SE524242C2

SE524242C2 - Use of composition comprising acidic aqueous solution of polyphenolic protein derived from byssus-forming mussel, as adhesive for attaching two surfaces and coating surface

Info

Publication number: SE524242C2
Application number: SE0202065A
Authority: SE
Inventors: Magnus Qvist
Original assignee: Magnus Qvist
Priority date: 2002-07-02
Filing date: 2002-07-02
Publication date: 2004-07-13
Also published as: SE0202065D0; SE0202065L

Abstract

Coating a surface or attaching two surfaces to each other involves use of a composition comprising an acidic aqueous solution of a bioadhesive polyphenolic protein derived from a byssus-forming mussel. Coating a surface or attaching two surfaces to each other involves use of a composition comprising an acidic aqueous solution of a bioadhesive polyphenolic protein derived from a byssus-forming mussel. The protein contains 30-300 amino acids and is formed of tandemly linked peptide repeats containing 3-15 amino acid residues. At least 3 (preferably 6-30) % of the amino acid residues of the protein are L-3,4-dihydroxyphenylalanine. The pH of the acidic solution is at most 4 (preferably at most 3, especially at most 2.5).

Description

20 25 30 - Q | . . , , H använda limmema toxiska reaktioner hos användaren, exempelvis p g a deras inne- håll av organiskt lösningsmedel. 20 25 30 - Q | . . The adhesives use toxic reactions in the user, for example due to their content of organic solvent.

Polyfenoliska proteiner, företrädesvis isolerade från musslor, har kända limegenska- per. Exempel på sådana proteiner kan påträffas i exempelvis US-A-4 585 585. Deras breda användning som lim har begränsats av problem som har samband med rening och karakterisering av de vidhäftande proteinema i tillräckliga mängder. För det mesta då de polyfenoliska proteinema används som limmer har man även varit tvungen att öka pH-värdet till neutralt eller lätt basiskt värde för att underlätta oxi- dation och härdning av proteinet. Emellertid är denna härdning långsam och resulte- rar i dålig vidhäﬂningsstyrka och av detta skäl tillsättes vanligen oxidationsmedel, fyllmedel och tvärbindande medel för att minska härdningstiden och ge ett starkare lim. Vidare visades lirnstyrkan vid användning av en sur lVIAP-lösning (5 mg/ml i 5% ättiksyra) som enda komponent utan pH-ökning vara dålig, i en tidigare studie (EP-A-244 688) jämfört med då ett fyllprotein sattes till kompositionen innan vid- häftning (2,5 myml vardera av MAP och kasein).Polyphenolic proteins, preferably isolated from mussels, have known adhesive properties. Examples of such proteins can be found in, for example, US-A-4,585,585. Their wide use as adhesives has been limited by problems associated with purification and characterization of the adherent proteins in sufficient amounts. For the most part, when the polyphenolic proteins are used as adhesives, it has also been necessary to increase the pH value to a neutral or slightly basic value in order to facilitate oxidation and hardening of the protein. However, this curing is slow and results in poor adhesion strength and for this reason oxidizing agents, fillers and crosslinking agents are usually added to reduce the curing time and give a stronger adhesive. Furthermore, in a previous study (EP-A-244 688) compared to when a filler protein was added, the liner strength using an acidic IVAP solution (5 mg / ml in 5% acetic acid) as the only component without pH increase was shown to be poor. the composition before adhesion (2.5 ml each of MAP and casein).

Vidhäftande musselprotein (MAP) bildas i en körtel i foten hos byssus-bildande musslor, såsom den vanliga blåmusslan (Mytilus edulis). Molekylvikten hos MAP från Mytílus edulis är ungefär 130 000 Dalton och proteinet har visat sig bestå av 75-80 närbesläktade upprepade peptidsekvenser. Proteinet kärmetecknas vidare av dess många epidermistillväxtfaktorliknande upprepade sekvenser. Den har en ovan- ligt hög andel hydroxiinnehållande aminosyror såsom hydroxiprolin, serin, treonin, tyrosin och den ovanliga aminsoyran 3,4-dihydroxi-L-fenylalanin (DOPA) såväl som lysin. Den kan antingen isoleras från naturliga källor eller framställas biotek- niskt. US-A-5 015 677 såväl som US-A-4 585 585 avslöjar att MAP har mycket kraftiga vidhäftande egenskaper efter oxidation och polymerisation, d v s genom aktiviteten hos enzymet tyrosinas, eller eﬁer behandling med bifuriktionella reagens. 10 15 20 25 30 .. 524 24? ==s"=°-.-' .. -- .... .. ~ n. n, ,,' :I 1 ,::° I . : :- .v . j, :v -. -. ' ' ' ' 'v v. a ~ v n - . . , ,, 3 MAP är tidigare känt for att vara användbart i vidhäftande kompositioner för exem- pelvis oftalmiska ändamål. Robin et al., Refractive and Corneal Surgery, Vol. 5, sid. 302-306, och Robin et al., Arch Ophthalmol., Vol. 106, sid. 973-977 avslöjar båda MAP-baserade limmer omfattande ett enzym som polymeriseringssubstans".Adherent mussel protein (MAP) is formed in a gland in the foot of gunshot-forming mussels, such as the common blue mussel (Mytilus edulis). The molecular weight of MAP from Mytílus edulis is approximately 130,000 Daltons and the protein has been shown to consist of 75-80 closely related repeated peptide sequences. The protein is further characterized by its many epidermal growth factor-like repeats. It has an unusually high proportion of hydroxy-containing amino acids such as hydroxyproline, serine, threonine, tyrosine and the unusual amino acid 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine (DOPA) as well as lysine. It can either be isolated from natural sources or produced biotechnically. US-A-5,015,677 as well as US-A-4,585,585 disclose that MAP has very strong adhesive properties after oxidation and polymerization, i.e. by the activity of the enzyme tyrosinase, or a treatment with bifurcational reagents. 10 15 20 25 30 .. 524 24? == s "= ° -.- '.. - .... .. ~ n. n, ,,': I 1, :: ° I.:: - .v. j,: v -. - . '' '' 'v v. a ~ vn -.., ,, 3 MAP is previously known to be useful in adhesive compositions for, for example, ophthalmic purposes. Robin et al., Refractive and Corneal Surgery, Vol. 5 , pp. 302-306, and Robin et al., Arch Ophthalmol., Vol. 106, pp. 973-977 both disclose MAP-based adhesives comprising an enzyme as a polymerizing substance ".

US-A-5 015 677 beskriver också ett MAP-baserat lim innehållande ett tvärbind- ningsmedel och eventuellt ett fylhnedel och ett ytalctivt medel. Föredragna tvärbind- ningsmedel enligt US-A-5 015 677 är enzymatiska oxidationsmedel, såsom katekol- oxidas och tyrosinas, men i bland kan även kemiska tvärbindningsmedel, såsom glutaraldehyd och forrnaldehyd användas. Exempel på fyllrnedel är proteiner, såsom kasein, kollagen och alburnin, och polymerer innehållande kolhydratgrupper, såsom kitosan och hyaluronan. US-A-5 030 230 hänför sig även till ett biolim innehållande MAP, svamptyrosinas (tvärbindare), SDS (natriumdodecylsulfat, ett ytaktivt medel) och kollagen (fyllmedel). Biolimmet används för att vidhäfta en homhinneprotes till ögonväggen.US-A-5,015,677 also discloses a MAP-based adhesive containing a crosslinking agent and optionally a filler and a surfactant. Preferred crosslinking agents according to US-A-5,015,677 are enzymatic oxidizing agents, such as catechol oxidase and tyrosinase, but sometimes chemical crosslinking agents such as glutaraldehyde and formaldehyde can also be used. Examples of fillers are proteins such as casein, collagen and alburnin, and polymers containing carbohydrate moieties such as chitosan and hyaluronan. US-A-5 030 230 also relates to a bioadhesive containing MAP, fungal tyrosinase (crosslinker), SDS (sodium dodecyl sulphate, a surfactant) and collagen (filler). The bio-adhesive is used to attach a corneal prosthesis to the eye wall.

EP-A-343 424 beskriver användning av ett vidhäftande musselprotein for att lirnma en vävnad, cell eller ett annat nukleinsyrainnehållande prov till ett substrat under nukleinsyrehybridiseringsförhållanden, då det vidhäftande musselproteinet, trots de svåra förhållanden som uppstår vid hybridiseringen, gav vidhäﬁning. US-A- 5 817 470 beskriver användning av ett vidhäftande musselprotein för att immobilise- ra en ligand till en fast bärare i samband med enzymlänkad irnmunanalys. Vidhäf- tande musselprotein har även använts i kosmetiska kompositioner för att förstärka vidhäftning till naglar och hud (WO 88/05654).EP-A-343 424 discloses the use of an adherent mussel protein to adhere a tissue, cell or other nucleic acid-containing sample to a substrate under nucleic acid hybridization conditions, when the adherent mussel protein, despite the difficult conditions arising from the hybridization, gave adhesion. US-A-5,817,470 discloses the use of an adherent mussel protein to immobilize a ligand to a solid support in connection with enzyme-linked immunoassay. Adhesive mussel protein has also been used in cosmetic compositions to strengthen adhesion to nails and skin (WO 88/05654).

Ett viktigare problem som har samband med kända MAP-baserade biolimkomposi- tioner trots de överlägsna egenskapema hos MAP i sig själv, är att en del bestånds- delar, i synnerhet vanligen använda tvärbindningsmedel, kan skada och/eller irritera levande vävnade och kan förorsaka toxiska och irnmunologiska reaktioner. Kemiska tvärbindningsmedel, såsom glutaraldehyd och formaldehyd, är allmänt toxiska for människor och djur, och det är mycket olämpligt att tillsätta sådana medel till en 10 15 20 25 524 242 §__'=s°æ=..= fr: .= -- uno I. 4 känslig vävnad, såsom ögat. Enzymer, såsom katekoloxidas och tyrosinas, är protei- ner, och proteiner anses allmänt som varande potentiella allergener, i synnerhet i de fall de härrör ﬁ-ån en annan art än patienten. P g a sina oxiderande och hydrolyse- rande egenskaper kan de också skada känsliga vävnader.A major problem associated with known MAP-based bioadhesive compositions, despite the superior properties of MAP itself, is that some ingredients, particularly commonly used crosslinking agents, can damage and / or irritate living tissue and can cause toxic and immunological reactions. Chemical crosslinking agents, such as glutaraldehyde and formaldehyde, are generally toxic to humans and animals, and it is very inappropriate to add such agents to a compound. uno I. 4 sensitive tissue, such as the eye. Enzymes, such as catechol oxidase and tyrosinase, are proteins, and proteins are generally considered to be potential allergens, especially in cases where they are derived from a species other than the patient. Due to their oxidizing and hydrolyzing properties, they can also damage sensitive tissues.

Således finns det fortfarande ett behov av vidhäﬁande kompositioner, både för me- dicinska och andra tillämpningar, som ger kraftig vidhäftning med små mängder lim, som är enkla att använda och som inte förorsakar toxiska och allergiska reak- tioner.Thus, there is still a need for adhesive compositions, both for medical and other applications, which provide strong adhesion with small amounts of glue, which are easy to use and which do not cause toxic and allergic reactions.

Sammandrag av uppfinningen Denna uppfinning hänför sig till användning av en sur vattenlösning av ett biovid- häﬂande polyfenoliskt protein, härrörande från en byssus-bildande mussla, för att förbinda två ytor med varandra eller för att täcka en yta, vilken sura lösning har ett pH på 4 eller mindre och i vilken koncentrationen av biologiskt vidhäftande protein ligger på mellan 10-50 mg/ml. Användningen av denna sura lösning av ett biolo- giskt vidhäﬁande protein som enda komponent undviker tillsats av ytterligare kom- ponenter för att framkalla vidhäﬁning och följaktligen är vidhäftningsprocessen för- enklad och risken för framkallande av allergi och/eller irritation beroende på ytterli- gare tillsatta komponenter har minskats. Kompositionen är av detta skäl väl lämpad för medicinska tillämpningar. Vidare är den erhållna lirnstyrkan hög, även med små mängder lim, och kompositionen används företrädesvis även då endast små mängder lim kan appliceras till ytor som skall förenas eller täckas. Kompositionen enligt denna uppfinning lämpar sig även för användning i våta miljöer. 10 15 20 25 30 (Il FJ -F>~ PO .ß FO u u.Summary of the Invention This invention relates to the use of an acidic aqueous solution of a bioadhesive polyphenolic protein, derived from a gunpowder-forming mussel, to connect two surfaces to each other or to cover a surface, which acidic solution has a pH of 4 or less and in which the concentration of biologically adherent protein is between 10-50 mg / ml. The use of this acidic solution of a biologically adherent protein as a single component avoids the addition of additional components to induce adhesion and consequently the adhesion process is simplified and the risk of induction of allergy and / or irritation due to additional added components has been reduced. For this reason, the composition is well suited for medical applications. Furthermore, the obtained strength is high, even with small amounts of glue, and the composition is preferably used even when only small amounts of glue can be applied to surfaces to be joined or covered. The composition of this invention is also suitable for use in wet environments. 10 15 20 25 30 (Il FJ -F> ~ PO .ß FO u u.

I | . :vn u.I | . : vn u.

Definitioner De här använda terrnema "polyfenoliskt protein", "vidhäﬁande musselprotein" eller "MAP" hänför sig till ett biologiskt vidhäftande protein härrörande ﬁ-ån byssus- bildande musslor eller som har framställts med rekombinant genteknik. Exempel på sådana musslor är musslor av släktena Mytilus, Geukensía, Aulacomya, Phragmato- poma, Dreissenía och Brachiodontes. Lämpliga proteiner har avslöjats i ett stort antal publikationer, exempelvis US-A-5 015 677, US-A-5 242 808, US-A- 4 585 585, US-A-5 202 236, US-A-5 149 657, US-A-S 410 023, WO 97/34016, och US-A-5 574 134, Vreeland et al., J. Physiol., 34: 1-8, och Yu et al., Macromolecu- les, 31: 4739-4745. De omfattar omkring 30-300 aminosyror och består väsentligen av på varandra förbundna peptidenheter omfattande 3-15 aminosyrarester, eventuellt åskilda av en förbindelsesekvens på 0-10 aminosyror. Ett karakteristiskt känneteck- en för sådana proteiner är en jämförelsevis hög mängd positivt laddade lysinrester, och i synnerhet den ovanliga aminosyran DOPA (L-3,4-dihydroxifenylalanin). Ett polyfenoliskt protein som lämpar sig för användning i denna uppﬁnning har en ami- nosyrasekvens i vilken åtminstone 3% och företrädesvis 6-30% av arninosyrarester- na är DOPA. Några få exempel på typiska peptidenheter ges nedan. Emellertid är det viktigt att notera att aminosyrasekvenserna hos dessa proteiner kan variera och att omfånget för denna uppﬁnning inte är begränsat till de exempliﬁerade underse- kvenserna nedan, då fackmannen inser att biologiska vidhäftande polyfenoliska pro- etiner från olika källor, inklusive rekombinant producerade, kan betraktas som ekvi- valenta: a) Val-Gly-Gly-DOPA-Gly-DOPA-GLY-ALA-LYS b) Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-diHyp-Hyp-Thr-DOPA-Lys c) Thr-Gly-DOPA-Gly-Pro-Gly-DOPA-Lys d) Ala-Gly-DOPA-Gly-Gly-Leu-Lys e) Gly-Pro-DOPA-Val-Pro-Asp-Gly-Pro-Tyr-Asp-Lys f) Gly-Lys-Pro-Ser-Pro-DOPA-Asp-Pro-Gly-DOPA-Lys v ~ ; - u. 10 15 20 25 30 g) Gly-DOPA-Lys h) Tlir-Gly-DOPA-Ser-Ala-Gly-DOPA-Lys i) Gln-Thr-Gly-DOPA-Val-Pro-Gly-DOPA-Lys j) Gln-Thr-Gly-DOPA-Asp-Pro-Gly-Tyr-Lys k) Gln-Thr-Gly-DOPA-Leu-Pro-Gly-DOPA-Lys Termen "yta" skall tolkas brett och kan omfatta i princip varje yta. Valet av yta är inte kritiskt för denna uppfinning. Exempel på ytor för vilka uppfinningen är särskilt lämpad innefattar icke-biologiska ytor såsom glas, plast, keramik och metallytor, etc, och biologiska ytor omfattande trä och olika vävnader såsom hud, ben, tänder, ögat, brosk, etc.Definitions The terms "polyphenolic protein", "adherent mussel protein" or "MAP" as used herein refer to a biologically adherent protein derived from gill-forming mussels or which has been produced by recombinant genetic engineering. Examples of such mussels are mussels of the genera Mytilus, Geukensía, Aulacomya, Phragmatopoma, Dreissenía and Brachiodontes. Suitable proteins have been disclosed in a large number of publications, for example US-A-5,015,677, US-A-5,242,808, US-A-4,585,585, US-A-5,202,236, US-A-5,149,657 , US-AS 410 023, WO 97/34016, and US-A-5 574 134, Vreeland et al., J. Physiol., 34: 1-8, and Yu et al., Macromolecules, 31: 4739 -4745. They comprise about 30-300 amino acids and consist essentially of linked peptide units comprising 3-15 amino acid residues, optionally separated by a linker sequence of 0-10 amino acids. A characteristic feature of such proteins is a comparatively high amount of positively charged lysine residues, and in particular the unusual amino acid DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanine). A polyphenolic protein suitable for use in this invention has an amino acid sequence in which at least 3% and preferably 6-30% of the amino acid residues are DOPA. A few examples of typical peptide units are given below. However, it is important to note that the amino acid sequences of these proteins may vary and that the scope of this invention is not limited to the exemplary subsequences below, as those skilled in the art will recognize that biologically adherent polyphenolic proteins from various sources, including recombinantly produced, may be contemplated. as equivalent: a) Val-Gly-Gly-DOPA-Gly-DOPA-GLY-ALA-LYS b) Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-diHyp-Hyp-Thr-DOPA-Lys c) Thr-Gly -DOPA-Gly-Pro-Gly-DOPA-Lys d) Ala-Gly-DOPA-Gly-Gly-Leu-Lys e) Gly-Pro-DOPA-Val-Pro-Asp-Gly-Pro-Tyr-Asp-Lys f) Gly-Lys-Pro-Ser-Pro-DOPA-Asp-Pro-Gly-DOPA-Lys v ~; - u. 10 15 20 25 30 g) Gly-DOPA-Lys h) Tlir-Gly-DOPA-Ser-Ala-Gly-DOPA-Lys i) Gln-Thr-Gly-DOPA-Val-Pro-Gly-DOPA- Lys j) Gln-Thr-Gly-DOPA-Asp-Pro-Gly-Tyr-Lys k) Gln-Thr-Gly-DOPA-Leu-Pro-Gly-DOPA-Lys The term "surface" is to be interpreted broadly and may include in basically any surface. The choice of surface is not critical to this invention. Examples of surfaces for which the invention is particularly suitable include non-biological surfaces such as glass, plastic, ceramics and metal surfaces, etc., and biological surfaces comprising wood and various tissues such as skin, bone, teeth, eye, cartilage, etc.

Med sur vattenlösning avses en vattenlösning omfattande en organisk eller oorga- nisk syra.Acidic aqueous solution means an aqueous solution comprising an organic or inorganic acid.

Detaljerad beskrivning av uppfinninggn Denna uppfinning beskriver användning av en polyfenolisk biologisk vidhäftande komposition för att förbinda två ytor med varandra eller för att belägga en yta. De kompositioner som tillhandahålles med uppfinningen kan i princip användas för att vidhäfta varje yta till varandra eller för att belägga varje yta. Emellertid är komposi- tionema enligt denna uppfinning särskilt användbara då vidhäﬂande eller beläggan- de kompositioner behövs som är icke-toxiska, icke-irriterande eller icke-allergena, eftersom den enda obligatoriska komponenten är det biologiska proteinet i sig självt och detta medför en låg risk för att framkalla sådana reaktioner. Användningen av en biologiskt vidhäﬂande komposition som beskrivs i denna uppfinning gör det möjligt för mycket små mängder lim att användas samtidigt som man fortfarande uppnår en kraftig vidhäftning. Av detta skäl är användning av kompositionen enligt denna uppfinning särskilt användbar då endast små mängder limmer kan användas.Detailed Description of the Invention This invention describes the use of a polyphenolic biological adhesive composition for joining two surfaces together or for coating a surface. The compositions provided by the invention can in principle be used to adhere each surface to each other or to coat each surface. However, the compositions of this invention are particularly useful when adhering or coating compositions are needed which are non-toxic, non-irritating or non-allergenic, since the only mandatory component is the biological protein itself and this poses a low risk. to elicit such reactions. The use of a biologically adhesive composition described in this invention allows very small amounts of adhesive to be used while still achieving a strong adhesion. For this reason, use of the composition of this invention is particularly useful as only small amounts of adhesives can be used.

Ytterligare fördelar med användning av kompositionen som anges i samband med 10 15 20 25 'm0 . f. -f,_ II! :'.: -2 - - - - -- su n. g, I - , I ß a I n . ._ 'IU ~ , sas. . 7 denna uppfrning ar dess vatte-_löslig_-et, möjligheten att undvika organiska lös- ningsmedel som normalt används i limmer eller beläggningskompositioner, och att de är biologiskt framställda och oskadliga för miljön.Additional advantages of using the composition stated in connection with 10 15 20 25 'm0. f. -f, _ II! : '.: -2 - - - - - - su n. G, I -, I ß a I n. ._ 'IU ~, sas. . 7 this invention is its water-soluble, the ability to avoid organic solvents normally used in adhesives or coating compositions, and that they are biologically produced and harmless to the environment.

Den enda obligatoriska komponenten enligt denna uppﬁnning är det polyfenoliska proteinet som i sig självt tillhandahålles i en sur lösning, exempelvis samma sura lösning som används för lagring av proteinet. Tidigare då polyfenoliska proteiner har använts har det antagits vara nödvändigt att tillsätta ytterligare komponenter, så- som fyllmedel och oxidationsmedel och/eller öka pH-värdet till neutralt eller lätt ba- siskt värde, för att framkalla tillräckligt kraftig lirnstyrka. Uppfmnaren bakom denna uppfmning har visat att en mycket kraﬁig vidhäftning, jämförbar med den limstyrka som erhålles vid användning av normalt använda MAP-kompositioner, kan erhållas genom att direkt utnyttja en koncentrerad sur MAP-lösning. Då inga ytterligare komponenter måste sättas till MAP-lösningen före dess användning har vidhäft- ningsprocessen således förenklats jämfört med tidigare användningar av biologiskt vidhäftande proteiner. Beroende på den enkla kompositionen av limmet har vidare riskerna för irritation och/eller allergi som varit vanliga tillsammans med tidigare användningar av biologiskt vidhäﬁande polyfenoliska proteiner undvikits.The only mandatory component according to this invention is the polyphenolic protein which is itself provided in an acidic solution, for example the same acidic solution used for storing the protein. In the past, when polyphenolic proteins have been used, it has been considered necessary to add additional components, such as fillers and oxidizing agents and / or increase the pH to a neutral or slightly basic value, in order to produce sufficiently strong resin strength. The inventor behind this invention has shown that a very strong adhesion, comparable to the adhesive strength obtained when using normally used MAP compositions, can be obtained by directly using a concentrated acidic MAP solution. Since no additional components need to be added to the MAP solution before its use, the adhesion process has thus been simplified compared to previous uses of biologically adhesive proteins. Furthermore, due to the simple composition of the adhesive, the risks of irritation and / or allergy that have been common with previous uses of biologically adhering polyphenolic proteins have been avoided.

Denna uppﬁnning appliceras i den sura lösningen av lVIAP-proteinet, som enda komponent, till åtminstone en av ytorna, vilka skall vidhäftas till varandra, före ytorna förenas, eller tillsätts till den ytan som skall beläggas. Kompositionen enligt uppfinningen visade sig härda både i torra och våta miljöer. Såsom visas i de vid- hängande exemplen kan härdningstiden vara kort som 1 minut.This invention is applied in the acidic solution of the IVAP protein, as a single component, to at least one of the surfaces, which are to be adhered to each other, before the surfaces are joined, or added to the surface to be coated. The composition of the invention was found to cure in both dry and wet environments. As shown in the accompanying examples, the curing time can be as short as 1 minute.

Koncentrationen hos MAP-lösningen enligt denna uppﬁnning är 10-50 mg/ml. Ännu hellre är koncentrationen av MAP-lösningen 20-50 mg/ml. Det är viktigt att koncentrationen av MAP-lösningen är åtminstone 10 mg eftersom tidigare experi- ment har visat en dålig limstyrka genom att utnyttja en 5 mg/ml MAP-lösning i 5% 10 15 20 25 524 ~ - - . . = , .- 8 ättiksyra (EP-A-244 688), om inte några ytterligare komponenter tillsätts för att framkalla härdning.The concentration of the MAP solution according to this invention is 10-50 mg / ml. Even more preferably, the concentration of the MAP solution is 20-50 mg / ml. It is important that the concentration of the MAP solution is at least 10 mg because previous experiments have shown a poor adhesive strength by using a 5 mg / ml MAP solution in 5%. . , Acetic acid (EP-A-244 688), unless additional components are added to induce curing.

MAP-proteinet enligt denna uppfinning tillhandahålles i en sur vattenlösning med ett pH på 4 eller lägre. Emellertid visade sig ett pH på 3 eller mindre också oväntat ge högre limstyrkor. Ännu mera överraskande visade det sig att ett pH på 2,5 eller mindre gav högre limstyrkor. Syror som lämpar sig i samband med denna uppfin- ning innefattar både oorganiska syror, såsom saltsyra och fosforsyra, och organiska syror, såsom citronsyra, askorbinsyra, och ättiksyra.The MAP protein of this invention is provided in an acidic aqueous solution having a pH of 4 or less. However, a pH of 3 or less was also unexpectedly found to give higher adhesive strengths. Even more surprisingly, it was found that a pH of 2.5 or less gave higher adhesive strengths. Acids suitable in connection with this invention include both inorganic acids, such as hydrochloric acid and phosphoric acid, and organic acids, such as citric acid, ascorbic acid, and acetic acid.

Ett föredraget ändamål med denna uppfinning är att tillhandahålla en vidhäftande eller beläggande komposition för medicinska tillämpningar, exempelvis för att vid- häfta biologiska och icke-biologiska komponenter till biologiska strukturer, ett än- damål för vilket MAP-proteinet i sig självt är väl lämpat, då det inte är toxiskt och då det är biologiskt nedbrytbart. Emellertid kan de komponenter som vanligtvis sätt- es till MAP-kompositioner för att erhålla tvärbindning och oxidation (kemiska och/eller enzymatiska tvärbindare och oxidationsmedel) av kompositionen kan leda till irritation och allergiska reaktioner och sådana MAP-kompositioner är således inte optimala med avseende på medicinska tillämpningar. Beroende på avsaknaden av sådana komponenter i kompositionen enligt denna uppfinning, är kompositioner- na enligt denna uppfinning särskilt lämpade för att förbinda biologiska ytor till var- andra eller till andra icke-biologiska material. Vidare, då endast små mängder av den vidhäftande kompositionen enligt denna uppfinning erfordras, samtidigt som höga limstyrkor fortfarande erhålles, är kompositionen enligt denna uppfinning sär- skilt användbar för medicinska tillämpningar där ofta endast små mängder lim kan appliceras till de ytor som skall vidhäftas till varandra eller de ytor som skall beläg- gas. Av ovan nämnda skäl är användning av kompositionen enligt denna uppfinning särskilt lämpad för vidhäftning av hornhinnor, senor, vävnader under kirurgiska operationer etc. Av ovan nänmda anledningar är kompositionema enligt denna upp- /l - . .. 2--2 - - - - -- . .. i | In s g . ° ﬂ v ,, _ . s v v v ae no s... ' I n , 0 f e , 00 a . , ~ a , _ a ' ' " ﬂ »o 1' I n a ,, _. 10 15 20 25 524 c a | - . . , ,, 9 ﬁnning även särskilt användbara i samband med beläggning av material som kan användas i medicinska tillämpningar eller biologiska vävnader.A preferred object of this invention is to provide an adhesive or coating composition for medical applications, for example for adhering biological and non-biological components to biological structures, an object for which the MAP protein itself is well suited. as it is not toxic and as it is biodegradable. However, the components commonly added to MAP compositions to obtain crosslinking and oxidation (chemical and / or enzymatic crosslinkers and oxidizing agents) of the composition may lead to irritation and allergic reactions and thus such MAP compositions are not optimal with respect to medical applications. Due to the absence of such components in the composition of this invention, the compositions of this invention are particularly suitable for bonding biological surfaces to each other or to other non-biological materials. Furthermore, when only small amounts of the adhesive composition of this invention are required, while still maintaining high adhesive strengths, the composition of this invention is particularly useful for medical applications where often only small amounts of adhesive can be applied to the surfaces to be adhered to each other. or the surfaces to be coated. For the reasons mentioned above, the use of the composition according to this invention is particularly suitable for the adhesion of corneas, tendons, tissues during surgical operations, etc. For the reasons mentioned above, the compositions according to this invention are .. 2--2 - - - - -. .. i | In s g. ° ﬂ v ,, _. s v v v ae no s ... 'I n, 0 f e, 00 a. , ~ a, _ a '' "ﬂ» o 1 'I na ,, _. 10 15 20 25 524 ca | -.., ,, 9 ﬁ nning also particularly useful in connection with the coating of materials that can be used in medical applications or biological tissues.

Beroende på den mycket höga lirnstyrka som tillhandahålles med mycket små mängder av kompositionema enligt denna uppﬁnning är ett föredraget tillämpnings- område för vilket kompositionema är särskilt användbara vidhäftning till icke- biologiska ytor såsom glas, plast, keramiska material och metalliska ytor. Detta är särskilt användbart inom elektroniska mikro- och nano-tekniker, optik, etc, för vid- häﬁning eller beläggning av komponenter i, exempelvis biosensorer, mikrochips, I solceller, mobiltelefoner, etc, eftersom endast mycket små mängder lirn kan använ- das i dessa tillämpningar. Kompositionema enligt denna uppfmning är även lämpa- de för beläggning av icke-biologiska ytor.Due to the very high tensile strength provided with very small amounts of the compositions of this invention, a preferred field of application for which the compositions are particularly useful is adhesion to non-biological surfaces such as glass, plastic, ceramics and metallic surfaces. This is particularly useful in electronic micro- and nano-technologies, optics, etc., for attaching or coating components in, for example, biosensors, microchips, I solar cells, mobile phones, etc., since only very small amounts of lirn can be used in these applications. The compositions of this invention are also suitable for coating non-biological surfaces.

De vidhäftande kompositionema enligt denna uppﬁnning är även användbara för vidhäftning av celler, enzymer, antikroppar eller andra biologiska prover till ytor.The adhesive compositions of this invention are also useful for adhering cells, enzymes, antibodies or other biological samples to surfaces.

Exempel 1 För att bestämma lirnstyrkan vid användning av kompositionema enligt denna upp- fmning, bestämdes limstyrkan mellan icke-biologiskt material (glasplattor, 75 x 25 x 2 mm) och biologisk vävnad (muskler från nötkreatur och gris). Den vattenbaserade sura MAP-lösningen med varierande koncentrationer (se Tabell 1) i 0,01 M citron- syra (pH ca 2,3) applicerades till en av ytorna som skulle vidhäftas till varandra före i förening av de två ytorna och ﬁxering med en klämma. Proverna fick därefter härda under olika tidsperioder och under olika förhållanden innan limstyrkan bestämdes genom att använda en digital fjädervåg (Milo) genom att förbinda varje glasskiva eller den biologiska vävnaden med vågen och därefter sträcka tills glasplattan och den biologiska vävnaden frigjordes från varandra. Vidhäftningsytoma var i de ﬂesta fall 0,2-0,4 cmz, med en variation från 0,1 till 0,8 cmz. Såsom kan konstateras ur re- 1 - - n. . . , s ., o . . » n (_ T _ Ls: 11 ,' : ; .. ,; s.. _". "q n .. , n . . - - . .. . g, -- . ° - c 1 , , .- -.o 10 15 20 524 2 - °.: : : ;- ' ' ' ' - ° ' ' ' H '-- o r - | . . , ,, 1 0 sultaten i Tabell 1 försvagas inte limstyrkan då proverna tillåts -äga under vå-a -Jr- hållanden, även då ingen tvärbindare utnyttjas.Example 1 To determine the adhesive strength using the compositions of this invention, the adhesive strength was determined between non-biological material (glass plates, 75 x 25 x 2 mm) and biological tissue (cattle and pig muscle). The aqueous acidic MAP solution of varying concentrations (see Table 1) in 0.01 M citric acid (pH about 2.3) was applied to one of the surfaces to be adhered to each other before joining the two surfaces and oxidizing with a clamp. The samples were then allowed to cure for different periods of time and under different conditions before the adhesive strength was determined using a digital spring wave (Milo) by connecting each glass sheet or the biological tissue to the scale and then stretching until the glass plate and the biological tissue were released from each other. The adhesion surfaces were in most cases 0.2-0.4 cm 2, with a variation from 0.1 to 0.8 cm 2. As can be ascertained from re- 1 - - n.. . , s., o. . »N (_ T _ Ls: 11, ':; ..,; s .. _". "Qn .., n.. - -. ... G, -. ° - c 1,, .- -.o 10 15 20 524 2 - ° .:::; - '' '' - ° '' 'H' - or - |.., ,, 1 0 the results in Table 1 do not weaken the adhesive strength when the samples are allowed - own under vå-a -Jr- conditions, even when no crosslinker is used.

Prov MAP- MAP Syra Härdningsförhållanden Limstyrka (g) -koncentration mängd (pg) (koncentration) (mg/ml) 1 23 69 Citronsyra (0,01 M) 24 h i vatten vid 4°C 40 2 25 75 Citronsyra (0,01 M) 24 h i vatten vid 4°C 45 3 20 60 Citronsyra (0,01 M) 1 h i vatten vid 35°C 60 4 20 60 Citronsyra (0,01 M) l hi vatten vid 35°C 40 5 24 72 Citronsyra (0,01 M) 1 min under torra förhållanden 40 Tabell 1. Limstyrka som uppnåtts mellan biologiska och icke-biologiska ytor genom att använda MAP-kompositionen enligt denna uppﬁnning Exempel 2 För att bestämma limstyrkan genom att utnyttja kompositionerna enligt denna upp- ﬁnning bestämdes limstyrkan mellan biologisk vävnad (muskler från nötkreatur och grisar). Den sura MAP-lösningen (se Tabell 2) i 0,01 M citronsyra (pH ca 2,3) ap- plicerades till en av ytoma som skulle förbindas innan de båda ytoma förenades och det hela ﬁxerades med en klämma. Proverna tilläts därefter härda under vatten i 35°C innan limstyrkan bestämdes genom att använda en digital fjädervåg (Milo) ge- nom att förbinda en av de två delarna av den biologiska vävnaden till vågen och däreﬁer sträcka tills de biologiska vävnaderna frigjordes från varandra. Vidhäft- ningsytoma var i de ﬂesta fall 0,2-0,4 cmz, med en variation från 0,1 till 0,8 cmz.Sample MAP- MAP Acid Curing conditions Adhesive strength (g) -concentration amount (pg) (concentration) (mg / ml) 1 23 69 Citric acid (0.01 M) 24 h Water at 4 ° C 40 2 25 75 Citric acid (0.01 M) 24 h water at 4 ° C 45 3 20 60 Citric acid (0.01 M) 1 h water at 35 ° C 60 4 20 60 Citric acid (0.01 M) 1 h water at 35 ° C 40 5 24 72 Citric acid (0.01 M) 1 min under dry conditions 40 Table 1. Adhesive strength obtained between biological and non-biological surfaces using the MAP composition according to this invention Example 2 To determine the adhesive strength by using the compositions according to this invention was determined the adhesive strength between biological tissue (muscle from cattle and pigs). The acidic MAP solution (see Table 2) in 0.01 M citric acid (pH about 2.3) was applied to one of the surfaces to be connected before the two surfaces were joined and the whole was med xerated with a clamp. The samples were then allowed to cure under water at 35 ° C before the adhesive strength was determined by using a digital spring wave (Milo) by connecting one of the two parts of the biological tissue to the wave and there stretching until the biological tissues were released from each other. The adhesion surfaces were in most cases 0.2-0.4 cm 2, with a variation from 0.1 to 0.8 cm 2.

Prov MAP- MAP Syra Härdningsfórhållanden Limstyrka (g) -koncentration mängd (pg) (koncentration) (mg/ml) l 20 50 Citronsyra (0,01 M) 1 h i vatten vid 35°C 100 2 18 45 Citronsyra (0,01 M) 1 h i vatten vid 35°C 120 Tabell 2. Limstyrka som uppnåtts mellan biologiska ytor genom att använda MAP- kompositionen enligt denna uppfinning 10 15 524 242 :nu . 11 Exempel 3 För att bestämma limstyrkan som uppnåtts mellan två icke-biologiska ytor, törbands två glasplattor (ca 75 x 25 x 1,5 mm) med varandra genom att placera en liten drop- pe sur MAP-lösning på en av glasplattorna, placera den andra glasplattan ovanpå den första och ﬁxera de två glasplattoma med varandra genom att använda en klämma. Koncentrationema och mängderna av de utnyttjade MAP-lösningarna an- ges i Tabell 3 nedan, såväl som syran, och dess koncentration, som används fór varje speciﬁkt experiment. pH-värdena för de olika syroma som utnyttjades var så- som fóljer: 0,05 M citronsyra: pH ca 1,8; 0,01 M citronsyra: pH ca 2,3; 0,2 M ätt- iksyra: pH ca 2,3; 0,014 M askorbinsyra: pH 2,9; 0,05 M HCI: pH ca 1,0; och 0,05 M H3PO4: pH ca 1,4. Provema ﬁck stå under 24 tirmnar vid rumstemperatur innan limstyrkan bestämdes. Limstyrkan bestämdes genom mätning av skjuvmots- tånd (se Tabell 3) genom att utnyttja konventionella tekniker. Den limmade ytan va- rierade mellan 0,3 och 1 cmz. Som en jämförelse bestämdes limstyrkan som erhålles då man använder normalt epoxilim. Användning av 10 mg av detta lirn på glasplatt- oma på ett liknande sätt som beskrivits ovan resulterade i en lirnstyrka på 380 N.Sample MAP- MAP Acid Curing conditions Adhesive strength (g) -concentration amount (pg) (concentration) (mg / ml) l 20 50 Citric acid (0.01 M) 1 h Water at 35 ° C 100 2 18 45 Citric acid (0.01 M) 1 h water at 35 ° C 120 Table 2. Adhesive strength obtained between biological surfaces using the MAP composition of this invention 524 242: nu. Example 3 To determine the adhesive strength achieved between two non-biological surfaces, dry two glass plates (approx. 75 x 25 x 1.5 mm) with each other by placing a small drop of acidic MAP solution on one of the glass plates, place the second glass plate on top of the first and era xer the two glass plates with each other using a clamp. The concentrations and amounts of the MAP solutions used are given in Table 3 below, as well as the acid, and its concentration used for each specific experiment. The pH values of the various acids used were as follows: 0.05 M citric acid: pH about 1.8; 0.01 M citric acid: pH about 2.3; 0.2 M acetic acid: pH about 2.3; 0.014 M ascorbic acid: pH 2.9; 0.05 M HCl: pH about 1.0; and 0.05 M H 3 PO 4: pH about 1.4. The samples should stand for 24 hours at room temperature before the adhesive strength was determined. The adhesive strength was determined by measuring the shear resistance (see Table 3) using conventional techniques. The glued surface varied between 0.3 and 1 cm 2. As a comparison, the adhesive strength obtained when using normal epoxy adhesive was determined. Use of 10 mg of this lirn on the glass plates in a similar manner as described above resulted in a lirn strength of 380 N.

Prov MAP- MAP Syra Limstyrka -koncentration (mg/ml) mängd (pg) (koncentration) (N) 1 24 48 i Citronsyra (0,01 M) 226 2 42 42 Citronsyra (0,05 M) 290 3 42 84 Citronsyra (0,05 M) 430 4 39 117 Citronsyra (0,05 M) 401 5 39 117 Citronsyra (0,05 M) 437 6 42 42 Citronsyra (0,05 M) 350 7 27 54 Ättiksyra (0,2 M) > 240 8 28 56 Askorbinsyra (0,014 NI) 353 9 28 56 Askorbinsyra (0,014 M) 328 i ' 0 nu n l.)- -. a a , ~ u » ~ . f. 5 f 2 12 : v , :z f : : q _: ,'°. _00. u". 'n z.. ., . . n' . , , . . 'o n g z a' 0 a o a z 1 :O o , n e "' 'H I w»- f 12 (Forts.) Prov MAP- MAP Syra Limstyrka -koncentration (mg/ml) mängd (ng) (koncentration) (N) 10 23 46 HCl (0,05 M) > 270 11 25 50 H3PO4 (0,05 M) 237 Tabell 3. Limstyrka som uppnåtts mellan icke-biologiska ytor genom att använda MAP-kompositionen enligt denna uppfinningSample MAP- MAP Acid Adhesive strength concentration (mg / ml) amount (pg) (concentration) (N) 1 24 48 in Citric acid (0.01 M) 226 2 42 42 Citric acid (0.05 M) 290 3 42 84 Citric acid (0.05 M) 430 4 39 117 Citric acid (0.05 M) 401 5 39 117 Citric acid (0.05 M) 437 6 42 42 Citric acid (0.05 M) 350 7 27 54 Acetic acid (0.2 M) > 240 8 28 56 Ascorbic acid (0.014 NI) 353 9 28 56 Ascorbic acid (0.014 M) 328 i '0 nu n l.) - -. a a, ~ u »~. f. 5 f 2 12: v,: z f:: q _:, '°. _00. u ". 'n z ...,.. n'.,,.. 'ongza' 0 aoaz 1: O o, ne" '' HI w »- f 12 (Cont.) Prov MAP- MAP Acid Limit - concentration (mg / ml) amount (ng) (concentration) (N) 10 23 46 HCl (0.05 M)> 270 11 25 50 H3PO4 (0.05 M) 237 Table 3. Adhesive strength obtained between non-biological surfaces by using the MAP composition of this invention

Claims

10 15 20 25 30 524 242. .u ,, 13 Patent claims

Use of a composition as a single component for adhering two surfaces to each other or for coating a surface, said composition consisting of an acidic aqueous solution of a biologically adhering polyphenolic protein derived from a gun-forming mussel, which protein comprises 30-300 amino acids and which consists essentially of sequentially linked repeated peptide sequences comprising 3-15 amino acid residues, where at least 3% and preferably 6-30% of the amino acid residues in said biologically adhering polyphenolic protein are DOPA, where the pH of said acidic solution is 4 or less, and wherein the concentration of said biologically adhering polyphenolic protein is 10-50 g / ml.

Use according to claim 1, wherein the pH of the acidic solution is 3 or less.

Use according to claim 1, wherein the pH of the acidic solution is 2.5 or less.

Use of a composition according to claims 1-3, wherein the acidic solution contains an organic acid.

Use of a composition according to claims 1-3, wherein the acidic solution contains an inorganic acid.

Use of a composition according to claims 1-4, wherein the acidic solution contains an acid selected from the group consisting of citric acid, acetic acid and ascorbic acid.

Use of a composition according to claims 1-6, wherein the concentration of the biologically adhering polyphenolic protein is in the range of 20-50 mg / ml.

Use of a composition according to claims 1-7, wherein at least one of the surfaces to be joined or the surface to be coated is a biological surface. 4 '' '* - f | f; 14

Use of a composition according to claims 1-7, wherein at least one of the surfaces to be adhered or the surface to be coated is a non-biological surface.