (1996)]. HIV-2Rod er i stand til å infisere HeLa-MAGI-celler, men dets infektivitet er imidlertid forhøyet minst 10 ganger i HeLa-MagI-88C (tabell 4). HeLa-celler uttrykker fusin endogent. Det molekylære klon av HIV-2Roci er således dobbelt tropisk og er i stand til å anvende 88C som én av dens koreseptorer i tillegg til CXCR4. En primær stamme av HIV-27312A infiserte likeledes HeLa-MAGI-88C-celler og ikke HeLa-MAGI-celler, hvilket indikerer at den likeledes som primær stamme av HIV-1 anvender 88C som en reseptor.

Ingen av de testede SIV-stammer infiserte HeLa-MAGI-cellene (tabell 4), og ingen infiserte HeLa-MAGI-celler som uttrykker 88-2B. Dette indikerer at en alternativ koreseptor anvendt av SIV i U373-celler ikke uttrykkes i HeLa-celler og er ikke 88-2B. Alle testede SIV-stammer infiserte HeLa-MAGI-88C-cellene i noen grad (tabell 3), hvilket indikerer at alle de testede SIV-stammer benytter minst 88C som én av deres koreseptorer.

Den tidligere klassifikasjon av M-tropiske og T-tropiske stammer av HIV har ofte blitt korrelert med hhv. "ikke-syncytiuminduserende" (NSI), og "syncytiuminduserende"

(SI). Analyser basert på cellelinjene beskrevet heri er sensitive overfor syncytiumdannelser. De infiserte celler kan danne store og små infeksjonssentere inneholdende mange kjerner [Kimpton og Emerman, supra].

Eksperimenter som anvender mange forskjellige virusstammer og U373-MAGI-88C eller HeLa-MAGI-88C, indikerer at SI/NSI-betegnelsen ikke er meningsfull fordi alle virusstammer dannet syncytium dersom den korrekte koreseptor var til stede. Disse eksperimenter viser at syncytiumdannelse mer sannsynlig er en markør for tilstedeværelse av en passende koreseptor på den infiserte celle, heller enn en indikasjon på tropisme. Infeksjon av HeLa-MAGI-88C-cellene med SIV-stammer som i litteraturen er rapportert til å være ikke-syncytiumdannende stammer, spesielt SIVmac239, SIVhhEc18 og SIVmke170, var bemerk-elsesverdig fordi størrelsen av syncytiene indusert i mono-laget var mye større enn de som ble indusert av en hvilken som helst annen av HIV-stammene.

Eksempel 8

Musemonoklonale antistoffer som spesifikk gjenkjenner 88C ble fremstilt. Antistoffene ble produsert ved å immunisere mus med et peptid som tilsvarer de aminoterminale 20 aminosyrer av 88C. Peptidet ble konjugert til Keyhole Limpet Cyanin (KLH) i overensstemmelse med fabrikantens veiledning (Pierce, Imject maleimidaktivert KLH), emulgert i komplett Freund's adjuvans og injisert i fem mus. To ytterligere injeksjoner av konjugert peptid i ukomplett Freund's adjuvans ble utført med tre ukers mellomrom. Ti dager etter den siste injeksjon ble serum fra hver av de fem mus testet for immunreaktivitet med det 20 aminosyrers peptid ved hjelp av ELISA. Immunreaktivi-teten av seraene ble dessuten testet mot intakt 88C-reseptor uttrykt på overflaten av 293-celler, ved fluorescensaktivert cellesortering (FACS). Musen med den beste anti-88C-aktivitet ble valgt for miltcellefusjon og produksjon av monoklonale antistoffer ved hjelp av standard laboratoriemetoder. Fem monoklonale cellelinjer (227K, 227M, 227N, 227P, 227R) ble etablert som produserte antistoffer som gjenkjente peptidet ved hjelp av ELISA, og 88C-proteinet på 293-celler ved hjelp av FACS. Hvert antistoff ble vist å reagere kun med 88C-uttrykkende 293-celler, men ikke med 293-celler uttrykker en nasrt beslektede MCP-reseptor (CCCKR-2) . Hvert antistoff ble også vist å gjenkjenne 88C uttrykt kortvarig i COS-celler.

Kanin-polyklonale antistoffer ble også dannet mot 88C. To kaniner ble injisert med konjugert aminoterminalt peptid som beskrevet ovenfor. Kaninene ble videre immunisert ved hjelp av fire ytterligere injeksjoner av det konjugerte aminoterminale peptid. Serum fra hver av kaninene (2337J og 2470J) ble testet ved hjelp av FACS av 293-celler som uttrykker 88C. Serane kjente spesifikke 88C på overflaten av 293-celler.

De fem anti-88C-monoklonale antistoffer ble testet for deres evne til å blokkere infeksjon av celler ved hjelp av SIV, apeimmunsviktviruset nært beslektet med HIV [Lehner, et al., Nature Medicine, 2:767 (1996)]. Ape-C4<+> T-celler, som vanligvis er mottakelige for infeksjon av SIV, ble inkubert med SIVmac32HJ5-klonen i nærvær av de anti-88C-monoklonale antistoffsupernatanter fortynnet 1:5. SIV-infeksjon ble målt ved å bestemme revers transkriptase (RT) aktivitet på dag 9 ved anvendelse av RT-påvisnings- og kvantifiseringsmetoden (Quan-T-RT analysesett, Amersham, Arlington Heights, IL). Fire av antistoffene var i stand til å blokkere SIV-infeksjon: Antistoff 227K blokkert med 53 %, 227M med 59 %, 227N med 47 % og 227P med 81 %. Antistoff 227R blokkerte ikke SIV-infeksjon.

De fem monoklonale antistoffer mot humant 88C-aminoterminalt peptid ble også testet for reaktivitet mot makak-88C

(SEKV.ID NR: X) (som har to aminosyreforskjeller fra humant 88C i det aminoterminale peptidområde). Kodingsområdene av humant 88C og makak-88C ble klonet i ekspresjonsvektoren pcDNA3 (Invitrogen). Disse ekspresjonsplasmider ble anvendt for å transfektere COS-celler ved anvendelse av DEAE. Den tomme vektor ble anvendt som en negativ kontroll. Tre dager etter transfeksjon ble celler innhøstet og inkubert med de fem anti-88C-monoklonale antistoffer og preparert for FACS. Resultatene viste at fire av de fem antistoffer (227K, 227M, 227N, 227P) gjenkjente makak-88C, mens dette ikke var tilfelle for ett antistoff (227R). Alle fem antistoffer gjenkjente det transfekterte humane 88C, og ingen kryssreagerte med celler transfektert med vektor alene.

Eksempel 9

Ytterligere metoder kan anvendes for å identifisere ligander og modulatorer av kjemokinreseptorene ifølge foreliggende oppfinnelse

I én utførelsesform omfatter oppfinnelsen en direkte analyse for ligander. Påvisbart merkede testforbindelser utsettes for membranpreparater som oppviser kjemokinreseptorer i en funksjonell konformasjon. HEK-293-celler, eller vevskultur-celler, transfekteres f.eks. med en ekspresjonsvehikkel som koder for en kjemokinreseptor. Et membranpreparat dannes deretter fra de transfekterte celler som uttrykker kjemokinreseptoren. Membranpreparatet utsettes for 125I-merkede testforbindelser (f.eks. kjemokiner) og inkuberes under egnede betingelser (f.eks. 10 minutter ved 37 °C) . Membranene, med eventuelt bundne testforbindelser, oppsamles deretter på et filter ved vakuumfiltrering og vaskes for å fjerne ubundne testforbindelser. Radioaktiviteten assosiert med den bundne testforbindelse kvantifiseres deretter ved å underkaste filtrene væskescintillasjonsspektrofotometri. Spesifisiteten av bindingen av testforbindelse kan bekreftes ved å gjenta analysen i nærvær av økende mengder umerket testforbindelse og notere nivået av konkurranse for binding til reseptoren. Disse bindingsanalyser kan også identifisere modulatorer av kjemokinreseptorbinding. Den tidligere beskrevne bindingsanalyse kan utføres med de følgende modifikasjoner. I tillegg til en påvisbart merket testforbindelse utsettes en potensiell modulator for membranpreparatet. Et økt nivå av membranassosiert markør indikerer den potensielle modulator er en aktivator; et redusert nivå av membranassosiert markør indikerer at den potensielle modulator er en inhibitor av kj emokinreseptorbinding.

I en annen utførelsesform omfatter oppfinnelsen direkte analyser for identifikasjon av reseptorligander som utnytter koblingen av kjemokinreseptorer til G-proteiner. Som beskrevet i Linder et al., Sei. Am., 267:56-65 (1992), reagerer en aktivert reseptor under signaltransduksjon med et G-protein som i sin tur aktiverer G-proteinet. G-proteinet aktiveres ved å utbytte GDP med GTP. Etterfølgende hydrolyse av det G-proteinbundne GTP deaktiverer G-proteinet. En analyse for G-proteinaktivitet undersøker derfor frigivelsen av <32>Pi fra [y-<32>P]-GTP. Ca. 5 x IO<7> HEK-193-celler som inneholder plasmider ifølge oppfinnelsen dyrkes f.eks. i MEM + 10 % FCS. Vekstmediet suppleres med 5 mCi/ml [<32>P]-natriumfosfat i 2 timer for å oppnå ensartet merking av nukleotidforråd. Cellene vaskes deretter i en isotonisk buffer med lavt fosfat-innhold. En aliquot av vaskede celler bringes deretter i kontakt med en testforbindelse mens en andre aliquot med celler behandles på lignende måte, men uten å bringe den i kontakt med testforbindelsen. Etter en inkubasjonsperiode (f.eks. 10 minutter) blir cellene pelletert, lysert og nukleo-tidf orbindelse blir fraksjonert ved anvendelse av tynnsjikts-kromatografi utviklet med 1 M LiCl. Merket GTP og GDP identifiseres med samtidig kromatografering av kjente standarder. Det merkede GTP og GDP kvantifiseres deretter ved hjelp av standard autoradiografiske teknikker. Forholdsvis høye nivåer av <32>P-merket GDP identifiserer testforbindelser som ligander. Denne type av GTP-hydrolyseanalyse er også anvendelig for identifikasjon av modulatorer av kjemokinreseptorbinding. Den ovennevnte analyse utføres i nærvær av en potensiell modulator. Et intensifisert signal som resulterer fra en forholdsvis økning av GTP-hydrolyse, som produserer <32>P-merket GDP, indikerer en relativ økning av reseptoraktivitet. Det intensifiserte signal identifiserer derfor den potensiell modulator som en aktivator. Et redusert relativt signal for <32>P-merket GDP, som indikerer redusert reseptoraktivitet, identifiserer derimot den potensielle modulator som en inhibitor av kjemokinreseptorbinding.

Aktivitetene av G-proteineffektormolekyler (f.eks. adenylylsyklase, fosfolipase C, ionekanaler og fosfodiester-aser) kan også analyseres. Analyser for aktivitetene av disse effektormolekyler er tidligere beskrevet. Adenylylsyklase, som katalyserer syntesen av syklisk adenosinmonofosfat (cAMP), aktiveres f.eks. av G-proteiner. Ligandbinding til en kjemokinreseptor som aktiverer et G-protein, som i sin tur aktiverer adenylylsyklase, kan derfor påvises ved å undersøke cAMP-nivåer i en rekombinant vertscelle ifølge foreliggende oppfinnelse. Ved å gjennomføre egnede kontroller som er forstått i teknikken kan et forhøyet nivå av intracellulært cAMP tilskrives en ligandindusert økning av reseptoraktivitet, og identifiserer derved en ligand. På nytt ved å benytte kontroller forstått i teknikken vil en relativ reduksjon av konsentrasjonen av cAMP indirekte identifisere en inhibitor av reseptoraktivitet. Konsentrasjonen av cAMP kan måles ved hjelp av en kommersiell enzymimmunanalyse. Bio Trak-settet tilveiebringer f.eks. reagenser for en kompetitiv immunanalyse.

(Amersham, Inc., Arlington Heights, IL). Ved anvendelse av dette sett i overensstemmelse med fabrikantens anbefalinger utformes en reaksjon som involverer konkurranse med umerket cAMP med cAMP konjugert med pepperrotperoksidase. Det umerkede cAMP kan f.eks. erholdes fra aktiverte celler som uttrykker kjemokinreseptorene ifølge foreliggende oppfinnelse. De to forbindelser konkurrerer med hensyn til binding til et immobilisert anti-cAMP-antistoff. Etter konkurransereaksjonen blir det immobiliserte pepperrotperoksidase-cAMP-konjugat kvantifisert ved hjelp av enzymanalyse ved anvendelse av et tetrametylbenzidin/H202 substrat med påvisning av fargede reaksjonsprodukter ved 450 nm. Resultatene gir en basis for beregning av nivået av umerket cAMP, ved anvendelse av standard teknikker. I tillegg til å identifiserer ligander som bindes til kjemokinreseptorer kan cAMP-analysen også anvendes

for å identifisere modulatorer av kjemokinreseptorbinding. Ved anvendelse rekombinante vertsceller ifølge foreliggende oppfinnelse utføres analysen som tidligere beskrevet, med tilsetning av potensiell modulator av kjemokinreseptoraktivitet. Ved anvendelse av kontroller som er forstått i teknikken vil en relativ økning eller reduksjon av intracellulære cAMP-nivåer avspeile aktiveringen eller inhiberingen av adenylylsyklaseaktivitet. Nivået av adenylylsyklaseaktivitet avspeiler i sin tur den relative aktivitet av kjemokinreseptoren av interesse. Et relativt forhøyet nivå av kjemokinreseptoraktivitet identifiserer en aktivator; et relativt redusert nivå av reseptoraktivitet identifiserer en inhibitor av kjemokinreseptoraktivitet .

Selv om foreliggende oppfinnelse er beskrevet uttrykt ved spesifikke utførelsesformer, er det underforstått at variasjoner og modifikasjoner vil fremgår for fagfolk. Oppfinnelsen er således kun begrenset i overensstemmelse med de medfølgende krav.

70 75 80

ACT GTC CCC TTC TGG GCT CAC TAT GCT GCC GCC CAG TGG GAC TTT GGA 345

Thr Val Pro Phe Trp Ala His Tyr Ala Ala Ala Gin Trp Asp Phe Gly

85 90 95

AAT ACA ATG TGT CAA CTC TTG ACA GGG CTC TAT TTT ATA GGC TTC TTC 393

Asn Thr Met Cys Gin Leu Leu Thr Gly Leu Tyr Phe Ile Gly Phe Phe

100 105 110

TCT GGA ATC TTC TTC ATC ATC CTC CTG ACA ATC GAT AGG TAC CTG GCT 441

Ser Gly Ile Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr Ile Asp Arg Tyr Leu Ala

115 120 125

GTC GTC CAT GCT GTG TTT GCT TTA AAA GCC AGG ACG GTC ACC TTT GGG 489

Val Val His Ala Val Phe Ala Leu Lys Ala Arg Thr Val Thr Phe Gly

130 135 140 145

GTG GTG ACA AGT GTG ATC ACT TGG GTG GTG GCT GTG TTT GCG TCT CTC 537

Val Val Thr Ser Val Ile Thr Trp Val Val Ala Val Phe Ala Ser Leu

150 155 160

CCA GGA ATC ATC TTT ACC AGA TCT CAA AAA GAA GGT CTT CAT TAC ACC 585

Pro Gly Ile Ile Phe Thr Arg Ser Gin Lys Glu Gly Leu His Tyr Thr

165 170 175

TGC AGC TCT CAT TTT CCA TAC AGT CAG TAT CAA TTC TGG AAG AAT TTC 633

Cys Ser Ser His Phe Pro Tyr Ser Gin Tyr Gin Phe Trp Lys Asn Phe

180 185 190

CAG ACA TTA AAG ATA GTC ATC TTG GGG CTG GTC CTG CCG CTG CTT GTC 681

Gin Thr Leu Lys Ile Val Ile Leu Gly Leu Val Leu Pro Leu Leu Val

195 200 205

ATG GTC ATC TGC TAC TCG GGA ATC CTA AAA ACT CTG CTT CGG TGT CGA 729

Met Val Ile Cys Tyr Ser Gly Ile Leu Lys Thr Leu Leu Arg Cys Arg

210 215 220 225

Claims (49)

1. Renset og isolert polynukleotid, karakterisert ved at det koder for aminosyresekvensen til kjemokinreseptor 88C vist i SEKV.ID NR: 2.

2. Polynukleotid ifølge krav 1, karakterisert ved at det er DNA.

3. Polynukleotid ifølge krav 2, karakterisert ved at polynukleotidet er genomisk DNA.

4. Polynukleotid ifølge krav 2, karakterisert ved at polynukleotidet er et cDNA.

5. Polynukleotid ifølge krav 1, karakterisert ved at det er et fullstendig eller delvis kjemisk syntetisert DNA.

6. RNA-transkript, karakterisert ved at det er et transkript av polynukleotidet ifølge krav 2.

7. cDNA ifølge krav 4, karakterisert ved at det omfatter DNA ifølge SEKV.ID. NR: 1.

8. Biologisk funksjonell DNA-vektor, karakterisert ved at den omfatter DNA ifølge krav 2.

9. Vektor ifølge krav 8, karakterisert ved at nevnte DNA er opererbart bundet til en DNA-uttrykkingskontrollsekvens.

10. Vertscelle, karakterisert ved at den er stabilt transfektert med et DNA ifølge krav 1 på en måte som tillater uttrykking av nevnte DNA.

11. Fremgangsmåte for fremstilling av et 88C-polypeptid, karakterisert ved at den omfatter trinnene med å dyrke en vertscelle ifølge krav 10 i et hensiktsmessig næringsmedium og isolere nevnte polypeptid fra nevnte celle eller medium.

12. Polynukleotid som koder for et 88C-polypeptid, karakterisert ved at nevnte polynukleotid under de følgende, stringente hybridiseringsbetingelser hybridiserer med komplementet til polynukleotidet ifølge SEKV.ID. NR.l, hybridisering ved 42 °C i 50 % formamid, 20 mM natriumfosfat, pH 6,8 og vasking i 0,2X SSC ved 55 °C.

13. Renset og isolert polypeptid, karakterisert ved at det består av aminosyresekvensen til kjemokinreseptoren 88C som fremlagt i SEKV.ID. NR.2.

14. Antistoffprodukt, karakterisert ved at det spesifikt binder et polypeptid som består av aminosyresekvensen til 88C som fremlagt i SEKV.ID. NR.2.

15. Hybridom, karakterisert ved at det produserer et antistoffprodukt ifølge krav 14.

16. Hybridomcellelinje, karakterisert ved at den er cellelinjen 227K.

17. Hybridomcellelinje, karakterisert ved at den er cellelinjen 227M.

18. Hybridomcellelinje, karakterisert ved at den er cellelinjen 227N.

19. Hybridomcellelinje, karakterisert ved at den er cellelinjen 227P.

20. Hybridomcellelinje, karakterisert ved at den er cellelinjen 227R.

21. Renset og isolert polynukleotid, karakterisert ved at det koder for aminosyresekvensen makak-kjemokinreseptoren 88C som fremlagt i SEKV.ID. NR:20.

22. Polynukleotid ifølge krav 21, karakterisert ved at polynukleotidet er DNA.

23. Polynukleotid ifølge krav 22, karakterisert ved at polynukleotidet er genomisk DNA.

24. Polynukleotid ifølge krav 22, karakterisert ved at polynukleotidet er et cDNA.

25. Polynukleotid ifølge krav 21, karakterisert ved at det er et fullstendig eller delvis kjemisk syntetisert DNA.

26. RNA-transkript, karakterisert ved at det er et transkript av polynukleotidet ifølge krav 22.

27. cDNA ifølge krav 24, karakterisert ved at det omfatter DNA ifølge SEKV.ID. NR.19.

28. Biologisk funksjonell DNA-vektor, karakterisert ved at den omfatter et DNA ifølge krav 22.

29. Vektor ifølge krav 28, karakterisert ved at nevnte DNA er opererbart bundet til en DNA-uttrykkingskontrollsekvens.

30. Vertscelle, karakterisert ved at den er stabilt transformert eller transfektert med et DNA ifølge krav 21 på en måte som tillater uttrykking av nevnte DNA.

31. Fremgangsmåte for fremstilling av makak-88C-polypeptid, karakterisert ved at den omfatter trinnene med å dyrke en vertscelle ifølge krav 30 i et hensiktsmessig næringsmedium og isolere nevnte polypeptid fra nevnte celle eller medium.

32. Polynukleotid som koder for et 88C-polypeptid, karakterisert ved at nevnte polynukleotid ved de følgende, stringente hybridiseringsbetingelser hybridiserer til komplementet til polynukleotidet ifølge SEKV.ID. NR. 19, hybridisering ved 42 °C i 50 % formamid, 20 mM natriumfosfat, pH 6,8 og vasking i 0,2X SSC ved 55 °C.

33. Renset og isolert polypeptid, karakterisert ved at det består av aminosyresekvensen til makak-kjemokinreseptoren 88C som fremlagt i SEKV.ID. NR.20.

34. Antistoffprodukt, karakterisert ved at det spesifikt binder et polypeptid som består av aminosyresekvensen til 88C som fremlagt i SEKV.ID. NR.20.

35. Hybridom, karakterisert ved at det produserer et antistoffprodukt ifølge krav 34.

36. Fremgangsmåte for å screene etter en modulator av HIV-infeksjon, karakterisert ved at den omfatter trinnene: (a) å bringe et første preparat som inneholder en mammalsk 88C-reseptor i kontakt med et annet preparat som inneholder et membranprotein fra humant immunsviktvirus (HIV)i nærvær og fravær av en forbindelse, (b) å måle påvirkningen den mammalske 88C-reseptoren har på HIV-membranproteinet i nærvær og fravær av forbindelsen, og (c) å screene etter en modulator av HIV-infeksjon, der redusert eller økt påvirkning av den mammalske 88C-reseptoren på HIV i nærvær av forbindelsen kontra i fravær av forbindelsen tyder på hvorvidt forbindelsen er en modulator av HIV-infeksjon.

37. Fremgangsmåte ifølge krav 36, karakterisert ved at den mammalske 88C-reseptoren omfatter human 88C som har aminosyresekvensen som fremlagt i SEKV.ID. NR.2.

38. Fremgangsmåte ifølge krav 36 eller 37, karakterisert ved at det første preparatet omfatter en celle som har blitt rekombinat modifisert slik at den uttrykker den mammalske 88C-reseptoren på sin overflate.

39. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 36-38, karakterisert ved at det andre preparatet omfatter et humant immunsviktvirus.

40. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 38-39, karakterisert ved at måletrinnet omfatter å måle HIV-infeksjon i cellen.

41. Fremgangsmåte for å påvise HIV-infeksjon i celler, karakterisert ved at den omfatter trinnene: (a) å bringe en celle som har blitt rekombinant modifisert til 88C i kontakt med HIV, og (b) å påvise HIV-infeksjon i cellen.

42. Fremgangsmåte for identifisering av en ligand som er i stand til å påvirke kjemokinreseptoren 88C, som er kjennetegnet ved aminosyresekvensen ifølge SEKV.ID. NR.2, eller et biologisk aktivt fragment derav, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter trinnene: (a) tilveiebringe en vertscelle som uttrykker nevnte reseptor eller et biologisk aktivt fragment derav, eller et membranpreparat som omfatter nevnte reseptor eller et biologisk fragment derav, (b) kontakte og inkubere nevnte reseptor eller nevnte fragment derav med en ligand, og (c) identifisere tilstedeværelsen av en ligand som spesifikt påvirker nevnte reseptor eller nevnte fragment derav.

43. Fremgangsmåte ifølge krav 42, karakterisert ved at nevnte fragment omfatter aminosyresekvensen som spenner over aminosyrene 1-32, 56-67, 89-112, 125-145, 166-191, 213-235, 259-280 eller 301-352 ifølge SEKV.ID. NR.2.

44. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 42 eller 43, karakterisert ved at nevnte ligand er merket.

45. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 42-44, karakterisert ved at nevnte ligand er en agonist eller en antagonist.

46. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 42-45, karakterisert ved at nevnte påvirkning blir identifisert ved å måle konsentrasjonen eller aktivitetsnivået for en komponent i en signaloverføringsvei.

47. Fremgangsmåte ifølge krave 46, karakterisert ved at nevnte signaloverføringsvei blir identifisert ved å måle en aktivitet som er valgt fra gruppen som består av: kalsiumkonsentrasjon, GTP-hydrolyse og fosfolipase-C-aktivitet.

48. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 42-47, karakterisert ved at nevnte reseptor eller nevnte fragment blir kontaktet og inkubert med en ligand og en ytterligere testforbindelse.

49. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 42-48, karakterisert ved at nevnte celle eller nevnte cellemembranpreparat blir valgt fra gruppen som består av HEK293 og COS-7.