SI8011695A8 - Postopek za pridobivanje novih derivatov tripeptidov - Google Patents

Description

POSTUPAK ZA DOBIJANJE NOVIH DERIVATA TRIPEPTIDA

1. Oblast tehnike u koju spada pronalazak

Pronalazak je iz oblasti hemije prirodnih organskih jedinjenja i odredjenije hemije peptida, i prema Medjunarodnoj klasifikaciji patenata nosi sledeče oznake: C 07 C 103/52.

2. Tehnički problem

Tehnički problem koji se rešava ovim predmetom je obezbedjivanje tadvog hemijskog postupka kojim bi se dobili novi tripeptidi, ko^i delu ju na centralni nervni sistem, i koji imaju sle deču opštu formulu (I)

X - Y - W - nh₂ u kojoj predstavljaju

X L-piroglutamil-, D-piroglutamil-, L-2-ketoimidazolidin-4-karbonil-., L-6-keto-pipekolil-, L-tiazolidin-4-karbonil-, L-prolil- iii orotil-grupu,

Y L-Leucil-, L-norvalil- iii L-histidil-grupu,

W L-prolil-, D-prolil, L-tiazolidin-4-karbonil-, L-homoprolil-, L-leueil-, L-izoleucil-, L-metionil-, L-pipekolil- iii D-pipekolil-grupu, dalje -W-NH₂ zajedno označava i pirolidil- iii piperidil-grupu, ali ako X označava L-pirolglutaminil- i Y

- 2 označava L-hietidil-grupu, tod« 'i ima značenje različito od

L-prolil grupe,

Ovi novi derivati tripeptiiu, koji odgovaraju gore definisanoj opštoj formuli I, predstavljaJu analoge L-piroglutnmil-L-histidil-L-prolinamida (Glp-His-Pro-RUg), koji su poznati kao hormoni koji oslobadjaju tirotropin (thyrotropin-releaeing hormone” TRH), i u kojima su neke grupe aminokiselina zamenjene izvesnim drugim grupama «aminokiselina (datim u gomjoj definiciji opšte formule I), odnosno u kojima Je -K-MIg u datom <

slučaju zamenjana pirolidil- iii piperidil- grupom.

3. Stanje tehnike

Postojanke TRH bilo Jo poznato Još šezdesetih godina, ali Je njegova struktura razjasnjena tek 1969. odnosno 1970· Rodine skoro istovremeno od Strane istraživačkih grupa R. Guillemin-a odnosno A. Schally-a (koje su to učinile nez&visno Jedna od druge) (uporeditilBovers, C. Y., etc., Endocrinology 86, 1143 (1970); R. Burgus etc., C. R. Aced. Sci. (Pariš) 269. 1870 (1969) Tripeptid TEH Je prvobitno opisan kao oslot.OdJanJe TSH (tireotropnog hormona) u hipofizi sisara regulišuči faktor, medjutim, istraživanje koje se ’ avi ovim hormonom uprnvljeno Je u Jedan novi pravac, kada Je nadjeno, da biološka funkcija ovog tripeptidn nije ograničena na regulisanje islobadjnnJa tirootropnog hormona, več postoji i njegovo dejstvo na centralni nervni sistem /uporediti* N. P. Plotnikoff i sur., Science 178_t 417 (197P), A. J. Prange i oar·, Loncot 2, 999 (197P)/· Metin J« utvrdjeno

- 3 da TRH, pored gore pomenute hormonske funkcijo, znatno smanjuje vreme trajanja ep&vanja prouzrokovanog barbituratima iii alkoholom, dalje smanjuje i hipotermiju izazvanu različitim lekovima poveažava lokomotomu aktivnost. Jedan dalji značajen faktSfr dejstva TRII na centralni nervni sistem je suzbijanje katalepsi** je prouzrokovane hal operi dolom. Ra osnovu ovog i zgleda da je poželjno za terapeutskupraksu da se proizvedu takvi analozi TRH koji samo slabo deluju na hipofizu, ali.nasuprot tome pokazuju dejstva na centralni nervni sistem koja dostižuili Čak premačuju dejstva TRH. U tom cilju napravljena su jedinjenja ovog tipa opisana u DS-OS 2 W 055, 2 W 057, 2 449 16?, 2 514 581

609 154, i 2 659 395 kao i u BE-PS 819 198. Dosadasnje istraživanje (koje se odnosi na ova jedinjonja)', njegovi rezultati i iskustva sakupljeni su od strane Λ. J. Prnnge-a i eax. /The Role of Hormones in Depression, Life Pcionce 20, 1305 (1977)/ i A. V. Schally-a i sar. /H.ypothalatiic Regulator? Hormones, Ann. Rev. »3iochem. 47, 89 (1978)/, ali, medjutim, nije moglo dovesti do rezultata koji u svakom pogleduzjidovoljav·'»ju zahteve terapeutske prakse.

- 4 ... :

medjutim, nije moglo dovesti do rezultata koji u svakom pogledu zadovoljavaju zahteve terapeutske prakse. .

Sada je nadjeno da se eistematskom zamenom nekih aminokiselina TRS molekula (nagradjenog od tri aminokiseline) može postiči da se sasvim prekine hormonsko dejstvo tri« peptida iii najmanje znatno redukuje, ali da se s druge strane zadrži iii čak znatno poveča dejstvo ispoljeno na centralni- nervni sistem. Kao naročito pogodnim su se pokazali oni derivati u kojima umesto histidinske grupe u položaju 2 stoji alifatična grupa aminokiselina, koja sadrži neračvast iii račvast niz ugljenika. U interesu još selektivnijeg biološkog dejstva isto tako se pokazalo pogodnim da se u ovaj molekul ugradi grupa 6-keto-pipekolinske kiseline umesto piroglutamilnog prstenastog sistema.

Derivati tripeptida, koji odgovaraju gore definosanoj opštoj formuli 1, prema ovom pronalasku dobivaju se iz odgovarajučih aminokiselina odnosno derivata aminokiselina, prema po sebi poznatim metodama hemije peptida, tako, što se

a. polazeči od jedinjenja opšte formule II

W - nh₂ u kojoj W ima gore dato značenje, (II) i

It»

4a i

Jedo n članek u J. Med. Cunm./ljh 484 (1971)/ bsvi ne istrv-ivunjem dejstva homonsko str:kfcurno VRH-annlo;;·?, tez dejstvo na centralni nervni sistoio. Jcdno slična tema jo ubradjon·» od G. Π. Pettit·' u 5ynthetic Poptides” Vol. 4, str. 17·;171. - vedski patentni spis br. 564 518 dotiio se pit.nj·. (po• » * desno za obredu Hgpothyroidis«ius- ) pirolutamil-hiiuidinpirolidida, čije dejstvo u oblasti endokrinologije atped?.. Može se takodje konstatovati da ovi lit era turni navodi tretiraju jednu sasviin različitu oblast •TRii-istr« živin je, ko jr je suprotno oblasti . ove podnete prijave.

U publikaciji nota Phana. Snec., 16, 95 (1979/ nalazi se dokument koji tečno govori o dostopnosti resuV-ιί ,rijnve. Ovoj *lunak, naime, ističe, osn -,vu jedo 1; r r--lelnog intra*.ivanja. hormonalno^ i DUS-dejstv·· , JR7 i HIP «nalog-.·, d«·: kod JRH-analoga su zahtevi hotijsfcih. struktura isti 23 dostizanjo JRS i hormonalno:^ dejstva,' odnosno j Mino ili drugo dejstvo so ne razdvaja ju pri opadanju drugog. Pri odred ji vonju odnaša strni-ture-cilja može se upravo to postiči, tj. povečanje CMS iojstvA pri opadanju hormona!nog dejetv··* (videti Tabeln I).

Tabela. I

Prirodni TRII

Hormon.-lno dejstvo CrD-dejstvo 1 1

/.vedsko patentna prijav 42S ',59

Kpc-iIis-Tca-KH₂

KPc -tii s-Pro-NHp

»)-Kpc-His-Pro-KHp

I» i c -Hi s-Pro-KHo

C.

Ki c -i! i s -Pro-OCH , __2_

Predloženo ostv.arehje Kpc -^T' v a -Pro-PIio r.po -Leu-Pr< i-RH_o

f.

Glv-Leu-Tco-PHp Kpc-I '^r ~ -HPro-ulU f .

, Glp-Lou-Fip-KIL,

1	R
1	4
t-,2	5
M	1
C,001	0

G 8

0,027	3,5
0	1,6
0	1,3
o,v?z	14

U poredjonju javg bp. 425 6.59, crs· jOdinjčA-·. poddejntvA;

on «trufc;-,”i!ie-citj*fw .ρχ/χη/Λ-Γ- pridejstvo predložene pr/JAtf.e, u. n Λ prje selektivni j e.

s'i

-4b~

4. Opis rešenja tehničkog problema

Sada je nadjeno da se sistematskom zamenom nekih aminokiselina TRH molekula (nagradjenofj od tri aminokiseline) može postiči da se sasvim prekine hormonsko dejstvo tripeptida iii najmanje znatno redukuje, ali da se s druge strane zadrži iii čak znatno poveča dejstvo ispoljeno na centralni nervni sinjem. Kao naročito pogodnim su se pokazali oni derivati u kojima umesto histidinske grupe u položaju 2 stoji alifatična grupa aminokiselina, koja sadrži neračvast iii račvast niz ugljenika. U interesu još selektivni jeg biološkog dejstva isto tako se pokazalo pogodnim da se u ovaj molekul ugradi grup» 6-keto-pipekolinske kiseline umesto piroglutamilnog prstenastog sistema.

Derivati tripeptida, koji odgovaraju gore definisanoj opštoj formuli (I), prema ovom pronalasku dobijaju se iz odgovarajučih aminikiselina odnosno derivata aminokiselina, prema po sebi poznatim metodama hemije peptida, tako, što se a. polazeči od jedinjenje opšte formule til) w-nh₂ (II) u kojoj W ima gore dato značenje^ gredi molekul .opšte formule I, u etupnjevima, priaenom metoda kuplovanja, koje su uobičajene u hemiji peptida, pogodno uz primenu aktivnih estara, mešovitih anhidrida iii dicikloheksilkarbodiimida, iii

b. što se jedinjenja opšte formule II,

W - nh₂ (II) u kojoj V ime gore deto značenje, <

aciluju ee azidima, koji su dobiveni iz dipeptidhidrazida opšte formule III

Z - X - T - nh-nh₂ (III) u kojoj Z oznečava benziloksikarbonil-£rupu i X i

Y imaju gore data značenja, i što se zatim iz jedinjenja opšte formule IV z-x-t-w - nh₂ (IV) u kojoj Z, X, Y i W imaju gore deta značenja, (koja au dobivena prema jednoj od gore datih metoda), odcepijuje zaštitna grupa Z prvenstveno ketalitičkom hidrogenizacijom i što se dobiveni proizvod opšte formule I izoluje iz reakcione smeše i/ili u datom slučaju prevodi u terapeutski primenljiv kompleks.

- 6 Pri primeni metode stupnjevite gradnje molekula svrsiahodno ae polazno jedinjenje opšte formule k-HHg, koje j-e upotrebljeno u višku, reaguje s$ aktiviranim derivatom, naročito sa pentafluorfenil-estrom zaštičene amino-kiseline opšte formule BOC-T-OH, u kojoj BOC označava zaštitnu tercbutiloksikarbonil-grupu, pri čemu se odgovarajuči derivati dipeptida BOC-T-V-NHg dobivaju u toku izrazito kratkog reakcionog vremena (u toku nekoliko minute), u obliku koji selako može obrsditi i koji večinom ne zahteva dalje prečiščavanje. Ovi isti derivati dipeptida opšte formule BOC-T-Vf-NHg, medjutim, mogu ee nagraditi takodje uz primenu drugih metoda kuplovanja, napr. aa mešovitim anbidridima iii aa alobodnim kiselinama u prisustvu dicikloheksilkarbodiimida.

Dipeptidi opšte formule H-Y-W-NH₂, koji se acidolizom oslobadjeju iz dobivenog zaštičenog derivata dipeptide B0C-Y-W-NH₂, zatim se pogodno reaguju ponovo sa pentafluorfenil-estrom neke zašticene aminokiseline opšte formule Ζ-Χ-ΟΗ, pri čemu se dobivaju na gore opisen pogodan način odgovarajuči derivati tripeptida opšte formule Z-X-Y-W-NH₂·

Acilovenje polaznog jedinjenja W-NH₂ s® azidom, koji se može dobiti iz hidrszida opšte formule Z-X-Y-NH-NH₂, ima prednost da pomenuti hidrazidi preddstavljeju medjuproizvode koji se mogu vrlo dobro kristalisati i prema tomeldolovati u vrlo čistom obliku.

-7 _

Jedinjenja opžte formule I, koja na mestu X sadrže piroglutamll-grupu, mogu ee izgraditi tako što se piroglutamilni prsten obrazuje samo u poslednjem stupnju sinteze iz jedne glutaminske grupe, i to teko, što se glutamin keo trača eminokiseline uvodi u molekul i na taj način dobiven tripeptid opŠte formule Gln-T-W-NH2 segreva nekoliko minuta u sircetnoj kiselini.

v’

Iz zaštičenlh derivata tripeptida opšte formula

Z-Z-T-V-NHg, koji su* dobiveni prema nekoj od gore opisanih metoda, mogu se osloboditi žaljeni krajnji proizvodi opšte formule I, pogodno primenom katalitičke hidrogenizadje. Prečiščevanje dobivenih krejnjih proizvoda može se Izvršiti proštom kristalizacijo!» iii taloienjem, po potrebi ček i hromatografijom na koloni· Ό datom slučaju krajnji proizvod može se preparirati jednostsvnom liofilizacijom nakon udaljavanja sporednih proizvoda«

Derivati tripeptida opšte formule I, koji su dobiveni prema postupku datom ovim pronalaskom, ispitani su na njihovo farmakološko dejstvo pomoču dole opisenih bioloških metoda.

- 9 1. Suzbijanje haloperidolme ketalppaije kod pacova

- i, (Uporediti: J. Delaj i P. Deniker: Coapt. Sand. Cong. Med. Alenietes Naurologistes, 1$, 497, Luzemburg 1952) mg/kg Haloparidole, tj. 4-(p-hlorfenil)-l-[5-(pfluorbenzoil)-propili-piperidin-4-ole, dato ja životine jama s.c. i posle 120 minuta kontroliaano je naetupanje katrflepsije; žetim eu pacovi podeljeni u grupe od po 10 životinje i tretirani intravenozno ds tim dozama TRH odnosno novih TRH-analoga tripeptida. Životinje kontrolnih grupa su tretirana ee fiziološkim rastvorom kuhinjske soli. U int erva lima od 15, 5θ» i 120 minuta posle tretiranja ispitano je dejstvo pojedinačnih jedinjenja koje prekida katalepeiju.

One životinje su smatrane kao kataleptičke, koja, kada su pestavljene prednjim šapama na stub višine 7 cm ne menjaju svoj položaj u toku 50 sekundi.

Iz broja životinje, koje ne pokazuju katalepsiju, probitnom analizom su odredjene odgovarajuce vrednosti ED^q za pojedine aktivne materije.

Ovi ogledi izvršeni su sa pacovima mužjacima soja V/istar pojedinačne težine 160 do 180 g.

- 9 2. Potenciranje lokomotornog aktiviteta kod miševa izezvanog sa L-dopa (Uporediti: The Thyroid Axis, Druga and Behavior, str. 116, A. J« Prage Jr., Raven Press, New lork, 197*}'

Život in jama je prvo intraperi tonalno dato po 40 mg/kg N-metil-N-propargil-benzilamina (Pargilina), zatim po 20 mg/kg TRH, odnoso latih doza novih tripeptida, koji se trabaju ispitati, i najzad 100 mg/kg L-dopa· Posla 50, 60, i 90 minuta nakon* gornjeg tratmana merena je lokomotorna aktivnost ovih životinja/ dobivene vrednosti su date u sledečoj tabeli u procentima u odnosu na vrednosti dobivene kod životinje tretiranih aa TRH. Za ove oglede upotrebljeno je po 15 miševa raužjake pojedinačne težine od 18 do 22 g.

5· Dejstvo koje obrce rezerpinsku hipotermiju kod miševa (Uporediti: B. M. Askew: Life Sci. 2, 725-750 (1965))

Miševima mužjacima, pojedinačne težine 18 do 22 g, koji su podeljeni u grupe od po 10 životinje, dato je

i.p. po 5 mg/kg rezeppina.; posle 16 časova ove životinje su tretirane 88 dozama od po 20 mg/kg TRH odnosno tripeptida koji se ispituje.

Rektalne temperatura životinja aerana je pre tretiranje aa rezerpinoa (u sledečoj tabeli označena kao norm.), 16 časova nakon tretiranje rezerpinom (u tabeli označena kao res·) i 1 odnosno 2 Čase nakon davanje ispitivanog tripeptida (u tabeli označeno kao posletret!}· U tabeli su date prosečne vrednosti rektalnih temperatura koje su izmerene kod miševa.

* *

4. Delovanje na trajanje epavanja izazvanog heksobarbitalom

Hiševima mužjacima, podeljenim u grupe od po 10 životinje, intravenozno je deto po 60 mg/kg Na-heksobarbitala p

(Evipan Bajer); posle 10 minutβ životinje su intraperitonalno tretirane sa dozama od po 20 mg/kg TRH odnosno «

ispitivanog jedinjenja. Vjpeme trajanja spevanje dato je u sledečoj tabeli u pročantima u odnosu na vrednosti izmerene kod životinja koantrolne grupe. Pri torne su uzete srednje vrednosti dobivene kod 10 životinja.

- 11 5. Narkoza etanolom (Uporediti: J. M. Cott et al., J. Bharmacol. Ezp. Ther.

196. 59* (1976))

Miševima CPLP (LATI), meŠovitog pola, pojedins&ne težine od 18 do 22 g i.p. je dato po 4,5 g etanola t nakon 10 minuta ove životinja eu zatim tr«tirane intraperitonalno ea dozama od po 20 mg/kg ispitivanog tripeptida. Vremena trajanja spevenja deta eu u sledečoj tabeli u procentima u odnosu ne vrednosti izmerene 'kod životinje kontrolne grupe. Pri torne je uzeta srednja vrednost merenja izvršenih kod 10 životinja.

6. Hormonska aktivnost (dejstvo TSH{ kod peco^a

Wister pacovi, mužjaci, pojedinačne težine od po oko 200 g podeljeni su u grupe od po 7 do 8 životinja i tretireni intravenozno se dozama od po 20 mg/kg TRH odnosno ispitivanog tripeptida. TSH reakcija ovih životinja odredjena je 15 minuta nakon tretiranje sa TRH odnosno TRH analozima iz plszme životinje primenom radioimuneg ispitivanje. Relativne veličine dejstva izračunate su prema metodi četiri tačke, pomoču kompjutera tipa TPA 101, pri čemu se višina (veličine) dejstva TRH uziroa kao 100.

- 12 U sledečoj tabeli su sakupljene vrednosti bioloških dajstava vežnijih jedinjenja opšte formule I, koja su odredjene preme gora opisanim farmakološkim metodama.

cr
fc»	*.
Ef		f-	cu
ca	ca	•fc	•fc
f-s	Ef	m O t>	p-

%

O o

ft

Tabela o

β r4

O i

P

Φ i

h <6 O La β rf

1-» φ S pp p > tj p o © rf o β > P A O -H > TO X 44 »N cn ko p~ co m

ft in

V vo in tn rf •rs

P -p r~ m

σι m

co <n tn io 'X) vo pcn en ko in in

OH Φ S TO rf S > TJ P O 44 p v «j o c > TO -H P ft o Ή XJ P > ra jg, 44 >n

		rf
		β
	o	rf
	o	e
		P
φ	•fc	φ
44	rf	tl
TO	p	P
β	rf
•H	P	Φ
3,	rf	r-1
P	tl	TO
Φ	Φ	O
TO	A	ft
Φ	• ε
β	φ φ
	ΠΡ	•
Φ	•H	TO
Ό	e d	Φ
	R β	β
rf	Φ ft

CM

P -P rf TO O P ί-t ΛΧ 44 -H TO O XJ k

A o

P *

O -H ® fiP t-3 o TO β 44 O d o P r—t

H

O rf P β Λ44 TO O rf P TJ o i to Aft β ο

σ>

to « to © a« ο

νο

TO β

rH φ Φ Ο ‘^> r-j'd -η

Η Φ β Α (STOTO Η ftr-l Ο Ο rf N r-j Ρ rf rf rf TO X! 44 (M

I

N

I

H

I

H

Φ

P

Φ

P >

σι	in	CM	O	P-	O	CM	kO	co	CM
•fc	•fc	•k	·»· ·	«k	«fc	«k	•fc	•fc	•fc
tn	CM	CM	r-1	o	σι	CJ	in	oo	o
tn	tn	m	tn	tn	CM	tn	CM	CM	tn
O		r-4	p-			in	00	r~’	in
«k	·»	«k	•fc	«fc	•fc	•fc	•k	•fc	•k
CM	tn	tn	o	r-1	o	kO	in	c-	in
tn	tn	K\	ΚΛ	tn	tn	CM	CM	CM	tn
in	cn	cn	10	00	kO	P-		ft	σι
fc	«k	«fc	«fc	«fc	«k	«fc	«fc	•fc	«fc
	tn	xtf·		CM	tn	o	P-		in
CM	CM	CM	CM	tn	CM	CM	CM	CM	CJ
tn	m	CM	4-	in		tn	in	in	CM
«h	•k	«fc	«fc	«h	«b	•fc	•fc	•k	•fc
kO	kO	kO	10	kO	10	10	kO	in	kO
tn	tn	tn	tn	tn	tn	tn	tn	tn	tn
p-	in	CM	CM	σι	o	00	in	00	O
CM	10	in	r-4	C—	r-	o	ft	cn	O
r-4			<—4			rH	r-4		r—1
2	in	CM	cn	t-	00	o	ao	o	o
co	«ς$-	M-	oo	M-	tn	tn	m	P-	o
		r-1		r-4					i—1
cn	kO	ft	r—4	in	tn	m	M	00	o
H	tn	C*-	o	cn	O	kO	in	f—4	o
tn		r-4	CM	ft	»—1			rH	r-4
O	O	o	O	O	o	in	m	o	in
kO	tn	CM	CM	tn	tn	r—4	r-1	tn	t—4

β «H ko r~ tn h * * ft CM +1 +1 m- <n »k «k

10 m mο in ft

W δβ δβ

C3

OJ >4

in	’0				tn	tn
«fc	«fc	•k	«fc		•fc	•fc
tn	o	r-4	00	<O	o	in	o	o	Q
CJ	rd	tn	tn	m	10	tn	P-	cn
o	o	rf	ft	rf	rf	u P	o	o
β	P	v	ft	o	O	ft	P	P
ft	ft	El	t-M	El	El	n:	i-M	ft
rf	rf	rf	rf	rf	rf	rf	rf Φ	eu	ϊΐ
Φ		Φ	Φ	>	>	>	ft	ft	Ef
ft	«	ft	ft	l -· /ft	.S	tt
							ft
0	o	ft	ft	ft	O	o		o
ft	ft	r-1	ft	r-4	ft	ft	1	ft
w	M	o	O	o	M		P	h4

W	w
ta	σι
+1	+1
P4	e-i
'χ.
•
rf
•o β
rf >
rf
ft	··
TO	rf
	n
Φ	β
ε	rf
a>	>
P	rf
>	ft
	n
o
β	TO p*
	fc TO
P	P
ft	ί»
ja
P	O
rf	β
,a	rl
o	O
TO	β
44	rf
TO	4J
,β	TO

Iz vrednosti datih u gornjoj tabeli može se zaključiti da ovi novi analozi TRH, kod kojih eu dve iii tri aminokiseline molekula TRH zamenjane ea drugim aminokiselinama, pokazuju značajna dejstva na centralni nervni sistem.

Ss tog aspekta su naročito pogodni oni derivati, u kojima ae ηβ mestu grupe His u položaju 2 molekule TRH nalazi alifatična aminokiselina sa neračvastim iii račvmstim ugljeničnim lancem. Isto tako, sa tog aspekta, ovog u

dejstva, pogodni su oni analozi TRH, u kojima je grupa Glp zamenjena sa 6-keto-pipekolinskom kiselinom. Kod ovih derivata je hormonsko dejstvo TRH iii potpuno prekinuto iii redukovano na minimum, pri čemu je istovremeno vrlo značajno dejstvo ispoljeno na centralni nervni sistem, u nekim slučajevima povišeno čak i na osmostruku vrednost.

Novi tripeptidi, koji se mogu dobiti prema ovom pronalasku, kao i njihovi farmaceutski primenljivi soli odnosno kompleksi, u terapiji se mogu prikeniti u obliku uobičsjenih preparate 1ekova. Ovi preparati lekove sadrže pronalaskom date aktivne materije zajedno sa neorganskim iii organskim nosačima, koji su pogodni za enteralno iii parenteralno davanje. Lekoviti preparati mogu se dobiti napr. u obliku tablete, dražea, injekcionih preparata, liofilizata itd. Dobivanje ovih lekovitih oblika može se izvršiti premo uobičajenim farmaceutskim metodama.

- 15 Praktično izvodjenja postupke datog ovim pronaleskom, odnosno kemijsko dobivanj a pronalaekom detih novih analoga TRH biče bliža objaSnjeno pomoču sledečih primere. Skračenice koja ee upotrebljavaju u ovim primerima odgovaraju skračenicema koje su uobičajane i konvencionalne u hemiji peptida (uporediti J. Biol« Chem. 24-7« 977 (1972). U sledečim primerima dalja sa primenjuju eledčče skračenice:

HPro

Kic

Kpc

Oro

Pip

Tea

DCC

DOT

PPPOH

DMPA

L-homoprolin *

L-2-kat oimida zolidin-4-kerbonska kiseline

L-6-ketopipekolinska kiselina orotinska kisalina L-pipekolinska kiseline L-tiazolidin-4-karbonska kisalina dicikloheksilkarbodiimid dicikloheksiluraa p enta fluorf enol dimetilformamid.

Tačke topljenja ovih jedinjenja, koje eu dete u pnimerima, odredjene su pomoču aparata za merenje tačke topljenja prema Dr. Tottoli-ju (Btichi). Optičke veličine (vrednost obrtanje polarizovane svetlosti) izmerene su pomoču polarimetra tipa Perkin-Slmer 141. U ispitivanjima pomoču hromatografije na tankom sloju odnosno pri razdvsjanjime

- 16 ris tankom sloju.primenjena eu ploča silikagele “Kieselgel G naoh Stahl (E. Merck, Darmstadt). Za razvijanja hrometograma upotrebljeni su Bledeče smeše rastvarača:

1. hloroform - metanol 9:1

2. etilacetat : (piridin: sirčetna kiselina:voda 20:6:11) 95:5

5· etilacetat : (piridintairčetna kiselina: voda 20:6:11) 9:1

4. etilacetat : (piridin:sirčetna kiselina: voda 20:6:11) 8:2

5· etilacetat : (piridin:sirčetna kiselina: voda 20:6:11) 5:2

6. etilacetat : (piridin:sirčetna kiselinasvoda 20:6:11) 2:3

Za razvijanje mrl je primenjen je raatvor ninhidrina; nakon špricanja ploča su sušena oko 5 minute pri 105°C· Zatim eu ovi hromatogrami stavljeni u atmosferu gasovitog hlora i nakon provetravanje razvijeni se rastvorom o-tolidin-kalijumjodide.

Za prečiščavanje ovih proizvoda pomoču hromatografija na koloni primenjen ja Kieselgel G (E. Merck) (silikegel) firma E. Merck, veličine deliča od 0,062 do 0,2 mm.

Za uparavanja rastvora u vakumu primenjen je Rotevepor

R iBttchi) vakum uparivaČ; uparevenje je izvodjeno pri temperaturama koja niau prešle 50°C.

Pentafluorfenil-estri aminokiselina, koje su zaštičene BOC-grupom, dobiveni su preme metodi L. Kisfaludy-8 i aar., Ann. 1975« 1421.

- 17 Primer 1:

Amid L-piroglutamil-L-leucil-L-pipekolinske kiseline

Stupanj ill:

Hidrohlorid 1-leucil-L-pipekolinske kiseline

1,54 g (12 mmol) H-Bip-NH₂ suspendira se u 20 ml 1MFA i ova suspenzija uz mešanje tretira sa 5,16 g (13 mmol) BOC-Leu-OPPP i 1,68 ml (12 mmol) trietilamina. Smeša se meša <d?ije još 6 časova, zatim se upari dobiveni rastvor i ulje, koje je dobiveno kao ostatak, rastvori u hloroformu (60 ml). Ovaj rastvor se pomeša sa 0,2 ml 2-(dimetilamino)-etilamina, ostavi da stoji 5 minuta i zatim isplra tri puta sa po 20 ml 1 N rastvora sone kiseline, tri puta sa po 20 ml 1 N rastvora natri jurabikarbonata i jedanput sa 20 ml vode. Potom se osUši anhidrovanim natrijum-sulfatom i upari. Uljast ostatak se rastvori u 3 ml etilacetata i ovaj rastvor tretira sa 10 ml 5 N rastvora sone kiseline u etilacetatu. Poele stajanja u toku 1 čas reakciona smeša se razblaži etrom, odfiltrira stvoreni taiog i ovaj osuši u vakumu iznad anhidrovanog natrijum-hidroksida.

Na ovaj način se dobiva 3,12 g H-Leu-Pip-NH^.HCl (94 % od teorijskog prinosa računatog na polazni H-Pip-NH₂); R^) = 0,46.

- 18 S tu pan,, ?

Amid benziloksikarbonil-L-piroglutamil-L-leucil-l-pipekolinske kiseline

5,13 g (11,2 mmol) H-feu-Pip-NHg.HCl i 4,94 g (11,5 mmol) Z-Glp-OPFP rastvori se u 35 ml EMFA i ovaj rastvor tretira sa 1.57 ml (11,2 mmol) trietilamina. Poale mešanja u toku 5 minuta doda se daljih 1,57 ml (11,2 mmol) trietilamina i posle daljeg mešanja u toku 20 minuta reakciona smeša se upari u vakumu. Ostatak se rastvori u hloroformu (90 ml) hidobiveni rastvor ispere dva puta sa po 30 ml 1 N rastvora sone Kiseline, tri puta sa po 30 ml 1 N rastvora natrijumhidroksida i jedanput sa 30 ml vode. Organska faza se zatim osuši anhidrovanim natri j ura-sulf atom i upari. Amorfni ostatak se promeša sa hladnim etrom, etar odekantuje i zaostalo ulje pod n-heksanom dovodi do očvršcavan ja. Na ovaj način dobiven amorfan sirov proizvod (4,7 g) kristališe iz etilacetata/etra. Dobiva se 3,32 g (61 % od teorijskog prinosa) Z-Glp-Leu-Pip-NI^;

Analiza za ΟοςΗ,.Οχ-Ν. (mol. tež.#86,57)

34 6 4 izračunato: C 61,71 %, H 7,04 %, N 11,51 nadjeno: C 61,67 %, H 7,05 %, N 11,40 %.

Stupanj 3:

I '· »,

Amid L-piroglutamll-L-leucil-L-pipekolinske kiseline

2,1 g (4,32 mmol) Z-Glp-Leu-Pip-NH₂ rastvori se u 40 ml metanola, doda 0,2 g 10 %-nog paladijuma ana aktivnom uglju (kao katallzatora) i u ovu smešu uvodi gasoviti vodonik u toku 1 čas. Zatim se odfiltrira katalizator, filtrat upari i ostatak tri j a sa dtrom. Na ovaj način dobiven sirov proizvod (1,48 g) rastvori se u 20 ml vode, obezboji aktivnim ugljem i izvrši filtriranje. U bistrom filtratu se rastvori 4 g natrijum-hlorida i rastvor ispere tri puta sa po 10 ml hloroforma. Organska faza se osuši anhidrovanim natri jurasulfatom, upari i amorfan ostatak tri ja sa smešora etilacetata i etra. Na ovaj način se dobiva 1,33 g (87,5 % od teorijskog prinosa) GlP-I»eu-Pip-llH₂; R^^ * 0,60; /^⁵- -86,4° (c 1, u sirčetnoj kiselini).

- 20 Primer 2i

Amid L-plroglutarail-L-leucil-I-vi ldin-4-karbonske kiseline

Stupanj 1:

Hidrohlorid amida

L-Leucil-L-tiazolidin-4-karbonske kiseline *·

1,81 g (11 mmol) H-Tca-NHg.HCl (uporediti S. Ratner i H. T. Clarke, J. Am. Chem. Soc. 2%, 200 (1937)) suspendira se u 30 ml DMFA i pomeša sa 3,97 g (10 mmol) BOC-Ieu-OPFP, 1,49 g (11 mmol) 1-hidroksi-benztriazola i 1,22 ral (11 mmol) N-raetilmorfolina. Dobiveni raetvor se ostavi da stoji preko noči na sobnoj temperaturi,, zatim upari u vakumu i ostatak rastvori u 80 ml hloroforma. Rastvor se ispira tri puta sa po 20 ral rastvora 1 N sone kiseline, tri puta sa po 20 ral j. N rastvora natri jum-bikarbonata i najzad jedanput sa 10 ml vode. Potom se osuši anhidrovanira natrijura-sulfatom i upari u vakumu. Peneči, araorfan ostatak se rastvori u 5 ml etilaoetata, pomeša sa 10 ml 7 N rastvora sone kiseline i ostavi da stoji 1 čas. Zatim ee reakciona smeša razblaži etrom, dobiveni talog odfiltrira i osuši u vakumi iznad anhidrovanog natrijumhidroksida. Na ovaj način se dobiva 1,84 g H-Leu-Tca-N^.HCl (65 Ji od teorijskog prinosa obracunatog na BOC-Leu-OPFP)? ^pf⁵) = 0,25; t.t. 170-174°C. (raspad.).

— 21 —

Stupanj 2:

• · *.

Amid benziloksikarbonil-L-piroglutamil-L-leucil-Ltiazolidin-4-karboneke kiseline

1,69 g (6 ramol) H-Leu-Tca-NH^.HCl suspeendira ae u 20 ml EMPA i pomeša sa 2,7 g (6,3 mmol) Z-Glp-OPFP i 0,84 ml (6 mmol) trietilamina. Smeša ee meša 20 minuta pri sobnoj temperaturi, zatim upari u vakum^. Ostatak posle uparavanja rastvori se u 50 ml hloroforma i ovaj rastvor ispere dva puta ea po 10 ml 1 N rastvora sone kiseline, tri puta sa po 10 ml 1 N rastvora natri jum-bikarbonata i najzad jedanput sa 10 ml vode. Organska faza se zatim upari, ostatak protrlja sa etrom i dobiveni sirov proizvod prečisti višestrukim taloženjem iz ameše etilacetata/etra. Dobiva se 1,64 g (56 % od teorijskog prinosa) Z-Glp-leu-Tca-HH₂·, t.t. 108-110% « 0,46·, M/p⁵ = -130,30° (c » 1, u sirčetnoj kiselini). »

Stupanj 3:

Amid L-piroglutamil-I-rleucil-L-tiazolidin-4-karbonske kiseline

1,62 g (3,3 mmol) Z-Glp-Leu-Tca-NH₂ rastvori se u 6 ml ledom ohladjenog 3,5 N rastvora bromvodonifca u ledenoj sirčetnoj kiselini i dobiveni rastv or ostavi da stoji 1,5 čas pri 0-5°C. Zatim se reakciona smeša razblaži etrom, gornja faza dekantuje im zaostalo ulje rastvori u 20 ml vode. Vodeni rastvor se neutrališe čvrstim natrijum-bikarbonatom i ispere

- 22— tri puta sa po 10 ral etra. Vodena faza se upari u vakumu, ostatak rastvori u 20 ral hloroforma, rastvor osuši anhidro• t.

vanim natrijum-sulfatom i upari. Amorfni ostatak se tri ja etrom i osuši. Dobiveni sirov proizvod (1,13 g) rastvori se u smeši rastvarača (4) i nanese na kolonu koja sadrži 20 g silikagela. Kolona se eluira istom smešom rastvarača. Iz frakcija, koje sadrže čist proizvod, izoluje se 0,78 g amorfnog proizvoda. Ovaj proizvod se rastvori u 20. ml vode, rastvor obezboji aktivnim ugljera i dobiveni bezbojan vodeni rastvor liofilizira. Na ovaj način se dobiva 0,62 g

<

» -145,0° (c » 1, u eirčetnoj kiselini).

Prime r 3

L -Pi roglutamil -L-leucil -D-proi inamid

Stupanj 1:

Benzil oksikarbonil-L-piroglutamil-L-leucil-D-prolinamid

1,54 g (5,8 mraol) H-Leu-D-Pro-HH₂.HC1 rastvori se u 20 ml DMFA i rastvor pomeša sa 0,81 ml (5,8 romol) trietilamina i 2,58 g (6 mmol) Z-Glp-OPFP. Smeša se meša 5 minuta, zatim doda daljih 0,81 φΐ (5,8 mmol) trietilamina i posle mešanja u toku još 10 minuta reakciona smeša se upari u vakumu. Ostatak posle uparavanja se rastvori u 60 ml hloroforma, rastvor isplra tri puta sa po 15 ml 1 N rastvora

- 23 sope kiseline, isto tako tri puta sa po 15 ml 1 N rastvora natri jum-hidroksida 1 najzad jedanput sa 15 ml vode. Potom ' t.

ae osuši anhidrovanim natrijum-sulfatom i upari. Amorfni ostatak ae trlja etrom. Dobiveni sirov proizvod (2,1 g) prekrlstališe se iz 5 ml etilacetata; na ovaj način se dobiva 1,8 g (66 % od teorijskog prinosa) Z-Glp-Leu-DPro-NHg» t.t. 153-157°C, « 0,38-, M/p⁵ - -24,5° (c » 1, u sircetnoj ki Belini).

*

Stupanj 2:

L-Pi roglutarail-L-l eucil-D-prol inarai d

1,5 g (3,25 ramol) Z-Glp-Leu-D->ro-NH₂ rastvori se u 70 ml metanola, rastvor pomeša sa 0,3 g 10 % -nog paladij um a na aktivnom uglju (kao katalizatora) i kroz rastvor provodi vodonik u toku perioda od 1 čas. Posle odfiltriranja katalizatora filtrat se upari i amorfni ostatak trlja sa etrom. Dobiveni sirov proizvod (0,94 g) rastvori se u vodi rastvor obezboji aktivnim ugljem i profiltrira. Bezbojni vodeni filtrat se liofilizira; na ovaj način se dobiva 0,87 6 (79 % od teori jskog prinosa) Glp-Iieu-D-Pro-NH₂;

Rp) » 0,47; /oC/p +8,4° (c « 1, u sircetnoj kiselini).

24-.

Primer 4 • I.

Amid L-piroglutamil-L-norvalil-L-tiazolidin-»4-karbonske kiseline

Stupanj 1:

k T *

Hidrohlorid amida L-norvalil-L-tiazolidin-4*karbonske kiseline

8,0 g (20 mmol) BOC-Nva-OH.DCHA suspendira se u 60 ml etra, pomeša sa 20 ml 2 N rastvora sumporne kiseline i mucka do rastvaranja čvrste ‘materije. Paze se odvoje, etarska faza ispere sa 20 ml 2 N rastvora sone kiseline i jedanput ea 20 ml vode, osuši anhidrovanim natri j um-sulf atom i upari.

Kao ostatak dobiveno ulje se rastvori u 40 ral DMFA, rastvor pomeša sa 2,8 ml (20 mmol) trietil unina, ohladi na -15°C i uz mešanje i ukapavanje tretira sa 2,5 ml (20 mmol) pivaloilhlorida, takvora brzinom da temperatura reakcione smeše ostane ispod -5°C. Na ovaj način dobivena suspenzija se meša pri istoj temperaturi u toku još 10 minuta.

Za vreme ovog perioda vremena suspendira se 3,72 g (22 mmol) H-Tca-NHg.HCl u 30 ral DMFA, pomeša sa 3,1 ml (22 mmol) trietilamina, odfiltrira nastali talog i filtrat ukapavanjem doda gore dobivenom rastvoru meŠovitog anhidrida. Dodavanje se vrši ukapavanjem pri temperaturi od -5°C. Posle završetka dodavanja reakciona smeša se meša još 30 minuta pri -10°C. Zatim se ostavi da stoji

-25- .

v z

* t u frižideru preko noči i upari eledeceg dana. Ostatak * posle uparavanja ee rastvori u 100 ml hloroforaa, rastvor •1.

ispira tri puta ea po 20 ml 1 N rastvora sone kiseline, zatim isto tako tri puta sa po 20 ml 1 N rastvoaa nat rij umbikarbon&ta i najzad jedanput sa 20 ml vode. Potom se osuši anhidrovanim natrijum-sulfatom i upari. Uljast ostatak Se rastvori u 20 ml etilacetata, rastvor ohladi ispod 5°C i pomeša sa 20 ml 5 N rastvora sone kiseline u etilacetatu. Reakciona smeša se drži 1 čas u led en oni kupatilu i zatim razblaži etrom. Nastali talog se odfiltrira i osuši u vakunu iznad anhidrovanog natri jum-hidroksida.

Na ovaj način se dobiva 3,77 g H-Nva-Tca-NHg.HCl (70 % od teorijskog prinosa obračunatog na BOC-Nva-OH.DCHA);

Rp)= 0,20.

Stupanj 2:

J

Amid benziloksikarbonil-L-pi roglutamil-L-norvalil-Ltiazolidin-4-karbonske kiseline

2,8 g (10,5 mmol) H-Nva-Tca-NH₂.HC1 suepndira se u 50 ml DMFA i uz mešanje doda 1,47 ml (10,5 mmol) trietilamina i 5,15 g (12 mmol) Z-Glp-OPFP. Reakciona smeša se tretira daljih 5 minuta sa jos 1,47 ml (10,5 mmol) trietilamina, meša dalje 10 minuta i zatim upari u vakumu. Ostatak se rastvori u 100 ml hloroforma, rastvor ispere tri puta sa po 20 ml sone kiseline, isto tako tri puta sa po 20 ral rastvora natri j um-bi karbona ta i najzad sa 20 ml vode (jedan- f’. o put). Potom se osuši anhidrovanim natri j um-sulf atom i upari. Amorfan ostatak de trija etrom i dobiven sirov proizvod (4,6 g) prekristališe iz smeše etilaoetata 1 etra. Ha ovaj način se dobiva 5,2 g (64 % od teorijskog prinosa) Z-Glp-Nva-Tca-NH₂; t.t. 116-118°C; R^.⁴^ 0,45; M/p⁵ « -12,9,0° (c « 1, u sirčetnoj kiselini).

Stupanj 3:

Amid Ii-piroglutamil-L-norvalil-L-tiazolidin-4-karbonske kiseline t

4,76 g (10 mmol) Z-Glp-Nva-Tca-NH₂ rastvori se u 20 ml ledom ohladjenog 3,5 H rastvora bromvodonika u glacijalnoj sirčetnoj kiselini i dobiveni rastvor ostavi da stoji 1,5 čas pri 0-5°C. Reakciona smeša se razbili etrom i izdvojeno ulje odvoji dekantovanjem od rastvarača. Dobiveno ulje se ι rastvori u 50ml vode, rastvor neutrališe dodatkom čvrstog natri j um-bikarbonat a i tri puta ispira sa po 20 ml etra. Vodeba faza se upari, ostatak rastvori u 100 ml hloroforma, rastvor osuši anhidrovanim natri jum-sulfatom, upari i ostatak trlja sa etrom. Dobiveni sirov proizvod (3 g) nanosi se na kolonu od 80 g silikagela i eluira smešom rastvarača (4). Iz frakcija, koje sadrže čist proizvod izoluje se 2,18 g amorfnog proizvoda, ovaj se rastvori u 40 ml vode, rastvor oebzboji aktivnim ugljem i hezbojan vodeni rastvor liofilizira. Na ovaj način se dobiva 1,84 g (54 % od teorijskog prinosa) Glp-Nva-Tca-NH₂; r|.^^ = 0,50| /¼⁵ = -14,5,6° (c » 1, u sirčetnoj kiselini).

Primer 5

L -Pirogiutamll-L-nervalil -L-leucinamid

Stupanj 1:

Metil-estar terc-butoksikarbonil-L-norvalil-L-leucina

BOC-Nva-OH, koji je oelobodjen iz 8,0 g (20 mmol) DCHA-soli ¹ * (na način opisan u primeru 4, stupanj 1) i 3,82 g (21 mmol) H-Leu-OMe.HCl rastvori ee u 60 ml hlorofonna i rastvor pomeša prvo sa 2,94 ml (22 mmol) trietilamina, zatim uz hlad jen je ledom i mešanje sa rastvorom od 4,33 g (21 mmol) DCC u 40 ml hlonoforma. Reakciona smeša se ostavi da stoji preko noči pri 5°C, zatim odfiltrira izdvojeni DCU, filtrat ispira tri puta sa po 30 ml 1 N rastvora sone kiseline, isto tako tri puta sa po 30 ml 1 N rastvora natri jum-bikarbonata i najzad sa 30 ml vode (jedanput). Potom se osuši anhidrovanira natrijum-sulfatom i upari. Kristalni ostatak se trlja sa n-heksanom, odfiltrira i dobiveni sirov proizvod (6,65 g) prekristališe iz smeše od 5 ml etilacetata i 20 ml petroletra. Na ovaj način se dobiva 5,20 g BOC-Nva-Leu-OMe (75 % od teorijskog prinosa); t.t. 100-101 °C; = 0,84j /«C/p5 =47,5° (c » 1, u metanolu).

-28 Stupanj 2:

Terc-butiloksikarbonil-L-norvalil-L-leucinamid

5,0 g (14,5 mraol) BOC-Nva-Leu-OMe rastvori se u 50 ml metanola, rastvor ohladi ledom 1 u ovako ohladjen rastvor uvodi gasovi ti amonijak u toku 0,5 čas. Rastvor se ostavi da stoji preko noči pri sobnoj temperaturi, zatim ponovo ohladi, ponovo zasiti gaeovitim amonijakom, ostavi da stoji 4 časa «r i potom upari. Kristalni ostatak se prekristališe iz smeše etilacetata i etra. Na ovaj način se dobiva 4,57 g (91 % od teorijskog prinosa) BCC-N<a-Leu-NH₂; t.t. 158-159°C;

Rp> » 0,60; /o6/p⁵ - -48,7° (c = 1, u metanolu).

rf

Λ t·

Stupanj 5:

z·

-LzJ ’

L-Norvalil^Ieucinamid-hidrohlorid :4

4,12 g (12,5 mmol) BOC-Naa-Leu-NH? suspendira se u 16 ral .3 etilacetata i pomeša sa 20 ml 6 N rastvora sone kiseline, .3

Smeša se ostavi da stoji 1 čas, zatim razblaži etrom; J dobiveni talog se odfiltrira i sirov proizvod (5,64 g) | prekristališe iz 25 mlm metanola. Na ovaj način se dobiva «

2,75 g (85 % od teorijskog prinosa) H-Nva-Leu-NH^.HCl; ·

t.t. 215-216°C_} r£⁵⁾= 0,45; /ot/?⁵ = -5,47° (c =1, u metanolu).

i i

J

- 29 St upanj 4:

Benziloksikarbonil-L-piroglutamil-L-norvalil-L-leucinamid

2,67 g (10 mmol) H-Nva-I»eu-NH₂.HC1 rastvori se u 30 ml IMF A. Ovom rastvoru se doda prvo 1,4 ml (10 mmol) trietilamina, zatim nakon filtriranja i odvjananja stvorenog taloga, doda 4,72 g (11 mmol) Z-Glp-OPFP. Posle 5 minuta . doda se. dal jih 1,4 np (10 mmol) trietilamina, i posle još 10 minuta reakciona smeša se upari u vakumu. Ostatak se trija etrom i na ovaj način dobiven sirov proizvod (5,5 g) prekristališe iz etanola. Dobiva se 3,84 g (81 % oe teorijskog ppnrinosa) Z-Glp-Nva-Leu-RH₂; t.t. 241-242°C; » 0,55;

M/p^{5 a} -52,6° (c · 1, u sirčetnoj kiselini).

Stupanj 5:

»

L-Plroglutamil-I»-norvalil-L-leucinamid

3,8 g (8 mmol) Z-Glp-Nva-Leu-NH₂ rastvori se u 200 ml sircetne kiseline, rastvor pomeša sa 0,8 g 10 %-nog paladijuma na aktivnom uglju (kao katalizatora) i kroz smešu uvodi gasoviti vodonik u toku 1 čas. Zatim se odfiltrira katalizator i gelni ostatak trlja sa etrom. Na ovaj način se dobiva 2,7 g Glp-Nva-Leu-NH₂ (99 % od teorijskog prinosa); t.t. 240°C (raspad.); R^) = 0,57; ⁼ “55,8° (c ^s 1, u sirčetno j kiselini).

t

Primer 6;

ί.

L-Piroglutamil-L-norvalil-I-izoleucinamid

Stupanj: 1:

«♦* terc-butiloksikarbonil-L-norvalil-L-izoleucin-amid

3,7 g (19 mmol) H-Ile-NH^.HCl rastv ori se u 30 ml BHPA, r' rastvor uz mešanje pomeša sa 2,7 ml (19 nunol) trietilamina i 6,63 g (17,3 mmol) BOC-Nva-OPPP i posle 5 minuta doda daljih 2,4 pl (17,3 mmol) trietilamina. Posle daljih 10 minuta reakciona smeša se upari u vakumu, ostatak rastvori u 100 ml hloroforma, rastvor dva puta ispere sa po 20. ml 1 N rastvora sone kiseline, zatim tri puta sa po 20 ml 1 N rastvora natrijum-bikarbonata i najzad jedanput sa 20 ml vode. Potom se osuši anhidrovanim natrijum-sulfatom

I i upari. Kristalni ostatak se trija sa etrom i osuši. Na ovaj način se dobiva 4,7 g B0C-Nva-Ile-NH₂ (83 % od teorijskog prinosa); t.t. 192-194°C; 0,60; » -43,7° (c - 1, u metanolu).

Stupanj 2:

L -No rval i 1 -1 -1 zol eucinami d -hi drohl ori d

4,5 g (13,7 mmol) B0C-Nva-Ile-hH₂ suspendira se u 20 ml etilacetata i pomeša sa 1? ml 6 M rastvora sone kiseline u etilacetatu. Reakciona smeša se ostavi da stoji 1 čas, zatim razblaži etrom. Stvoren talog se odvoji filtriranjem i na ovaj način dobiven sirov proizvod (3,6 g) prekristališe iz smeše metanola i etra. Dobiva se 3,5 g H-Nva-Ile-NHg.HCl (96 % od teorijskog prinosa)q t.t. 254-255°C; Rp^ ^e 0,45;

» +5,8° (c 1, u metanolu).

Stupanj 3:

Benziloksikarbonil-L-piroglutarail-L-norvalil-Ii-izoleucinamid

3,3 g (12,4 mmol) H-Nva-Iše-NH₂.HC1 rastvori se u 40 ml DMFA i rastvor uz mešanje pomeša sa 1,74 ml (12,4 mmol) trietilamina i 5,85 g (13,6 mmol) Z-Glp-OPPP. Posle 5 minuta doda se dal jih 1,74 ml (12,4 mmol) trietilamina. Reakciona smeša, koja posle nekoliko sekundi postaje gelasta i očvrsnuta, razblaži se etrom i meša. Potom se ostavi da stoji 2 časa u frižideru i zatim odfiltrira. Na ovaj način se dobiva 5,1 g Z-Glp-Nva-Ile-NH₂ (86%od teorijskog prinosa); t.t. 252-253°C; R<⁴>» 0,60; /oC/p⁵ = -57,5° (c « 1, u sirčetnoj kiselini).

Stupanj 4:

L-Pi rogi utamil-L-norvalil-L~izoleucinamid

4,75 g (10 mmol) Z-Glp-Nva-Ile-NH₂ rastvori se u200 ml sirčetne kiseline i posle dodatka 1 g 10 %-nofc paladijuma na aktivndm uglju (kao katalizatora) kroz ovaj rastvor se provodi gasoviti vodonik u toku 1 čas. Posle završetka hidrogenizacije katalizator se odvoji filtriranjem, filtrat upari i ostatak trija sa etrom. Dobiva se 3,44 g Glp-Nva-Ile-NH₂ (98 % od teorijskog prinosa); t.t.

267-270 (raspad.); = 0,61; /et/^ - -50,2° (c = 1, u sirietnoj kiselini). .

Primer 7

L-Pirogiutamil-L-norvalil-L-metioninamid

Stupanj 1:

Metil-estar terc-hutiloksikarbonil-L-norvalil-l-metionina

Iz 4,78 g (12 mmol) DCHA-soli oslobodi se BOC-NvaOH (na način koji je opisan u primeru 4, stupnju l) i sa 2,6 g (13 mmol) H-Met-OMe.HCl rastvori u 40 ml hloro forma. U ovaj rastvor prvo se doda 1,82 ml (13 mmol) trietiiamina, zatim uz hladjenje ledom i mešanje, rastvor od 2,58 g (12,5 mmol) DCC u 20 ml hloroforma. Reakciona smeša se ostavi da stoji

- 33 preko noči pri 5°0, zatim odfiltrira izdvojena DCU, filtrat • t, ispira tri puta sa po 20 ml 1 N rastvora sone kiseline, tri puta sa po 20 ml 1 N rastvora natrijum-bikarbonata i najzad jedanput sa 20 ml vode. Potom se osuši anhidrovanira natrijumsulfatom i upari. Uljast ostatak se dovodi do kristalizacije dodatkom petroletra. Na ovaj način dobiven sirov proizvod (3,42 g) prekristališe se is smeše etilacetata i petroletra. Dobiva se 3,08 g BOC-Nva-Met-OMe (71 % od teorijskog prinosa); t.t. 69-70°C; Rp) « 0,81; /od/p^ » -42,7° (c » 1, u metanolu)

Stupanj 2:

Terc-Butiloksikarbonil-L-norvalil-L-metioninamid

1,81 g (5 mmol) BOC-Nva-Met-OMe rastvori se u 20 ml metanola i uz hlad jen je u ovaj rastvor uvodi amonijak u gasovitom stanju u toku perioda od 0,5 čas.Reakciona smeša se ostavi da stoji preko noči pri sobnoj temperaturi, zatim se nekoliko časova drži u frižideru. Izdvojeni kristalni proizvod (1,27 g) se odfiltrira; filtrat upari, ostatak prekristališe iz 5 ml etanola i sjedini sa glavnom količinom ovog proizvoda, koja je dobivena na gore opisan način. Na ovaj način se dobiva ukupno 1,62 g B0C-Nva-Met-NH₂ (93 % od teori jskog prinosa); t.t. 166-167°C; r(²⁾ = 0,57; /oirff « -40,9° (c = 1, u metanolu).

- 34 -.

Stupanj 3:

L-Norvali1-L-metioninamid-hidrohlorid

4,5 g (13 mmol) BOC-Nva-Met-NH_? suspendira se u 20 ml etilacetata i pomeša sa 20 al 6 M rastvora sone kiseline u etilacetatu. Reakciona smeša se ostavi da stoji 1 čas pri sobnoj temperaturi; zatim razblaži etrom; dobiveni talog se odfiltrira i osuši u vakumu iznad anhidrovanog natri jum-hidroksida. Na ovaj način dobiven sirov proizvod (4 g) prekri stali še sse iz smeše metanola i etra. Dobiva se 3,28 g (89 % od teorijskog prinosa)i t.t. 198-200°C; Rp^ = 0,40; /X//£⁵ - +10,2° (c = 1, u metanolu).

Stupanj 4i t ere-Butil oksikarbonil-1-gl utami ni 1-L-norval il-L metioninamid

2,84 έ (10 mmol) H-Nva-Met-NI^.HCl suspendira se u 40 ml DMFA i uz mešanje u to doda 1,4 ml (10 mmol) trietilamina i 4,53 g (11 mmol) BOC-Gln-OPFP. Posle 5 minuta doda se daljih 1,4 ml (10 mmol) trietilamina i posle mešanja u toku jos 10 minuta upari dobivena gusta suspenzija u vakumu. Čvrst ostatak posle uparavanja trlja se sa etanolom i na ovaj način dobiven sirov proizvod (4,82 g) prokuva sa 50 ml etanola. Posle hladjenja ova suspenzija se drži nekoliko časova u frižideru i zatim profiltrira. Na ovaj

- 35 način se dobiva 4,08 g (86 % od teorijskog prinosa) BOC-ein-Nva-Met-HH₂; t.t. 237-258°C; R^ - 0,43;' m/|⁵ - -37,1° (c » 1, u sirčetnoj kiselini).

Stupanj 5:

L-Pi roglutamil -L-ncrvalil «L-me tioninami d

3,6 g (8 mmol) BOC-Gln-NvažMet-NH« rastvori ee u 100 ml χ ^ά %-ne mravlje kiseline, rastvor ostavi da stoji dva časa pri sobnoj temperaturi i zatim upari u vakumu. Kao ostatak dobiveno ulje se rastvori u 50 ml sirčetne kiseline, rastvor kuva 2 časa i zatim ponovo upari u vakumu. Gelast ostatak se trija sa etrom i profil tri ra. Na ovaj način dobiva se 2,8 g )98 % od teorijskog prinosa) Glp-Nva-Met-NH₂ t.t. 249-250°C (raspad.b Rf⁵⁾ = 0,58; /ot/p⁵ « -48,4° (c = 1, u sirčetnoj kiselini).

- 36 Primer 8

N-(L-Piroglutarail-L-leucil)-pirolidin

Stupanj 1:

N-(I»-Iieucil) -pirolidin-hidrohlorid

3,46 g (15 mraol) BOC-Leu-OH rastvori se u 50 ml etilacetata, rastvor pomeša sa 2,1 ml (15 mmol) trietilamina i ohladi na <

-15°C. Zatim se uz mešanje pri temperaturi ispod -10°C u to ukavanjem doda l,97 ml (16 mmol) pivaloilhlorida. Dobivena suspenzija se dalje meša još 10 minuta, zatim se pri istoj temperaturi ukapavanjem doda 1,37 ml (16,5 mmol) pirolidina i smeša meša pola časa pri -10°C i zatim ostavi da stoji 3 časa pri 5°C. Dobiveni rastvor ee ispira tri puta sa po 10 ml 1 N rastvora sone kiseline, zalim isto tako tri puta sa po 10 ml 1 N rastvora natri jura-bikarbonata i najzad jedanput sa 10 ml vode. Potom se osuši anhidrovanim natri jum-sulf atom i upari u vakumu. Ulje, koje je dobiveno kao ostatak, rastvori se u 5 ml etilacetata i pomeša sa 10 ml 5 N rastvora sone kiseline u etilacetatu. Smeša se ostavi da stoji 1 cae, zatim razblaži etrom i ispere vodom. Vodena faza se ispere etrom, učini alkalnom kalijum-karbonato i ekstrahuje hloroformom. Hloroformski rastvor se odvoji, osuši anhidrovanim natrijum-sulfatom i upari. Uljast ostatak se rastvori u 10 ml etra, pH ovog rastvora pomoču končentrovanog rastvora sone kiseline u etilacetatu podesi na vrednost

- 37 3 i odfiltrira izdvojeni·kristalni proizvod. Na ovaj način se dobiva 2,41 g H-Leu-pirolidin-hldrohlorida (73 % od teori jskog prinosa); t.t. 17O-174°C (raspad.); Rp) ·

Stupanj 2:

N -(Benziloksikarbonil-L-pirroglutamil-L-leucil) -pirolidin

1»7 g (7,7 mmol) H-ieucin-pirolidin-HCl, 3,0 6 (7 mmol) Z-Glp-OPFP i 1,08 ml (7,7 mmol) trietilamina rastvori se u 20 ml hloroforma i posle 5 minuta doda dal jih 0,98 ml (7 ramol) trietilamina. Posle dal jih 5 miniata rastvor se razblaži hlorofotmom, ispere ddaa puta sa po 10 ml 1 N rastvora sone kiseline, zatim tri puta sa po 10 ml 1 N rastvora natri j um-bikarbonata i najzad jedanput sa 10 ml vode. Potom se osuši anhidrovanim natri jum-sulfatom i

A upari. Uljast ostatak se dovodi do kristalisanja pomocu n-heksana i na ovaj način dobiven sirov proizvod (2,85 g) prekrlstališe se iz smeše etanola i etra. Dobiva se 2,14 g Z-Glp-Leu-pirolidina (71 % od teorijskog prinosa); t.t. 109-H0°C; Rp) - 0,55; /X/p⁵ = -53,3° (c = 1, u sircetnoj kiselini).

Analiza za ^C23^H31°5^N5 (mol. tež. 429,52):

izračunato: C 64,32 %, H 7,27 %, N 9,78 %;

nadjeno: C 64,31 %, H 7,47 %, N 9,78 %.

- 58 Stupanj 3:

N-(L-Piroglutamil-L-leucil)-pirolidin

2,0 g (4,66 mmol) Z-Glp-Leu-piršlidina rastvori se u 40 ml metanola, u ovaj raetvor doda 0,4 g paladijuma na aktivnom uglju (kao katallzatora) i kroz rastvor provodi gasoviti vodonik u toku 1 čas. Posle odfiltriranja katalizatora filtrat se upari, kao ostatak dobiveno ulje rastvori u tt etru. Potom se dobiveni rastvor ostavi da stoji preko noči u frižideru i izdvojeni kristali odvoje filtriranjem.

Na ovaj način se dobiva 1,25 g Glp-Leu-pirolidina (91 % od teorijskog prinosa); t.t. 1O3-1O4°C; » 0,65;

/«Zz/^5 ^β -31,6° (c » 1, u sirčetnoj kiselini).

Analiza aminokiselina: Glu 1,00 (1,0), Leu 1,00 (1,0).

t

Primer 9

N-(H?iroglutamil-L-leucil) -piperidin

Stupanj 1:

N -(L-Leucil) -piperidin-hidrohlorid

3,46 g (15 mmol) BOC-Leu-OH rastvori seu 50 ml etilaoetata, rastvor pomeša sa 2,1 ml (15 mmol) trietilamina i ohladi na -15°C. Pri ovoj temperaturi se ukapevanjem doda prvo 1,97 ml (16 mmol) pivaloilhlorida, zatim posle 10 minhta 1,65 ml (16,5 mmol) piperidina. Nakon završetka dodavanja, reakciona smeša se meša još pola časa pri -10°C, zatim ostavi da stoji preko noči u frižideru. Tada ee talog odfiltrira, filtrat ispere tri puta sa po 10 ml 1 N rastvora sone kiseline, isto tako tri puta ea po 10 ml 1 N rastvota natri jura-bikarbonat a i najzad jedanput sa 10 ral vode.

Potom se osuši anhidrovanim natri j um-sulfatom i upari.

Kao ostatak dobivene» ulje se rastvori u 15 ml i N rastvora sone kiseline u etilacetatu. Rastvor se ostavi da stoji 1 čas, zatim razblaži etrom i preko noči ostavi da stoji u frižideru. Sledečeg dana odvoji se proizvbd koji je dobiven kao talog. To se-vrši filtriranjem. Na ovaj način se dobiva 2,0 g H-leu-piperidin-HCl (57 % od teorijskog prinosa obraČunatog na BOC-Leu-OH)^ t.t. 123-125% R^^ * 0,45.

Stupanj 2: i

N-(Benziloksikarbonil-Ii-piroglutamil-L-leucil) -piperidin

1,81 g (7,7 mmol) H-leu-piperidin-HCl, 3,0 g (7 mmol)

Z-Glp-OPPP i 1,08 ml (7,7 mmol) trietilamina rastvori se u 20 ml hloroforma.i posle 5 minuta (stajanja) doda daljih 0,98 ml (7 mmol) trietilamina. Posle daljih 5 minuta rastvor se razblaži sa 30 ml hloroforma, ispira dva puta sa po 10 ml 1 N rastvora sone kiseline, tri puta sa po 10 ml 1 N rastvora natri j um-bikarbonata i najzad jedanput sa 10 ml vode.

fcli*

- 40 /,

Potom se osuši anhidrovanim natri j um-sulf atom i upari. Kristališuče ulje, koje je dobiveno kao ostatak, trlja se smešom etra i n-heksana. Sirov proizvod, koji je dobiven na ovaj način (2,75 g), prekristališe se iz smeše etanola i etra. Dobiva se 2,21 g Z-Glp-Leu-piperidina (71 % od teorijskog prinosa); t.t. 113-115% Rp^ - 0,69;

M/*⁵ » -42,5° (c « 1, u sirčetnoj kiselini).

Analiza za ^C24^Ii33°5^3 (®^o1· tež. 443,55) izračunato: C 64,99 %, H 7,50 %, N 9,47 %;

nadjeno: C 64,90 %, H 7,72 %, N 9,53 %.

Stupanj 3:

N-(L-Pi rogi utamil-L-leucil)-pipe ridin

2,0 g (4,51 mmol) Z-Glp-Leu-piperidina rastvori še u 40 ml metanola, pomeša sa 0,4 g 10 %-nog paladijuma na aktivnom uglju (kao katalizatora) i u ovaj rastvor uvodi gasoviti vodonik u toku perioda od 1 čas. Posle odfiltriranja katalizatora filtrat se upari i ostatak dovodi do kristalisanja aa etrom. Na ovaj način se dobiva 1,12 g Glp-Leu-piperidina (81 % od teorijskog prinosa); t.t. 99-100°C r(5) _a 0,71; * +30,4° (c = 1, u sirčetnoj kiselini).

Analiza aminokiselina: Glu 0,95 (1,0), Leu 1,00 (1,0).

t .

Primer 10

L-Tiazolidin-4-karbonil-L-leuoil-L-pro1inamid

Stupanj 1:

L -Ti azol i din-4-karbonil -L -1 euc il -L -prol i nami d «

5,13 g ‘(22 mmol) BOC-Tca-OH i 4,05 g (22 mmol) PPPOH rasF' tvori se u 60 ml etilacetata i rastvor (uz mešanje i hladjenje ledom) pomeša sa 4,12 g (20 mmol) DCC. Reakciona smeša se meša 2 časa pri 0-5°C, zatim se odfiltrira DCU, filtrat upari i oetatak rastvori u 50 ml n-heksana. Rastvor se ispira pet puta sa po 25 ml 1 N rastvora natri jum-bikarbonata i zatim jedanput sa 25 ml vode. Potom se osuši anhidrovanira natri jum-sulf atom i upari. Na ovaj način dobivenih 7, >2 f ul jastog BOC-Tca-OPPP rastvori se u 20 ml DMPA i rastvor doda u suspenzi ju od 5,23 g (20 mmol) H-Leu-Pro-NH₂.HC1 u 30 ml LMFA, zatim dobivena smeša (uz mešanje i hladjenje ledom) pomeša sa 2,8 gl (20 mmol) trietilamina. Posle 5 minuta doda se daljlh 2,8 ml (20 mmol) trietilamina, smeša meša dalje još 20. minuta i zatim upari u vakumu.

Ulje, koje je dobiveno kao ostatak, rastvori se u hloroformu, (100 ml), Dobiveni rastvor se ispere tri puta sa po 30 ml 1 N sone kiseline, tri puta sa po 30 ml 1 N rastvora natrijum-bikarbonata i najzad jedanput sa 30 ml vode.

Potom se osuši anhidrovanim natri jum-sulf atom i upari.

8,84 g ul jastog BOC-Tca-Leu-Pro-NH^ rastvori se u 15 ml f

•s

S

- 42 -........

etilacetata i dobiveni rastvor pomeša sa 15 ml 6 N rastvora sone kiseline u etilacetatu. Reakciona smeša ostavi se da stoji 1 čas, zatim razblaži etil acetatom, nastali talog trija i odfiltrira . Potom se osuši u vakumu, iznad anhidrovanog natrijum-hidrokeida. Na ovaj način dobiveni 8,05 g tripeptidamid-hidrohlorida rastvori ee u 80 ml vode', rastvor. tri puta izmučka sa po 20 ml etra, zatim se pH vrednost vodenog rastvora sa natrijum-bikarbonatorn podesi na 8 i alkalno podešen rastvor ekstrahuje pet puta sa po 20 ml hloroforma. Spojeni hlorofozmski ekstrakti se osuše anhidrovanim natri jum-sulfatom i uapare. Ostatak posle uparavanja se trija sa etrom i osuši. Na ovaj način se dobiva 5,20 g H-Tca-Leu-Pro-NH₂ (76 % od teorijskog prinosa);

t.t. 159-16O°C; Rp^- 0,63; /oC/p⁵ - -162,9° (c - 1, u sirčetnoj kiselini).

Primer 11

L-2-Ketoiraidazolidin-4-karbonil-I,-prolinamid

Stupanj 1:

Pentafluorfenil-estar benziloksikarbonil-Ii-2-ketolmidazolidinv

4-karbonske kiseline

10,56 g (40 mmol) Z-Kic-OH i 9,09 g (44 mmol) PFPOH rastvori se u 100 ml smeše DMFA i dioksana (1:2) i dobiveni rastvor (uz hladjenje ledom i mešanje) pomeša sa 9706 g (44 mmol) DCC. Reakciona smeša meša se 1,5 čas pri 0-5°C, zatira odfiltrira DCU, filtrat upari i ulje, koje je dobiveno kao ostatak, dovodi do kristalisanja pomoču n-heksana. Na ovaj način dobiven sirov proizvod (16,46 g) prekristališe se iz 50 ml etil acetata. Dobiva se 12,75 g Z-Kic-OPFP (»74 % od teorijskog prinosa); t.t. 146-148°C; » 0,53;

-42,1° (c « 1, etilacetatu}.

Analiza za ^οΐ8^Η11°5^Ν2^?5 (^mo1· ^te*· 430,29):

izračunato: C 50,25 %, H 2,58 %, N 6,51 %, F 22,08 %; nadjeno: C 49,88 %, H 2,35 %, N 6,66 %, F 21,81 %.

Stupanj 2:

Benziloksikarl iii -1,-2 ketoimidazolidin-4-karbonil-L1 euc il-L-prol i nam i d

-44-2,38 g (9 mmol) H_rLeu-Pro-NH₂.HCl suspendira se u 3θ ml DMPA i pomeša sa 3,87 g (9 mmol) Z-Kic-OPFP i 1,26 ml (9 mmol) trietilamina. Posle mešanja u toku 5 minuta doda se daljih

1,26 ml (9 mmol) trietilamina i posle mešanja od još 20 minuta reakciona smeša se upari u vakumu. Ostatak posle uparavanja rastvori se u 50 ml hloroforma, rastvor ispira dva puta sa po 10 ml 1 N sone kiseline, tri puta sa po 10 ml rastvora natrijum-bikarbonata 1 najzad jedanput sa 10 ml J vode. Potom se osuš V anhidrovanim natri jum-sulfatom i upari. ζ

Ulje, koje je dobiveno kao ostatak, dovodi se do kristalisanja * sa etrom i odflitrira dobiveni talog. Na ovaj način dobiven sirov proizvod (3,31 g) prokuva se sa 30 ml etilacetata.

Posle hladjenja suspenzij-a ee oetavi da stoji nekoliko časova u hladnjaku 1 zatim profil tri ra. Dobiva se 3,0 g

Z-Kic-Leu-Pro-NH₂ (70 % od teorijskog prinosa); t.t. 172-174°C;

0,18; * -102,6° (c - 1, u sirčetnoj kiselini).

t

Analiza za ^C23^H31°6^N5 (^mo1· ^tež· 473,50):

izračunato: C 58,34 %, H 6,60 N 14,79 %;

nadjeno: C 57,52 %, H 6,62 %, N 14,62 %.

Stupanj 3:

L-2-Ketoimidazolidin-4-karbonil-L-leucil-L-prolinamid • t.

1,2 g (2,54 mmol) Z-4tic-Leu-Pro-NH₂ rastvori ee u 30 ml vode, rastvor pomeša sa 0,25 g 10 %-nog paladijuma na uglju (kao katalizatora) i kroz ovu smešu provodi gasoviti vodonik u toku 4 časa. Zatim se odfiltrira katalizator, filtrat upari i amorfni ostatak osuši u vakumu iznad anhidrovanog fosforpentoksida. Na ovaj k

način dobiven sirov proizvod (0,75 g) rastvori se u vodi, rastvor obezboji aktivnim ugl jem i bistar vodeni vodeni rastvor liofilizira. Dobiva se 0,61 g Kic-Leu-Pro-NHg (71 % od teori jskog prinosa); Rp^ » 0,35; /e^/P * -90,4° (c « 1, u sircetnoj kiselini).

Primer 12:

L-6-Ketopiperidin-2-karbonil-L-leucil-L-prolinamid

Stupanj:1: ·*

Pentafluorfenil-estar L-6-ketopipekolinske kiseline '4,3 g (30 mmol) L-6-ketopipekolinske kiseline i 6,07 g (33 mmol) PPPOH rastvori se u 100 ml hloroforma i ovaj rastvor (uz hlad jen je ledom i mešanje) pomeša sa 6,8 g (33 mmol)

DCC. Ova smeša se meša jedan čas pri 0°C, zatim ostavi da

- 46 :-:

stojji preko noči u frižideru. Sledečeg dana ae odfiltrira izdvojena DCU, filtrat upari i kristalni ostatak $rlja sa n-heksanom. Na ovaj način dobiveni sirov proizvod (9,87 g) rastvori se u 20 ml etilacetata, rastvor ostavi da stoji jedan čas u frižideru, zatim obezboji aktivnim ugljem, profil trira i upari. Kao ostatak dobiveno ulje rastvori se u smeši od 5 ml etilacetata i 20 ml M-heksana, rastvor ostavi da stoji preko noči u frižideru i sledečeg dana izdvojeni kristali odvoje filtriranjem. Dobiva se 6,34 g Kpc-OPFP (68,5 % od teorijskog prinosa); t.t. 96-98°C; /d(»/p5 * +30,0° (c » 1, u sirčetnoj kiselini).

Analiza za θ^2®8θ3^5 (^mQ^· tez. 309,20):

izračunato: C 46,62 %, H 2,61 %, N 4,53 %, F 30,72 %; nadjeno: C 46,37 %, H 2,88 %, N 4,26 %, F 30,51 %.

Stupanj 2: ¹

L-6rKetopiperidin-2-karbonil-Lleucil-L-prolinamid

1,32 g (5 mmol) H-Leu-Pro-NHg.HCl suspendira se u 20 ml DMFA i uz hladjenje ledom i mešanje pomeša sa 1,61 g (5,2 mmol) Kpc-OPFP i 0,7 ml (5 mmol) trietilamina. Posle mešanja u toku 5 minuta doda se daljih 0,7 ml (5 mmol) trietilamina i posle mešanja u toku još 20 minuta reakciona smeša se upari u vakumu. Kristalni ostatak se trlja etrom, kristali odfiltriraju, na filtru isperu etrom i hladnim hloroformom i potom osušfc. Na ovaj način se dobiva

1,27 g Kpc-Leu-Prp-NHg (72 % oda teorijskog ptinosa); t.t. 214-216°C, Rp)« 0,41, * -83° (c » 1, u sirčetnoj kiselini).

Analiza aminokiselina: ^amino-adipinska kiselina 0,99 (1,0), Leu 1,00 (1,0), Pro 0,98 (1,0).

Primer 13 k

ar

L-6-Ketopiperidin-2-karbonil-L-norvalil-l-prolinamid

2,38 g (9,5 mmol) H-Nva-Pro-NHg.HCl suspendira se u 30 ml DMFA i uz hladjenje ledom i mešanje pomeša ea 30,09 g (10 mmol} Kpc-OPPP i 1,33 ml (9,5 mmol) trietilamina.

Posle mešanja u toku 5 minuta doda se dal jih 1,3 ml (9,5 mmol) trietilamina i posle mešanja u toku dal jih 20 minuta reakciona smeša se upari u vakumu. Kristalni ostatak se trija etrom, odfiltrira, ispira na filteru hladnim etanolom i osuši. Ra ovaj način dobiven sirov proizvod (3,66 g) rastvori se u vodi, rastvor obezboji aktivnim ugljem, bezbojni (bistar) vodeni rastvor upari i kristalni ostatak trija sa 10 ml etanola. Ova smeša se ostavi da stoji u hladnjaku (frižideru) i zatim profiltrira. Dobiva se 2,10 g Kpc-Nva-Pro-NH₂ (65 % od teorijskog prinosa); t.t. 192-195°C; Rp^ 0,31; /<Z/p⁵ - -83,2° (c = 1, u sirčetnoj kiselini).

Primer 14 · I.

D-Pi roglutamil -L -1 eucll -L-prol inami d

Stupanj 1:

Pentafluorfenil-eetar benziloksikarbonil-D-piroglutamiteke kiseline

4,55 g (18 mmol) Z-D-Glp-OH i 3,68 g (20 mmol) PPPOH rastvori se u 50 ml etilacetata i ovaj rastvor se (uz « hladjenje ledom i mešanje) pomeša sa 4,12 g (20 mmol) DCC. Reakciona smeša se meša 1 čas pri 0°C, zatim ee odfiltrira DCU, filtrat upari i uljast ostatak dovodi do kristalisanja sa n-heksanom. Na ovaj način dobiven sirov proizvod (7,3 g) rastvori se u 20 ml etilacetata, rastvor ostavi da stoji 1 čas u frižideru, zatim obezboji sa akktivnim ugiLjem i upari. Kao ostatak dobiveno ulje se rastvori u 5 ml etilacetata 1 dodavanjera 20 ml n-heksana proizvod se ietaloži. Dobiva se ¢,60 g Z-D-Glp-OPFP (85 % od teorijskog prinosa); t.t. 81-82°C; Rp) « 0,84; /ot/p^{5 e} +40,1° (c - 1, u etilacetatu).

Analiza za θχ9^Η^2°5^Ν?5 (mol. tež. 429,30):

izračunato: C 53,16 %, H 2,82 %, N 3,26 %, P 22,13 %; nadjeno: C 53,28 Ji, H 3,04 %, K 3,02 %, P 21,86 %.

Stupanj 2:

Benziloksikarbonil-D-piroglutamil-L-leueil-L-prolinaoid • #.

5,24 g (12,5 mmol) H-Leu-Pro-Ni^.HCl suspendira se u 50 ral IMPA i uz hladjenje ledom i mešanje pomeša sa 5,6 g (15 mmol) Z-D-Glp-OPFP i 1,72 ml (12,5 mmol) trietilamina.

Posle mešanja u toku 5 minuta doda se daljih 1,72 ml (12,5 mmol) trietilamina i nakon mešanja u toku još 20 minuta reakciona smeša se upari u vakumu. Ostatak se rastvori u 120 ml hlorofo ima, rastvor ispira dva puta sa po 50 ml k

N sone kiseline, tri puta sa po 50 ml 1 N rastvora natrijum-bikarbonata i najzda sa 50 ml vode (jedapput). Potom se osuši anhidrovanim natrijum-sulfatom i upari. Uljast ostatak od uparavanja se dovodi do kristalisanja sa etrom. Na ovaj način dobiven sirov proizvod (5,51 g) prokuva se ea 50 ral etilacetata, 'dobivena suspenzija ostavi da stoji tri sata u frižideru i u obliku taloga izdvojen proizvod odvoji filtriranjem. Na ovaj način dobiva se 4,61 g Z-D-Olp-Leu-Pro-NH^ (80 % od teorijskog prinosa); t.t. 189-194°C; = 0,44; = -51,2° (c = 1, u sircetnoj kiselini).

-5Γί?Stupanj 3:

D-PirogUrtamil-L-leucil-L-prol inamid

4,48 g (9,5 mmol) Z-D-Glp-Leu-Pro-NH₂ rastvori se u 200 ml metanola i rastvor pomeša sa 0,9 g 10 %-nog paladijuma na aktivnom uglju (kao katalizatora). Kroz ovu smešu provodi se u toku 1 čas ga so vi ti vodonik. Zatim se katalizator odfiltrira, filtrat upari i araorfan ostatak posle uparavanja trlja pa etrom. Na ovaj način dobiven sirov proizvod (3,07 g) rastvori se u vodi, rastvor obezboji aktivnim ugljem i dobiveni bezbojan vodeni rastvor liofilizira. Na ovaj način ee dobiva 2,90 g (90,5 % od teorijskog prinosa) D-Glp-Leu-Pro-NH₂ (90,5 %); r|⁵⁾ = 0,40> /«i/p⁵ « -23,6° (c «1, u sirčetnoj kiselini).

Primer 15

Amid orotil-L-histidil-L-pipekol inske kiseline

Stupanj 1:

Metil-estar ohotil-L-histidina

24,2 g (100 mmol) H-His-0Mer2H01 rastvori se u smeši od 120 ral (1:1) BMPA-dioksan i rastvor pomeša sa 17,41 g (100. mmol) monohidrata orotne kiseline. Rastvor se

- 51 ohladi na 0°C 1 pri ovoj temperaturi se dodall,J fe (100 »

mmol) N -hidroksi -eukcinimida, 11,1 ml (100 mmol) N-metilraorfolina i najzad 20,6 g (100 mmol) DOC. Reakciona smeša se meša jedan čas pri 0°C i zatim preko noči pri aobnoj temperaturi. Sledečag dana reakciona smeša se ostavi da stoji 2 sata u frižideru, zatim odfiltrira DOU i filtrat upari. Kao ostatak dobiveno ulje ae dovodi do ktietallsanja sa vodom, kristali odfiltrira ju 1 aa filtru isperu sa 5 %-nim vodenih rastvorom llmuhske kiseline i •x vodom. Na ovaj način se dobiva 11,6 g. Oro-Hie-dle (38 % od teorijskog prinosa); t.t. 258-262°C> Rp^^e 0,40.

Analiza za C^H^O^ (mol. tež. 307,27):

izračunato: N 22,79 %;

nadjeno: N 22,51 %.

Stupanj 2: t

Orotil-histldin-hidrazid

9,21 g (SO mmol) Oro-His-OMe rastvori se u 120 ml DMFA i rastvor pomeša sa 7,33 ml (150 mmol) hidrazinhidrata. Reakciona Smeša se ostavi da stoji 2 dana pri sobnoj temperaturi, zatim razblaži sa 100 rol etilacetata! drži preko noči u frižideru. Izdvojeni talog se zatira odfiltrira i prekristališe iz metanola. Na ovaj način se dobiva 8,07 g Oro-His-^H^ (88 % od teorijskog prinosa); t.t. 250-26O°C; r£⁵⁾ « 0,35.

Analiza za O^^^O^N? (ίηοϊ; tšx. 307,28):

izračunato: N 31,91 %;

nadjeno: N 30,75 %. ·

- /,

Stupanj 3:

Amid ototil-l-histidil-L-pipekolinske kiseline

5,0 g (16,28 mmol) Oro-His-N^H^ suspendira se V 135 ml EMFA i pomeša sa 5,99 ml (48*i4 mmol) 8,1 N rastvora sone kiseline u dioksanu. Dobiveni rastvor ee ohladi na ~15°® i uz mešanje ukapavanjem pomeša sa 2,13 ml (17,9 mmol) terc-butilnitrita. Reakciona sir^ša se zatim meša pri -10°β u toku 20 minuta, zatim ukpavanjem pri -10°C pomeša sa 4,56 ml (32,56 fluppl) trietilamina, potom ea ras tvorom od 2,05 g (16,28 mmol) H-Pip-NH₂ u 10 ml EMPA i najzad sa daljih 2,28 ml (16,26 mmol) trietilamina. Posle završetka dodavanja reakciona smeša se meša još 1 čas pri -10°C, zatim preko noči pri 2°C ostavi da stoji. Sledečeg dana se odfiltrira lzdvojenf talog, filtrat upari u vakumu i ostatak trlja sa etilacetatom. Na ovaj način dobiven sirov proizvod (4,6 g, 74 % Od teorijskog prinosa) odvoji se filtriranjem i 1,3 g ovog proizvoda nanosi se na kolonu načinjenu od smeše (1:1) karboksi» metilceluloze-23 i karboksimetilceluloze-52 i eluira sa 0,005-0,1 M raetvorom amonijumacetata (pH * 5).

Frakcije koje sadrže čist proizvod se sjedine i liofiliziraju. Na ovaj način se dobiva 820 mg amorfnog : - 93 -. ...

Gro-HisuPip-NHg» R^^ = O,1O> /o£/^ » -19,0° (8 = 1, u vodi).

Analiza amirtokiselina: His 1,00 (1,0), Pip 0,94 (1,0).

Primer 16

Amid orotil-L-histidil-D-pipekolinske kiseline

5,0 g (16,28 mmol) Oro-His-NgH^ suspendira se u 135 ml 1MFA i pomeša sa 5,99 ml (48,84 mmol) 8,1 H rastvora sone kiseline u dioksanu. Dobiveni talog se ohladi na -15°C⁽i uz mššanje, ukapavanjem pomeša sa 2,13 ml (17,9 mmol) terc-butilnitrita. Reakciona smeša se meša pri -10°C u toku 20 minuta, zatim pri istoj temperaturi ukapavanjera pomeša sa 4,56 ml (32,56 mmol) trietilamina, zatim sa rastvorom od 2,05 g (16,28 mmol) H-D-Pip-N^ i najzad sa još 2,28 ml (16,28 mmol) trietilamina. Posle završetka dodavanja reakciona smeša se meša još 1 čas pri -10°C, zatim ostavi da stoji preko noči u frižideru. Sledeče^ dana se odfiltrira nastali talog, filtrat upari u vakumu i ostatak posle uparavanja trija sa etilacetatom. Na ovaj način se dobiva 4,1 g (66 % od teorijskog prinosa) sirovog proizvodaj 1,3 g ovog proizvoda se nanosi na kolonu načinjenu od smeše (1:1) karboksimetilceluloze-23 i karboksitnetilceluloze-52 i eluira 0,005-0,1 M rastvorom amonijuraacetata (pH « 5). Frakcije koje eadrže čist ' - >4 - - · / .

proizvod se sjedine i liofiliziraju. Na ovaj način se dobiva 795mg amorfnog Oro-Hic-D-Pip-NH₂; R^) ₃ 0,10; /<j6/d⁵ * ⁺43,5° (c - 1, u vodi).

Analiza aminokiselina: His 1,00 (1,0), Pip 0,96 (1,0).

Primer 17

Orotil-L-histidil-L-homoprolinaraid

5,0 g (16,28 mmol) Oro-His-S^ suspendira se u 135 ml DMPA i pomeša sa 5,99 ml (40,84 nun«!) 8,1 N rastvora sone kiseline u dioksanu. Dobiveni rastvor se ohladi na -15°C i uz mešanje ukapavanjem pomeša sa 2,13 ml (17,9 mmol) terc-butilnitrita. Reakciona ameša ae meša 20 minuta pri -10 °C, zatim pri -10°C ukapavanjem doda (jedno za drugim) 4,56 ml (32,56 mmol) trietiiamina, rastvor od 2,05 g (16,28 mmol) H-Jro-NH₂ u 10 ml DMPA i najzad još 2,28 ml (16,28 mmol) trietiiamina. Posle završetka dodavanja reakciona smeša se meša još jedan čas pri -10°C, zatim ostavi da stoji u frižideru pri temperaturi od 2°0. Sledeceg dana se odfiltrira talog, filtrat upari u vakumu i ostatak trija sa etilacetatom.

Od sirovog proizvoda, koji je dobiven na ovaj način, (čija ukupna težina iznosi 4,2 g, što iznosi 97 % od teorijskog prinosa), 1,3 g nanosi se na kolonu načinjenu od smeše (1:1) karboksimetilceluloze-52 i karboksimetilceluloze-23 i eluira sa 0,005-0,1 M rastvorom — 55 - . · ·· •amoni juraacetata. Frakcije koje sadrže Čist proizvod su spojene i liofilizirane. Dobiva se 802 mg amorfnog Oro-J^is-HPro-NHg; Rp) = 0,10; /X/^^{4 β} -12,8° (c » 1, u vodi).

Analiza aminokiselina: His 1,00 (1,0), HPro 0,91 (1,0).

Primer 18

Amid L-6-ketopiperidin-2-karbonil-L-norvalil-I»-tiazolidin4-karbonske kiseline

2,55 g (9,5 mmol) H-Nva-Tca-NHg.HCl suspendira se u 30 ml IMFA i uz hladjenje i mešanje pomeša sa 3,09 g (10 mmol) Kpc-OPFP i 1,33 ml (9,5 mmol) trietilamina. Posle mešanja u toku 5 minuta doda se dal jih 1,33 ml (9,5 mmol) trietilamina i posle 20 minuta (daljeg mešanja) reakciona smeša se upari u vakumu. Kao ostatak dobiveno ulje se ostavi da stoji preko noči u frižideru i na 'taj način dovodi do kristalizacije. Sledečeg dana se kristali odfiltriraju, isperu etrom i hladnim etanolom. Na ovaj nač|n dobiveni sirov proizvod (3,25 g) rastvori se u vodi, rastvor obezboji aktivnim ugljem, bezbojan (bistarj vodeni rastvor upari, kristalni ostatak trlja sa 20 ral etanola i ostavi da stoji preko noči u frižideru. Sledečeg dana se odfiltrira dobiveni proizvod i osuši. Dobiva se 2,0 g Kpc-Nva-Tca-NH₂ (59 % od teorijskog prinosa); t.t, 183-185°C; Rp) = 0,47;

-136,0° (c = 1, u sirčetnoj kiselini).

Primer 19

Ι·ι.ι.^ '- /.

L-6-Ketopiperidin-2-karbonil-L-norvalil-L-homoprolina,nid

Stupanj 1:

hotno) terc-Butiloksikarbonil-L-^rolinamid

2,29 g (10 mmol) BOC-HPro-OH rastvori se u 30 ml etilacetata, rastvor pomeša sa 1,4 ml (10 mmol) trietilamina, zatim se smeša ohladi na -10°C i ukapavanjem doda 1,3 ml (10 mmol) izobutil-eetra hlorugljene kiseline. P^usle mešanja u toku 15 minuta pri -10°C u ovu reakcionu smešu se uvodi pola časa gasoviti amonijak, zatim se smeša ostavi da stoji 2 časa pri 0-5°C. Talog se zatim odfiltrira, filtrat upari i ulje, koje je dobiveno kao ostatak, rastvori u 30 ml hloroforma. Rastvor se ispira dva puta sa po 10 ml 1 X rastvora sone kiseline, isto tako dva puta sa po 10 ml 1 N rastvora natri j um-bikarbonata i najzad jedanput sa 10 ml vode. Potom se osuši anhidrovanim natri jum-sulfatom, upari i uljae, koje je dobiveno kao ostatak, dovodi do kristalisanja sa n-heksanom. Na ovaj način dobiven sirov proizvod (1,95 g) prekrlstališe se iz smeše etilacetata i etra; na ovaj način se dobiva 1,78 g B0C-HPro-NH₂ (7θ % od teorijskog prinosa); t.t. 138-140°C; r|²⁾ = 0,43; /<</p⁵ = -24,85° ( c=l, u sircetnoj kiselini).

rf . *

- 57 - ·

Analiza za (^mo1· tež. 228,29):

izračunato: C 57,87 %, H 8,83 %, N 12,27 %;

nadjeno: C 57,60 %, H 8,89 %, N 12,11 %.

Stupanj 2:

L -Homoprol Inami d-hi drohl o ri d

1,6 g (7 mmol) BOC-HPro-NHg rastvori se na toplo u 10 ml ‘ if etilacetata, rastvor ohladi na sobnu temperaturni i pomeša sa 10 ml 6 N rastvora sone kiseline u etilacetatu. Reakciona smeša se ostavi da stoji 1 čas pri sobnoj temperaturi, zatim razblaži etrom, izdvojeni talog trlja sa etrom i odfiltrira. Na ovaj način se dobiva 1,05 g I^Pro-NHg.HCl (91 % od teorijskog prinosa); t.t. 178-180°C; R^) » 0,32;

+26,2° (c · 1, u metanolu).

>

Stupanj B:

L-Norvalil-L-homoprolinamid-hidrohlorid

0,99 g (6 mmol) H-Pro-NH₂.HC1 suspendira se u 20 ml EMKA i uz mešanje pomeša sa 0,84 ml (6 mmol) trietilamina i

2,3 g (6 mmol) BOC-Nva-OPFP. Posle stajanja u toku 5 minuta u reakcionu smešu se doda još 0,84 ml (6 mmol) trietilamina i posle mešanja u toku 1 Čas smeša se upari u vakumu. Rastvori se dobiveni ostatak u 50 ml hlorofoima, dobiveni rastvor ispira dva puta sa po 10 ml 1 N rastvora

-5« sone kiseline, isto tako dva puta ea po 10 ml 1 S rastvora natrijum-bikarbonata. Potom se osuši anhidrovanim natri j urn• I, sulfatom i upari. Ulje, koje je dobiveno kao ostatak, rastvori se u 6 ml etilacetata i rastvor pomeša sa 10 ml 6 N sone kiseline rastvorene u etilacetatu. Posle staajnja u toku 1 čas reakciona smeša se razblaži etrom, amorfni ortatak trlja etrom, odfiltrira i osuši u vakumu iznad anhidrovanog natri jum-hidroksida. Na ovaj način se dobiva

1,22 g H-Nva-HPro-NHg.HCl (89,5 Jfod teorijskog prinosa);

Rp) » 0,12.

Stupanj 4: t

L-6-Ketopiperidin-2-karbonil-L-norvalil-L-4iomoprolinamid

1,22 g (5,37 mmol) H-Nva-HJro-NH^.HCl rastvori se u 20 ml DMFA i ras Ja 0,75 ml (5,37 mmol) trietilamina i 1,7 g (5,5 mmol) Kpc-OPFP pomeša (uz mešanje). Posle mešanja u toku 5 minuta doda se daljih 0,75 ml (5,37 mmol) trietilamina i posle daljeg mešanja u toku još 20 minuta reakciona smeša se upari u vakumu. Ostatak se trlja sa etrom i na ovaj način dobiven amorfan sirov proizvod (1,8 g) nanese na kolonu načinjenu od 40 g silikagela i eluira sa smešom rastvarača (4). Frakcije koje sadrže čist proitvod se spoje i upare. Dobiva se 1,1 g čistog proizvoda, ovaj se rastvori u vodi, obezboji aktivnim ugljem i dobiveni bezbojan rastvor liofilizira. Na ovaj način se dobiva 1,0 g

Kpc-Nva-Hpro-NHg (53 % od teorijskog prinosa); 1U⁵⁾ · O,35i /«4/d⁵ ’ *⁴⁴> 6° (c « 1, u sirčetnoj kiselini).

Claims (1)

1. Patentni zahtev

   Ρ-Ϊ695/80 ia/c

   1· Postupak za dobivanja novih derivata tripeptida/opate formula (I):

   X - Ϊ - W - NH₂ (I) u kojoj X ja L-piroglutamil, D-piroglutamil, L-tiazolidin4-karbonil, L-2-ketoimidazolin-4-karbonil, L-6-ketopiperidin2-karbonil iii orotil grupa, Y je L-leueil, L-aorvalin lli L-hiatidil grupa, V ja L-plpekolil, D-pipekolil, L-tiazolidin-4-karbonil, L-leueil, Ip-izoleucil, D-prolil, L-prolil, L-metionil, L-homoprolil iii V-NB₂ označava pirolidil ill pipiridil grupu, naznačen tima, ito e· is jedinjenja opite formule (XI)t <

   «

   W - NHg (II) u kojoj V kao ito jo prethodno definisano u stupnjevima gradi molekul opite formule (I), primenom postupka kuplovanja, u stvari tako ito se jedinjenja opite formule (II) u kojoj V ima napred dato snačenje aciluje u dimetilformamidu, u prieuetvu trietilamina na sobnoj temperaturi, ea zaitičenim estrom pentafluorofenil amino kiseline opite formule (III):

   BOC - Y - OPFP (III) *

   u kojoj BOO označava terc-butil-okeikarbonilnu grupu,

   OPPP označava pentafluorofenokel grupu, a Ϊ iaa napred dato značenje, i iz dobivenog za&tičenog dipeptida opite formule (IV):

   BOC - Ϊ - W - NH2 (IV) u kome BOO i Y imaju napred data značenja, u etilacetatu preko acidolize ea hlorovodoničnom kiselinom, se oslobadja dipeptldaald opite formule (V):

   h - ϊ - to·- iiH₂ (V) f, u kojoj C i to iran ju napred data značenja, H je vodonik, i ovaj sa zašticenim pentafluorofenil estrom amino kiseline opšte formule (VI):

   Z - X - OPFP (VI) u kojoj Z označava benzilokeikarbonilnu grupu a X i OFST imaju napred deta značenje se aciluje u diemtilformamidu u prisustvu trietilamina na sobnoj temperaturi· i iz dobivenog zaštičenog tripeptida opšte formule (VII)«

   Z - X - Y - W - NH, (ra) u kojoj Z, X, Ϊ i W imaju napred data enačenja, zaštitna grupa se odcepljuje katalitičkom hidrogenizacijom u ledenoj eirčetnoj kiselini na sobnoj temperaturi u prisustvu kata^1izatora-10^ paladiju* na aktivnom uglju ·

   RICHTER GEDeOM VEGYEGZETI GYAR RT Zastupnik«

   DRAG

   BBOGRAO^I T

   M.ilSTIČ ara 7

   APSTRAKT

   Pronalaskom je dat postupak za dobijanje novih peptida opšte formule U) χ - γ _ w - NH₂ U) koji deluju na centralni nervni sistem, u kojoj X je L-piroglutamil, D-piroglutamil, L-2-keto-iraidazolin-4-karbonil, L-6-keto-pipekolil, L-Uazolidln-4-karbonil, L-prolil ill ototil grupa, Y je L-leucil, L-norvalil ill L-histidil grupa, i V je L-prolil, D-prolil, L-tiazolidin-4-karbonil, L-homoprolil, L-leucil, L-izoleucil, L-metanil, L-plpekolfl 111 D-pipekolil grupa, ill V-NH,, označava i pilidilil ill piperidil grupu, nadalje njihovih farmaceutski prihvatljivih kompleksa, koji je okarakterisan time što

   a) polazeči od jedinjenja opšte formule (Π) v-nh₂ * Ul) u kojej V je kao što je prethodno definisano, molekul trazenog tripeptida se gradi stupnjevito, pomoču postupaka kuplovapja koji se uopšte primenjuju u hemiji peptida, pogodno upotrebljavajuči aktivne estre, mešovite anhidride iii dicikloheksilkarbodiimid, iii što

   b) jedinjenje opšte formule (II) w-nh₂ Ul) u kojoj je V kao što je prethodno definisano , se aciluje sa azidom dobljenim iz dipeptid hidrazida opšte formule UU)

   Z - X - Y - N/H - NH₂ UlI) u kojoj Z označava benziloksikarbonil i X i Y su kao što je prethodo definisano, zatim ako se želi Z-zastitna grupa jedinjenja opšte formule (IV) dobijenog bilo kojim prethodnim postupcima

   Z-X-Y-W - nh₂ (IV) u kojoj Z, X, Y i V su kao što je prethodno definisano, se otkida, i nastali tripeptid opšte formule (I) se izdvoji iz reakcione smese, proizvoljno posle prevodjenja u farmaceutski primenljiv kompleks.