SI8511660A8 - Postopek pridobivanja mukopolisaharidov ali mps, ki imajo povišan antitrombozni učinek - Google Patents

Description

3889

ΟΗΟΑϊ S.A,

Pariš,

France

POSTUPAK U DOBIVANJE SMEŠA MVKOPOLISAHARIDA KOJE SS ODLIKUJU POVIŠENOM ASTITROMBOZNOM AKTIVKOS^U

Ovaj pronalazak ina za predmet postupak za dobivanje s ©e Ir asukopolisaharida koje se odlikuj u povllenoa antitrouiboznoK aktiv&ollu.

Poznato je da su smele ovog tipa dobivane» polazeli od heparina, alkoholno® ekstrakcijoa ili depoliseriaacijo;, kenijskim ili enzimekia puten,

Preaa opitem nalinu, ovi postupci »©©oguluju dobivanje formiranih smela ili frakcija sukopolisaharida (KPS) liji lanci obuhvataju oko 23 do 30 jedinica aonoatera, ili lak vile od toga, 1 Imaju anti*Xa dejstvo, moreno titros Yin Vessler (YV), vele od dejstva hep&rina i g1obaInu antikoagulacionu aktivnost, tzralenu titrom VSP, aanju od heparina, pri lesu ovaj titfcr može pokaaivati vrlo aalu vrednost, praktilno jednaku nuli.

- 2 Ovi proizvodi eu značajni jer vrle specifičnije dejstvo od heparina na nekim etapama prislonjenim u procesu koaguladje*

Za dati tretman, bira se proiavod u funkciji vrednosti njegovog titra 1W i odnosa njegovih titara YW i USP,

Sa tog aspekta ovi pronalaaačisu istralivali načine koji omogučuju pogodno dobivanje ovih smela koje odgovaraju dat ob profilu It o se u prvo® redu odnosi na njihov titar i njihov odnos titara YW preaa USP. Izvrleni rad ovi dovode do zaključka da ako se radi pod odredjenia usloviaa, aoguMe je izolovati ove proizvode polazeči od drugih saela.

Ovaj pronalazak iaa za cilj da obezbedi nov postupak za dobivanje smela aukopolisaharida (MpS) sa povllenos antitromboznom aktivnolču, koji se bazira na tretiranju drug® smele MPS i čija prisesa omogučuje jednostavan i lak pristup proizvodlaa velike koristi,

Postupak preaa pronalasku naznačen jo time, Ito se smole MPS koje su formirane večino® od lanaca MPS čija je molekulska talina oko 1800 do 8000 daltona.i koje isaju titar IW 1 odnos titara ϊϊ/USP veči od ovih vrednosti heparina, podvrgavaju najnanje jednom stupnju frakeionleanja, aatia selektivnoe odvajaju ove smele kod kojih najnanje veči deo lanaca iaa mole kulaku tejtlnu manju od oko 2000 i one smele sa veČom molekulsko® tellnom, ali koje imaju

- 3 - :>

sadržaj aulfatnih grupa manji od onih lanaca koji odgovaraj u prirodnos heparinu, i It o ee nasad dobivaju oslobodjene frakcije ovih lanaca. Ove frakcije ista ju odnos titara W prema USP sanji od ovog odnosa kod polaznih e mola ali veži od istog odnosa kod heparina sa titross USP vedla od ovog titra kod polaanih smela»

Pogodno se stupanj frakoioniaanja vrli pomolu smele koja sadrži a) vodu koja sadr Si mineralnu so i b) organski rastvara!» pri lesu je ovaj, rastvara! odabran od onih rastvarala u kojima jo najmanje vedi deo ispitIvanih pr Mukata selektivno nerastvoran i u njima se taloži·

Relativni odnosi mineralne soli i raatvarala ee podelava ju i to u funkciji vrednosti pH sredine radi poetima* nja taloženja ispitivanih l&naea MPS.

Prema jednom pogodnom olilenju ovog pronalaska organski rastvara! je pogodnoalkoholni rastvara!, naro!ito etanol»

Prema drugo® pogodno® olilenju upotrebljena mineralna 00 ee sastoji narolito od soli koja se mela sa primenjenim organski® rastvaralea, kao Ito je natriju®- ili kalijum* hlorid*

Prema jednom drugom pogodno® olllenju, vrednost pH reakcione smele se podelava na vrednost koja odgovara pH kiseline, nar o! it o pli ispod /»·

- A Pre&a pogodnom načinu realizacije ovog pronalaska» snele MPS upotrebljene za frakcionisanje obuhvataju večino l&naca (1) sa aolekulakom telinoa od oko 1800 do 8000» (2) isaju odnos titara TW prema U8P najsanje oko 10 i (3 J titar YW od oko 200 do 250 u/ag.

Upotrebljen» satele MPS pogodno su dobiven» preran postupku delinične depoliaerlzacije kaparina pod ciejstvos heaijskog sredstva kao Ito je azotasta kiselina. To se naročito odnosi na postupak opisan od Strahe ovih potpiaalka u drugoa sahtevu dopunske prijave br· 80 062282 od 2X narta 1980. godine koja je dopuna p atentu ?R 78 31357 od 6. novembra 1978, godine.

Preša pogodnoa načinu izvodjenja upotrebljava se postupak depoliserissolje ovog tipa» ali koji se zasniva na auto» regulaciji reakcije depoliseriz&cije, kao Ito je ©pisano u patentnoj prijavi PR 81 072283 od 10. aprila 1981. godine u iae ozih potpisnlka.

Prema opltlje« aspektu ove autoregulacione depiliserizaclje hepar in reaguje aa asotastoa kiselinom u vodenoj sredini» pri pH vrednosti 2 do 3, irvenstveno 2,5, 1 u t&kvla kolilinaaa da koncentracija hep&rina iznosi naj manje oko S tel. 5 a isolarnoet azot as te kiseline iznosi oko 0,02 do 0,10 M.

* £ *

Asotasta kiselina sa proizvodi in situ dodavanje® kiseline koja pogodno sadrži bioločki prihvatljive anjone» kao Ho je hlorovodonična ili slrčetna kieelina» na derivat asotaste kiseline, naročite na so» etar-ao i prvenstveno na alkalnu ili semnoalkalnu so» Naročlto ee koristi natrijua-nitrit prsna solarnosti od 0,03 do 0,05 M.

Za priaenu postupka prana ovo® pronalasku» pogodno se koristi NaNGg konoentraoije 0,040 do 0»046 M» naročito pogodno reda veličine G»043 M,

Π zavisnosti od načina njihovog dobivanja ove saeče HPS iaaju na redukcionom savrčetktt sonornemu Jedlnicu strukture 2,5-anhidroaano» pogodno odabranu od grupa

2,5-anhidroaanoae, 2»5»&nbidroaaaltola ill 2,5-anhldro· Kanonske kiseline«

Upotrebljene polarne smeče HPS se primenjuju u rastvoru u udelu od 5 M teS/sapr« u vodi koja sadrži 10 g/1 NaCl,

Posle podečavanja vrednosti pH na 3»8, frakclonis&nje ovih MPS se vrči pomoču organskog raetvarača koji omogučuje selektivno taloČenje MPS koje imaju veČu Eolekulsku tepzinu ili koje imaju toliki udeo sulfata kao Sto je onaj koji se nalasi kod odgovar&jučih lanaoa u prir odnosi heparinu.

nski rastvarač se sastoji naročito od alkoholnog rastvarača naročito etanola

- 6 Eliminacija lan&ea male molekulake tetin· 1 lanaca ea šali a udelon sulfata Iaa za poslediou da se dobiju frakcije MPS ea poviteni® titroa USP pri temu titar TV se praktižno ne aenja.

Smete MP3 koje su ladvojene j toku talotenja karakteritu se uoptte time tto su u sultini forairane od lanaca (1) srednje aolekuske tetine od 4-000 do 5000 daltona, naredit© oko 4500 daltona, (2) imaju titar IW od oko 180 do 200 u/og i odnos titara XW/US? Ispod 10, narelito oko $ do 3, specijalno reda oko 4»

Ove smete su osim toga forairane vedla delom od lanaca koji 3© zavrtavaju jedinioama strukture 2,5-aahidroaaao kada polazna smete rezultuju iz postupka nitritne depoliaerizacije hepariaa.

Smete dobiveno prema postupku datom ovim pronalaskom eu naznačene biolotkom aktlvnotču koja im oaogutava fcontrolisanje nekih stupnjeva koagulacije krvi.

One su narodito dragocene za proizvodnju lekova koji ee mogu koristiti narotito za spretavanje i letenje tromboz· i staranja tkiva. Ovi lekovi ae koriste u svojim oblicima davanja i prema pozologijama koje su uobilajene za ovaj tip datih indikacija.

Smete dobivenih sukopolisaharida su takodje korisne za proizvodnju blolotklh reaktiva koji se mogu koristiti u laboratoriji, narollto kao refereatna aaterija za poredjenje za Izutavanje drugih proizvoda kod kojih se testira antikoagulaciona aktivnost, narotito na nivou inhlbioije faktora Xa.

- 7 Sto se tiše proizvoda r&etvornlh u smeši v oda-organe ki rastvara$ koja je upotrebljene aa frakcionisanje, oni su lišeni ili praktišno lišeni antitrombozne aktivnosti.

Ovi proizvodi sa mogu izdvojiti filtriranj en preko gela rastvorne frakcije. Priaena jednog etupnja jonoisnanjivaSke hroaatografije onogudava odvajanje od smeše, ako se to Seli» razlišitog tipa ollgosaharida, nar©Sito lanaca heksasaharida okarakterisanih povišano® inhibicionom aktlvnošdu nasuprot neoanglogeneai.

Izdvajanje ovih proizvoda polaaešl od frakcija pogodno se realisuje, na primer, alkoholnim talošenjes ili liofilia&eijom.

Druge karakteristike i prednosti ovog pronalaska de biti oSigledni ia sledeših priaera. Primeri 1 i 2 ae odnose aa dobivanje smeša mukopilisaharida (KPS) koje imaju odnos tltara XW prema Π3Ρ reda 4, primeri 3 i 4 se odnose na dejstvo dobivenih proizvoda u odnosu na primer 112, i primer 5 se odnosi na dobivanjeproisvoda koji su praktično lišeni antitromboanog dejstva a pri toae »e polaai od rastvornih frakcija.

·* 8 *

Postupak aa dobivanje smeta KPS koje l»aju odnos tltara Td/USP ©ko 4.

500 g beparlna koji ae mote ubrizgavati injekcijo©, u obliku natrijumove soli, rastvori se u 4500 al deainerallaovane vode pri temperaturi od 18°C,

Odnos YW/USP upotrebljenog heparisa ianosi blizu 1, ^ov^ njegovi tltri imaju vrednost reda 160-170.

Dobiveni rastvor se snažno meča 1 njegov pH snižava na 2,5 dodavanjem koncentrovane hlorovodonične kiseline. Doda se 15 g natrijum-nltrita rastvorenog u 300 al vode. pH reakcije se podežava aa 2,5 dodavanjem koncentrovane hlorovodonične kiseline, i ukupna zapremina ovog rastvora dovodi se na 5000 al, Ostavi se da reakcija traje 45 minuta a zatim proverava odeuetvo zaostalih nitritnih joaa u reakcionoa rastvoru, na primer, pomoču indikatorskog papira iapregniranog kalijum-jodidom i škrobom (koji razvija plavo-ljubičasta obojenje & prisustvu jena NO^*).

Reakoijase vrad i dalje do potpunog nestanka nitritnih Jona i odsustva pozitivne reakcije na kalijun-jodidskrobnoj kartiji, uz kontrolisanje svakih 3 ili 4 minuta.

Kada se kontrola pokaže negativnoa reakcija se eaatra aavrčenoa. Vrednost pH rastvora sc sati® povisi na 10 pomoču koncentrovanog rastvora natrijum-hidroksida, i dodaje s® 5 g natrijua_tetrahidroborata»

Rastvor se održava us mečanje u toku 15 sati,

Seproreagovan natrijum-tetrahidroborat se razori snižavanje® vrednosti pH na 3,0 pomoču koncentrovane hlorcvodonične kiseline» Rastvor Se meča 15 minuta, sati® pK ponovo podesi do vrednosti 7,0 pomoču koncentrovanog rastvora natrijum-hidroksida.

Reakoioni proizvodi se iadvajaju dodavanje» 10 litara etanola. Posle 43 sati stajanja, proi3vod se odekantuje i eliainiSe gornji te_čni sloj.

Talog se ponovo rastvor^ u 9 litara demineralizovane vode. Poda se 100 g natrijum-hidrida i pH rastvora snizi na 3,8 dodavanje» koncentrovane hlorovodonične kiseline,Zapremina se podesi na tačno 10 litara poaoču diaineralisovene vode, i uz snažno sesanje doda 10 litara etanola, Ostavi se da stoji 48 sati. Sifonira se gornji tečni sloj koji ae odhaci, Talog se izdvoji, ispira etanolom, isitni i suči na vakumu.

Dobiva se 230 g proizvoda koji Ima sledeče karakteristike! titar Π3Ρ = 52 ul/»g titar lin i Kessler « 225 ul/ag srednja molekulska tez ina. » 4000 do $000 daltona.

— ΙΟ —

Priser 2

Postupak aa dobivanj© frakcija KPS koje laaju odnos titara IW i USP oko 4.

5000 g heparina koji a© nože ubrizgavati injekcijo® rastvori ss u 45 litara diahneraliaovane vode pri 18°C.

Radi se analogno kao Ito je opisano u priiaaru 1 s tim žto se koliSine reaktiva povežavaju aa deset puta, tj.

- dodaje se 150 g natrij uxs-nitr ita rastvorenog u 3 litravode,

- podelava se a&preaina reakcione snele na 50 litara,

- dodaje se 50 g tetrahIdroborata,

- taloži se pomolu 100 litara etanola,

- ponovo s© rastvara u 90 litara vode,

- dodaje s® 1000 g natrijun-hlorida,

- podelava se krajnj& zaprenina ns 100 litara,

- dodaje se najzad 100 litara etanola.

Ka taj naline se dobiva 2230 g proizvoda koji iaa sledele karakteristike» titar U3P = 54 ul/ag titar Tin i Nsssler * 232 ul/ag srednja molekulska težina « 4000 do 5000 daltona.

Reikcioni proizvodi se izdvajaju dodavanjem 10 litara etanola, ostave da stoj® 48 sati, dekantuju i eliainile gornji telni sloj.

- u

Talog ae ponovo rastvori u 9 litara vode koja je prethodno deaineralizovana, Doda ae 100 g natrijun-hlorida i poti» snanji pfi vrednost reatvora na 3,8 dodavanjem koneentrovane hlorovodonične kiseline* Zapremina ae podesi tarčno na 10 litara dodavanjem demineralizovane vode* i potom uz analno močanje dodaje 10 litara etanola. Ostavi ao da hoji 48 sati. Sigonlra se gornji tečni sloj koji ae zatim odbaoi, Talog ae izdvoji* ispira etanolom* isitni i s uči na vakumu do suva*

Dobiva ae 230 g proizvoda koji ima sledeče karakteristike! titar USP « 52 ul/ag titar lin i Veaaler » 225 ul/ag srednja molekulska težina » 4000 do 5000 daltona»

U dole datom primeru 3 navedeni su rezultati farnakoločkih ogleda koji au izvrženi sa proizvodom dobiveni® u primeru 1» *

Proučevanje in vitro aktivnosti proizvoda iz primera 1.

da slikama 1-4 d at e su krive doblvene pri proučevanju (in vitro) promena vremena koagulaoljekoja je izazvana u humanoj krvnoj plazmi raatudim dozama komereijalnog h e pari» a 1 proizvoda iz primeta 1.

Π ogledima koji odgovaraju rezultatlma dati» na slikama 3 i 4 koristi se plazma odnosno plazme oslobodjene iz krvnih pločioa* tj. koje su oslabljene za faktor XI,

Ove slike prikazuju varijacije vremena u sekundama kod trombina (slika 1)» cefalin-kaolina (slika 2), koagulacije u prisustvu koncentrovanog treaboplastina (slika 3) i razblaženeg treaboplastina (slika 4)» koje su Indukovane ispitivania proisvodima» satla proizvod is primera 1 (krive a^ a_2> a^ i a^) i heparin (krive bp b₂, b^ 1 b^) u funkciji upotrebijenih doza.

Vremena trombina i vremena cefalin-kaolina 8 in e dva tipa mere koja odražava vade dejstvo isučavanih preparata u odnosu na inhibiciju sa faktor IX i u odnosu na ukupnu koagulaciju. Proučevanje krivih sa slika 112 pokasuje daMPS prema ovom pronalasku is pol J avaj u nato efekat aanji od efekta heparina na inhibioiju aktiviranja protrosbina i na nivo ukupno koagulacije. Slike 314* koj® su reprezentativni predstavnici direktnijeg fenomena vezanog za niz enzisatiČnih reakcija» karakterističnih za spoljaSnju koagulaciju (naročito u relativnom odsustvu faktora Ha), prikazuju povaljan efekat KPS doblvenih prema ovom pronalasku u odnosu na heparin«

Dole naveden primer 4 odnosi se ns rezultate ogleda in vivo kod kunidda sa MPS dobiveni® u primeru 2,

Primer k

Proučevanje antitroabozne aktivnosti proiavoda is primera 2 kod kunida.

DA van j e 500 u XW kod kuaiča prouarokuje znatnu antl*Xa aktivnost dok antikoagul&eiena aktivnost ostaje relativno slaba»

Dva aata posle davanja aktivnost W je reda 0,88 u/ml dok vremena oefalin-kaolina iznosi 0,09 ul/ml.

Ogledi in vitro i in vivo pokazuju da je neto dejstvo aelekfetivnije kod MPS dobiVenih prema ovom pronalasku naročito pri nbvou inhibioije fakt or a Xa, nego Što je to slučaj kod heparina.

g£A«ft£··?

Postupak za dobivanje frakcija MP8 koji su praktično bez antitnroohoan® aktivnosti.

Izdvaja se rastvorna frakcija iz primera 1. Ova frakcija obuhvata lanee sa 2 d|> 14 jedinica aonoaera»

Paza dopuaskog alkoholnog frakcionisanja ove frakcije dovodi do dobivanja taloga, koji se odvoji, i do rastvorne frakcije iz koje se Izdvaja saeča y_A Ova smeša je u suštini formirana od lanaca sa 6 do 8 jedinioa monomera i više od — 14· * toga 1 ima titar ispod oko 70 i titar USP ispod oko 5*

Podvragavanjea sseže y filtriranju na gelu korižgenjea klasičnih tehnika, izdvajaju se scele hekaasaharida. ove saeče eu praktično ličene globalne antikoagulaeione aktivnosti i aktivnosti YW»

Primer 6

Dejstvo saečča y i z na neoangiogenezu.

Ogledi in vitro koji se odnose na antiangiogenszno dejstvo izvrženi suna ©aferionu pileta kultivisano® 6 dana u petrijevoj čolji. Pri torne je ispitivano dejstvo na korloalantičnu aeabranu ovog ®9Ebriona_x

Naprave se pastile aeč&ajea 5 yUg kldrokartisona u 10 /ul aetlleeluloze> zatia dodaja sraeče y ί z, preaa dozama koje se kredu od 5/Ug do 100 yug. Hapr&vljene pastile se suče zatia stavljaju na korloalantičnu nseabranu na koju prianjaju. Za svaki ogled se upotrebljavaju 4 zametka_x

Posle lnkubacije u toku 48 sati» ispltuje se prisustvo avaskularnih zona. Nalazi se znatno saanjenje vaskularnlh zona* Ovi rezultati su dobiveni sa samo 6 /Ug lepit Ivanih proizvoda.

- 15 Primer 7

Dejstvo saeSe hekaaaaharida s na aelanoa tipa δ 16 kod mita»

Izvode se ogled na nilu C57 BL/6 koji Ima melanom B 16.

Tretiranje se iavrdi u toku 15 dana. Svakom sidu ee daje potkodnoa inejkcijom (dva puta na dan) 0«15 ag smela heksasaharida i kortizonacetata prema dosasia koje se kreduza vreme tretmana od 250 do 40-50 mg/kg/dan pri lesu se smanjuju ove doze od podatka do kraja tretiranja. Ha kraju 15 dana konstatovano je zaustavljanje raavoja ovog tuaora.

Zapadena je regresija ovog tumoradto je vrlo pogodno aa ledenje ovakvih oboijenja.

Claims (8)

1. Postupak za dobivanje mukopolisaharida ili MPS koji imaju pvileno antitroabozno dejstvo» naznaSen time» Ho se smeše formirane vedinom od lanaea

MPS Sija je solekulskA težina oko 1800 do 8000 daltona i koje imaju titar IV i odnos titara YW/USP vedi od ovih vrednosti kod heparina, podvrgavaju najmanje jednom stupnju frakoionisanja, zatim selektivnem odvajanju ovih smelakod kojih najmanje vedi deo lanaea ima molekulsku telinu ispod oko 2000 od onih smola koje imaju molekulaku tešinu vedu od ove vrednosti, ali koje imaju udeo sulfatne grupe sanji od onih lanaea koji odgovarajupr ir odnos heparinu, i Ito se nazad dobivaju oslokodjene fmakeije ovih lanaea, pri lesu pomenute frakeije imaju odnos titara YW prema USP panji od ovog odnosa kod polaznih smela ali vedi od istog odnosa kod heparina sa titroa USP vedi® od ovog titra polaznih smela.

2. Postupak prema zahtevu 1, naznalen time, Ito se frakcionisanje vrli pomodu smele vode koja obuhvata aineralnu so i organski rastvara! u koje® je nerastvorna selektivno najmanje vedina Ispitivanih proizvoda,

3. Postupak prema zahtevu 2, naznalen time, Ito se frakoionisanje vrli pomodu organskog rastvarada koji oisogudava selektivno taloženje MPS formiranih od lanaea sa srednjoa molekulsko® težinom od 4000 do 5000 daltona, nar elito reda 4500, i koji imaju odnos titara TV i USP

- 17 .

sanji od oko 10, prvenstveno ta sed j it 6 i 3, a a pool j alno blizu 4, aa titrom TW oko 180 do 200 u/mg.

4· Postupak preaa zahtevu 2 tli 3, naznažen t i n e* Sto je organski raatvaraS ustvari alkohol»! rastvaraS, narodito etanol*

5» Postupak preša sahtevu 2, a a z n a d e n time,

Stoje upotrebijena mineralna so takva da se meSa sa upotrebijenim organskim rastvaračem, kao Sto je» na primer, natriju®* ili kalijua-hlorid.

6. Postupak preaa nekom od zahteva 2 do 5, n a s n a S e n time» Sto se pH reakcione snete podstava na vredn,st koja odgovara kisel©» pB, narotlto na pH ispod 4*

7. Postupak prema nekom od zahteva ldo6,naznaten time» Sto smete KPS koje su upotrebljene za frakoioni* sanje imaju odnos titara YW i VSP najmanje oko 10 i titar YW oko 200 do 250 u/mg.

8. Postupak prema zahtevu l»nazna$en time, Sto se radi u rastvoru u vodi koncentracije 5 % teS./zapr. smeta MPS koji obuhvata 20 g/1 «aCl i koji se posle podeSavanJa pB na 3,8 podvrgava frakeionisanju dodavanjem zapremina etanola i la kojeg se zatim isdvaja formiran talog.

18 9. Postupak preča nakon od zahteva koji su gore dati, naznačen t i a e, Mo polazne saejta KPS iaaju za reduktlvai zavržetak sonosernu jedinleu strukture 1,5-anhidroaano koja je prvenstveno izabrana isaedju grupa 2,5-anihidroaanose, 2,5xanbidroaaaitola ili 2,5-anhidroaanonske kiselina.