SE524242C2 - Användning av en komposition bestående av en sur vattenlösning av ett biologiskt vidhäftande polyfenolskt protein härrörande från en byssus-bildande mussla för att vidhäfta två ytor till varandra eller för att belägga en yta - Google Patents

Description

20 25 30 - Q | . . , , H använda limmema toxiska reaktioner hos användaren, exempelvis p g a deras inne- håll av organiskt lösningsmedel.

Polyfenoliska proteiner, företrädesvis isolerade från musslor, har kända limegenska- per. Exempel på sådana proteiner kan påträffas i exempelvis US-A-4 585 585. Deras breda användning som lim har begränsats av problem som har samband med rening och karakterisering av de vidhäftande proteinema i tillräckliga mängder. För det mesta då de polyfenoliska proteinema används som limmer har man även varit tvungen att öka pH-värdet till neutralt eller lätt basiskt värde för att underlätta oxi- dation och härdning av proteinet. Emellertid är denna härdning långsam och resulte- rar i dålig vidhäflningsstyrka och av detta skäl tillsättes vanligen oxidationsmedel, fyllmedel och tvärbindande medel för att minska härdningstiden och ge ett starkare lim. Vidare visades lirnstyrkan vid användning av en sur lVIAP-lösning (5 mg/ml i 5% ättiksyra) som enda komponent utan pH-ökning vara dålig, i en tidigare studie (EP-A-244 688) jämfört med då ett fyllprotein sattes till kompositionen innan vid- häftning (2,5 myml vardera av MAP och kasein).

Vidhäftande musselprotein (MAP) bildas i en körtel i foten hos byssus-bildande musslor, såsom den vanliga blåmusslan (Mytilus edulis). Molekylvikten hos MAP från Mytílus edulis är ungefär 130 000 Dalton och proteinet har visat sig bestå av 75-80 närbesläktade upprepade peptidsekvenser. Proteinet kärmetecknas vidare av dess många epidermistillväxtfaktorliknande upprepade sekvenser. Den har en ovan- ligt hög andel hydroxiinnehållande aminosyror såsom hydroxiprolin, serin, treonin, tyrosin och den ovanliga aminsoyran 3,4-dihydroxi-L-fenylalanin (DOPA) såväl som lysin. Den kan antingen isoleras från naturliga källor eller framställas biotek- niskt. US-A-5 015 677 såväl som US-A-4 585 585 avslöjar att MAP har mycket kraftiga vidhäftande egenskaper efter oxidation och polymerisation, d v s genom aktiviteten hos enzymet tyrosinas, eller efier behandling med bifuriktionella reagens. 10 15 20 25 30 .. 524 24? ==s"=°-.-' .. -- .... .. ~ n. n, ,,' :I 1 ,::° I . : :- .v . j, :v -. -. ' ' ' ' 'v v. a ~ v n - . . , ,, 3 MAP är tidigare känt for att vara användbart i vidhäftande kompositioner för exem- pelvis oftalmiska ändamål. Robin et al., Refractive and Corneal Surgery, Vol. 5, sid. 302-306, och Robin et al., Arch Ophthalmol., Vol. 106, sid. 973-977 avslöjar båda MAP-baserade limmer omfattande ett enzym som polymeriseringssubstans".

US-A-5 015 677 beskriver också ett MAP-baserat lim innehållande ett tvärbind- ningsmedel och eventuellt ett fylhnedel och ett ytalctivt medel. Föredragna tvärbind- ningsmedel enligt US-A-5 015 677 är enzymatiska oxidationsmedel, såsom katekol- oxidas och tyrosinas, men i bland kan även kemiska tvärbindningsmedel, såsom glutaraldehyd och forrnaldehyd användas. Exempel på fyllrnedel är proteiner, såsom kasein, kollagen och alburnin, och polymerer innehållande kolhydratgrupper, såsom kitosan och hyaluronan. US-A-5 030 230 hänför sig även till ett biolim innehållande MAP, svamptyrosinas (tvärbindare), SDS (natriumdodecylsulfat, ett ytaktivt medel) och kollagen (fyllmedel). Biolimmet används för att vidhäfta en homhinneprotes till ögonväggen.

EP-A-343 424 beskriver användning av ett vidhäftande musselprotein for att lirnma en vävnad, cell eller ett annat nukleinsyrainnehållande prov till ett substrat under nukleinsyrehybridiseringsförhållanden, då det vidhäftande musselproteinet, trots de svåra förhållanden som uppstår vid hybridiseringen, gav vidhäfining. US-A- 5 817 470 beskriver användning av ett vidhäftande musselprotein för att immobilise- ra en ligand till en fast bärare i samband med enzymlänkad irnmunanalys. Vidhäf- tande musselprotein har även använts i kosmetiska kompositioner för att förstärka vidhäftning till naglar och hud (WO 88/05654).

Ett viktigare problem som har samband med kända MAP-baserade biolimkomposi- tioner trots de överlägsna egenskapema hos MAP i sig själv, är att en del bestånds- delar, i synnerhet vanligen använda tvärbindningsmedel, kan skada och/eller irritera levande vävnade och kan förorsaka toxiska och irnmunologiska reaktioner. Kemiska tvärbindningsmedel, såsom glutaraldehyd och formaldehyd, är allmänt toxiska for människor och djur, och det är mycket olämpligt att tillsätta sådana medel till en 10 15 20 25 524 242 §__'=s°æ=..= fr: .= -- uno I. 4 känslig vävnad, såsom ögat. Enzymer, såsom katekoloxidas och tyrosinas, är protei- ner, och proteiner anses allmänt som varande potentiella allergener, i synnerhet i de fall de härrör fi-ån en annan art än patienten. P g a sina oxiderande och hydrolyse- rande egenskaper kan de också skada känsliga vävnader.

Således finns det fortfarande ett behov av vidhäfiande kompositioner, både för me- dicinska och andra tillämpningar, som ger kraftig vidhäftning med små mängder lim, som är enkla att använda och som inte förorsakar toxiska och allergiska reak- tioner.

Sammandrag av uppfinningen Denna uppfinning hänför sig till användning av en sur vattenlösning av ett biovid- häflande polyfenoliskt protein, härrörande från en byssus-bildande mussla, för att förbinda två ytor med varandra eller för att täcka en yta, vilken sura lösning har ett pH på 4 eller mindre och i vilken koncentrationen av biologiskt vidhäftande protein ligger på mellan 10-50 mg/ml. Användningen av denna sura lösning av ett biolo- giskt vidhäfiande protein som enda komponent undviker tillsats av ytterligare kom- ponenter för att framkalla vidhäfining och följaktligen är vidhäftningsprocessen för- enklad och risken för framkallande av allergi och/eller irritation beroende på ytterli- gare tillsatta komponenter har minskats. Kompositionen är av detta skäl väl lämpad för medicinska tillämpningar. Vidare är den erhållna lirnstyrkan hög, även med små mängder lim, och kompositionen används företrädesvis även då endast små mängder lim kan appliceras till ytor som skall förenas eller täckas. Kompositionen enligt denna uppfinning lämpar sig även för användning i våta miljöer. 10 15 20 25 30 (Il FJ -F>~ PO .ß FO u u.

I | . :vn u.

Definitioner De här använda terrnema "polyfenoliskt protein", "vidhäfiande musselprotein" eller "MAP" hänför sig till ett biologiskt vidhäftande protein härrörande fi-ån byssus- bildande musslor eller som har framställts med rekombinant genteknik. Exempel på sådana musslor är musslor av släktena Mytilus, Geukensía, Aulacomya, Phragmato- poma, Dreissenía och Brachiodontes. Lämpliga proteiner har avslöjats i ett stort antal publikationer, exempelvis US-A-5 015 677, US-A-5 242 808, US-A- 4 585 585, US-A-5 202 236, US-A-5 149 657, US-A-S 410 023, WO 97/34016, och US-A-5 574 134, Vreeland et al., J. Physiol., 34: 1-8, och Yu et al., Macromolecu- les, 31: 4739-4745. De omfattar omkring 30-300 aminosyror och består väsentligen av på varandra förbundna peptidenheter omfattande 3-15 aminosyrarester, eventuellt åskilda av en förbindelsesekvens på 0-10 aminosyror. Ett karakteristiskt känneteck- en för sådana proteiner är en jämförelsevis hög mängd positivt laddade lysinrester, och i synnerhet den ovanliga aminosyran DOPA (L-3,4-dihydroxifenylalanin). Ett polyfenoliskt protein som lämpar sig för användning i denna uppfinning har en ami- nosyrasekvens i vilken åtminstone 3% och företrädesvis 6-30% av arninosyrarester- na är DOPA. Några få exempel på typiska peptidenheter ges nedan. Emellertid är det viktigt att notera att aminosyrasekvenserna hos dessa proteiner kan variera och att omfånget för denna uppfinning inte är begränsat till de exemplifierade underse- kvenserna nedan, då fackmannen inser att biologiska vidhäftande polyfenoliska pro- etiner från olika källor, inklusive rekombinant producerade, kan betraktas som ekvi- valenta: a) Val-Gly-Gly-DOPA-Gly-DOPA-GLY-ALA-LYS b) Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-diHyp-Hyp-Thr-DOPA-Lys c) Thr-Gly-DOPA-Gly-Pro-Gly-DOPA-Lys d) Ala-Gly-DOPA-Gly-Gly-Leu-Lys e) Gly-Pro-DOPA-Val-Pro-Asp-Gly-Pro-Tyr-Asp-Lys f) Gly-Lys-Pro-Ser-Pro-DOPA-Asp-Pro-Gly-DOPA-Lys v ~ ; - u. 10 15 20 25 30 g) Gly-DOPA-Lys h) Tlir-Gly-DOPA-Ser-Ala-Gly-DOPA-Lys i) Gln-Thr-Gly-DOPA-Val-Pro-Gly-DOPA-Lys j) Gln-Thr-Gly-DOPA-Asp-Pro-Gly-Tyr-Lys k) Gln-Thr-Gly-DOPA-Leu-Pro-Gly-DOPA-Lys Termen "yta" skall tolkas brett och kan omfatta i princip varje yta. Valet av yta är inte kritiskt för denna uppfinning. Exempel på ytor för vilka uppfinningen är särskilt lämpad innefattar icke-biologiska ytor såsom glas, plast, keramik och metallytor, etc, och biologiska ytor omfattande trä och olika vävnader såsom hud, ben, tänder, ögat, brosk, etc.

Med sur vattenlösning avses en vattenlösning omfattande en organisk eller oorga- nisk syra.

Detaljerad beskrivning av uppfinninggn Denna uppfinning beskriver användning av en polyfenolisk biologisk vidhäftande komposition för att förbinda två ytor med varandra eller för att belägga en yta. De kompositioner som tillhandahålles med uppfinningen kan i princip användas för att vidhäfta varje yta till varandra eller för att belägga varje yta. Emellertid är komposi- tionema enligt denna uppfinning särskilt användbara då vidhäflande eller beläggan- de kompositioner behövs som är icke-toxiska, icke-irriterande eller icke-allergena, eftersom den enda obligatoriska komponenten är det biologiska proteinet i sig självt och detta medför en låg risk för att framkalla sådana reaktioner. Användningen av en biologiskt vidhäflande komposition som beskrivs i denna uppfinning gör det möjligt för mycket små mängder lim att användas samtidigt som man fortfarande uppnår en kraftig vidhäftning. Av detta skäl är användning av kompositionen enligt denna uppfinning särskilt användbar då endast små mängder limmer kan användas.

Ytterligare fördelar med användning av kompositionen som anges i samband med 10 15 20 25 'm0 . f. -f,_ II! :'.: -2 - - - - -- su n. g, I - , I ß a I n . ._ 'IU ~ , sas. . 7 denna uppfrning ar dess vatte-_löslig_-et, möjligheten att undvika organiska lös- ningsmedel som normalt används i limmer eller beläggningskompositioner, och att de är biologiskt framställda och oskadliga för miljön.

Den enda obligatoriska komponenten enligt denna uppfinning är det polyfenoliska proteinet som i sig självt tillhandahålles i en sur lösning, exempelvis samma sura lösning som används för lagring av proteinet. Tidigare då polyfenoliska proteiner har använts har det antagits vara nödvändigt att tillsätta ytterligare komponenter, så- som fyllmedel och oxidationsmedel och/eller öka pH-värdet till neutralt eller lätt ba- siskt värde, för att framkalla tillräckligt kraftig lirnstyrka. Uppfmnaren bakom denna uppfmning har visat att en mycket krafiig vidhäftning, jämförbar med den limstyrka som erhålles vid användning av normalt använda MAP-kompositioner, kan erhållas genom att direkt utnyttja en koncentrerad sur MAP-lösning. Då inga ytterligare komponenter måste sättas till MAP-lösningen före dess användning har vidhäft- ningsprocessen således förenklats jämfört med tidigare användningar av biologiskt vidhäftande proteiner. Beroende på den enkla kompositionen av limmet har vidare riskerna för irritation och/eller allergi som varit vanliga tillsammans med tidigare användningar av biologiskt vidhäfiande polyfenoliska proteiner undvikits.

Denna uppfinning appliceras i den sura lösningen av lVIAP-proteinet, som enda komponent, till åtminstone en av ytorna, vilka skall vidhäftas till varandra, före ytorna förenas, eller tillsätts till den ytan som skall beläggas. Kompositionen enligt uppfinningen visade sig härda både i torra och våta miljöer. Såsom visas i de vid- hängande exemplen kan härdningstiden vara kort som 1 minut.

Koncentrationen hos MAP-lösningen enligt denna uppfinning är 10-50 mg/ml. Ännu hellre är koncentrationen av MAP-lösningen 20-50 mg/ml. Det är viktigt att koncentrationen av MAP-lösningen är åtminstone 10 mg eftersom tidigare experi- ment har visat en dålig limstyrka genom att utnyttja en 5 mg/ml MAP-lösning i 5% 10 15 20 25 524 ~ - - . . = , .- 8 ättiksyra (EP-A-244 688), om inte några ytterligare komponenter tillsätts för att framkalla härdning.

MAP-proteinet enligt denna uppfinning tillhandahålles i en sur vattenlösning med ett pH på 4 eller lägre. Emellertid visade sig ett pH på 3 eller mindre också oväntat ge högre limstyrkor. Ännu mera överraskande visade det sig att ett pH på 2,5 eller mindre gav högre limstyrkor. Syror som lämpar sig i samband med denna uppfin- ning innefattar både oorganiska syror, såsom saltsyra och fosforsyra, och organiska syror, såsom citronsyra, askorbinsyra, och ättiksyra.

Ett föredraget ändamål med denna uppfinning är att tillhandahålla en vidhäftande eller beläggande komposition för medicinska tillämpningar, exempelvis för att vid- häfta biologiska och icke-biologiska komponenter till biologiska strukturer, ett än- damål för vilket MAP-proteinet i sig självt är väl lämpat, då det inte är toxiskt och då det är biologiskt nedbrytbart. Emellertid kan de komponenter som vanligtvis sätt- es till MAP-kompositioner för att erhålla tvärbindning och oxidation (kemiska och/eller enzymatiska tvärbindare och oxidationsmedel) av kompositionen kan leda till irritation och allergiska reaktioner och sådana MAP-kompositioner är således inte optimala med avseende på medicinska tillämpningar. Beroende på avsaknaden av sådana komponenter i kompositionen enligt denna uppfinning, är kompositioner- na enligt denna uppfinning särskilt lämpade för att förbinda biologiska ytor till var- andra eller till andra icke-biologiska material. Vidare, då endast små mängder av den vidhäftande kompositionen enligt denna uppfinning erfordras, samtidigt som höga limstyrkor fortfarande erhålles, är kompositionen enligt denna uppfinning sär- skilt användbar för medicinska tillämpningar där ofta endast små mängder lim kan appliceras till de ytor som skall vidhäftas till varandra eller de ytor som skall beläg- gas. Av ovan nämnda skäl är användning av kompositionen enligt denna uppfinning särskilt lämpad för vidhäftning av hornhinnor, senor, vävnader under kirurgiska operationer etc. Av ovan nänmda anledningar är kompositionema enligt denna upp- /l - . .. 2--2 - - - - -- . .. i | In s g . ° fl v ,, _ . s v v v ae no s... ' I n , 0 f e , 00 a . , ~ a , _ a ' ' " fl »o 1' I n a ,, _. 10 15 20 25 524 c a | - . . , ,, 9 finning även särskilt användbara i samband med beläggning av material som kan användas i medicinska tillämpningar eller biologiska vävnader.

Beroende på den mycket höga lirnstyrka som tillhandahålles med mycket små mängder av kompositionema enligt denna uppfinning är ett föredraget tillämpnings- område för vilket kompositionema är särskilt användbara vidhäftning till icke- biologiska ytor såsom glas, plast, keramiska material och metalliska ytor. Detta är särskilt användbart inom elektroniska mikro- och nano-tekniker, optik, etc, för vid- häfining eller beläggning av komponenter i, exempelvis biosensorer, mikrochips, I solceller, mobiltelefoner, etc, eftersom endast mycket små mängder lirn kan använ- das i dessa tillämpningar. Kompositionema enligt denna uppfmning är även lämpa- de för beläggning av icke-biologiska ytor.

De vidhäftande kompositionema enligt denna uppfinning är även användbara för vidhäftning av celler, enzymer, antikroppar eller andra biologiska prover till ytor.

Exempel 1 För att bestämma lirnstyrkan vid användning av kompositionema enligt denna upp- fmning, bestämdes limstyrkan mellan icke-biologiskt material (glasplattor, 75 x 25 x 2 mm) och biologisk vävnad (muskler från nötkreatur och gris). Den vattenbaserade sura MAP-lösningen med varierande koncentrationer (se Tabell 1) i 0,01 M citron- syra (pH ca 2,3) applicerades till en av ytorna som skulle vidhäftas till varandra före i förening av de två ytorna och fixering med en klämma. Proverna fick därefter härda under olika tidsperioder och under olika förhållanden innan limstyrkan bestämdes genom att använda en digital fjädervåg (Milo) genom att förbinda varje glasskiva eller den biologiska vävnaden med vågen och därefter sträcka tills glasplattan och den biologiska vävnaden frigjordes från varandra. Vidhäftningsytoma var i de flesta fall 0,2-0,4 cmz, med en variation från 0,1 till 0,8 cmz. Såsom kan konstateras ur re- 1 - - n. . . , s ., o . . » n (_ T _ Ls: 11 ,' : ; .. ,; s.. _". "q n .. , n . . - - . .. . g, -- . ° - c 1 , , .- -.o 10 15 20 524 2 - °.: : : ;- ' ' ' ' - ° ' ' ' H '-- o r - | . . , ,, 1 0 sultaten i Tabell 1 försvagas inte limstyrkan då proverna tillåts -äga under vå-a -Jr- hållanden, även då ingen tvärbindare utnyttjas.

Prov MAP- MAP Syra Härdningsförhållanden Limstyrka (g) -koncentration mängd (pg) (koncentration) (mg/ml) 1 23 69 Citronsyra (0,01 M) 24 h i vatten vid 4°C 40 2 25 75 Citronsyra (0,01 M) 24 h i vatten vid 4°C 45 3 20 60 Citronsyra (0,01 M) 1 h i vatten vid 35°C 60 4 20 60 Citronsyra (0,01 M) l hi vatten vid 35°C 40 5 24 72 Citronsyra (0,01 M) 1 min under torra förhållanden 40 Tabell 1. Limstyrka som uppnåtts mellan biologiska och icke-biologiska ytor genom att använda MAP-kompositionen enligt denna uppfinning Exempel 2 För att bestämma limstyrkan genom att utnyttja kompositionerna enligt denna upp- finning bestämdes limstyrkan mellan biologisk vävnad (muskler från nötkreatur och grisar). Den sura MAP-lösningen (se Tabell 2) i 0,01 M citronsyra (pH ca 2,3) ap- plicerades till en av ytoma som skulle förbindas innan de båda ytoma förenades och det hela fixerades med en klämma. Proverna tilläts därefter härda under vatten i 35°C innan limstyrkan bestämdes genom att använda en digital fjädervåg (Milo) ge- nom att förbinda en av de två delarna av den biologiska vävnaden till vågen och därefier sträcka tills de biologiska vävnaderna frigjordes från varandra. Vidhäft- ningsytoma var i de flesta fall 0,2-0,4 cmz, med en variation från 0,1 till 0,8 cmz.

Prov MAP- MAP Syra Härdningsfórhållanden Limstyrka (g) -koncentration mängd (pg) (koncentration) (mg/ml) l 20 50 Citronsyra (0,01 M) 1 h i vatten vid 35°C 100 2 18 45 Citronsyra (0,01 M) 1 h i vatten vid 35°C 120 Tabell 2. Limstyrka som uppnåtts mellan biologiska ytor genom att använda MAP- kompositionen enligt denna uppfinning 10 15 524 242 :nu . 11 Exempel 3 För att bestämma limstyrkan som uppnåtts mellan två icke-biologiska ytor, törbands två glasplattor (ca 75 x 25 x 1,5 mm) med varandra genom att placera en liten drop- pe sur MAP-lösning på en av glasplattorna, placera den andra glasplattan ovanpå den första och fixera de två glasplattoma med varandra genom att använda en klämma. Koncentrationema och mängderna av de utnyttjade MAP-lösningarna an- ges i Tabell 3 nedan, såväl som syran, och dess koncentration, som används fór varje specifikt experiment. pH-värdena för de olika syroma som utnyttjades var så- som fóljer: 0,05 M citronsyra: pH ca 1,8; 0,01 M citronsyra: pH ca 2,3; 0,2 M ätt- iksyra: pH ca 2,3; 0,014 M askorbinsyra: pH 2,9; 0,05 M HCI: pH ca 1,0; och 0,05 M H3PO4: pH ca 1,4. Provema fick stå under 24 tirmnar vid rumstemperatur innan limstyrkan bestämdes. Limstyrkan bestämdes genom mätning av skjuvmots- tånd (se Tabell 3) genom att utnyttja konventionella tekniker. Den limmade ytan va- rierade mellan 0,3 och 1 cmz. Som en jämförelse bestämdes limstyrkan som erhålles då man använder normalt epoxilim. Användning av 10 mg av detta lirn på glasplatt- oma på ett liknande sätt som beskrivits ovan resulterade i en lirnstyrka på 380 N.

Prov MAP- MAP Syra Limstyrka -koncentration (mg/ml) mängd (pg) (koncentration) (N) 1 24 48 i Citronsyra (0,01 M) 226 2 42 42 Citronsyra (0,05 M) 290 3 42 84 Citronsyra (0,05 M) 430 4 39 117 Citronsyra (0,05 M) 401 5 39 117 Citronsyra (0,05 M) 437 6 42 42 Citronsyra (0,05 M) 350 7 27 54 Ättiksyra (0,2 M) > 240 8 28 56 Askorbinsyra (0,014 NI) 353 9 28 56 Askorbinsyra (0,014 M) 328 i ' 0 nu n l.)- -. a a , ~ u » ~ . f. 5 f 2 12 : v , :z f : : q _: ,'°. _00. u". 'n z.. ., . . n' . , , . . 'o n g z a' 0 a o a z 1 :O o , n e "' 'H I w»- f 12 (Forts.) Prov MAP- MAP Syra Limstyrka -koncentration (mg/ml) mängd (ng) (koncentration) (N) 10 23 46 HCl (0,05 M) > 270 11 25 50 H3PO4 (0,05 M) 237 Tabell 3. Limstyrka som uppnåtts mellan icke-biologiska ytor genom att använda MAP-kompositionen enligt denna uppfinning

Claims (9)

10 15 20 25 30 524 242 . .u ,, 13 Patentkrav

1. l. Användning av en komposition som enda komponent för att vidhäfta två ytor till varandra eller för att belägga en yta, där nämnda komposition består av en sur vat- tenlösning av ett biologiskt vidhäfiande polyfenoliskt protein härrörande från en byssus-bildande mussla, vilket protein omfattar 30-3 00 aminosyror och som väsent- ligen består av efter varandra länkade upprepade peptidsekvenser omfattande 3-15 arninosyrarester, där åtminstone 3% och företrädesvis 6-30% av aminosyrarestema i nämnda biologiskt vidhäftande polyfenoliska protein är DOPA, där pH hos nämnda sura lösning är 4 eller mindre, och där koncentrationen av nämnda biologiskt vid- häftande polyfenoliska protein är 10-50 g/ml.

2. Användning enligt krav l, där pH hos den sura lösningen är 3 eller mindre.

3. Användning enligt krav 1, där den sura lösningens pH är 2,5 eller mindre.

4. Användning av en komposition enligt krav 1-3, där den sura lösningen innehåller en organisk syra.

5. Användning av en komposition enligt krav l-3, där den sura lösningen innehåller en oorganisk syra.

6. Användning av en komposition enligt krav 1-4, där den sura lösningen innehåller en syra vald ur gruppen bestående av citronsyra, ättiksyra och askorbinsyra.

7. Användning av en komposition enligt krav l-6, där koncentrationen hos det bio- logiskt vidhäfiande polyfenoliska proteinet ligger inom intervallet 20-50 mg/ml.

8. Användning av en komposition enligt krav 1-7, där åtminstone en av ytoma som skall förbindas eller den yta som skall beläggas är en biologisk yta. 4 ' ' ' * - f | f; 14

9. Användning av en komposition enligt krav 1-7, där åtminstone en av ytorna som skall vidhäfias eller den yta som skall beläggas är en icke-biologisk yta.