SI20877A - Lipopeptidi, njihova priprava in njihova uporaba za inaktivacijo gram-negativnih bakterij, gram-pozitivnih bakterij in za nevtralizacijo endotoksinov - Google Patents

Abstract

Izum se nanaša na nove lipopeptidne spojine s formulo P-B, kjer P označuje peptid, ki vsebuje visok delež (večji od 20%) bazičnih aminokislin Arg in/ali Lys in nepolarnih aminokislin Phe, Tyr, Trp, Ile, Leu ali Val in kjer skupina B označuje nasičeno ali nenasičeno alifatsko verigo, ki vsebuje od 6 do 18 ogljikovih atomov, nadalje na postopek za pripravo teh spojin in na njihovo uporabo za inaktivacijo Gram-negativnih in Gram-pozitivnih bakterij in nevtralizacijo endotoksinov. Izum predstavljamo z antimikrobnim delovanjem proti Gram-negativnim in Gram-pozitivnim bakterijam in endotoksin nevtralizirajočim delovanjem spojin na osnovi rekombinantnega kationskega antimikrobnega peptida LF12 (aminokislinsko zaporedje: Phe-Gln-Trp-Gln-Arg-Asn-Ile-Arg-Lys-Val-Arg-hSer), ki jih pripravimo z derivatizacijo peptida LF12 z različno dolgimi nasičenimi in nenasičenimi alkilnimi verigami.ŕ

Description

Lipopeptidi, njihova priprava in njihova uporaba za inaktivacijo Gram-negativnih bakterij, Gram-pozitivnih bakterij in za nevtralizacijo endotoksinov

Področje tehnike, v katero spada izum

Predstavljeni izum spada v področje farmacevtske industrije in se nanaša na nove antimikrobne in/ali endotoksin nevtralizirajoče učinkovine, to je lipopeptide s formulo P-B, kjer P označuje peptid z visokim deležem (> 20 %) bazičnih aminokislin Arg in/ali Lys in nepolarnih aminokislin Phe, Tyr, Trp, lle ali Val, skupina B pa označuje nasičeno ali nenasičeno alifatsko verigo, ki vsebuje 6 do 18 ogljikovih atomov.

Tehnični problem

Z naraščanjem odpornosti patogenih mikroorganizmov proti konvencionalnim antibiotikom narašča potreba po novih učinkovinah, ki bi imele širok spekter delovanja, tako proti Gram-pozitivnim kot tudi Gram-negativnim bakterijam. Dodaten problem je, da ne poznamo učinkovitega zdravljenja septičnega šoka, ki lahko nastopi zaradi okužbe krvi z Gram-negativnimi in/ali Grampozitivnimi bakterijami in drugimi mikroorganizmi. Tudi v razvitih državah umre zelo visok odstotek bolnikov s sepso (20-40 %). Sepso sprožijo sestavine celičnih sten bakterij, v prvi vrsti lipopolisaharidi (LPS), imenovani tudi endotoksini, ki so prisotni v zunanji membrani Gram-negativnih bakterij. Tako se iskanje učinkovitih antimikrobnih sredstev ujema tudi z iskanem učinkovin, ki bi hkrati nevtralizirale endotoksine in delovale antimikrobno.

Predhodno znanje (Stanje tehnike)

Učinkovine, ki vežejo LPS, ki se je sprostil iz bakterijskih celičnih sten v krvni obtok, lahko nevtralizirajo njegovo toksično delovanje. Vretenčarji, nevretenčarji, rastline in glive imajo v cirkularnem sistemu proteine in peptide, ki lahko vežejo LPS in služijo kot prva obrambna črta za boj proti mikrobom (antimikrobni peptidi mikrobnega izvora, npr. polimiksin B, oktapeptin; endogeni peptidi ali fragmenti večjih proteinov, npr. defenzini, magainin, laktofericin, peptidi iz proteina BPI (bacteriacidal permeability increasing protein)...). {Swanson, P.E., et al. (1980) Biochemistry 19, 33073314}, {Odeli, E.W., Sarra, R., Foxworthy, M., Chapple, D.S. & Evans, R.W. (1996) FEBS Lett. 382, 175-178}, {Marra, M.N., et al. (1990) J.Immunol. 144, 662-666}, {Su, G.L., et al. (1995) Crit.Rev.Immunol. 15, 201-214}, {Tobias, P.S., et al. (1997) J.Biol.Chem. 272, 18682-18685}.

V zadnjih 50-ih letih so odkrili stotine peptidnih antibiotikov, ki jih lahko razdelimo v dve skupini. V prvo skupino uvrščamo neribosomalne (gramicidini, polimiksini, bacitracini, glikopeptidi idr.), v drugo pa ribosomalne peptidne antibiotike. Prvi večinoma nastajajo v bakterijah, medtem ko drugi nastajajo tudi v evkariontskih organizmih kot sestavni del sistema na ravni odpornosti teh organizmov {Hancock, R.E. & Chapple, D.S. (1999) Antimicrob.Agents Chemother. 43, 1317-1323}.

Sprejeto mnenje je, da antimikrobna specifičnost peptidov za različne mikroorganizme izhaja iz razlik v interakcijah peptidov z membranami z različno lipidno sestavo {Epand, R.M. & Vogel, H.J. (1999) Biochim.Biophys.Acta 1462, 11-28}. S študijem morfologije Gram-negativnih in Gram-pozitivnih bakterij, na katere so delovali kationski antimikrobni peptidi, so s pomočjo elektronskega mikroskopa ugotovili, da je vzrok smrti celic razpad citoplazemske membrane {Sitaram, N. & Nagaraj, R. (1999) Biochim.Biophys.Acta 1462, 29-54}, v kateri so v veliki meri prisotni anionski lipidi, kar ne velja za membrane pri sesalcih. Zelo verjetno ne obstaja en sam univerzalen mehanizem antimikrobnega delovanja, ki bi ga imeli kationski peptidi. Očitno pa interakcija peptidov z membranami določa antimikrobno specifičnost posameznega peptida.

Večina antimikrobnih peptidov, ki se vežejo na LPS, ima amfipatično strukturo z visoko vsebnostjo hidrofobnih in pozitivno nabitih aminokislin. Kationski ciklični peptidni antibiotik mikrobnega izvora polimiksin B je zelo učinkovito sredstvo za nevtralizacijo LPS, ki je v fizioloških pogojih negativno nabita molekula, vendar je preveč toksičen za uporabo kot zdravilo, saj povzroči poškodbe membran in hemolizo. Poznavanje interakcij med temi peptidi in proteini z LPS in še posebej z membranami tako bakterijskih celic kot tudi celic višjih evkariontov, je nujno potrebno za uspešen razvoj novih učinkovin za boj proti sepsi, ki ne bi imele toksičnih stranskih učinkov. Menijo, da je asimetrična porazdelitev bazičnih in nepolarnih skupin v polimiksinu B, ker povzroči amfifilnost, potreben pogoj za nevtralizacijo molekul LPS {Thomas, C.J., et al. (1999) J.Biol.Chem. 274, 29624-29627}. Podobno segregacijo kationskih in hidrofobnih skupin najdemo tudi v kationskih antimikrobnih peptidih in nekaterih serumskih proteinih, ki se vežejo na LPS {Frecer, V., et al. (2000) Eur.J.Biochem. 267, 837-852}.

Ker se povečuje pogostost Gram-pozitivne sepse, je potrebno iskanje učinkovin, ki bi delovale tako proti Gram-negativnim kot tudi Gram-pozitivnim bakterijam. Smrtnost pacientov z Gram-negativno sepso je sicer večja kot tistih z Gram-pozitivno sepso. O tem pa ne smemo zanemariti pomena sestavin celične stene Gram-pozitivnih bakterij (npr. lipoteihoična kislina), ki tudi sprožijo imunski odziv, ki lahko vodi do sepse. Za nekaj sintetičnih kationskih peptidov, ki se vežejo na LPS in delujejo antimikrobno proti Gramnegativnim bakterijam, se je pokazalo, da pride do interakcije tudi z lipoteihoično kislino, ki je glavna sestavina Gram-pozitivnih bakterij, ki sproži aktivacijo celic {Scott, M.G., et al. (1999) Infect.lmmun. 67, 6445-6453}. Manjše sintetične molekule, ki nevtralizirajo LPS in niso toksične za človeške celice, bi lahko bile uporabne kot potencialna zdravila za preprečitev in zaustavitev septičnega šoka. Ob tem velja poudariti, da sta antimikrobno delovanje in vezava na LPS, ki je prisoten le pri Gram-negativnih bakterijah, dva ločena pojava, ki pa se pogosto prekrivata, ter da vezava molekul LPS še ne pomeni nujno tudi nevtralizacije LPS.

Za učinkovito terapevtsko sredstvo proti sepsi pa je zaželjeno, da nevtralizira sproščene molekule LPS, ne povzroča stranskih učinkov v pacientu ter deluje hkrati kot antimikrobno sredstvo.

Različni lipopeptidi mikrobnega izvora so učinkoviti antibiotiki {Vater, J. (1986) Progr.Colloid and Polymer Sci. 72, 12-18}. Pred kratkim so pokazali, da nekateri lipopoliamini učinkovito nevtralizirajo LPS in da nimajo škodljivih stranskih učinkov na sesalske celice {David, S.A., et al. (1999) Antimicrob.Agents Chemother. 43, 912-919 in US 5,998,482 }. V primeru polimiksina B so pokazali, da odstranitev lipidne verige povzroči zmanjšanje antimikrobnega delovanja in slabše anti-endotoksično delovanje tako spremenjenega antibiotika. Kemijsko modifikacijo lipopeptidov mikrobnega izvora iz Actinoplanes so uporabili za pripravo učinkovin z izboljšanimi farmakološkimi lastnostmi - t.j. znižano hemolitično aktivnostjo (US 6,194,383) in dobro antimikrobno aktivnostjo proti Gram-pozitivnim bakterijam.

Fragmenti človeških proteinov kot so BPI, baktenecin in laktoferin so bili že uporabljeni kot učinkovine za nevtralizacijo endotoksina (US 6,153,730;

EP 1 074 561 A2; US 6,172,185; US 5,856,438; WO 0049040).

Tehnični problem

Najpomembnejši cilj izuma je bil pripraviti nove učinkovine, ki bi delovale antimikrobno proti Gram-negativnim in Gram-pozitivnim orgnizmom in hkrati nevtralizirale endotoksin in bi bile tako uporabne za zdravljenje infekcij in septičnega šoka.

Prav tako je namen izuma priprava novih farmacevtskih pripravkov, ki bi bili uporabni za zdravljeneje infekcij in septičnega šoka.

Podroben opis izuma z izvedbenimi primeri

Prvi predmet našega izuma so novi lipopeptidi na osnovi človeških peptidnih fragmentov.

Drugi predmet izuma je priprava zgoraj navedenih novih lipopeptidov.

Tretji predmet izuma je uporaba navedenih novih lipopeptidov za pripravo farmacevtskih sredstev proti Gram-pozitivnim bakterijam, Gram-negativnim bakterijam in za nevtralizacijo endotoksina.

Po predmetnem izumu smo pripravili nove lipopeptide na osnovi peptidnih fragmentov človeških proteinov, ki vsebujejo visok delež bazičnih in hidrofobnih aminokislin.

Nove spojine po predmetnem izumu so predstavljene v obliki splošne formule P-B (1), kjer P označuje peptid, z zaporedjem podobnim fragmentu človeškega proteina, ki vsebuje visok delež (> 20 %) bazičnih aminokislin Arg in/ali Lys in hidrofobnih aminokislin Phe, Tyr, Trp, Ile ali Val in kjer skupina B označuje nasičeno ali nenasičeno alifatsko verigo, ki vsebuje od 6 do 18 ogljikovih atomov.

Specifični primeri vsebujejo kot del zgornje formule P peptide na osnovi zaporedja človeškega laktoferina z zaporedjem:

Phe-Gln-Trp-Gln-Arg-Asn-lle-Arg-Lys-Val-Arg-hSer, kjer hSer označuje homoserin, medtem ko primeri skupine B v splošni formuli (1) vključujejo:

C6, C8, C12, C14, C16, C18:1 (cis) alifatske verige, povezane z amidno vezjo s homoserinom.

Omenjene spojine so bile po predmetnem izumu pridobljene iz rekombinantnega fuzijskega proteina med ketosteroid-izomerazo, izbranim peptidom in heksahistidinskim dodatkom z metioninskim aminokislinskim ostankom prisotnim samo med vsemi tremi deli {Kuliopulos, A. & Walsh, C.T. (1994) J.Am.Chem.Soc. 4599-4607}.

S cepitvijo omenjenega fuzijskega proteina s CNBr se sprosti peptid, ki na Cterminalnem delu vsebuje homoserin laktonsko skupino, nakar ga izoliramo in derivatiziramo z alkilamini. Lipopeptidne spojine, ki so predmet našega izuma, lahko pridobimo tudi s kemijsko sintezo.

Spojine v izumu imajo povečano antimikrobno delovanje tako proti Grampozitivnim kot Gram-negativnim bakterijam in izboljšano nevtralizacijo lipopolisaharida.

Pokazali smo, da peptid LF12 z alifatsko verigo dolgo 6, 8, 12, 14, 16 in 18 ogljikovih atomov deluje antimikrobno proti Gram-negativnim in Grampozitivnim bakterijam ter da podaljšanje peptida LF12 z različno dolgimi lipidnimi verigami izboljša antimikrobno delovanje peptida. Tako smo opazili največje izboljšanje pri lipopeptidu LF12-C12, ki je deloval antimikrobno proti E. coli DC2 kar pri 50-krat nižji koncentraciji, proti S. aureus pri 80-krat nižji koncentraciji ter proti S. epidermidis pri 400-krat nižji koncentraciji kot izhodiščni peptid LF12.

Pri lipopeptidih s še daljšimi lipidnimi verigami (LF12-C14, LF12-C16, LF12C18) smo opazili ponovno zmanjšanje učinkovitosti antimikrobnega delovanja v primerjavi z lipopeptidom LF12-C12. Z LAL testom smo izmerili, da lipopeptid LF12-C12 povzroči 50 % inhibicijo LAL reakcije pri 12-krat nižji koncentraciji, kot to velja za sam peptid LF12. Učinkovita nevtralizacija LPS z lipopeptidom LF12-C12 potrjuje našo domnevo na začetku dela, da bomo s povečanjem lipofilnosti rekombinantnega kationskega peptida LF12 izboljšali nevtralizacijo molekul LPS. Naši rezultati se skladajo s podatkom o nevtralizaciji LPS s sintetičnim peptidom iz 33 aminokislin človeškega laktofericina, ki vsebuje del, na katerem temelji naš rekombinantni peptid LF12 {Zhang, G.H., et al. (1999) Infect. Immun. 67, 1353-1358}.

Omenjeno antimikrobno delovanje spojin po predmetnem izumu lahko uporabimo za profilakso ali zdravljenje infekcij in septičnega šoka v sesalcih, vključno s človekom.

Spojine se lahko vključi v farmacevtske pripravke, ki se uporabljajo bodisi parenteralno bodisi intravensko z uporabo različnih farmacevtskih nosilcev in dodatkov. Spojine po predmetnem izumu lahko uporabimo v različnih biofarmacevtskih pripravkih kot so tablete, pilule, praški, aerosoli, vodne raztopine ali suspenzije, injekcijske in infuzijske raztopine; same ali v kombinaciji z drugimi antimikrobnimi učinkovinami, tudi za in vitro nevtralizacijo endotoksina.

Izum pojasnjujemo, nikakor pa ne omejujemo z nasednjimi izvedbenimi Primeri. Kjerkoli v navedenih Primerih niso omenjeni viri uporabljenih reagentov, so ti reagenti kvalitete, ki je potrebna za delo v molekularni biologiji in biokemiji.

PRIMER 1

Priprava rekombinantnega peptida LF12

Vključitev kodirajočega zaporedja za peptid v ekspresijski vektor pET31b(+) (Novagen, Madison, Wl, ZDA) omogoča prepoznavno mesto za restrikcijski encim A/ivNI (New England Biolabs, Beverly, MA, ZDA), ki povzroči nastanek komplementarnih koncev s tremi nukleotidi (AGT), ki kodirajo za metionin, na obeh koncih prepoznavnega mesta, sestavljenega iz treh nukleotidov.

Ketosteriod-izomeraza (KSI) je tako modificirana, da ne vsebuje metioninskih ostankov. Tako sta edini mesti v fuzijskem proteinu, ki ju cepi CNBr, na meji med KSI in peptidom ter peptidom in heksahistidinskim repom. Takšen konstrukt omogoča tudi razvrstitev nekaj povezanih zaporedij za peptid, ločenih med sabo z nukleotidi za metionin {Kuliopulos, A. & Walsh, C.T. (1994) J.Am.Chem.Soc. 4599-4607}. Celotno kodirajoče zaporedje za peptid LF12 je bilo vsebovano v dveh fosforiliranih začetnih oligonukleotidih (The Great American Gene Company, Ramona, CA, ZDA), ki smo ju subklonirali v ekspresijski vektor pET31b(+).

Začetna oligonukleotida za rekombinantni peptid LF12, to je LF12-5' (5'P-TTTCAGTGGCAACG CAACATTCGTAAAGTGCGCATG-3' (v fosforilirani obliki na 5'koncu)) in LF12-3' (5'P-GCG CACTTTA CGAATGTTGCGTTGCCACTGAAACAT-3'(v fosforilirani obliki na 5'koncu)), smo denaturirali 10 min pri 95°C, ju zlepili v ligacijskem pufru in ligirali v ekspresijski vektor pET31b(+) s T4 DNA ligazo (New England Biolabs) čez noč pri 16°C.

Po transformaciji v E. coli DH5a smo kolonije z rekombinantnim ekspresijskim vektorjem določili z reakcijo verižne polimerizacije z uporabo začetnih oligonukleotiodov KSI (GGCAAGGTGGTGAGCATC) in T7term (TGCTAGTTATTGCTCAGC) (The Great American Gene Company, Ramona, CA, ZDA). Rekombinantni peptid LF12 smo pridobili v bakteriji E. coli BL21(DE3)pLysS v obliki inkluzijskih telesc fuzijskega proteina KSILF12-His₆. Pripravili smo ustrezno količino vcepka (1/100 do 1/20 končnega volumna) v gojišču LBA in ga inkubirali čez noč pri 37°C in 200 obr/min. Bakterijsko kulturo smo naslednji dan razredčili s tolikšno količino gojišča LBA, da je bila Οϋθοο med 0.15 in 0.2, in inkubirali v Erlenmeyer steklenicah pri 37°C ob stresanju 220 obr/min. Ko je vrednost absorbance pri 600 nm fermentacijske zmesi narasla do 0.8, smo dodali 0.4 mM IPTG (izopropil-1 tio-p-D-tiogalaktozid). Fermentacija je potekala še naslednji 2 uri, nakar smo fermentacijsko zmes centrifugirali 10 minut pri 4°C in 8000 obr/min. Po centrifugiranju smo supernatant odlili, pelet pa resuspendirali v pufru za lizo (0.1 % deoksiholat, 50 mM fenilmetilsulfonilfluorid, 1 mM etilendiamintetraocetna kislina (EDTA), 10 mM Tris/HCI pH 8.0). Suspenzijo smo prelili v čašo in inkubirali na ledu. Sprostitev celičnega materiala smo dosegli z razbijanjem bakterijskih celičnih sten z ultrazvokom (razbijalec celic ΤΜΧ400, Tekmar). Sondo smo potopili v čašo z vzorcem, ki smo jo imeli ves čas na ledu, in sonicirali 3 minute (impulz 1 sekunda, pavza 2 sekundi), dokler viskoznost raztopine ni padla. Suspenzijo smo centrifugirali 10 minut pri 4°C in 12.000 obr/min. Pelet, v katerem je bil protein v obliki inkluzijskih telesc, smo nato sprali dvakrat s pufrom za lizo, dvakrat z 2 M ureo (sečnino) v 10 mM Tris/HCI pH 8.0 in enkrat z 10 mM Tris/HCI pH 8.0, s tem, da smo suspenzijo vsakokrat centrifugirali 10 minut pri 4°C in 12.000 obr/min in zavrgli supernatant. Tako očiščena inkluzijska telesca smo shranili v zamrzovalniku na -20°C. Produkcija fuzijskega proteina je znašala v gojišču LBA 400 mg/l gojišča, kar ustreza 40 mg peptida LF12 na 1 L gojišča LB (kazeinski hidrolizat, 10 g/L, kvasni ekstrakt, 5 g/L , NaCI, 10 g/L, pH nastavljen na 7.0 z NaOH). Navedeni dobitek fuzijskega proteina velja za stresano kulturo v Erlenmeyer steklenicah. Fuzijski protein KSI-LF12-His6 smo pridobili tudi z gojenjem v fermentorju z gojiščem LBA (gojišče LB z dodatkom ampicilina do 100 pg/l). V tem primeru je bila produkcija proteina do 1 g/L gojišča. Inkluzijska telesca fuzijskega proteina smo raztopili v 6 M GuHCI (gvanidinijev hidroklorid), 20 mM Tris pH 8.0. Po centrifugiranju 15 minut pri 12.000 obr/min in sobni temperaturi smo supernatant nanesli na Ni²⁺-NTA kolono (Ouiagen), ki smo jo predhodno nasitili z 1 M NiS0₄ in ekvilibrirali s pufrom, ki je vseboval 5 mM imidazol, 0.5 M NaCI, 6 M GuHCI in 20 mM Tris/HCI pH 8.0. Po nanosu vzorca smo kolono 2-krat sprali s po 4 ml raztopin za spiranje I (5 mM imidazol, 0.5 M NaCI, 6 M GuHCI, 20 mM Tris/HCI pH 8.0) in II (16 mM imidazol, 0.5 M NaCI, 6 M GuHCI, 20 mM Tris/HCI pH 8.0), oziroma dokler ni bila vrednost absorbance pri 280 nm pod 0.01. Fuzijski protein smo eluirali z raztopino za eluiranje (300 mM imidazol, 0.5 M NaCI, 6 M GuHCI, 20 mM Tris/HCI pH 8.0). Eluirane frakcije smo združili in dializirali preko noči proti deionizirani vodi z 1 mM EDTA pH 8.0 v dializni vrečki, ki je neprepustna za molekule večje od 10 kDa.

Izoliran fuzijski protein KSI-LF12-His₆ smo raztopili v 70 % TFA (trifluoroocetna kislina) (Sigma) ali v 80 % mravljični kislini (Fluka) do končne koncentracije proteina 10 mg/ml in prenesli v 100 ml stekleno bučko. V digestoriju smo raztopini dodali trden CNBr (Aldrich) v 100-kratnem molarnem prebitku nad vsemi metionini v fuzijskem proteinu. Vsebino bučke smo nato 1 minuto prepihavali z dušikom, nato pa bučko zaprli, ovili v aluminijasto folijo in inkubirali 24 ur ali več pri sobni temperaturi. Produkte reakcije smo posušili do suhega na rotavaporju (rotacijskem uparilniku) pri 30°C in trikrat sprali z dvakrat deionizirano vodo.

-1010

Suspenzijo produktov v dvakrat deionizirani vodi, prepihano z dušikom, smo mešali čez noč pri 50 obr/min in sobni temperaturi, zaščiteno pred svetlobo. Naslednji dan smo suspenzijo centrifugirali 15 minut pri 12000 obr/min in sobni temperaturi. Supematant, ki je vseboval odcepljeni peptid, smo skoncentrirali v vakuumski centrifugi. Netopni pelet je vseboval hidrofoben nosilni protein KSI.

Odcepljeni peptid v supernatantu smo ločili od primesi ostalih peptidov (predvsem od peptida, ki je vseboval terminalni heksahistidinski rep) z RPHPLC (tekočinska kromatografija visoke ločljivosti z reverzno fazo) (Knauer, VWM) z uporabo kolone LiChrospher 100 RP-18. Pri eluciji z gradientom ΟΙ 00 % pufra B (80 % acetonitril, 0.1 % TFA v dvakrat deionizirani vodi) v 20 minutah ob pretoku 0.5 ml/min se je odcepljeni peptid eluiral pri 60 % pufra B, pri 100 % pufra B pa seje eluiral nerazcepljeni fuzijski protein KSI-LF12His6 Končni dobitek izoliranega peptida LF12 je znašal 6 mg na 1 L gojišča LB. Učinkovitost cepitve s CNBr in čistost izoliranega peptida LF12 smo preverili s SDS poliakrilamidno elektroforezo na 12 % poliakrilamidnem gelu (Protean II, Bio Rad).

PRIMER 2

Priprava polsintetičnih lipopeptidov na osnovi peptida LF12

Rekombinanten peptid LF12 po cepitvi s CNBr vsebuje na C-terminalnem delu reaktivno homoserin laktonsko skupino, ki jo lahko uporabimo za vezavo na primarno ali sekundarno amino skupino druge molekule. Očiščen peptid LF12 (170-260 nmol) smo najprej posušili do suhega v vakuumski centrifugi, nato pa popolnoma laktonizirali z dodatkom 20 μΙ 70 % TFA in takoj zatem posušili do suhega. Posušen pelet smo raztopili v 50 μΙ brezvodnega DMF (Ν,Ν-dimetilformamid) (Fluka), ki smo ga dodali s Hamilton injekcijsko iglo, ki tesni pline, in nato dodali 8 μΙ Et₃N. Nato smo dodali izbran alifatski amin v 100-kratnem molarnem prebitku in inkubirali čez noč pri 45°C.

-1111

Za derivatizacije rekombinantnega peptida LF12 smo uporabili alifatske amine z različno dolgimi nasičenimi in nenasičenimi verigami (Tabela 1).

Tabela 1. Polsintetični lipopeptidi na osnovi peptida LF12, ki smo jih pripravili.

LF12 lipopeptid	Dodana funkcionalna skupina
LF12-etilendiamin	-NH-(CH2)2-NH2
LF12-spermidin	-NH-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH2
LF12-C6	-NH-CH3(CH2)5
LF12-C8	-NH-CH3(CH2)7
LF12-C12	-NH-CH^CH^n
LF12-C14	-NH-CH3(CH2)i3
LF12-C16	-NH-CH3(CH2)15
LF12-C18	-NH-CH3(CH2)8=(CH2)9

Po končani reakciji smo reakcijski zmesi v DMF dodali enak volumen kloroforma in deionizirane vode in 5 minut intenzivno stresali epruveto z vzorcem. Po centrifugiranju 5 minut pri 10000 obr/min in sobni temperaturi smo zgornjo (vodno) fazo prenesli v čisto epruveto ter še dvakrat ponovili ekstrahiranje, tako da smo vsakič dodali enak volumen dvakrat deionizirane vode kot na začetku. Vsebnost lipopeptida v vodni fazi po ekstrakciji smo preverili z merjenjem absorbance pri 280 nm.

Lipopeptide iz vodne faze smo izolirali z RP-HPLC kolono kot prej sam peptid (linearni gradient 30-70 % pufra B v 20 minutah in 70-100 % pufra B v 10 minutah pri pretoku 0,5 ml/min). Lipopeptidi so se eluirali pri višjem deležu pufra B kot osnovni peptid (Tabela 2).

-1212

Tabela 2. Elucije peptida LF12 in polsintetičnih lipopeptidov pri RP-HPLC.

Peptid	Elucija pri % pufra B #
LF12	45
(15N)LF12	45
LF12-etilendiamin	45
LF12-spermidin	46
LF12-C6	52
LF12-C8	54
LF12-C12	58
LF12-C14	72
LF12-C16	76
LF12-C18	80

# Pri linearnem gradientu 30-70 % pufra B v 20 minutah in 70-100 % pufra B v 10 minutah pri pretoku 0,5 ml/min.

Izoliran LF12 in pripravljene lipopetide smo analizirali s FAB masnim spektrometrom (Tabela 3).

Tabela 3. Primerjava teoretičnih in eksperimentalnih molekulskih mas

peptidov, ki smo jih pripravili.
Peptid	Teoretična molekulska masa (Da)	Eksperimentalna molekulska masa (Da)
LF12	1613,8	1613,6
(15N)LF12	1639,8	1640,2
LF12-etilendiamin	1673,9	1674,3
LF12-spermidin	1759,0	1759,3
LF12-C6	1714,9	1715,0
LF12-C8	1743,2	1743,2
LF12-C12	1798,7	1798,7
LF12-C14	1827,2	1828,1
LF12-C16	1854,3	1854,3
LF12-C18	1881,3	1881,6

-1313

PRIMER 3

Nevtralizacija LPS in vitro s peptidom LF12 in polsintetičnimi lipopeptidi na osnovi peptida LF12

Zmožnost pripravljenih peptidov za nevtralizacijo delovanja LPS in vitro smo testirali z encimskim testom amebocitnega lizata ostvarja Limulus polyphemus (LAL test). LPS v živalih sproži proteolitsko kaskado, ki vodi do želiranja hemolimfe. Z dodatkom kromogenega substrata, ki ga razgradijo aktivirane proteaze iz hemolimfnega lizata, pa lahko pri testu spremljamo razvoj barve.

Uporabili smo kromogeni LAL test proizvajalca Cape Cod Associates, ZDA. Test smo izvajali v apirogenih steklenih epruvetah ali sterilnih mikrotitrskih ploščah za gojenje celičnih kultur (Costar). V žepke smo nanesli 50 pl raztopine s konstantno koncentracijo LPS (3,2 EU/ml) in posameznih peptidov različnih koncentracij v apirogeni vodi (LAL voda). Dodali smo še 50 pl reagenta Pyrochrome, ki je vseboval kromogen substrat in ekstrakt iz amebocit ostvarja, ter inkubirali 22 minut pri 37°C. Reakcijo smo ustavili z dodatkom stop reagenta (50 % ocetna kislina), tako da je bila končna koncentracija ocetne kisline 10 %.

S spektrofotometrom smo izmerili absorbanco pri 405 nm. Rezultate smo primerjali z delovanjem antibiotika polimiksina B, ki učinkovito nevtralizira LPS, ter še s pozitivno kontrolo, kjer smo inkubirali sam LPS brez prisotnosti peptidov, in negativno kontrolo (LAL voda).

Z LAL testom smo pokazali, da tako peptid LF12 kot njegovi derivati inhibirajo aktivacijo faktorjev v LAL reagentu, ki jo sproži LPS. Ugotovili smo, da vsi peptidi inhibirajo LAL reakcijo na LPS v odvisnosti od koncentracije (Tabela 4).

-1414

Tabela 4. 50 % inhibicija (IC50) LAL reakcije v prisotnosti peptidov.

Peptid	IC50 (μΜ)*	± napaka*
LF12	29,98	2,47
LF12-C6	11,22	2,24
LF12-C8	8,84	3,32
LF12-C12	2,43	1,62
LF12-C14	19,72	1,00
LF12-C16	12,09	1,41
polimiksin B	1,40	0,56

* Izračun (IC50 ± napaka) s sigmoidnim prileganjem.

PRIMER 4

Določanje antimikrobnega delovanja peptida LF12 in polsintetičnih lipopeptidov na osnovi peptida LF12

Za poskus smo uporabili bakterijske seve, ki so navedeni v Tabeli 5.

Tabela 5. Bakterijski sevi, ki smo jih uporabili za določanje antimikrobnega delovanja peptida LF12 in polsintetičnih lipopeptidov na osnovi peptide LF12.

• Gram-negativni bakterijski sevi:
Escherichia coli DC2	CGSC 7139 (E. coli Genetic Stock Center, Yale University, ZDA)
Escherichia coli UB1004	CGSC 7138 (E. coli Genetic Stock Center, Yale University, ZDA)
Escherichia coli	Zbirka kultur na Kemijskem
BL21(DE3)pLysS	inštitutu, Ljubljana, Slovenija
• Gram-oozitivna bakterijska seva:
Staphylococcus aureus	ATCC 25923 (American Type Culture Collection, Manassas, ZDA)
Staphylococcus epidermidis	ATCC 12228 (American Type Culture Collection, Manassas, ZDA)

-1515

Pripravili smo zmes iz 1,8 ml LB top agaroze, avtoklavirane in ohlajene na 50°C, in 0,2 ml prekonočne kulture bakterijskih celic v gojišču LB ter jo prelili na ploščo z gojiščem LB, ki smo jo predhodno ogreli na temperaturo 37°C. V pol ure se je polje bakterij na plošči strdilo. Na tako pripravljene plošče s poljem bakterij smo nanesli po 10 μΙ peptidov v območju koncentacij od 10'⁷ do IO'² M in inkubirali 3 ure pri 37°C. Antibakterijsko delovanje smo ugotovili, če je okrog mesta nanosa peptida na ploščo nastala bistra cona brez celic. Dodatno smo preverili tudi antimikrobno delovanje vseh sestavin, ki smo jih uporabili za pripravo polsintetičnih lipopeptidov.

Pokazali smo, da peptid LF12, podaljšan z alifatsko verigo dolgo 6, 8, 12, 14, 16 in 18 ogljikovih atomov, deluje antimikrobno proti Gram-negativnim in Gram-pozitivnim bakterijam ter da to podaljšanje peptida LF12 izboljša antimikrobno delovanje peptida proti bakterijam E. coli DC2, S. aureus in S. epidermidis (Tabela 6).

Tabela 6. Antimikrobno delovanje peptidov proti Gram-negativni bakteriji E. coli DC2 in Gram-pozitivnim bakterijam S. aureus in S. epidermidis.

Peptid	E. coli DC2 (M) #	S. aureus (M) #	S. epidermidis (M) #
LF12	1,0*10'3	7,5*10’4	3,8*10'4
LF12-C6	5,0*10'4	3,8*10'4
LF12-C8	1,0*10'4	5,0*10'5
LF12-C12	2,0*105	9,5*10'6	9,5*10‘7
LF12-G14	1,0*10'4	5,0*10'5
LF12-C16	5,0*10'4	2,5*105
LF12-C18	5,0*10'4	5,0*10'5
LF12-		7,7*10'5
spermidin
polimiksin B	2,0*10'6	2,0*10'4	5,0*10’5

# Koncentracije peptidov, pri katerih je nastala na plošči z gojiščem LB z navedenimi bakterijami bistra cona brez celic.

-1616

Polsintetični lipopeptidi, opisani v izumu, delujejo antimikrobno proti Gramnegativnim in Gram-pozitivnim bakterijam pri koncentracijah nekaj 10- do 100-krat nižjih, kot to velja za izhodni peptid, ter nevtralizirajo delovanje molekul LPS pri nekajkrat nižjih koncentracijah kot izhodni peptid. Nove spojine po predmetnem izumu omogočajo uničenje Gram-negativnih in Gram-pozitivnih bakterij in nevtralizacijo endotoksina, in so zato uporabne za preprečevanje infekcij, zdravljenje sepse in drugih podobnih obolenj.

Zaradi podobnosti peptida s človeškim zaporedjem je zmanjšana verjetnost za imunski odziv na peptide v človeškem telesu. To je zelo ugodno tudi v luči iskanja novih tipov antimikrobnih učinkovin zaradi naraščajoče, odpornosti bakterij na konvencionalne antibiotike. /

Claims (14)

1. PATENTNI ZAHTEVKI

   1. Spojine s formulo P-B, kjer P označuje peptidni del z visoko vsebnostjo (> 20 %) bazičnih aminokislin Arg in/ali Lys in hidrofobnih aminokislin Phe, Tyr, Trp, Ile ali Val, skupina B pa označuje nasičeno ali nenasičeno alifatsko verigo, ki vsebuje od 6 do 18 ogljikovih atomov.
2. 2. Spojine po zahtevku 1, značilne po tem, da je peptidni del P podoben aminokislinskemu zaporedju fragmenta človeškega proteina ali peptida.
3. 3. Spojine po zahtevku 1, značilne po tem, da je aminokislinsko zaporedje peptidnega dela P: Phe-Gln-Trp-Gln-Arg-Asn-lle-Arg-Lys-Val-Arg-hSer.
4. 4. Spojina s formulo:

   Phe-Gln-Trp-Gln-Arg-Asn-lle-Arg-Lys-Val-Arg-hSer.
5. 5. Spojina s formulo:

   Phe-Gln-Trp-Gln-Arg-Asn-lle-Arg-Lys-Val-Arg-hSer-heksilamid.
6. 6. Spojina s formulo:

   Phe-Gln-Trp-Gln-Arg-Asn-lle-Arg-Lys-Val-Arg-hSer-oktilamid.
7. 7. Spojina s formulo:

   Phe-Gln-Trp-Gln-Arg-Asn-lle-Arg-Lys-Val-Arg-hSer-dodecilamid.
8. 8. Spojina s formulo:

   Phe-GIn-T rp-Gln-Arg-Asn-lle-Arg-Lys-Val-Arg-hSer-oleilamid.
9. 9. Spojina s formulo:

   Phe-Gln-Trp-Gln-Arg-Asn-lle-Arg-Lys-Val-Arg-hSer-tetradecilamid.

   -1818
10. 10. Spojina s formulo:

    Phe-Gln-Trp-Gln-Arg-Asn-lle-Arg-Lys-Val-Arg-hSer-heksadecilamid.
11. 11. Spojina s formulo:

    Phe-Gln-Trp-Gln-Arg-Asn-lle-Arg-Lys-Val-Arg-hSer-2-amino-etilenamid.
12. 12. Postopek za pripravo spojin po zahtevku 1, značilen po tem, da je peptidni del pridobljen v mikroorganizmih.
13. 13. Uporaba spojin po zahtevku 1 za pripravo farmacevtskih sredstev za inaktivacijo Gram-negativih bakterij, Gram-pozitivnih bakterij in za nevtralizacijo endotoksina.
14. 14. Uporaba spojin po zahtevku 1 za pripravo antimikrobnih sredstev proti Gram-pozitivnim bakterijam Staphyloccocus aureus in/ali Staphyloccocus epidermidis.