SK10922002A3

SK10922002A3 - Spôsob separácie paclitaxelu od cefalomanínu

Info

Publication number: SK10922002A3
Application number: SK1092-2002A
Authority: SK
Inventors: Bruno Gabetta; Gianfranco Zini
Original assignee: Indena S. P. A.
Priority date: 2000-11-28
Filing date: 2001-11-09
Publication date: 2003-01-09
Also published as: SK287109B6; WO2002044162A1; DK1392669T3; HUP0204028A2; AU1908502A; HU229096B1; CN1187347C; CZ304180B6; CN1396917A; PT1392669E; EP1392669A1; IL150901A; CA2398405C; EP1392669B1; KR20020068088A; ATE427305T1; PL202590B1; PL355683A1; CZ20022490A3; SI1392669T1

Description

Spôsob separácie paclitaxelu od cefalomanínu

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa zaoberá separáciou paclitaxelu od jeho analógu cefalomanínu z výťažkov rastlín rodu Taxus alebo z ich bunkových kultúr. Paclitaxel sa separuje od cefalomanínu najmä chromatografiou na silikagélových stĺpcoch s priamymi fázami.

Doterajší stav techniky

Paclitaxel, predtým nazývaný „taxoľ je neobyčajne sľubné protirakovinové

I činidlo. Bol izolovaný z kôry Taxus brevifolia Wanim a kol. v roku 1971 (J. Am. Chem. Soc. 93, 2325, 1971) a jeho štruktúra sa určila použitím chemických metód a rôntgenovej kryštalografickej analýzy.

R = PhCO-

Paclitaxel bol schválený Správou pre potraviny a lieky [Food and Drug Administration] na liečenie rakoviny prsníka a vaječníkov a v súčasnej dobe sa podrobuje klinickým skúškam na liečenie rakoviny pľúc alebo hrubého čreva (pozri napríklad W. P. McGuire a E. K. Rowinsky, Paclitaxel in Cancer Treatment, M. Dekker, New York, 1995, strany 1 až 337).

Hlavným prírodným zdrojom paclitaxelu je kôra tisu s krátkymi ihličkami,

Taxus brevifolia. Taktiež sa zistilo, že paclitaxel je .prítomný v epigeálnych častiach a koreňoch iných druhov tisu, medzi ktoré patrí európsky tis (Taxus baccata),

-2ázijské tisy (Taxus wallichiana a Taxus chinensis), a odrody tisu, kultivované pre dekoratívne účely (napríklad Taxus média).

Spôsob izolácie paclitaxelu z ktoréhokoľvek prírodného zdroja je zložitý a drahý, čiastočne kvôli jeho relatívne nízkej koncentrácii v rastlinných materiáloch, ale taktiež kvôli prítomnosti jedného z jeho príbuzných, cefalomanínu. Ich obsahy a pomery medzi paclitaxelom a cefalomanínom sa v rastlinných materiáloch rôznia v závislosti od druhu a časti rastliny, o ktorej je reč. Vo všeobecnosti sa zistilo, že obsah paclitaxelu a cefalomanínu sa pohybuje pre každú látku samostatne v rozmedzí od 0,001 % do 0,08 % a od 0,001 % do 0,22 % (K. M. Witherup a kol., J. Nat. Prod., 53, 1249,1990; R. G. Kelsey a kol., 55, 912, 1992; N. C. Wheeler a kol., J. Nat. Prod., 55, 432, 1992). Najmä druhy Taxus média, ktoré sú obnoviteľným rastlinným materiálom, a sú najčastejšie používaným surovým materiálom na prípravu paclitaxelu, obsahujú v priemere najvyššiu koncentráciu cefalomanínu v porovnaní s inými druhmi.

Dokonca, spôsoby produkcie paclitaxelu, založené na bunkových kultúrach tisu, ktorým bola poskytnutá v poslednom čase značná podpora, aby sa tak vyhlo bežnej extrakcii drahého rastlinného materiálu, prinášajú okrem paclitaxelu aj významné množstvo cefalomanínu.

Jediný štrukturálny rozdiel medzi paclitaxelom a cefalomanínom sa týka časti bočného reťazca zlúčeniny, z čoho pramenia aj podobné chemické vlastnosti. Tieto dve zlúčeniny majú z tohto dôvodu aj veľmi podobné chromatografické vlastnosti a čistá separácia týchto dvoch príbuzných zlúčenín je obtiažna. Bolo navrhnutých množstvo chromatografických metód, založených prevažne na použití chromatografie s obrátenými fázami alebo drahých stĺpcov s viazanými fázami (J. H. Cardellina, J. Liq. Chromatograf.; 14, 659, 1991; Š. L. Richheimer a kol., Anál. Chem., 64, 2323, 1992; E. R. M. Wickremesinhe a kol., J. Liq. Chromatogr., 16, 3263, 1993; K. M. Witherup a kol., J. Liq. Chromatogr., 12, 2117, 1989), ale tieto sa nedajú jednoducho prispôsobiť komerčnej veľkotonážnej prevádzke. Z tohto dôvodu zostáva dostupnosť metód, umožňujúcich separáciu paclitaxelu a cefalomanínu predmetom, z praktického hľadiska veľmi dôležitým.

V minulosti boli predkladané metódy separácie paclitaxelu a cefalomanínu, ktoré boli založené na rôznej reaktivite týchto dvoch zlúčenín voči oxidačným

-3činidlám. Zistilo sa, že dvojitá olefínová väzba, nachádzajúca sa vtiglínovom zvyšku cefalomanínu sa môže oxidovať reakciou s oxidom osmičelým (D. G. I. Kingston a kol., J. Nat. Prod., 55, 259, 1992) alebo ozónom (J. T. Beckvermit a kol., J. Org. Chem., 61, 9038, 1996), zatiaľ čo paclitaxel nepodlieha žiadnej chemickej premene počas oxidačných reakcií. Ďalší prístup zvažuje vzájomné pôsobenie zmesi paclitaxelu a cefalomanínu s brómom (J. M. Rimoldi a kol., J. Nat. Prod., 59, 167, 1996). Pôsobenie brómu, uskutočnené pri podmienkach riadenej teploty a reakčného času, spôsobí tvorbu dibrómcefalomanínu, zatiaľ čo toto chemické činidlo nepôsobí na paclitaxel. Avšak tieto metódy majú nevýhodu v tom, že sa pri nich používajú jedovaté činidlá, napríklad akým je oxid osmičelý, a v každom prípade je výsledkom zničenie alebo premena cefalomanínu na jeho deriváty, z ktorých sa cefalomanín dá regenerovať len prostredníctvom zložitých syntéznych procesov. Preto je tu doposiaľ potreba nie drahej, jednoduchej, bezpečnej a účinnej separácie cefalomanínu od paclitaxelu. Preto je základnou úlohou tohto vynálezu poskytnutie jednoduchého spôsobu separácie paclitaxelu a cefalomanínu z ich zmesí alebo tisových extraktov.

Podstata vynálezu

I

Podstatou vynálezu je spôsob separácie paclitaxelu od cefalomanínu a iných príbuzných zlúčenín, ktorý zahrnuje najmä získanie východiskového materiálu, obsahujúceho paclitaxel a cefalomanín; rozpustenie východiskového materiálu v ktoromkoľvek z množstva zvlášť definovaných rozpúšťadiel, aby sa tak vytvorila zmes; podrobenie zmesi stĺpcovej chromatografii, čírp sa získa eluovaná frakcia paclitaxelu, eluovaná frakcia cefalomanínu a zvyšok; a samostatné vysušenie frakcie paclitaxelu a frakcie cefalomanínu, čím sa získajú kryštalické formy paclitaxelu a cefalomanínu.

Rozpúšťadlo je výhodne butylformiát alebo butylacetát alebo benzylacetát.

Prekvapujúco sa zistilo, že vysokočistý paclitaxel a cefalomanín sa môžu získať s vysokým výťažkom chromatografickou separáciou na silikagéiových stĺpcoch s priamymi fázami, s použitím jedného rozpúšťadla ako éluenta. Výhodne má toto rozpúšťadlo nasledovný všeobecný vzorec;

-4R¹

O—R² kde je R¹ vodík alebo metyl a R² výhodne obsahuje päť uhlíkových atómov, to znamená, že ním môže byť n-butyl, izobutyl, sek-butyl alebo ŕerc-butyl. Tieto rozpúšťadlá nie sú často používané v rutinných chromatografických čisteniach na stĺpcoch, ale poskytujú prekvapujúco dobré praktické výsledky v špecifickom prípade separácie zmesi paclitaxel-cefalomanín.

Východiskovým materiálom podľa predkladaného vynálezu môže byť samotná zmes cefalomanínu a paclitaxelu v akomkoľvek pomere alebo extrakt z čerstvých alebo vysušených koreňov, listov, vetiev, semien rastlín rodu Taxus, alebo ich zmesi. Spôsob podľa tohto vynálezu môže taktiež zahrnovať extrakt získaný z bunkovej kultúry. Tieto východiskové materiály sú všeobecne známe odborníkovi v danej oblasti techniky, takže nie je potrebné sa o nich ďalej zmieňovať.

Predmetným extraktom môže byť surový alebo čistený extrakt, na ktorý sa pôsobilo s bežnými rozpúšťadlami a podrobil sa predbežnému chromatografickému čisteniu. Tieto techniky sú opäť odborníkovi v danej oblasti techniky známe, takže ďalšia zmienka o nich nie je potrebná. Východiskový materiál môže byť vo forme tuhej látky, sirupu alebo polotuhej lepkavej látky, v závislosti od experimentálnych podmienok, použitých pri ich príprave. Materiál sa môže jednoducho podrobiť stĺpcovej chromatografii, nasledujúcej po jeho rozpustení v jednom z rozpúšťadiel opísaných vyššie.

Chromatografické čistenie podľa predkladaného vynálezu využíva jednoduchý silikagél s priamymi fázami v množstve približne 50 až 100 hmotnostných dielov vzhľadom na hmotnosť východiskového materiálu, v závislosti od jeho zloženia.

Stĺpcová chromatografia s rozpúšťadlami podľa vynálezu je rýchla, nevyžaduje vysoké tlaky a uskutočňuje sa za normálnych gravitačných podmienok.

Tabuľka 1 ukazuje správanie sa cefalomanínu a paclitaxelu pri tenkovrstvovej chromatografickej analýze, s použitím silikagélových platni a radu rozpúšťadiel

-5podľa predkladaného vynálezu, ktoré umožňujú uspokojivú separáciu týchto dvoch zlúčenín.

Tabuľka 1 _;

Rf hodnoty paclitaxelu a cefalomanínu na silikagélových platniach

Rozpúšťadlo	R¹	R²	Paclitaxel	Cefalomanín
n-butylformiát	H	n-C₄H₉	0,17	0,12
/-butylformiát	H	/-C4H9	0,20	0,15
terc-butylformiát	H	terc-C₄H₉	0,20	0,13
n-butylformiát	ch₃	n-C₄H₉	0,36	0,28
s-butylformiát	ch₃	s-C₄H₉	0,35	0,24
/'-butylacetát	ch₃	Z-C₄Hg	0,31	0,19
ŕerc-butylacetát	ch₃	terc-C₄H₉	0,19	0,09
benzylacetát	ch₃	PhCH₂	0,28	0,16

Použitie rozpúšťadiel, opísaných v predkladanom vynáleze, na izoláciu paclitaxelu a cefalomanínu prostredníctvom chromatografie na silikagélových stĺpcoch s priamymi fázami ponúka množstvo výhod.

Po prvé, stĺpcová chromatografia ponúka paclitaxel prakticky bez cefalomanínu a cefalomanín takmer bez paclitaxelu. Po druhé, použitie silikagélových stĺpcov s priamymi fázami ponúka značné ekonomické výhody oproti silikagélom s obrátenými fázami, opísaných vo vyššie spomenutej literatúre, a po tretie, použitie jedného rozpúšťadla na elúciu stĺpca umožňuje jeho rýchlu recykláciu bez uchýlenia sa k frakčnej destilácii v prevádzkach napojených na priemyselné, kontinuálne procesy prípravy. Akékoľvek ďalšie zložky, prítomné spoločne s paclitaxelom a cefalomanínom vo východiskovom materiáli sa eliminujú chromatografickým čistením.

Eluované frakcie sa vákuovo odparia do sucha a zvyšky sa kryštalizujú pomocou vhodného rozpúšťadla, aby sa tak získal paclitaxel a cefalomanín v požadovanej kryštalickej forme.

-6Spôsob opísaný v predkladanom vynáleze, preto poskytuje jednoduché riešenie, ako pripraviť značné množstvá paclitaxelu, neobsahujúceho cefalomanín, zvýšením výťažku získaných množstiev a propagáciu lacnejšieho spôsobu výroby tohto protinádorového lieku.

Nasledujúce príklady demonštrujú, ale neobmedzujú predkladaný vynález.

Príklady uskutočnenia wnálezu

Príklad 1

Izolácia paclitaxelu z extraktu z Taxus média, obsahujúceho cefalomanín

Pomocou HPLC analýzy sa zistilo, že 290 g extraktu, pripraveného zo 620 kg Taxus média (celá rastlina) podľa postupu opísaného V. Senilthom a kol., (J. Nat. Prod., 47, 131, 1984), obsahuje 183 g paclitaxelu a 81 g cefalomanínu. Extrakt sa rozpustil v 3,5 I terc-butylacetátu a vložil sa do stĺpca, ktorý obsahoval 60 kg silikagélu. Celkovo sa eluovalo 1200 I íerc-butylu. Získala sa 400 litrová frakcia, obsahujúca paclitaxel a menej ako 3 % cefalomanínu a ďalšia frakcia, obsahujúca cefalomanín a menej ako 3 % paclitaxelu sa získala nasledujúcou elúciou 350-tich litrov rozpúšťadla. Tieto dve frakcie sa každá osobitne skoncentrovali do sucha prostredníctvom vákua a zvyšky sa kryštalizovali pomocou zmesi hexán-acetón. Takto získaných 154 g paclitaxelu a 70 g cefalomanínu mali HPLC čistotu nad 99 % a ich fyzikálno-chemické a spektroskopické hodnoty súhlasili s hodnotami uvedenými v literatúre (G. N. Chmúrny a kol., J. Nat. Prod., 55, 414, 1992; C. J. Falzone g kol., Tetrahedron Letters, 33, 1169, 1992; V. Senilth a kol., J. Nat. Prod.,, 47,131,1984).

Príklad 2

Izolácia paclitaxelu a cefalomanínu zo zmesi, ktorá ich oba obsahuje

Zmes, obsahujúca 70 g paclitaxelu a 30 g cefalomanínu sa rozpustila y 1,5 I terc-butylformiátu a vložila sa do stĺpca, ktorý obsahoval 10 kg silikagélu suspendovaný v tom istom rozpúšťadle. Stĺpec sa eluoval s terc-butylformiátom

-7a frakcie sa po HPLC/TLC analýze spojili. Frakcie, obsahujúce paclitaxel a cefalomanín sa každá osobitne skoncentrovali do sucha a zvyšky sa kryštalizovali pomocou zmesi acetónu a heptánu vo vhodných pomeroch, čo poskytlo paclitaxel a cefalomanín s HPLC čistotou nad 99 %.

I

TT 4V9Z- Eoez~

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob separácie paclitaxelu od cefalomanínu, vyznačujúci sa t ý m, že zahrnuje:

- získanie východiskového materiálu, obsahujúceho paclitaxel a cefalomanín;

- rozpustenie východiskového materiálu v rozpúšťadle všeobecného vzorca

O—R kde R¹ znamená vodík alebo metyl a R² znamená alkylovú alebo arylalkylovú skupinu, obsahujúcu štyri až sedem uhlíkových atómov, na vytvorenie zmesi;

- podrobenie zmesi stĺpcovej chromatografii na získanie eluovanej frakcie paclitaxelu, eluovanej frakcie cefalomanínu a zvyšok; a

- samostatné vysušenie frakcie paclitaxelu a frakcie cefalomanínu za získania kryštalických foriem paclitaxelu a cefalomanínu.
2. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že východiskový materiál obsahuje cefalomanín a paclitaxel v akomkoľvek pomere.
3. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že východiskovým materiálom je extrakt z čerstvých alebo vysušených koreňov, listov, vetiev, semien rastlín rodu Taxus, alebo ich zmesi.
4. Spôsob podľa nároku 1,vyznačuj úci sa tým, že východiskový materiál je získaný z bunkových kultúr rastlín rodu Taxus.
5. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že východiskový materiál je vo forme tuhej látky, sirupu alebo polotuhej lepkavej látky.

-96. Spôsob podľa nároku 1, v y z n a č u j ú c i sa t ý m, že vo všeobecnom vzorci rozpúšťadla, R¹ znamená vodík alebo metyl a R² môže byť n-butyl, izobutyl, sek-butyl alebo terc-butyl.
7. Spôsob separácie paclitaxelu od cefalomanínu, vyznačujúci sa t ý m, že zahrnuje:

- získanie východiskového materiálu, obsahujúceho paclitaxel a cefalomanín;

- rozpustenie východiskového materiálu v rozpúšťadle všeobecného vzorca kde R¹ znamená vodík alebo metyl a R² znamená alkylovú alebo árylalkylovú skupinu, obsahujúcu štyri až sedem uhlíkových atómov, čím sa vytvorí zmes;

- podrobenie zmesi stĺpcovej chromatografii, s použitím silikagélového stĺpca s priamymi fázami, s použitím jednoduchého rozpúšťadla všeobecného vzorca určeného vyššie ako eluenta, čím sa získa eluovaná frakcia paclitaxelu, eluovaná frakcia cefalomanínu a zvyšok; a

- samostatné vysušenie frakcie paclitaxelu a frakcie cefalomanínu, čím sa získajú kryštalické formy paclitaxelu a cefalomanínu.
8. Spôsob podľa nároku 7, v y z n a č u j ú c i sa t ý m, že vo všeobecnom vzorci rozpúšťadla, R¹ znamená vodík alebo metyl a R² môže byť n-butyl, izobutyl, sek-butyl alebo terc-butyl.

1 '
9. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že silikagél sa použije v množstve približne 50 až 100 hmotnostných dielov vztiahnuté na hmotnosť východiskového materiálu.
10. Spôsob podľa nároku 7, v y z n a č u j ú c i sa t ý m, že východiskový materiál obsahuje cefalomanín a paclitaxel v akomkoľvek pomere.

- ΙΟΙ 1. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že východiskovým materiálom je extrakt z čerstvých alebo vysušených koreňov, listov, vetiev, semien rastlín rodu Taxus, alebo ich zmesi.
12. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že východiskový materiál je získaný z bunkových kultúr rastlín rodu Taxus.
13. Spôsob podľa nároku 1, v y z n a č u j ú c i sa t ý m, že východiskový materiál je vo forme tuhej látky, sirupu alebo polotuhej lepkavej látky.
14. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že vo všeobecnom vzorci rozpúšťadla, R¹ znamená vodík alebo metyl a R² môže byť n-butyl, izobutyl, sek-butyl alebo terc-butyl.