SE530442C2 - Diagnos av karies - Google Patents

Description

25 30 35 539 442 tandytan gradvis bli kemiskt modifierad vilket över tiden kan resultera i en nettoförlust av mineral.

Ur klinisk synpunkt har tandkaries beskrivits som en mjuk, gulbrun missfärgning av dentinet [6]. Det har in vivo också visats att dentinet blir blekt gult då det utsattes för glukos [7].

Tidigare undersökningar av tandkaries har påvisat reaktioner mellan proteiner och socker (allmänt kallade Maillard reaktioner) och det har föreslagits att dessa är ansvariga för den typiska missfärgningen [7]. Andra författare har förklarat missfärgningen som en effekt av bindningen mellan ketogrupperi glyceraldehyd (en fermentationsprodukt av kolhydrater) och kariöst dentin, till exempel, vilken sedan förorsakar den bruna pigmenteringen [8].

Denna indikativa missfärgning omfattar också dentin då det reagerar med både glukos och glukosamin [8]. Vidare har skillnader inom kariös vävnad beskrivits av Kuboki och medarbetare [9], som delade upp tandkaries i ett första/yttre skikt och ett andra/inre skikt intill det normala dentinet. Det yttre kariesskiktet är mera infekterat och nekrotiskt jämfört med det inre skiktet.

Kariöst dentin innehåller signifikanta mängder av socker [8] och kan därför bilda avancerade glycationsslutprodukter (AGEs) t.ex., Maillard produkter, mellan socker och sidokedjorna på basiska aminosyror såsom lysin och arginin H01. Dessa Maillard reaktioner är icke-enzymatiska tvärbindningsreaktioner. De två mest välkända Maillard reaktionsprodukterna som återfinnesi kariöst dentin, pentosidin och karboxylmetyllysin [10. 11] har inte återfunnits i friskt dentin [11].

Sålunda föreligger ett behov för en enkel men säker metod att diagnostisera närvaron av kariös dentin vävnad.

Sammanfattning av föreliggande uppfinning Föreliggande uppfinning avser ett förfarande att diagnostisera den eventuella närvaron av kariös dentin vävnad på ett enkelt men tillförlitligt sätt. Av det skälet har försök att finna en specifik grupp genomförts.

Detaljerad beskrivning av föreliggande uppfinning Föreliggande uppfinning avseri synnerhet en specifik kemisk förening, en ester, som har visat sig föreligga i kariös dentin vävnad. Den kemiska föreningen kan lätt detekteras med infraröd spektroskopi, eller genom fluorescensljus, när en fluorescensgrupp har kopplats till den kemiska föreningen i synnerhet vid estergruppen. 10 15 20 25 30 35 53Ü 442 l kariös vävnad kan det också föreligga organiska molekylarmodifieringar andra än Maillardreaktioner som beskrivits ovan. Närvaron av estrari tandkaries har undersökts och det har visat sig att esteraser är mera vanliga i kariös vävnad än i intakt vävnad [12].

Vidare, igenkände Dirksen [13] estrar, härrörande från bakterie fettkomponenter, såsom kolesterolestrar, i både frisk och kariöst dentin.

Emellertid, experimentella bevis för närvaro av estrarl tandkaries saknas fortfarande och möjliga skillnader i estrarna för yttre och inre skikten av tandkaries har inte undersökts.

Hypotetiskt kan det antagas att förestring av hydroxylgrupperna i de sura sidokedjorna på aspartat och glutamatrester som möter en sur miljö (mjölksyra) är unik för kariesskador. Ändamålet med föreliggande beskrivning är därför att utvärdera närvaron av presumptiva estergrupper i yttre och inre skikten pá kariesskador.

Material och Metoder Provberedning Den hårda vävnaden från två, human permanenta premolarer, med manifesta kariesskador användes för försöken i föreliggande studie. Tänderna extraherades på grund av allvarlig karies status och hade inte några tidigare tandrestaureringar. Tiden mellan extraktion och vidare hantering var maximalt en vecka. Under denna tid, lagrades tänderna i avjonat vatten vid +4°C.

Den yttersta delen av tandkariesskadorna avlägsnades med en steriliserad utrymmare och kastades bort. Återstâende tandkaries delades i två skikt; ett yttre skikt med missfärgad, mjuk och infekterad tandkaries och ett inre skikt med hårdare, mindre missfärgad tandkaries. Skikten av yttre och inre tandkaries avlägsnades med en utrymmare och överfördes till provrör. En ren utrymmare användes för de olika respektive proven, dvs. en ren utrymmare användes för tandens varje skikt. Friskt dentin utrymdes från en icke- infekterad del av tanden, som en referens avseende oförändrade peptider.

Denna exkaveringsprocedur upprepades för den andra tanden. Efter exkavering lämnades det utvalda tand materialet att spontantorka vid omgivningstemperatur. Torrvikten hos varje tandprov var ungefär 1 mg.

Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTlR) Tandmaterialet som hade avlägsnats blandades med kaliumbromid (KBr) för beredning av en KBr pellet och efterföljande FTlR undersökning. Totalvikten hos varje KBr pellet var 100 10 15 20 530 442 mg. IR analyser genomfördes med användning av Mattson Cygnus FTlR spektrofotometer med 4 cm” upplösning. Varje spektrum erhölls från c:a 100 scanningar. För att undanröja effekter av atmosfärisk koldioxid och vattenånga, fylldes instrumentet med luft av kvalitet för analytiska instrument, torkades och renades med Balstron typ 75-60 konditioneringsanordning. Samtliga FTlR spektra erhölls inom nägra timmar efter KBr pellet beredning: oftast omedelbart efter KBr pellet beredning. Spektra baslinjekorrigerades med användning av FTlR mjukvara. För samtliga spektra valdes samma våglängspositioner.

En sammanfattning av FTlR spectra med olika beteckningar för friskt dentin och kariös vävnad presenteras i Figur 1 respektive Tabell 1. inget av provning uppvisade någon distinkt absorptionstopp vid 1735-1750 cm'1, vilket är den karaktäristiska toppen för ester- karbonylgruppen (141. Emellertid, kunde ett knä runt 1740 om* iamidbandet vid 1660 cm” detekteras för båda de inre skikten dentalkaries proven och ett av de yttre dental-karies proven (Figur 2). Detta knä fanns inte i dentinspektra (Figur 3). Varken friskt dentin eller kariös vävnad uppvisade någon distinkt topp vid 1050-1300 cm'1, vilket är andra karaktäristiska IR absorptionsregioner för estrar [15]. Emellertid toppen vid 1030 cm* för friskt dentin skiftade till c:a 1040 cm* för kariösa prov (Figur 4) Tabell 1. Sammanfattning av föreslagna tillhörigheter [14-16] för huvud FTlR topparna detekterade för friskt och kariöst dentin.

Kurv Tand Tand Positioner (cm'1) för huvudtoppar med föreslagna tillhörigheter Note- prov nr N-H C-H C=O C=0 P'0H P'0 ring stretch stretch hos stretch för bend deformering estrar amid I A Friskt 1 3500- 2927 - 1668 1032 561 dentin 3380 ß Friskt 2 3500- 2941 - 1653 1034 561 dentin 3380 C Yttre 1 3500- 2920 Knä vid 1655 1045 561 kariöst 3380 1740 om* skikt o Yttre 2 3500- 2924 - 1653 1034 561 kariöst 3380 skikt E Inre 1 3500- 2920 Knä vid 1657 1038 563 kariöst 3380 1740 cm* skikt F Inre 2 3500- 2924 Knà vid 1653 1034 559 kariöst 3380 1740 cm* skikt Resultaten visar klart att hexosester grupper är unika för kariös vävnad och återfinnes därför inte l friskt dentin. 10 15 20 25 30 35 530 442 Huvuddelen av kända analytiska tekniker kräver att proteiner extraheras från den kalcifierade vävnaden för att medge analys av funktionella grupper, t.ex., estrar. Det första steget är att mekaniskt överföra tandvävnaden i stycken; dentinet behöver pulveriseras och tandkaries behöver endast exkaveras med skarpa exkavatorer för efterföljande extraktion av proteiner [18]. Vidare, efter den mekaniska behandlingen kräver upplösning av humant kollagen en kombination av syror och enzymer [18, 191. För att kringgå svårigheterna involverade i extraktion av proteiner frân dentin och dentinkaries, FTIR valdes i föreliggande fall, eftersom det är en teknik som medger analys av fast material utan omfattande provberedning.

FTlR har ofta använts l dentalforskningen och då man studerar FTlR spectra från friskt dentin som presenterats i tidigare studier [17.20-25] kan inte något knä runt 1740 cm* vid amid I bandet detekteras, vilket å andra sidan har visats i föreliggande studie. Den andra karaktäristiska absorbansregionen för estrar vid 1050-1300 cm* är mera svår att tolka, eftersom andra funktionella grupper också absorberar l den regionen. Även fastän inga distinkta toppar àterfinnes för friskt dentin är kariösa prov i den regionen kan en mindre skiftning i toppen vid 1040 cm* möjligen ha förorsakats av estrar. Emellertid, fastän FTlR ofta har använts för studier av dentin föreligger en brist pä publicerade FTlR spektra av kariöst dentin.

Resultaten häri indikerar klart närvaron av estergrupperl både det inre skiktet av tandkaries proven och i endast ett av de yttre tandkariesproven. Sålunda visar resultaten att hexosestergrupper är unika för kariös vävnad och återfinnes därför inte i friskt dentin.

Detta resultat kan möjligen förklaras av det faktum att en sur miljö krävs för att estergrupper skall bildas. Karboxylsyror reagerar med små kolhydrater för att bilda estrar genom en kondensationsreaktion känd som förestring [14]. Vidare, genom att avlägsna vatten, bildas mera estrar [14]. Mineraliserad vävnad innehåller mindre vatten än saliv, vilket är ett villkor för estrar. När de bildas, varierar stabiliteten hos estrarna med pKa värdena från 11 till 25, beroende på de grupper/atomer som flankerar estern [26].

Dessutom, då estrar produceras in vitro vid transförestringsreaktioner är de stabila vid pH 4-8. Vidare degraderas de inte eftersom degraderande enzymet lipas inte existerar i munhålan [27]. Vid en kariesskada är den yttre delen äldre och har ett högre pH [6]. eftersom det är mera utsatt för salivens neutrala pH, jämfört med det inre skiktet vid tandkaries. Ett högre pH i det yttre skiktet vid tandkaries kan därför möjligen förorsaka en minskad stabilitet hos estrar, som indikerats av resultaten i föreliggande studie (Figur 2). 10 15 20 25 30 530 442 Ett annat significant kännetecken hos tandkariesskador är den arrest som antages vara förorsakad av Maillardreaktioner [8, 1191. Dessa fynd har bekräftats genom fluorescensmätningar av Maillardprodukter från kollagennedbrytningar av kariös vävnad

[11] . Vidare modifierar Maillardprodukterna de basiska aminogrupperna I kollagen, vilka omvandlar dentinet till en kollagenas-resistent form [8]. Dessutom, har Armstrong [8] hävdat att hydroxylgrupperna acetyleras i dentin kollagen, viiket modifierar kollagen till en koIlagenas-resistent form.

I en ytterligare test, placerades dentinprov I mjölksyra (0,4 M) utan normala dentalbakterier och med tilsatt D-glukos (0,2 M) (FIG. 5) eller dentinprov i mjölksyra (0,4 M) med normala dentalbakterier och med tillsatt D-glukos (0,2 M) (FIG. 6) och dessa analyserades med FTIR och jämfördes med ett dentinspektrum utan tillsatt D-glukos (referens använd som subtraktionsspektra).

Eftersom mängden karbonylgrupper tycks liten användes Fouir Self-Deconvolution teknik för att förstärka närvaron av karbonylbindningari spektra (FIG. 5 och 6).

Som ett resultat av dekonvolutionen uppträder toppar vid 1725 cm *respektive 1720 cm 4,.

För att undvika falska toppar, som lätt kan uppstå dä dekonvolution användes också spektrumsubtraktionstekniker (FIG. 7 och 8). Ett spektrum av dentin i mjölksyra med ett föreslaget normalt bakterieinnehàll och utan tillsats av D-glukos användes som referens, dvs., ett karbonylfritt spektrum.

Toppens uppträdande beror pà tillsatsen av socker till prov I FIG. 5. Dessutom tycks de normala dentinbakterierna ha mindre effekt pà karbonylesterbildningen. Märk att inga kariesbakterier användes i denna studie.

Topp uppträdande beror på tillsats av socker i FIG. 6. Återigen, tycks de normala dentinbakterierna ha mindre effekt på karbonylesterbildningen. Märk att inga kariesbakterier användes I denna studie. 10 15 20 25 30 35 530 442 FIGURTEXTER Figur 1. FTIR spektra av A) friskt dentin från tand 1, B) friskt dentin från tand 2, C) yttre skikt av tand 1, D) yttre skikt av karies från tand 2, E) inre skikt av karies från tand 1 och F) inre skikt av karies fràn tand 2.

Figur 2. Amid l bandet från kariös vävnad från yttre (kurvor C och D) och inre (kurvor E och F) skikten från skadorna. Knäna vid 1740 cm* har markerats med pilar.

Figur 3. Amid l bandet från friskt dentin från olika tänder; A) friskt dentin frán tand 1, B) friskt dentin från tand 2 och *) härrör från tidigare försök [17].

Figur 4. En inzoomning av regionen mellan 1400 och 1000 cm'“, vilken visar ett mindre skift vid 1040 cm* för kariösa prov. FTlR spectra av A) friskt dentin från tand 1, B) friskt dentin från tand 2, C) yttre skikt av tand 1, D) yttre skikt av karies från tand 2, E) inre skikt av karies från tand 1 och F) inre skikt av karies från tand 2.

Figur 5: Dekonvoiuterade spektra av dentin utan normala dentinbakterier i mjölksyra och också med tillsatt glukos, (1725 cm").

Figur 6: Dekonvoiuterade spektra av dentin med normala dentinbakterier i mjölksyra och också med tillsatt glukos, (1720 cm-f).

Figur 7: Provet l FIG. 5 (dekonvoluterade spectra av dentin utan normala dentinbakterier I mjölksyra + glukos) minus dekonvoluterade spektra av dentin inkluderande normala dentinbakterier i mjölksyra (given som referens).

Figur 8: Provet l FlG. 5 (dekonvoluterade spectra av dentin inkluderande normala dentinbakterieri mjölksyra + glukos) minus dekonvoluterade spektra av dentin inkluderande normala dentinbakterier i mjölksyra (given som referens). 10 15 20 25 30 35 5313 442 REFERENSER 1. 10. 11. 12. 13. 14. 15.

Marsh PD. Microbiologic aspects of dental plaque and dental caries. Dent Clin North Am 1999:43: 599-614.

Geddes DA. Acids produced by human dental plaque metabolism in situ. Caries Res 1975; 9: 98-109.

Borgström MK, Sullivan Å, Granath L, Nilsson G. On the pH-lowering potential of lactobacilli and mutans streptococci from dental plaque related to the prevalence of caries. Comm Dent Oral Epidemiol 1997; 25: 165-169.

Borgström MK, Edwardsson S, Sullivan A, Svensater G. Dental plaque mass and acid production activity of the microbia on teeth. Eur J Oral Sci 2000; 108: 412-417.

Beighton D. The complex oral microflora of high-risk individuals and groups and its role in the caries process. Community Dent Oral Epidemiol 2005; 33: 248-255.

Thylstrup and Fejerskov: Clinical and pathological features of dental caries; in: Textbook of clinical cariology. Second edition. Copenhagen, Munksgaard, 1994, pp 136-154.

Kleter GA, Damen JJM, Buljs MJ, Ten Cate JM. The Maillard reaction in demineralized dentin in vitro. Eur J Oral Sci 1997; 105: 278-28.

Armstrong WG. Modiflcations of the properties and composition of the dentin matrix caused by dental caries. Adv Oral Biol 1964; 42: 309-332.

Kubokl Y, Ohgushi K and Fusayama T. Collagen Biochemistry of the two layers of carlous dentin. J Dent Res 1977; 56: 1233-1237.

Kislinger T, Humeny A, Peich CC, Zhang X, Niwa T, Pischetsrieder M, Becker C-M.

Relative quantification of Ng -(carboxymethyl)lysine, imidazolone A, and the amadori product in glycated lysozyme by MALDl-TOF mass spectrometry. J Agric Food Chem 2003; 51: 51-57.

Kleter GA, Damen JJ, Buijs MJ, Ten Cate JM. Modification of amino acid residues in carious dentin matrix. J Dent Res 1998; 77: 488-495.

Larmas M. A chromatographic and histochemical study of non-specific esterases in human carlous dentine. Arch Oral Biol 1972; 17: 1121-1132.

Dirksen TR. Lipid components of sound and carious dentin. J Dent Res 1963; 42: 128-132.

Solomons UNG. Infrared Spectroscopy; in: Fundamentals of organic chemistry.

Third ed. New York, John Wiley & Sons, 1990, pp 565-573.

Skoog DA, Leary JL. Infrared Absorption Spectroscopy; in: Principles of Instrumental Analysis. Fourth ed. Fort Worth, Saunders College Publishing, 1992, pp 252-295. 20 25 30 16. 17. 18. 19. 20. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 530 442 Eliades G, Palaghias G, Vougiouklakis G. Effect of acidic conditioners on dentin morphology, molecular composition and collagen conformation in situ. Dent Mater 1997; 13: 24-33.

Arvidsson A, Liedberg B, Möller K, Lyvén B, Sellén A, Wennerberg A. Chemical and topographical analyses of dentine surfaces after Carisolv treatment. J Dent 2002; 30: 67-75.

Beltz RE, Herrmann EC, Nordbø H. Pronase Digestion of Carious Dentin. Caries Res 1999; 33: 468-472.

Dung S-Z, Gregory R L, Li Y, Stookey GK. Effect of lactic acid and proteolytic enzymes on the release of organic matrix components from human root dentin.

Caries Res 1995; 291483-489.

Eliades G, Vougiouklakis G, Palaghias G. Effect of dentin primers on the morphology, molecular composition and collagen conformation of acid- demineralized dentin in situ. Dent Mater 1999; 15: 310-317.

. Di Renzo M, Ellis TH, Sacher E, Stangel l. A photoacoustic FTIRS study of the chemical modifications of human dentin surfaces: I. Demineralization. Biomaterials 2001; 22: 787-792.

Magne D, Guicheux J, Weiss P, Pilet P, Daculsi G. Fourier transform infrared microspectroscopic investigation of the organic and mineral constituents of peritubular dentin: a horse study. Calcif Tissue lnt 2002; 71: 179-185.

Sasaki KM, Aoki A, Masuno H, lchinose S, Yamada S, lshikawa l. Compositional analysis of root cementum and dentin after Er: YAG laser irradiation compared with C02 lased and intact roots using Fourier transformed infrared spectroscopy. J Periodontal Res 2002; 37: 50-59.

Verdelis K, Crenshaw MA, Paschalis EP, Doty S, Atti E, Boskey AL. Spectroscopic imaging of mineral maturation in bovine dentin. .J Dent Res 2003; 82: 697-702.

Eugenio S, Sivakumar M, Vilar R, Rego AM. Characterisation of dentin surfaces processed with KrF excimer laser radiation. Biomaterials 2005; 26: 6780-6787.

McMurry J: Organic chemistry. Third ed. Pacific Grove, Brooks/Cole Publishing Company, 1992.

Devulapalle KS, Gomez de Segura A, Ferrer M, Alcalde M, Mooser G, Plou FJ.

Effect of carbohydrate fatty acid esters on Streptococcus sobrinus and glucosyltransferase activity. Carbohydrate Research 2004; 339: 1029-1034.

Claims (4)

10 53Ü 442 10 PATENTKRAV

1. Förfarande för att bestämma närvaron av kariös vävnad l dentin genom att identifiera medelst infraröd spektroskopi varje absorption vid våglängden 1740 cm'1.

2. Förfarande enligt krav 1, vari varje absorption vid våglängden 1040 om* också bestämmas.

3. Förfarande enligt krav 1, vari en hexosester bestämmes.

4. Förfarande enligt krav 3, vari en glukosid ester bestämmas.