SK110499A3

SK110499A3 - Method and apparatus for continuous flow isoelectric focusing for purifying biological substances

Info

Publication number: SK110499A3
Application number: SK1104-99A
Authority: SK
Inventors: Boer Gerben Foppe De; Otto Sova
Original assignee: Cerberus Entpr B V
Priority date: 1997-02-20
Filing date: 1998-02-20
Publication date: 2000-05-16
Also published as: CA2281867A1; DE69815069D1; EP0963237A1; EP0963237B1; KR100493975B1; ATE241422T1; CN1251538A; CN1245246C; AU739328B2; BR9807579A; IL131312A0; ZA981370B; OA11147A; DE69815069T2; US20030206894A1; WO1998036821A1; AP9901607A0; US6572751B1; JP2001513013A; KR20000071204A

Description

Spôsob a zariadenie na izoelektrickú autofokusáciu plynulého toku na čistenie biologických látok

Oblasť vynálezu

Vynález sa vzťahuje na čistenie, izoláciu, koncentráciu a separáciu organických alebo biologických látok metódou izoelektrickej autofokusácie plynulého toku a zariadenia, techniky, ktorá používa elektricky nízko vodivé pole na koncentráciu alebo separáciu nabitých látok. Kroky .odstreďovania, filtrácie a absorbcie alebo nosný elektrolyt alebo amfolyt na stanovenie vhodného pH gradientu sa nepoužívajú.

Doterajší stav techniky

Izoelektrická autofokusácia je známa technika na separáciu nabitých molekúl, napr. proteínov zo zlúčeniny, ktorá ich obsahuje, za použitia princípu, že takéto nabité atmosférické molekuly majú nulový čistý náboj pri určitom pH, tzv. izoelektrický bod (hodnota pl). Zlúčeniny migrujú k pH svojho vlastného izoelektrického bodu, ak sú vystavené elektrickému poľu, a podľa toho sa separujú.

Spôsob a zariadenie na statickú izoelektrickú autofokusáciu sú známe, napr. z WO 79/00942; EP-A-256552 a US 5,256,269. Ich nedostatkom je malé množstvo, ktoré je možné vyčistiť, a ich dávkové použitie v prevádzke. Technologické pozadie predmetného vynálezu je popísané v elektroforéznom zariadení na plynulý tok v US 4,465,582 (1982), ktoré používa riadený tok kvapaliny v komore elektródy, ktorý prechádza paralelne, ale oddelene od toku v „pracovných“ komorách.

US 5,160,594 uvádza izoelektrický autofokusovacie zariadenie s núteným obehom v každom článku, t.j. proces obehovej izoelektrickej autofokusácie. Obeh sa v tu uvedenom vynáleze nepoužíva. US patent používa množstvo prístrojov na zabránenie zmiešaniu sa vyčistených a znečistených atmosférických látok. V každom článku sa vyžaduje prídavné chladenie na zníženie odporového ohrevu. Silné kyseliny a zásady, katolyt alebo anolyt, sú zachytené v komorách elektródy prostredníctvom iónových selektívnych membrán, aby odpudzovali záporne alebo kladne nabité ióny a stanovili vhodné pH gradienty. Na rozdiel od US 5,160,594, tu uvádzaný vynález používa iónové selektívne membrány na rôzne účely, menovite na selektívne umožnenie prechodu nízkomolekulárnych látok k priestoru elektródy na vypustenie z výtokového otvoru elektródy. Všetky prístroje tohto typu vyžadujú amfolyty pre pracovné komory, ktoré majú pomerne nízku vodivosť a vyrovnávaciu schopnosť. US 5,160,594 popisuje maximálnu vodivosť do 600 gS/cm, čo je omnoho menej ako vodivosť do 5000 gS/cm tohto vynálezu. Podobne ako predchádzajúce zariadenia, ani toto nie je navrhnuté na čistenie na priemyselnej báze, a dokonca US 5,160,594 ani neuvádza príklady látok, ktoré sa majú čistiť.

Metódu a zariadenie na izoelektrickú autofokusáciu plynulého toku bez použitia tlmiacich amfolytových roztokov, ale na použitie v priemysle, uvádza maďarský patent 210,584 (1992). Popisuje systém toku smerom hore komorami v dôsledku gravitácie do separatívnych komôr až do úrovne výtokového otvoru. Systém zahrnuje dve komory nevodivého roztoku, kde druhá komora má dva alebo viacej otvorov na výtok roztoku a priechod pre tok roztoku smerom dole z prvej komory na dno druhej komory. Dvojica elektród je umiestnená v druhej komore. Väčší počet priľahlých deliacich členov je umiestnený po celej druhej komore s cieľom vytvoriť v podstate roztok bez prúdenia a trasy pre prúd vo vodorovnom smere. Nedostatkom HU 210,584 je skutočnosť, že v prítokovej komore roztoku sa gradient môže vytvoriť sám. Prítok roztoku formou kvapkania sa dá ťažko riadiť. Systém toku smerom hore maďarského patentu je menej zraniteľný ako skutočná tvorba gradientu, podobne ako v tu uvádzanom vynáleze, ale dvojkomorový systém je komplikovaný a ťažko zostrojiteľný. Ba čo viac, separácia organických roztokov sa uskutočňuje na oboch náprotivných stranách druhej separačnej komory v blízkosti elektród. Anorganické ióny sa ľahko zmiešavajú s jednoduchými frakciami anorganických alebo biologických látok, aby boli separované. Druhý separačný krok sa často vyžaduje.

Podstata vynálezu

Tu uvádzaný vynález poskytuje kontinuálny autofokusér na separáciu látok v elektricky vodivom roztoku; toto zariadenie je vyrobené z elektricky nevodivého materiálu a zahrnuje akoby tehlovú separatívnu komoru s jedným prítokom kvapaliny, dvomi výtokmi v priestore elektród a jedným alebo viacerými výtokmi pracovnej kvapaliny a priechod pre tok roztoku smerom hore odo dna k horným výtokovým otvorom. Pomer výšky, šírky a hĺbky separatívnej komory môže byť 3 : 2 :0,2. Dvojica elektród je umiestnená vo vertikálnej polohe pozdĺž oboch náprotivných najužších stien separatívnej komory. Sú prispôsobené tak, aby mohli byť pripojené k externému zdroju jednosmerného prúdu.

Zariadenie je rozdelené do troch častí dvomi prepážkami zo selektívnych iónových membrán. Tieto prepážky sú umiestnené v zvislej polohe na oboch stranách zariadenia v blízkosti elektród, takže každá oddeľuje asi 1/25 alebo 1/15 od oboch koncov. Obe prepážky majú otvor v dolnej časti s priemerom jednej polovice prítokovej rúrky zariadenia. Obzvlášť tá, ktorá uzatvára priestor katódy je katiónová selektívna membrána , a tá druhá, je aniónová selektívna membrána. Iónové selektívne membrány sú špecifické, aby umožňovali prenos katiónov alebo aniónov, aby sa vylúčilo ich vylúčenie cez odpadové otvory.

Na oboch koncoch sú umiestnené odpadové otvory v blízkosti elektród v 1/40 až 1/10 od horného okraja zariadenia. Pracovné výtoky na odber látok, ktoré treba čistiť, sú umiestnené na rovnakej úrovni v strede. Je výhodou, že autofokusér má aspoň tri zo spomínaných výtokových otvorov. Medzi výtokovými otvormi, s výnimkou priestoru elektród, sa nachádzajú prepážky z elektricky nevodivého materiálu, ktoré sú uzavreté v hornej štvrtine, a majú malé otvory zdola hore až do napr. troch štvrtín svojej výšky.

Ako ďalšie vylepšenie je potrebné uviesť väčší počet striedajúcich sa deliacich členov v tvare cik-cak alebo v tvare T alebo v tvare mnohých T vo zvyšnom priestore zariadenia medzi hore uvedenými prepážkami, ale nie v priestore elektród. Sú tiež vyrobené z elektricky nevodivého materiálu a sú perforované alebo vyrobené z porózneho materiálu priepustného pre ióny a molekuly v oboch smeroch a rozprestierajú sa zdola po najvyššiu úroveň vývodu pracovnej kvapaliny a po celej komore. Prepážky sú voľne umiestnené nad celou šírkou zariadenia a sú novými prostriedkami na poskytnutie v podstate nekonvekčného roztoku, ale poskytujú nerušený tok elektrolytov alebo atmosférických častíc vo vodorovnom smere. Perforované membrány sú od seba vzdialené, aby bol umožnený vertikálny tok. Tento vynález má dôležité prednosti v porovnaní s predchádzajúcimi typmi zariadenia v tom, že môže spracovať až 3 600 1 enzýmov dážďoviek za deň (podľa HU 210,584: 280 až 300 1) s výrobou 80 000 až 170 000 U. vyčistených enzýmov na 1/deň (HU 210,584 : 60 000 až 70 000 U.).

Ďalšou výhodou tohto vynálezu je, že roztok alebo suspenzia môžu mať vodivosť v rozsahu 50 až 5 000 pS/cm namiesto 50 - 2 000 pS/cm u predchádzajúcich zariadení (US 5,160,594 popisuje v tabuľkách vodivosť do 600 pS/cm).

V tomto vynáleze preteká roztok chemicky inertným priechodom uvádzaného zariadenia vertikálne smerom hore cez množstvo vertikálnych prietokových kanálov vytvorených medzi dvomi membránovými prepážkami, ktoré oddeľujú dve membránové prepážky od pracovného priestoru medzi nimi. Malá časť roztoku preteká horizontálne malými otvormi v týchto prepážkach. Predpätie je aplikované medzi elektródami, čo má za následok separáciu elektricky nabitých komponentov v horizontálnom smere cez celé zariadenie smerom ku katóde alebo k anóde. Komponenty sa zbierajú, keď odchádzajú výtokovými otvormi, ktoré sú umiestnené blízko hornej časti zariadenia. Nabité komponenty s nízkym M.W., t.j. kovy a ióny, sa pohybujú smerom k priestoru elektród. Opúšťajú zariadenie odpadovými otvormi, a tak sú oddeľované od látok s vyšším M.W., ktoré sa pohybujú k stredu zariadenia. V tomto vynáleze obsahuje cieľová látka minimálne jeden amfotérny druh charakterizovaný hodnotou pl, kým spomínané druhy sú obklopené atmosférickými nečistotami. pH gradient vytvoria uvádzané nečistoty v celom zariadení, keď sa aplikuje predpäťový potenciál. V pH gradiente sú amfotérne druhy hnané k bodu s pH odpovedajúcim pl uvádzaných druhov a je neutralizovaný. Potom látka tečie vertikálnym smerom k výtoku v hornej časti zariadenia.

Aby sa zvýšila kapacita, je možné k sebe pripojiť dva autofokuséry v dvojkonfigurácii a sú oddelené vodotesnými stenami. „Dvoj-autofokusér“ má spoločné elektródové priestory (2,4) na oboch koncoch zariadenia, a jeden pár elektród slúži obom komorám autofokuséra. Dvoj-autofokusér má spoločný vtok (7) v strede dna zariadenia, kde prítok je rovnako rozdelený medzi oba iautofokuséry. Z oboch elektródových priestorov je možné zriadiť jeden alebo dva výtoky (11). Dvoj-autofokusér má na oboch stranách pracovné výtoky (12) ako v pôvodnom autofokuséri. Dvoj-autofokusér má dvojnásobný prietok a dvojnásobnú separačnú schopnosť, kým potreba elektrickej energie sa zvýši iba o jednu tretinu.

Čistenie, izolovanie a koncentrácia biologických látok v priemyselnej škále sú popísané. Nie sú potrebné kroky na odstreďovanie, filtráciu, absorbciu alebo prídavné nosné amfolytové tlmivé roztoky. Viacnásobné delenie a perforované prepážky prepúšťajúce častice v oboch smeroch sú situované vertikálne po celej šírke zariadenia ako nové prostriedky s cieľom poskytnúť bezkonvekčný roztok a vytvoriť nerušený vertikálny tok kvapaliny. Autofokusér je navrhnutý na najúčinnejšie čistenie napr. plazmidov, peptidov, aminokyselín, enzýmov, imunoglobulínov, antigénov pre diagnostické testovacie súpravy alebo na prípravu vírusových alebo bakteriálnych (subunitových) vakcín, alergénov a na izoláciu bunkových populácií alebo rekombinovaných produktov z mlieka, krvi alebo moču. Autofokusér je možné ďalej používať na vylúčenie nečistôt alebo jedovatých látok z procesov kvasenia alebo bakteriálnej fermentácie, antibiotík, organických rozpúšťadiel, pitnej vody a nápojov.

Autofokusér je možné tiež používať na izoláciu alebo čistenie produktov, ktoré sú vylisované alebo extrahované z mikroorganizmov (vrátane baktérií, húb, kvasníc, rias a iných mono- alebo oligobunkových organizmov), zvierat (vrátane cicavcov, hmyzu, bezstavovcov) alebo rastlín (vrátane chalúh, planktónu, húb, machu, bylín a vyšších rastlín) alebo ich častí alebo derivátov. Takéto produkty zahrnujú mikrobiálne vylisované produkty, látky vyrobené transgénnymi cicavcami, ako napr. kravy alebo ošípané, produkujúce vo svojom mlieku medicínske produkty, a látky extrahované z lesníckych a sadárskych produktov. Príkladmi sú prírodné farbivá, pesticídy, lignín, polyoly, napr. xylitol, uhľohydráty, oligo- a polysacharidy, napr. xylany a mikrokryštalická celulóza, diétne a iné vlákniny, glykoproteíny a lipoproteíny.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr.l je perspektívny pohľad na zariadenie tohto vynálezu;

Obr.2 je vertikálny pohľad na prednú časť zariadenia;

Obr.3 je pohľad na vertikálny prierez zariadenia pozdĺž čiary 3-3/obr.2;

Obr.4 je pohľad na vertikálny prierez zariadenia v dvojkombinácii pozdĺž čiary 3-3/obr.2;

Obr.5 je pohľad zhora na zariadenie s prepážkami v tvare cik-cak; Obr.6 je pohľad zhora na zariadenie s prepážkami v tvare T;

Obr.7 je pohľad zhora na zariadenie v dvojkombinácii;

Obr.8 je pohľad zhora na tri typy priestorových prepážok zariadenia; Obr.9 je pohľad zhora na zariadenie s ukážkou štyroch prepážok;

Obr. 10 je diagram vodivosti po šírke zariadenia v prevádzke; Obr. 11 je schéma zariadenia tu uvádzaného vynálezu;

Príklady uskutočnenia vynálezu

Teraz sa budeme odvolávať na výkresy, v ktorých rovnaké súčiastky sú označené rovnakými číslicami. Najprv sa odvolávame na výkresy 1-11, zariadenie 1 zahrňuje univerzálnu pravouhlú elektrochemický inertnú nádrž s koncovými stenami 2. spodným panelom 3. prednou stenou 4 a zadnou stenou

5. Zariadenie 1 je vybavené prepážkou 6 vertikálne pripojenou k zadnej stene 5 a prednej stene 4 medzi každým výtokom s výnimkou výtokov z priestoru elektród. Tieto prepážky sú vyvŕtané alebo vyrobené z porézneho materiálu v jednej tretine svojej výšky odo dna. Zadná stena 5 má vtokový otvor v dolnej časti. Šírka steny 3 W2 je väčšia ako šírka zariadenia 1 Wl (viď obr.2). Obe elektródy 9 sú oddelené od ostatných častí zariadenia prepážkou 10 iónovými selektívnymi mebránami, t.j. aniónovou selektívnou membránou v blízkosti anódy a katiónovou selektívnou membránou v blízkosti katódy. Priestory elektród v hornej časti zariadenia majú v jednej rovine s ostatnými pracovnými výtokmi 12 elektródové výtoky. Priestor medzi prepážkami 6 zariadenia 1 je rozdelený množstvom menej preferovaných prepážok v tvare C (10) alebo perforovanými prepážkami v tvare cik-cak (13) alebo prepážkami v tvare viacnásobného T (6) z porézneho materiálu, ktoré sú umiestnené mimo vo vzdialenosti 1 cm, 0,5 cm a 0,3 cm (viď obr.8).

Ako je ilustrované na obr.8, vynález používa zdroj kvapalného roztoku, ktorý obsahuje organické alebo biologické látky, ktoré treba separovať, podľa možnosti s vodivosťou medzi 50 a 5 000 gS/cm. Nosné amfolyty na dosiahnutie vhodného pH gradientu sa nepoužívajú. Tok zo zdroja 14 je možné regulovať vhodným ventilom 15 z nevodivého materiálu. Počet pracovných výtokových otvorov 12 závisí od povahy aplikovaného separačného procesu. Separované roztoky sú odoberané z každého otvoru H do vhodnej nádoby 16. viď obr. 11. Zariadenie 1 zahrňuje nivelizačnú skrutku 8 umiestnenú na vonkajšom konci dolného panelu 3, kým skrutka 8 je na nastavovanie horizontálnej polohy výtokových otvorov 12 na prednej stene 4. Zariadenie 1 je vybavené dvojicou elektród priliehajúcich ku koncovým stenám 2. Elektródy 9 sa rozprestierajú v podstate od spodnej časti zariadenia 1 po horný okraj a sú nainštalované tak, aby ich bolo možné ľahko zasunúť a odstrániť. Elektródy 9, ktoré sú buď anóda alebo katóda, sú ukončené v elektrických prípojkách alebo zástrčkách umiestnených v hornej časti koncových stien 2 tak, aby bolo možné pripojenie elektród 9 k externému zdroju energie, viď „P“ na obr. 2. Elektródy 9 sú podľa možnosti chemicky inertné, ako i odolné voči katodickému a anodickému rozpúšťaniu v rovnakom roztoku pri aplikácii podmienok predpätia. Použitie platiny a uhlíka je uspokojivé. Ba čo viac, steny zariadenia sú vyrobené alebo povlakované s chemicky a elektricky inertným materiálom, napr. teflon, akrylát, keramický materiál alebo sklo.

Odvolávajúc sa na obr. 5, 6 a 7, zariadenie je vybavené množstvom kvapalných priepustných deliacich členov v tvare C, cik-cak alebo T 13, ktoré sa rozprestierajú vertikálne medzi dolnou časťou zariadenia a bodom tesne pod úrovňou výtokových otvorov 11 a 12, a rozprestierajú sa horizontálne medzi vodotesné inštalovanými prepážkami 6 a 10. s výnimkou priestoru elektród. Deliace členy v tvare C alebo cik-cak 13 zahrňujú množstvo otvorov alebo dier s priemerom 0,5 až 1 mm, ktoré sú rovnako rozložené vo vertikálnom smere. Deliace členy v tvare T 13 sú z porézneho materiálu cca. 50 gm. Vertikálne prepážky 6 majú v podstate rovnakú výšku ako zariadenie 1.

Priestory elektród oddeľujúce prepážky 10 sú inštalované vodotesné a ich úlohou je zabezpečiť, aby nízkomolekulárne anióny a katióny prechádzali cez iónové selektívne membrány z pracovných komôr buď do priestoru anódy alebo priestoru katódy. Malý otvor na základe prepážok umožňuje obmedzený tok roztoku cez elektródové priestory na vymytie koncentrovaných iónov. Prepážky 6 sú inštalované vodotesné vo svojej hornej tretine. Ich funkcia je dôležitá pre stavbu zariadenia a pre dobrú separáciu kvapalných frakcií separovaných počas prietoku zariadením v poslednom kroku - pred opustením zariadenia pracovnými výtokovými otvormi 12. Perforované deliace členy 13. slúžia na rôzne účely. Po prvé, diery alebo otvory umožňujú horizontálny tok tekutiny v zariadení. Druhou funkciou dier je poskytnutie dráhy na tvorbu množstva horizontálnych dráh toku iónického prúdu medzi elektródami 9, keď sa medzi nimi vytvorí napätie. Ba čo viac, tvar T alebo cik-cak deliacich členov 13 umožňuje tvorbu vertikálnych kanálov v zariadení 1 (obr. 3,4 a 5), ktoré umožňujú plynulý laminárny tok smerom hore zo spodnej časti k hornej časti zariadenia 1. A nakoniec, prepážky 13 potláčajú turbulenciu a konvekciu horizontálne medzi elektródami 9 v zariadení L

Odvolávajúc sa na obr.9, zariadenie 1 má prepážky 8 pritavené pozdĺž ich vonkajších hrán k prednej stene 4 a zadnej stene 5 medzi dvomi susediacimi pracovnými výtokovými otvormi 12 s cieľom vytvoriť kvapalné nepriepustné tesnenie. Rozmery každej podkomory sú vybavené množstvom deliacich členov 13 a sú rozdelené prepážkami 6 v súlade s pracovnými výtokovými otvormi 12. V prevádzke je zmes obsahujúca látky, ktoré je potrebné separovať, suspendovaná alebo riedená v destilovanej vode a počiatočná koncentrácia látky má vodivosť v rozsahu 50 - 5 000 gS/cm. Zariadenie 1 sa potom plní konštantným prítokom roztoku alebo suspenzie do prítokového otvoru 7. Keď sa zariadenie 1 naplní na úroveň tesne pod otvormi 11-12. prítok roztoku sa ukončí a nivelizačná skrutka 8 sa nastaví tak, že výtokové otvory 11-12 sú horizontálne vyrovnané. Elektródy 9 sú potom pripojené k externému zdroju energie „P“ a vytvorí sa pokles potenciálu jednosmerného prúdu (DC) aplikovaného medzi elektródami 2 a roztokom.

Vzniká horizontálny tok zlúčenín roztoku do zariadenia 1 v dôsledku nízkeho prúdu medzi elektródami 9.

Počas autofokusovania vytvoria komponenty roztoku, ktoré je potrebné separovať, automatický pH gradient horizontálne v zariadení, kým rôzne amfotérne komponenty obsahujúce počiatočnú látku sú hnané alebo fokusované do polohy v zariadení s hodnotou pH rovnajúcou sa ich vlastnej hodnote pl alebo izoelektrickému bodu. Silne polarizované nízko nečistoty s nízkym M.W. sú fokusované do priestorov elektród a vylučované zo zariadenia odpadovými otvormi elektródových priestorov. Keď sú komponenty separované a neutralizované pri svojom vlastnom pl, stávajú sa nehybnými v elektrickom poli v horizontálnom smere, ale ešte stále tečú vertikálne smerom hore v prietokových kanáloch medzi prepážkami 12 smerom k hornej časti zariadenia 1. Tieto odchádzajú pracovnými výtokovými otvormi 12 a sú odoberané alebo znehodnotené. Alebo je možné roztok recirkuláciou vrátiť do pôvodného roztoku, nádrž 14. alebo do iného sériovo umiestneného autofokuséra . Počet výtokových otvorov 12 zariadenia 1 závisí od počtu komponentov, ktoré je potrebné separovať. Ak treba separovať rôzne komponenty s rôznymi izoelektrickými bodmi, je možné použiť väčšie množstvo výtokových otvorov. Aby sa vytvoril všestranný autofokusér pre rôzne látky, je možné skonštruovať zariadenie 1 s niekoľkými výtokovými otvormi 12 s posúvacími členmi nainštalovanými vo vnútornej časti prednej steny 4 na otváranie alebo zatváranie výtoku cez otvory 12.

V normálnej situácii sa udržuje prietok za minútu na hodnote 1/10 objemu komory zariadenia 1. Vzťah medzi prietokom a objemom zariadenia 1 platí tiež pre zariadenie 1, v ktorom sa objem zväčšuje paralelne s väčšou výškou, kým šírka zariadenia 1 ostáva konštantná. Čas potrebný na horizontálny pohyb nabitých komponentov v elektrickom poli ostáva rovnaký.

Z tohto dôvodu zväčšujúca sa vertikálna výška zariadenia umožňuje vyššie prietoky. Ak komponenty majú podobné hodnoty pl, bolo by potrebné zvýšiť rozlíšenie s ohľadom na pH gradienty, ktoré treba dosiahnúť. Dosiahne sa to väčšou horizontálnou dĺžkou zariadenia, čo si vyžaduje dlhšiu dobu horizontálneho pohybu komponentov a nižší prietok.

Ďalším faktorom, ktorý určuje hornú hranicu prietoku je dosiahnutie a udržanie stabilného pH gradientu v pracovnom priestore zariadenia. Keď amfotérické nečistoty v roztoku majú výrazne nižšie M.W. ako cieľové látky, dosiahne sa pH gradient v kratšej dobe ako je doba prechodu komponentov, ktoré je potrebné čistiť. Komponenty s nižším M.W. sa pohybujú rýchlejšie. Ba čo viac, tie s extrémnymi hodnotami pl (<pH 2 - >pH 12) sa pohybujú do priestorov elektród cez iónové selektívne membrány a sú vylučované odpadovými otvormi. A tak sa pH gradient v zariadení, ktorý sa na začiatku zakladal na nízkomolekulárnych nečistotách, neskôr udržiaval komponentami s vyšším M.W.

Obr. 10 ilustruje profil vodivosti v ustálenom stave v zariadení 1 v prevádzke a ukazuje, že vodivosť je minimálna v pracovnom priestore a vysoká v priestoroch elektród, v ktorých sa koncentrujú nabité komponenty s nízkym M.W.. Toto ilustruje užitočnosť autofokuséra pre elimináciu nečistôt z neutrálnych tekutín, napr. voda, nápoje a organické rozpúšťadlá.

Zariadenie tu uvádzaného vynálezu jednoducho využíva elektrické pole a môže byť v činnosti niekoľko dní bez dohľadu, pretože tam nie sú nijaké elektrochemické alebo iné prístroje vyžadujúce si plynulý dozor obsluhy. Energia, ktorá vyplynie do optimálnej prevádzkovej charakteristiky pre väčšinu autofokusačných aplikácií, t.j. rýchla separácia s minimálnym ohmickým ohrevom, sa pohybuje v rozpätí 3 - 50 W.

Priemyselné čistenie enzýmov dážďoviek

Tu uvádzaný vynález je možné použiť na čistenie enzýmov bezstavovcov, napr. kalifornské dážďovky Eisenia foetida a bude prezentované množstvo príkladov využitia v priemysle. Enzýmy sú produkované nasledujúcim spôsobom: dážďovky sa pestujú v priemyselnom odpade, spotrebovávajú a vylučujú veľké množstvá, a vzniká biohumus alebo červíkový kompost. Atraktant slúži na separáciu červíkov z biohumusu, červíky sa premyjú vodou, zničia zmrazením alebo náhlou dekompresiou tlaku vzduchu v nádobe a sú homogenizované v destilovanej vode. Chovom na prežitie sa separujú populácie červíkov na výrobu potrebných enzýmov pri vyšších koncentráciách.

Autofokusér v dvojkonfigurácii (objem 2 X 25 1) sa používa s kapacitou prietoku 2,5 1/min. (3 600 1/deň). Z pracovných výtokových otvorov (odpadové výtokové otvory sa nachádzajú medzi nimi) možno denne získať

000 1 čistených enzýmov. Druhá autofokusačná dávka aa používa na ďalšie čistenie. Koncentrácia proteínov oboch autofokusačných dávok dáva koncentráciu proteínov 1 g/1. Konečný výnos 1 200 1/deň má priemernú aktivitu enzýmov 80 až 170 U/ml. Je to pozitívne v porovnaní s enzymatickými aktivitami podobných produktov založených na bakteriálnej fermentácii (0,001 až 0,002 U/ml). Na 25. Salón Internationale des Inventions, Ženeva, Švajčiarsko, v apríli 1997, bol 10 1 autofokusér ocenený zlatou medailou za čistenie enzýmov dážďoviek a za čistenie vodky.

PRÍKLAD 1

Izolovanie a čistenie prírodných enzýmov E. foetida

Z dážďoviek bolo získaných päť nových typov čistených nebakteriálnych enzýmov. Enzýmy pre tento príklad boli pripravené nasledujúcim spôsobom: Zozbieralo sa desať kg geneticky zvoleného rodu E. foetida. Dážďovky boli zmrazené pri teplote -18 °C na dobu 24 hodín, a potom rozmrazené v studenej vode s teplotou 4 °C, ktorá obsahovala 0,1 % glyoxal. Táto surová suspenzia sa po dávkach mixovala vo vysokokapacitnom mixéri a homogenizovala v 100 1 destilovanej vody. Roztok bol odstredený v centrifúge s plynulým tokom a do 2 1 autofokuséra bol zavedený supernatant. Bolo použité zariadenie so štyrmi výtokovými otvormi. Aplikoval sa jednosmerný prúd o napätí 250 V a intenzite 80 mA a počiatočným prietokom 100 ml/min. Všetky manipulácie sa uskutočňovali pri 4 až 10 °C. Autofokusácia trvala 16 hodín. Roztok z každého pracovného výtoku bol zvlášť odoberaný v súlade s izoelektrickými bodmi 8,3, 7,0, 6,5, 3,2 a 2,8. Každá aktívna enzýmová frakcia získaná prípravnou SDS elektroforézou bola hydrolyzovaná minerálnou a peptickou hydrolýzou a merali sa zvyšky aminokyselín automatickým analyzátorom aminokyselín. Vypočítal sa priemerný počet a percento aminokyselín v troch analýzach. Päť enzýmov v poradí podľa klesajúcej pH hodnoty je:

Eisenáza- Základná zmes enzýmov s proteolytickou aktivitou, pl 8,3, optimálnou pH hodnotou 6,0, M.W. 17 kDa a azokazeínovou štiepiacou aktivitou 100 - 120 U/mg (jedna jednotka bude hydrolyzovať azokazeín sulfanilamidu (Merck katalóg, str. 142, 1992) a vyprodukuje farebný ekvivalent pomocou Folin-Ciocatteau reagentu do 1,0 μΜ (=181 gg) tyrozínu za minútu pri pH 7,5 a 37°C jednotku (U) azokazeínovej štiepiacej aktivity ako mieru proteolytickej aktivity je ďalej definované ako množstvo enzýmu, ktorý dokáže štiepiť 1 μΜ azokazeínu za minútu ako bolo odhadnutí UV spektroskopiou pri 370 nm (Tomarelli et al., J.Lab.Clin.Medicíne 34, 428 1949). Tento enzým je pomenovaný „eisenase“ a má charakteristiku ako zmiešaná endo- a exopeptidáza so serínovou a metaloproteolytickou aktivitou podľa popisu v „International Enzýme Classification Catalogue“, ECC odstavce 3.4.21.1, 3.4.21.4, 3.4,23.6, 3.4.21.14. Môže sa používať ako prírodný konzervačný prostriedok, napr. pri balení mäsa, a na lokálnu liečbu pokožky.

Feluláza - Enzým vyznačujúci sa celulytickou, ako aj proteolytickou aktivitou, pl 7,0, pH optimom 5,9 a M.W. 67 kDa. Tento enzým sa označuje ako „feluláza“ a má charakteristiku ECC odstavca 3.2.1.4. Celulytická aktivita je cca. 10-20 U/mg (jedna jednotka uvoľňuje 1,0 μΜ glukózy z celulózy za jednu hodinu pri pH 5,0 a 37°C). Feluláza uskutočňuje svoju celulytickú aktivitu v prostredí s nízkou kyslosťou.

Tabuľka I

Funkčné a fyzikálne proteínové charakteristiky

E. foetida

	Eisenáza	Feluláza	Fetiláza	Fetipáza	Wormáza
pl* pH optimum rozsah ž: 50% T optimum °C rozsah ž 50%^b M.W. kDa (gel)^e	8,3 6,0 4,2-8,1 50 25-60	7,0 5,9 4,4-7,1 45 10-55	6,5 7,2 5,8-8,6 60 30-65	3,2 4,6 3,6-8,6 50 25-60	2,8 3,6 2,7-5,3 50 5-70

M.W.kDa (kalk.)^d	17	67	36	18	31
Amino-
Kyseliny*	13,2	± 54	± 29	± 14,5	± 25
% zásad, a.a.	110	446	240	120	205
% kysl. A.a.	23	4	6	25	15
proteo lytické^f	0	7	5	7	22
a-amylo-	+	+		+/-	+
lytické⁸	Ser; Asn
β-amylolytické*¹	-	-	+	-	-
celulo-	-	-	+	-	-
lytické'
lipolytické^J	-	+	-	-	-
Michaelis	-	-	-	+
(mM)^k	1,76	0,85	1,60	0,88	0,35

izoelektrický bod stanovený autofokusáciou rozsah s £ 50 % aktivitou maximálnej aktivity stanovené z SDS-OAGE vypočítané z obsahu aminokyseliny (neglykosylovanej) celkový počet stanovený kompletnou hydrolýzou stanovené aktivitou na polyseríne, polyarginíne, polytryptofane a polyTrp.Arg stanovené aktivitou na škrobe pri 37°C a pri pH 6,9 stanovené aktivitou na škrobe pri 20°C a pri pH 4,8 (V tejto štúdii pomocou prípravnej SDS elektroforézy bola získaná iba β-amyláza v jednej enzymatickej aktívnej línii. Strata β-amylázy mohla byť spôsobená rozkladom v SDS).

stanovené aktivitou na azúre celulózy (Merck) Fernley, N.H., Biochem.J., 87, 90 (1963) stanovené aktivitou na triglyceride č. 339 (Merck)

Michaelisova konštanta stanovená na špecifickom substráte pre každý jednotlivý enzým indikácia enzýmovej aktivity v ráde 0,1 U

Tabuľka 2

Zloženie aminokyselín enzýmov E. foetida (hodnoty ± 5%)

aminokyse lina	Eisenáza	Feluláza	Fetiláza	Fetipáza	Wormáza
Číslo a.a.	110	240	446	120	205
Ala	4,46	12,3	15,8	2,6	3,3
β-alanin	0	3,7	0,7	4,1	4,8
Arg	10,30	2,0	1,0	6,8	3,2
Asp+Asn	17,24	4,0	0,9	5,8	12,3
Cys	6,89	4,0	1,2	0	1,7
Glu+Gln	6,89	5,5	7,6	8,3	12,9
Gly	13,79	14,5	12,1	7,5	6,5
His	3,45	4,0	2,9	8,5	8,1
íle	2,50	2,0	0	0	1,6
Leu	3,45	10,2	9,9	6,8	3,2
Lys	10,34	0	0	8,5	3,2
Met	3,45	0	0	4,1	4,8
Phe	3,45	6,2	4,1	2,2	3,2
HydroxyPro	0	0	0	8,5	8,1

Pro	0	0	15,2	10,2	9,7
Ser	3,45	12,0	10,7	5,1	3,2
Thr	0	3,6	2,4	0,7	1,6
Trp	0	2,0	2,0	1,7	1,6
Tyr	6,89	0	0	5,1	4,8
Val	3,45	14,0	13,6	3,4	1,6

Fetiláza - Enzým s a- a β-amilolytickou alebo obzvlášť proteolytickou aktivitou, pl 6,5 a pH optimom 7,2, M.W. 36 kDa a azokaseínocou štiepiacou aktivitou 80 - 100 U/mg. Tento enzým sa nazýva „fetiláza“ a má charakteristiku ECC odstavcov 3.2.1.1., 3.2.1.2, 3.4.22.6. Amylolytická aktivita fetilázy je cca. 20-40 Uúmg (jedna jednotka uvoľňuje 1,0 mg maltózy zo škrobu za 3 minúty pri pH 6,9 a 37 °C (P.Bernfeld: „Metódy v enzymológii 1, 149, 1955). Fetilázu možno použiť na amylázu s nízkym obsahom jačmeňa v procese kvasenia piva a ako náhradu za pankreatický enzým v liekoch.

Fetipáza - Enzým s lipolytickou a mierne proteolytickou aktivitou, pl 3,2, pH optimom pH 4,6. M.W. 18 kDa a azokaseínovou štiepiacou aktivitou 80 100 U/mg. Tento enzým sa nazýva „fetipáza“ a má charakteristiku ECC kapitol 3.1.1.1., 3.1.1.3, 3.4.22.6. Lipolytická aktivita fetipázy je 20 U/mg /jedna jednotka hydrolyzuje 1,0 meq. Mastné kyseliny z triglyceridu za hodinu pri pH 7,7 a pri 37°C. Fetipázu možno použiť ako aktívnu látku v pracích prostriedkoch.

Wormáza - Zmes kyselinových enzýmov s proteolytickou aktivitou, pl cca.

2,8, pH optimum 3,6, M.W. 31 kDa a azokeseínovou štiepiacou aktivitou 80 100 U/mg (jedna jednotka bude hydrolyzovať kaseín na produkciu farbiva rovnajúceho sa 1.0 μΜ (181 gg) tyrosínu za minútu pri pH 7,5 a 37°C. Tento enzým sa nzýva „wormáza“ A má chrakteristiky v súôlade s EEC kapitolami

3.4.23.1, 3.4.23.6 a 3.4.22.3. Wormázu možno používať v pracích práškoch, potravinárskom priemysle a pri výrobe nápojov, obzvlášť na štiepenie nežiadúcich proteínov pri pomerne nízkom pH; v ovocných šťavách, pive a víne je rozsah pH 3,9 - 6,0 bežný. Znižuje obsah proteinov o cca. 70 % a umožňuje redukciu alebo dokonca vylúči filtráciu pri výrobe nápojov.

Príklad 2

Zmesi enzýmov E. foetidapre priemyselné účely

Enzymmix je multi-enzýmová zlúčenina pozostávajúca zo zmesi wormázy, eisenázy, fetipázy a fetilázy v pomere 30 : 40 : 15 : 15 a s následovnými aktivitami: wormáza = 65 - 90 U/ml; eisenáza = 80 - 100 U/ml; fetiláza = 60

- 90 U/ml; fetipáza = 60 - 90 U/ml. Zmes enzýmov štiepi a odburáva hydrolyticky najmä proteíny, škrob a lipidy. Zvyšky proteinov (z piva a vína), škrob, svalové proteíny ( v mäse a slanine) sú čiastočne štiepené alebo odbúrané. Dosiahne sa zlepšenie chuti. Enzýmová zmes môže nahradiť bakteriálne čistenie odpadovej vody a bez prevzdušnenia. Enzýmovú zmes možno použiť v biologických pracích práškoch, pracích práškoch, čisiacich prostriedkoch, mydlách, zubnýcn pastách, šampónoch, atď. Zmes enzýmov možno používať v kombinácii so surfactantom, viď dole. Zmes enzýmov dokázala znížiť koncentráciu polychlórobifenylov (PCB) v znečistenej vode zo 40 na 5 pg/l. Zmes enzýmov nevyvoláva alergie, ekzémy, ani nemá toxické účinky na ľudskú pokožku alebo telo. Obsahuje 30 krát menej proteinov ako podobné výrobky vyrobené bakteriálnou fermentáciou.

Recultor slúži na rekultiváciu pôdy znečistenej najmä zvyškami minerálnych olejov. Skladá sa zo zmesi enzýmov a polovičného objemu surfactantu kyseliny dikarboxylovej s dlhým reťazcom (C23), nazývaného „laurylan“. Recultor možno aplikovať na pôdu priamo, dvojnásobným postriekaním postihnutej oblasti, alebo ho možno pridať podzemného zavlažovacieho systému. Jeden ml recultolu je schopný rozštiepiť cca. 50 mg komtaminátu. Priemerná dávka na pôdu, ktorú treba rekultivovať, je 300 - 700 1/ha plus 150

- 300 1 laurylanu. Recultol je možno tiež použiť na zrýchlenie rozkladu na skládkach odpadu. Špeciálnu aplikáciu predstavuje čistenie ropných tankerov, pretože enzymatická aktivita nie je narušená vyššími koncentráciami soli. So zmesou enzýmov viazanou na nosný, podľa možnosti rozkladateľný produkt, s takou hustotou, že pláva na povrchu olejovej fázy, a ďalší s fobicitou pre fázu voda-olej, možno odstraňovať ropné škvrny na mori. Oba prípravky zahrnujú rozkladateľné farbivo, červené alebo biele, získané autofokusáciou z rastlín. Farba horného povrchu sa zmení z bielej na ružovú. V prípade pevných povrchov, cementu, betónu, železníc, atď. rekultivácia recultolom sa uskutoční pod vysokým tlakom so zmesou 1 1 zmesi enzýmov a 1 1 laurylanu v 1 000 1 teplej vody (do 50°C).

Sanamor je tekutý umývací prostriedok, ktorý obsahuje zmes enzýmov, surfactant a dezinfikačný prostriedok, 0,1 0 glyoxalu. Sanamor možno používať na premývanie potrubia a zariadení v mäsopriemysle, mliekárenskom a potravinárskom priemysle. Sanamor je alternatívou kyselín a hydroxidov, ktoré vyžadujú vysoké teploty a je potrebné ich vymývať veľkým množstvom vody. Sanamor má pomer riedenia 1 : 100 až 1 : 200, pôsobí pri teplote 40°C. Je potrebné iba jedno umytie s dobou pôsobenia 20 minút. Sanamor má ďalšiu výhodu v tom, že odstraňuje usadeniny a vodný kameň v skrytých kútoch potrubia. Štiepi organickú stromu. Potom sa enzýmy plus hydrolyzované produkty vymyjú jedným prepláchnutím celého systému potrubia. Sanamor možno používať na zníženie emisií NH4 v kurínoch pravidelným sprejovaním kureniec a podstielky. Pretože asi dve tretiny emisií NH4 v kurínoch sa tvoria činnosťou baktérií v podstielke, jej úprava je dôležitá.

Enzympremix je tá istá zmes, ale enzýmy sú tentokrát absorbované vo vhodných nosičoch napr. zeolit alebo bentonit. Kŕmna zmes je vhodná pre broilery a ošípané na podporu rastu a látkovej výmeny. Znižuje okrem iného energiu potrebnú na syntézu vlastných enzýmov zvierat. Počas testov s enzympremixom neboli pozorované nijakú vedľajšie účinky alebo toxicita u testovaných zvierat alebo u ošetrovateľov zvierat. Nebolo možné určiť smrteľnú dávku u nyši, pretože tento materiál bol zjavne skonzumovaný ako normálna potrava.

Pre tento Príklad bol pripravený enzymmix pre účel komparatívnej skúšky v dvoch skupinách brojlerov spoločnosti Omega Kft., 1078 Budapešť, Maďarsko. Obe skupiny boli kŕmené stravou pre mjláďatá v prvom týždni života, obe skupiny dostávali vysoko energetickú potravu s antibiotikami od druhého týždňa života a konečnú zmes bez antibiotík počas posledného (7.) týždňa života. Voda bola dodávaná ad libitum. Jediným rozdielom medzi skupinami bolo pridanie počas miešania kŕmnej zmesi 1 1 enzymmixu do každej tony potravy podávanej od druhého dňa života. Boli pozorované významné rozdiely medzi dvomi skupinami po dosiahnutí želanej hmotnosti, v prospech skupiny, ktorá dostávala enzymmix. Rozdiely boli následovné: (3) Rýchlejší rast za kratšiu dobu, čo znamenalo o 200 g vyššiu konečnú telesnú hmotnosť na vtáka (v priemere sa dosiahlo 2 000 g za 36 dní oproti 1 800 g za 42 dní), (2) lepšie spracovanie potravy v skupine kŕmenej potravou s pridanými enzýmami, a (1) zníženie celkových strát o 52 % (celková úmrtnosť

5,5 % oproti 11,5 %). Kombinácia pridania enzymmixu do kŕmnej zmesi a sprejovanie kŕdľov a podstielky so sanamorom v 4 denných intervaloch malo za následok príjemnú vôňu v kuríne. Takto sa dosiahol nižší stupeň emisie NH4, ale nebola presne zmeraná. Celková emisia NH4 v týchto situáciách môže byť znížená o 70 %.

PRÍKLAD 3

Izolovanie lysozýmu

Lysozým je enzým , ktorý je prítomný v slzách a vaječnom bielku. Pre tento Príklad boli pozbierané bielky z 2 000 vajec (asi 50 1) a rozpustené v ľadovo studenej destilovanej vode, až 150 1. Všetky manipulácie sa uskutočňujú pri 4°C. Roztok bol prefiltrovaný a zavedený do 4 1 iautofokuséra s tromi výtokovými otvormi (plus dva elektródové výtokové otvory). Autofokusér bol najprv naplnený destilovanou vodou. Prietok bol nastavený na 75 ml/min., jenposmerný prúd mal napätie 1 000 V a počiatočný výkon systému bol 1,5 W. Po pridaní suspenzie z bielkov surových vajec sa výkon zvýšil na 10,5 W. Autofokusácia trvala 34 hodín. 40 1 tohto materiálu sa odobralo z pracovného výtokového otvoru najbližšieho ku katóde pri pH 10,5 s obsahom lysozýmu pri koncentrácii 200 U/ml. Táto suspenzia bola postupne zavádzaná do 1 1 kontifúzéra s tromi pracovnými a dvomi výtokovými otvormi. Prietok s destilovanou vodou bol nastavený na 10 ml/min., jednosmerný prúd mal napätie 1 000 V. Počiatočný výkon bol 1,6 W, ale sa zvýšil po pridaní

Iysozýmovej suspenzie. Autofokusácia trvala 3 dni. Odber sa uskutočnil na výtokovom otvore, ktorý bol najbližšie ku katóde pri pH 10,5. Analýza ukázala aktivitu lysozýmu 1 500 U/ml. Táto frakcia 12 1 bola potom zavedená do štyroch frakcií na 200 x 1 500 mm chromatografické stĺpce obalené molekulárnym gélom, Spheronom P-200, a odobrali sa 25 ml frakcie. V každej bol stanovený obsah proteínov a činnosť lysozýmu. Boli pozorované štyri proteínové vrcholy. Prvý vrchol obsahoval vyčistený lysozým pri štiepiacej aktivite proteínov 20 000 U/g.

PRÍKLAD 4

Izolovanie ot-amylázy

Rody Bacillus subtilis majú základný význam pre základnú vedu, medicínu a priemysel. Celý genóm je v súčasnosti predmetom výskumu (Náture 390, str. 237 a str. 1249, 1997) spojeným úsilím viacerých laboratórií. Sledovanie tohto spórotvorného gram-pozitívneho bacilu poskytuje vodítka k pochopeniu antibiotického odporu gram-pozitívnych patogénov a zakódovanie niektorých enzýmov, ktoré je možné využiť v priemysle.

Pre tento Príklad rod Bacillus subtilis A - 200 bol kultivovaný v 500 1 sa zastavil po spektrometrickom meraní pri 550 mm a bola zistená hodnota > 0,5. Bakteriálna hmota bola oddelená z média pomocou separátora. Do 10 1 autofokuséra bol zavedený supernatant, prietok bol 250 ml/min a jednosmerný prúd mal napätie 350 V. Použil sa autofokusér s tromi pracovnými výtokovými otvormi, ktorý mal dva výtoky na stranách oboch elektród a jeden v strede zariadenia. Výtok elektród bol zavedený do druhého 5 1 autofokuséra. Opäť sa použilo zariadenie s tromi výtokovými otvormi a zo stredného otvoru sa odobrala vyčistená α-amyláza. Prietok bol nastavený na 100 ml/min a jednosmerný prúd mal napätie 500 V. Z výtokového otvoru v strede sa získala pomerne čistá α-amyláza s amylolytickou aktivitou 200 U/g.

PRÍKLAD 5

Izolovanie inzulínu

Pre tento príklad bol v destilovanej vode suspendovaný priemyselne vyrábaný inzulín (NovoNordisk, DK) pri 1 mg/ml. Tri litre tejto suspenzie boli zavedené do 1 1 iautofokuséra s piatimi výtokovými otvormi (2 elektródové a 3 na zber pracovného roztoku). Podmienky boli následovné: prietok 25 ml/min., jednosmerný prúd s napätím 400 V a elektrický výkon 8 W. Autofokusácia trvala dve hodiny. Z prvého pracovného výtokového otvoru v blízkosti anódy sa zhromaždilo 800 ml vyčisteného inzulínu. Kontrolná analýza PAGE ukázala v pôvodnom neupravenom inzulínovom prípravku štyri pásy medzi 12-8 kB. Keď autofokusácia pokračovala, bol pozorovaný iba jeden pás pri 10 kB, čo zodpovedalo vyčistenému inzulínu. Ak je potrebné inzulín ďalej čistiť, je možné zaviesť ďalšie spracovanie gelovou chromatografious použitím 100 x 500 chromatografického stĺpca obaleného so Spheronom P-20. Vyčistený inzulín sa objaví v prvom proteínovom vrchole.

PRÍKLAD 6

Čistenie lyzínu

Technický lyzín možno získať z rôznych zdrojov. Používa sa ako zdroj aminokyselín na zvýšenie kvality krmiva zvierat Ak je potrebný čistejší lyzín, je potrebné učiniť viacero komplikovaných krokov a finálny produkt je drahší. Pre tento Príklad sa použil tu uvádzaný vynález na čistenie lyzínu. Technický lyzín bol zriedený v destilovanej vode na koncentráciu 3 %. Vodivosť bola 2 000 gS/cm. Päťsto 1 tohto roztoku bolo zavedených do 3 1 autofokuséra s piatimi výtokmi, viď Príklad 5. Vyčistený lyzín bol odobratý z prvého výtokového otvoru. Tento materiál mal vodivosť cca. 500 gS/cm a koncentrácia lyzínu bola > 15 %. Strata vstupného proteínového materiálu bola cca. 5 - 10 %, ale zahrnovala i stratu nečistôt v dôsledku pôvodnej bakteriálnej fermentácie.

PRÍKLAD 7

Čistenie whisky

Pri väčšine alkoholických nápojov sú potrebné jeden alebo dva destilačné kroky, aby sa eliminovali rôzne nežiadúce látky, napr. octany amylnaté, hexanáty etylnaté, oktanoáty etylnaté, dekanoáty etylnaté, dodekanoáty etylnaté, ktoré obzvlášť kazia chuť. Elimináciu týchto nežiadúcich frakcií je možné dosiahnúť iba dodatočnými destilačnými postupmi. Tu uvádzaný vynález umožňuje nákladné čistenie. Pre tento Príklad bola whisky značky Canadian Club zavedená do 10 1 autofokuséra. Prietok bol 1 1/min., jednosmerný prúd mal napätie 1 000 V a intenzitu 10 mA, čo vyplynulo do výkonu 10 W. Boli použité tri pracovné výtokové otvory (dva elektródové a jeden otvor v strede). Whisky získanú zo všetkých otvorov analyzovali desiati špecialisti, ktorí hodnotili rozdiely vo farbe, vôni a chuti. Iba vzorka získaná z tretieho výtokového otvoru potrebovala ďalšiu destiláciu. Druhé dve vzorky boli zmiešané, a kvalita a chuť sa zlepšili. Plynová chromatografia mala za následok zmenu jednotlivých komponentov následovne: octany amylnaté - pokles z 0,04 na 0,01 mg/100 ml, hexanáty etylnaté - z 0,05 na 0,02, oktanoáty etylnaté - z 0,03 na 0,01, dekanoáty etylnaté - z 0,25 na 0,001, dodekanoáty etylnaté - z 0,01 na 0,005 mg/100 ml.

PRÍKLAD 8 Čistenie vodky

Pre tento príklad bolo zavedených 20 1 slovenských a holandských značiek do 3 1 autofokuséra. Prietok bol 3 1/hod., počiatočný výkon jednosmerného prúdu bol nastavený pri 275 V a 80 mA na 22 W. Kvôli eliminácii elektrolytov cez odpadové výtokové otvory vodivosť poklesla. Napätie sa zvýšilo na 750 V pri poklese prúdu, čo malo za následok výkon 12 - 18 W. Dva pracovné výtoky boli pripojené k 40 % a 60 % pracovných komôr. Bolo namerané percento obsahu alkoholu 41 % v dvoch pracovných výtokoch, ako aj v odpadovom výtoku. Vodka získaná z prvého pracovného výtokového otvoru na strane katódy mala „ostrú“ chuť a možno ju použiť ako lieh na „čistenie“. Vodka z druhého výtokového otvoru mala „mäkkú“ chuť.

Koncentrácia poly-nenasýtených mastných kyselín a aldehydov poklesla o 75 % a 80 %.

Kontiautofokusér v dvojkombinácii na čistenie vodky mal prietokovú kapacitu 5 1/min. a 7 2000 1/deň. Za deň sa získalo celkovo 6 800 1 vyčistenej vodky. Počas tohto čistenia poklesli poly-nenasýtené mastné kyseliny o 68 % a aldehydy o 88 %.

PRÍKLAD 9 Čistenie vína

Prírodné vína môžu mať vysokú koncentráciu kyselinových komponentov. Na dôvažok sa nadmernou fermentáciou alebo rozkladom spôsobeným zvyškovými produktmi kvasenia znižuje kvalita. Pri použití bežných postupov je ťažké eliminovať kyslosť alebo umelú príchuť. Tu uvádzaný vynález poskytuje technické riešenie vedúce k zlepšeniu kvality vína, ako je to ukázané na tomto Príklade: 50 1 tokajského vína s kyslou chuťou a pH hodnotou 3,8 bolo zavedených do 10 1 autofokuséra. Bol nastavený 200 ml prietok za minútu a medzi elektródami bolo vytvorené napätie jednosmerného prúdu v hodnote 250 V. Použilo sa zariadenie s tromi pracovnými výtokovými otvormi. Separácia trvala 4 hodiny. Získané roztoky boli poskytnuté panelu profesionálnych ochutnávačov, ktorí hodnotili farbu, vôňu a chuť. Zlepšené víno bolo odobraté z pracovného výtokového otvoru v strede a z výtokového otvoru katódy. Vzorky sa premiešali, a tak bola dosiahnutá lepšia kvalita vína s hodnotou pH 5,2. 80 % vloženého objemu sa zlepšilo. Vodivosť poklesla z 1,670 gS na 1 200 gS., čo znamená, že nežiadúce nabité látky s nízkym M.W. boli eliminované.

PRÍKLAD 10 Čistenie pitnej vody

Čistenie a výroba kvalitnej pitnej vody závisí od zdroja pôvodnej vody. Posledné kroky čistenia sú zvyčajne najdrahšie alebo najťažšie. Je možné vylúčiť bakteriálne znečistenie absorbčnými filtrami, ale je omnoho ťažšie spracovať chemické znečistenie, napr. dusitany, dusičnany a rôzne kovy spôsobujú veľké problémy.

Tu uvádzaný vynález poskytuje prostriedok na čistenie vody v pomerne malej škále, napr. pre domácnosti, prívesy, farmy a továrne pri minimálnych nákladoch na energiu a zariadenie. Maximálna koncentrácia soli, ktorú možno pomocou zariadenia zvládnuť podľa tohto vynálezu, sa pohybuje medzi 900 1 2000 mg/1. A preto s týmto autofokusérom nie je možné uskutočniť odsoľovanie morskej vody. Maximálny výkon jednej jednotky s interným objemom 1 je 150 1/deň. Pri sériovom zapojení napr. 5 jednotiek dokáže vyčistiť cca. 750 1/deň.

Pre tento príklad bolo v 10 1 autofokuséri s jedným pracovným výtokovým otvorom a dvomi otvormi v blízkosti elektród nastavený prietok 1 1/min. Ako dole uvedená analýza ukazuje, zo stredného výtokového otvoru bola získaná vyčistená pitná voda, kým z elektródových výtokových otvorov voda obsahovala množstvo nežiadúcich iónov a prvkov. Strata objemu vody bola 15-20 %. Výsledky analýzy tohto pokusu boli nasledovné:

Komponent pred po Komponent pred po

meď	8,7	1,6	zinok	71,0	12,4
železo	12,3	1,2	arzén	0,12	0,04
nikel	0,05	stopa	olovo	0,71	0,05
chróm	3,14	0,8	kadmium	stopa	žiadna
ortuť	0,05	stopa

Kvalita pitnej vody získaná zo stredného pracovného výtokového otvoru sa dá regulovať nastavením napätia, výkonu a prietoku. Objem komory alebo počet zariadení je možné prispôsobiť požadovaným podmienkam, napr. urobí sa výpočet pre farmu s 200 ks dobytka, ktorá používa pitnú vodu zo studne. Dobytok potrebuje cca. 40 000 1/deň alebo prietok 40 000 : 24 : 60 = prietok 28 1 /min. Z toho dôvodu je potrebných šesť 10 1 kontiautofokusérov s prietokom 5 1/min.

PRÍKLAD 11

Izolovanie imunoglobulínu

Ha. Myš: Pre tento príklad sa použil 300 ml sérum pool myší, ktoré boli imunizované s králičím IgG (Sevac, Praha). Sérum bolo zriedené v pomere 1 : 3 s ľadovo studenou destilovanou vodou, a 1 200 ml tohto roztoku sa aplikovalo na 1 1 autofokusér s piatimi vopred určenými výtokovými otvormi. Autofokusér bol najprv naplnený destilovanou vodou. Tok bol nastavený na 8 ml/min., výkon jednosmerného prúdu na 1 000 V a počiatočný výkon systímu činil 1,6 W. Po pridaní séra sa výkon zvýšil na 5 W v dôsledku zvýšenej vodivosti. Autofokusácia prebiehala cca. 3 hodiny. Vo všetkých piatich výtokových otvoroch sa testoval imunoglobulín pomocou imunoelektroforézy. Imunoglobulíny boli zistené v druhom výtokovom otvore na strane anódy, pH bolo medzi 4 a 6. Anti IgG titer tohto výtoku bol 1 : 128 na základe pasívneho hemaglutinačného testu s použitím antiséra proti králičiemi IgG. 180 ml z tohto materiálu bolo zavedených na chromatografický stĺpec obalený Spheronom P-200 a vyrovnaný destilovanou vodou. Boli odobrané 10 ml frakcie a testovala sa v nich prítomnosť imunoglobulínov. Ukázali sa štyri proteínové vrcholy. Polovyčistené imunoglobulíny boli prítomné v koncentrácii 0,5 mg/ml v prvom vrchole. V teste pasívnej hemaglutinácie sa získal anti-IgG titer 1 : 1024. Všetky vzorky z tohto vrcholu boli odobrané a suchým mrazením skoncentrované na ďalšie použitie.

11b. Človek: Pre tento Príklad sa čistilo ľudské sérum s protilátkami proti vírovému antigénu hepatitídy typ B (HbsAG). Dva 1 séra boli zriedené až v 8 1 v destilovanej vody, t.j. pomer riedenia bol 1:4a boli nasýtené až 8 M močoviny; pridal sa 0,1 % glyoxal. Do 1 1 kontiautofokuséra so štyrmi výtokovými otvormi bol zavedený konečný objem 10 1. Prietok bol nastavený na 0,25 1/hod. A počiatočný výkon jednosmerného prúdu bol 10 W. Po a5 hodín. Odobralo sa množstvo proteínov, 9 mg/ml a vrátane špcifických protilátok z druhého výtokového otvoru na strane anódy pri pH 5,6. Boli odobrané celkom 2 1. Na titri 1 : 512 boli prítomné imunoglobulíny proti HbsAg v imunodifúznom teste. HbaAg protilátky boli ďalej čistené gélovou chromatografiou následovne: polovyčistená vzorka séra bola rozdelená na päť častí po 400 ml a každá z nich bola zavedená na zvláštny obalený Spheronom P-200. Boli dosiahnuté štyri proteínové vrcholy. Prvý vrchol obsahoval špecifické protilátky. Boli odobratí všetky špecifické protilátky v piatich spracovaniach gélovou chromatografiou a zriedené v celkovom objeme 4 500 ml destilovanej vody. Potom sa kontifokúzovanie opakovalo, viď hore. HbsAg protilátky boli odobraté z dvoch pracovných výtokových otvorov v strede pri pH 5,1 a pH 5,4.

Tu uvádzaný vynález umožňuje účinnú prípravu protilátky proti celému spektru imunitných reakcií vyvolaných napr. enzýmom, toxínom alebo varovým alebo bakteriálnym povrchovým proteínom. V sieťovej teórii regulácie imunity (Jerne: Ann.Immunol. 125; 373-389) boli popísané mimikračné vlastnosti antiisiotypických protilátok ako funkčný vnútorný obraz antigénov.

11c. Ošípaná: Pre tento Príklad bolo imunizovaných s komerčnou vakcínou proti vírusu horúčky ošípaných (SFV) na základe čínskeho druhu C päť ošípaných s telesnou hmotnosťou 100 kg. Ošípané boli zabité a pitvané 5 týždňov po imunizácii. Odstredením pri 800 rpm bolo získaných 10 1 séra. Sérum bolo 3 krát riedené v destilovanej vode a 30 1 bolo nasýtených močovinou do 8 M; bol pridaný 0,1 % glyoxal. Táto látka bola zavedená do 2 1 autofokuséra s piatimi výtokovými otvormi. Podmienky boli nastavené na 100 ml/min. prietok a výkon jednosmerného prúdu 250 V na začiatku.

v

Autofokusácia trvala 5 hodín. Špecifické protilátky proti SFV boli pozorované vo vzorkách odobratých z dvoch výtokových otvorov, z prvého pracovného výtokového otvoru pri pH 4,5 a z druhého pri pH 6,2. Bola použitá SFV neutralizačná testovacia súprava (VNT) (Sevac, (Praha) (Nakoľko to bolo úplne neočakávané pozorovanie, SFV vakcína bola vystavení kontifokúzovaniu tak isto, v ktorom sa ukázalo, že táto SFV vakcína obsahovala dve populácie SFV, pravdepodobne SFV E₂ (gp55) a SFV E^rns epitopy, ktoré oba zavádzajú neutralizačné protilátky proti SFV. VNT ukázala, že oba vírové vrcholy boli SFV špecifické a nebolo odhalené znečistenie S BVD vírom). A tak dve frakcie anti-SFV vírusu po 1 1 boli získané. Obe frakcie boli hlboko zmrazené, potom zriedené v 0,9 % NaCl v destilovanej vode až do koncentrácie proteínu 3 mg/ml a boli oddelene v oddelených spracovaniach zavedené na chromatografické stĺpce obalené Spheronom P-40. PH 6,2 frakcia dala jednu proteínovú frakciu, ktorá mala titer VNT protilátok 1 : 512. pH 4,5 frakcia dala štyri proteínové frakcie po gélovej chromatografii. Dva vrcholy boli pozitívne na SFV protilátky s titrami VNT protilátok 1 : 64. Tri frakcie pozitívne na SFV protilátky, ako aj tri frakcie pozitívne na SFV protilátky skombinované budú použité na imunizáciu kôz, aby sa zistilo, že vynález možno použiť na prípravu vakcíny antiidiotypu proti horúčke ošípaných.

PRÍKLAD 12

Príprava novej sub-unit vakcíny proti infekciám E.coli

V súlade s predošlým spôsobom bola vyvinutá séria vakcín proti rôznym adhéznym faktorom E(scherichia) coli. Pre každý adhézny faktor sa použil zvláštny fermentačný krok. Tento Príklad popisuje unikátnu multifaktoriálnu vakcínu vzniknutú rekombináciou sub-units proti E. coli infekciám dobytka, ošípaných a oviec, ktorá si vyžaduje iba jeden krok bakteriálnej fermentácie. Druhé zlepšenie je výroba podľa tohto vynálezu: Geneticky modifikovaný E.coli konštrukt sa vyrobil z E.coli obsahujúci K 88 ab antigén, druh G-7 (získané z Veterinárnej fakulty, Univerzita Košice, SK); U-200 obsahujúceho druh K 88 ac (Štátna veterinárna univerzita, Montevideo, Urugvaj); a Lt enterotoxinovej protilátky s druhom S-IH (Československá zbierka mikroorganizmov, Brno, SK) a z druhu 987-P (Dr. Salajka, Ivanovice na Hané, CZ). Plazmidy dekódujúce antigény boli klonované za použitia reštrikčných enzýmov BglI, BglII a Pst. Prostredníctvom analytickej a prípravnej PAGE boli izolované reťazce DNA 20-90 kDa a spojení s Lambda L4 ligázou v rôznych kombináciách. Konštrukty boli transfektované do druhu E.coli bez plazmidov H -110 elektroporáciou. Dva konštrukty boli vybrané, ktoré dekódovali rezistenciu na chloramfenikol a tetracyklíny, a ktoré obsahovali všetky hore uvedené adhézne faktory a enterotoxíny. Integrácia a vyjadrenia K88 ab, ac, K99, 987(P a Lt enterotoxínových génov boli testované hemoglutinačnými testami. Päťdesiat sekvenčných bakteriálnych kultivačných krokov sa použilo na dokázanie stability integrácie a vytlačenia všetkých cudzích antigénov. Modifikovaný druh H-110 E.coli bol kultivovaný v 300 ml fermentéra. Po 8 hodinách fermentácie bola odobratá kultúra baktérií odstredená pri 800 rpm. Bol získaný celkový bakteriálny sediment o hmotnosti 750 g a táto látka bola vystavená posuvu povrchových proteínov (fimbrae) v 20 1 ľadovo studenej destilovanej vody po dobu 10 min. Po prvom posuve bol roztok opäť odstredený pri 3 000 rpm a bol odobratý supernatant. Zvyšný sediment bol rozriedený v 20 1 ľadovo studenej vode, pridalo sa 750 mg sklenených guličiek a miešalo sa po dobu 10 minút. Povrchové proteiny boli ďalej čistené v autofokuséri s 10 výtokovými otvormi, dva v blízkosti elektród, štyri pracovné výtokové otvory a tri odpadové výtokové otvory medzi nimi. Antifokusácia prebiehala pri prietoku 75 ml/min. prietoku, napätí jednosmerného prúdu 500 V, výkone 14 W, teplote 4°C a trvala 9 hodín. Roztoky z 2., 4., 6. A 8. pracovného výtokového otvoru odpovedajúce pH hodnotám od 4,5 - 5,0, pH 6,0 - 7,0, pH 7,0 - 7,5 a pH 9,5 - 10,0 dali purifikované frakcie obsahujúce K 88ab, ac; 987-P; enterotoxín LT a antigéne K 99. Titre sú stanovené testom pasívnej hemaglutinácie, a vyčistené antigény možno zriediť 5 - 10 X k titru 1 : 152. Kroky koncentrácie nie sú potrebné. Bola pripravená stabilná olejová emulzia zahrnujúca 0,5 mg/ml K88 ab, ac, K99, 987/P a antigény Lt. enterotoxínu. Boli pridané adjuvanty (Specol®, 20 % W/W, ID-DLO Inštitúte, Lelystad, NL) a 0,1 % glyoxal. Táto nová vakcína vzniknutá rekombináciou sub-units bola použitá na vakcináciu pregnantných kráv 5 týždňov pred pôrodom, aby sa dosiahla pasívna imunita u potomka. Pozorované titre matkiných protilátok u teliat boli 2-3 násobne vyššie ako v prípade predchádzajúceho typu vakcíny. Bola pozorovaná nižšia strata (1,5 %) hnačky a otravy spôsobenej E.coli. Pokusy s patogénnymi druhmi E.coli (2 ml obsahujúce 10⁹ baktérií/ml) nemali za následok vyššiu úmrtnosť. Túto vakcínu možno použiť obzvlášť v hospodárskej prevádzke, kde antibiotiká nie sú k dispozícii alebo z nejakých dôvodov nie sú žiadané.

PRÍKLAD 13

Čistenie polynukleotidov

Pôvodný druh autofokusácie sa použil na čistenie založenom na odporovej heterogenite antibiotík DNA plazmidov, nositeľov faktorov E.coli spôsobujúcich hnačku a otravu E.coli. Pre tento príklad boli izolované DNA plazmidy štandardným spôsobom podľa Maniatisa et al., J. Bacteriology (1982) z druhov E.coli F 027 (plazmid RMS 151), C 600 (RSF 1010) a J 53 (pSa). 3 % glycerolu rozpustený v destilovanej vode sa použil na riedenie DNA plazmidov. Na kontifokusáciu sa použil objem 1 1 každého plazmidu obsahujúceho cca. 7 gg čistého DNA/lOOml. Bol použitý malý 0,5 1 autofokusér s deviatimi pracovnými výtokovými otvormi. Prietok bol 50 ml/hod. Separácia trvala 10 hodín u každého plazmidového prípravku. Boli získané následovné výsledky: Plazmid RMS 151 bol separovaný do dvoch frakcií a tieto pochádzali z prvého a tretieho anodického výtokového otvoru pri pH 2,7 a 4,1. Na základe odporu proti antibiotikám sa ukázalo, že izoelektrická frakcionácia plazmidu DNA vytvorila frakcie s tetracyklínmi a ampicilínom, ale jedna frakcia ukázala odpor proti tetracyklínu a druhá iba proti ampicilínu. Plazmid pSa sa rozdelil do troch frakcií, ktoré sa objavili v prvom, druhom a treťom výtokovom otvore pri anóde pri pH 2,1, 3,4 a 4,2. Plazmid RFS 1010 ale ostal homogénny po autofokusácii a iba jedna frakcia vykazujúca odpor proti tetracyklínu a ampicilínu bola odobratá z druhého anodického výtokového otvoru pri pH 2,9. UV spektrometrické meranie ukázalo, že koncentrácia plazmidu sa zvýšila na 20 - 28 gg DNA/100 ml, čo znamená 4-násobnú koncentráciu pôvodnej vzorky. Podobná koncentrácia bola nameraná pre každú frakciu plazmidy RMS 151a pSa.

Výhodou tohto vynálezu pre čistenie DNA je, že čistené plazmidy sa získavajú na základe určitých hodnôt pl na základe rôznej rezistencie proti antibiotikám a súčasne sa dosiahne 4-násobná koncentrácia. Obe sú dôležité pre veľkovýrobu.

PRÍKLAD 14

Čistenie tetracyklínu

Predchádzajúce izoelektrické metódy sa používali na čistenie komerčne predávaného tetracyklínu získaného od firmy Spofa ČSFR (Farmaceutické závody, CZ). Tetracyklín bol separovaný do štyroch vrcholov s rôznou farbou a pH hodnotou, a jedna frakcia vykázala zvýšenú bakteriálnu aktivitu v testoch rezistencie na antibiotiká na E.coli a dve na Streptococcus Spp. Vyčistená vzorka odobraná pri pH 2,3 obsahovala leukotriény, skupinu biologicky aktívnych metabolitov kyseliny arachidonickej s tromi združenými dvojitými väzbami, ktoré spôsobujú toxické a alergické reakcie. Je možné eliminovaž takéto polynasýtené mastné kyseliny počas výrobného procesu prostredníctvom tu uvádzaného vynálezu.

Pre tento príklad sa rozpustilo 200 g komerčného tetracyklínu rovnakej značky v 2 1 destilovanej vody obsahujúcej 30 % etylalkoholu a bol zavedený do 800 ml autofokuséra s ôsmimi pracovnými výtokovými otvormi. Prietok bol nastavený na 40 ml/min. a počiatočný výkon jednosmerného prúdu na 4 W. Štyri frakcie boli odobrané z každého nepárneho výtokového otvoru, t.j. pri pH 2,2 s hnedou farbou, pri pH 6,8 so svetložltou farbou, pri pH 7,9 s oranžovo-žltou farbou a pri pH 9,2 s oranžovou farbou. Štyri odpadové výtokové otvory sa nachádzali medzi nimi. Bakteriálna aktivita štyroch frakcií bola testovaná z hľadiska rezistencie proti druhu E.coli G7 a proti Streptococcus aureus, kat. č. 644 527 (Česká zbierka mikroorganizmov). Úplný bakteriálny rast okolo kotúča bol označený ako prázdna oblasť veľkosti kotúča ako „+“, neprítomnosť bakteriálneho rastu v oblasti dvojnásobne veľkej ako veľkosť kotúča „++“ a väčšia „+++“. Baktericidálne aktivity frakcií pri pH 2,2, 6,8, 7,9 a 9,2 boli hodnotené u oboch druhov a boli hodnotené z anodickej strany nasledovne:

„+++“, „++“ a „+“. Tieto výsledky indikujú, že kontiautofokusér v dvojkombinácii (2 x 25 1 objem) možno používať s kapacitou prietoku 2,5 1/min. (3 600 1/deň). Z výtokového otvoru možno denne odobrať 360 1 vyčisteného tetracyklínu pri pH 6,8. Predbežné štúdie môžu určiť, či podobnú podporu baktericidálnu aktivitu a elimináciu toxických produktov možno obdržať I pre iné antibiotiká.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY ' * I - • r ’ ·. ‘

1. Izoelektrické zariadenie.s plynulým tokom na separáciu nabitých látok v kvapalnom médiu autofokusáciou zahrnujúce separačnú komoru (1), dvojicu vertikálnych elektród (9) umiestnených v separačnej komore na krajoch jej prierezu, dva alebo viaceré výtokové otvory (12) v rovnakej výške v hornej časti komory, vertikálnu stenu (6) medzi každým z dvoch hore uvedených výtokových otvorov rozdeľujúcich komoru minimálne vo výške uvádzaných výtokových otvorov vyznačujúce sa tým, že obsahuje vertikálnu katiónovú selektívnu membránu (10) umiestnenú v blízkosti katódy a vertikálnu aniónovú selektívnú membránu (10) umiestnenú v blízkosti anódy na separáciu elektródových priestorov od centrálnej časti komory s kvapalinou, uvádzané katiónové a aniónové selektívné membrány umožňujúce priechod katiónov a aniónov s nízkou molekulárnou váhou z uvádzanej centrálnej časti do spomínaných elektródových priestorov, uvádzané iónové selektívne membrány, ktoré v podstate neprepúšťajú látky s vysokou molekulárnou váhou, sekundárny výtokový otvor (11) v hornej časti komory v každom elektródovom priestore, zariadenie ďalej zahrnuje vertikálne priepustné deliace steny (13), ktoré sú konštruované tak, aby sa predchádzalo horizontálnym turbulenciám.
2. Izoelektrické zariadenie s kontinuálnym tokom podľa nároku 1, vyznačujúce sa tým, že uvádzané vertikálne priepustné deliace steny (12) sú steny v tvare T.
3. Izoelektrické zariadenie s kontinuálnym tokom podľa nároku 1, vyznačujúce sa tým, že uvádzané vertikálne priepustné deliace steny (13) sú steny v tvare cik-cak.
4. Izoelektrické zariadenie s kontinuálnym tokom podľa ktoréhokoľvek nároku 1 až 3, vyznačujúce sa tým, že obsahuje minimálne tri uvádzané primárne výtokové otvory (12).
5. Izoelektrické zariadenie s kontinuálnym tokom podľa ktoréhokoľvek nároku 1 až 4, vyznačujúce sa tým, že obsahuje vertikálnu priečnu stenu, ktorá je v podstate kolmá na hore uvádzané vertikálne steny, s výtokovými otvormi na jednej alebo druhej strane uvádzanej priečnej steny.
6. Metóda separácie alebo čistenia látky z vodnej zmesi, vyznačujúca sa tým, že používa izoelektrické zariadenie s plynulým tokom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5.
7. Metóda podľa nároku 6, vyznačujúca sa tým, že sa udržuje tok vodnej zmesi smerom hore.
8. Metóda podľa nároku 7, vyznačujúca sa tým, že uvádzaný tok je medzi 25 a 250 1/deň.
9. Metóda podľa niektorého z nárokov 6 až 8, vyznačujúca sa tým, že látky, ktoré treba separovať, obsahujú nečistoty v pitnej vode alebo iných nápojoch , či už s obsahom alebo bez obsahu alkoholu.
10. Metóda podľa niektorého z nárokov 6 až 8, vyznačujúca sa tým, že uvádzaná látka je polynukleotid, aminokyselina, peptid, proteín vrátane antigénov a imunoglobulínov, enzým, antibiotikum, alergén, alkaloid alebo komponent bunkovej štruktúry.
11. Metóda podľa niektorého z nárokov 6 až 8, vyznačujúca sa tým, že uvádzaná látka je látka vytlačená alebo extrahovaná z mikroorganizmu, suchozemského alebo morského živočícha alebo rastliny alebo ich častí alebo derivátov.
12. Metóda výroby vakcíny, vyznačujúca sa tým, že zahrňuje čistenie antigénu prostredníctvom metódy podľa nároku 10 a kombinujúcej vyčistený antigén s ďalšími zložkami vakcíny.
13. Metóda výroby testovacej súpravy, vyznačujúca sa tým, že zahrňuje čistenie antigénu prostredníctvom metódy podľa nároku 10 a kombinujúcej vyčistený antigén s ďalšími komponentmi testovacej súpravy.
14. Vyčistený hydrolytický enzým derivovaný z dážďoviek, obzvlášť z druhu E. foetida, odpovedajúci eisenáze, feluláze, fetiláze, fetipáze a wormáze s izoelektrickým bodom stanoveným izoelektrickým fokusovaním na 8,3, 7,0, 6,5, 3,2 a 2,8 a s molekulárnou hmotnosťou 17, 67, 36, 18 a 31 kDA stanovenou metódou SDS-PAGE, alebo kombinácia dvoch alebo viacerých z enzýmov.
15. Použitie enzýmu podľa nároku 14 alebo ich zmesi na rekultiváciu pôdy a podzemnej vody, čistenie olejových škvŕn v morskej vode, úpravu odpadovej vody alebo na čistenie námorných lodí, najmä tankerov.
16. Použitie enzýmu podľa nároku 14 alebo ich zmesi na čistenie bitúnkov, dojacich zariadení, umývačiek áut, kúpelní, podláh, potrubia alebo zariadení.
17. Použitie enzýmu podľa nároku 14 alebo ich zmesi na podporu rastu.
18. Použitie enzýmu podľa nároku 14 alebo zmesi enzýmov na úpravu pachov alebo zníženie emisie čpavku.
19. Použitie enzýmu podľa nároku 14 alebo zmesi enzýmov v šampónoch alebo zubných pastách.
20. Použitie fetilázy podľa nároku 14 ako,prísady pri varení piva.