SE503238C2 - Glasmikropärlor med bakteriostatiska egenskaper och förfarande för framställning av sådana mikropärlor - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 505 238 2 partiklar av ett annat material, som har baktericida egenskaper.

De föreslagna partiklarna är partiklar av metall såsom kalcium eller magnesium eller aluminium eller vismut eller silikon- partiklar. Frånsett svårigheter, som kan uppstå genom valet av storleken på sådana partiklar för att göra dem kapabla att fluidisera utan separation från glasmikropärlorna, är det självklart att ett förslag av detta slag har en definitiv risk vid användning. Det föreligger en risk för antändning av partik- larna i närvaro av fukt eller av ett varmt ställe eller t o m vid rumstemperatur när det gäller kalcium. Det är därför önsk- värt att hitta andra medel, som är enklare och säkrare för att ge bäddmaterialet baktericida eller bakteriostatiska egenskaper.

Enligt föreliggande uppfinning kännetecknas glasmikropärlor av att pärlorna är överdragna med proteiner, som är kovalent bundna till glaset och ger pärlorna bakteriostatiska egenskaper, samt av att pärlorna har en icke porös yta.

Föreliggande uppfinning tillhandahåller sålunda ett svar på problemet att ge bädden baktericida eller bakteriostatiska egenskaper, eftersom den möjliggör användning av ett enda slags partiklar, som införes i fluidiserande bäddar på sjukhus, nämligen glasmikropärlor, som i sig själva har bakteriostatiska egenskaper. Vidare kan sådana partiklar recirkuleras och re- genereras.

Mikropärlorna enligt uppfinningen, till vilka proteiner, som ger dem en bakteriostatisk förmåga, är bundna kovalent, bibehåller sina egenskaper under tidens gång. Dessa egenska- per upprätthålles under flera månader före användning om pärlorna lagras under bra betingelser i torr tillsluten för- packning och de kvarhåller sin bakteriostatiska förmåga under en period, som förenlig med deras användning i fluidiserande bäddar, dvs. under flera dagars eller t o m flera veckors exponering för luft. Denna bakteriostatiska förmåga upp- rätthålles när pärlorna föreligger i fuktig atmosfär eller när de utsättes för en moderat temperatur (t ex under 60 eller 70'C). Den bakteriostatiska förmågan bibehålles t o m när pärlorna utsättes bland varandra för slipning under deras 10 15 20 25 30 35 coli, Salmonellae, Pseudomonas, Legionellae och Staphylococcus âLIIGUS . med huden t.ex. i förband, och i detta fall väljs företrädesvis ett speciellt bionedbrytbart glas. Det är även möjligt att matsmältningstrakt. Det är även möjligt att använda dem för att skapa ett sterilt medium, som inte står i kontakt med kroppen, vilket är fallet med fluidiserande bäddmaterial. 10 15 20 25 30 35 40 503 238 4 draget från pärlorna, men ett nytt proteinöverdrag kan lätt bindas kovalent till pärlorna så att de kan åateranvändas.

I de mest föredragna utföringsformerna enligt uppfinningen har nämnda mikropärlor en icke porös yta. Denna egenskap medför avsevärda fördelar med hänsyn till hygienen. Vilken kropp som helst eller andra vätskor, som kommer i kontakt med pärlorna, som har porösa ytor, kan lätt adsorberas. Även om detta adsorberade material lätt kan steriliseras såsom nämnts ovan, är det extremt svårt att avlägsna från porösa pärlor så att det blir kvar som en möjlig hälsorisk även efter sterilisering och bindning av bakteriostatiska proteiner till pärlorna. Om det bakteriostatiska överdraget på en sådan porös pärla skulle saknas skulle det adsorberade materialet vara en fertil mikrobiell grogrund. Detta är inte fallet med pärlor, som har icke porösa ytor. Mycket litet om något sådant material visar sig vara adsorberat, och det som adsorberats kan lätt avlägsnas under sterilisering så att det är möjligt att återanvända pärlorna med mycket mindre skaderisk för patienten. Pärlor, som har icke porösa ytor, har vidare fördelen i jämförelse med porösa ytor att de i allmänhet är lättare och därför billigare att producera.

Företrädesvis är de proteiner, som binds till glasmikropärlor- na, enzymer. Valet av enzymer möjliggör att tillväxten eller förökningen av bakterier kan undertryckas eller förhindras enligt en totalt selektiv specifik mekanism, som möjliggör att'en skadlig verklighet för bakterierna kan alstras in situ.

De föredragna enzymerna för användning i fluidiserade bäddar är peroxidaser, som katalyserar oxidationen av olika joner, som föreligger i vätskor såsom plasma eller serum, vilket skapar baktericida verkligheter.

Proteiner såsom transferrin eller myeloperoxidas kan bindas till pärlor, men det föredrages att välja proteiner såsom laktoferrin eller laktoperoxidas. Laktoferrin tar upp järn- joner och alstrar därvid ett medium, som är olämpligt för bakterietillväxt. Laktoperoxidas bildar med ett oxidations- medel såsom väteperixod (tillhandahållet metaboliskt eller genom inverkan av glukosoxidas på glukos) och SCN_-joner ett 10 15 20 25 30 35 40 5 503 238 medium, som innehåller OSCN_-joner, som förstör bakterier.

Eftersom den bakteriostatiska verkningen av proteiner är mycket effektiv är det inte fullständigt nödvändigt att be- lägga ytorna på pärlorna med proteiner. Företrädesvis före- ligger proteinerna i proportionen mindre än 0,1 viktprocent i förhållande till glasets vikt. En mängd så liten som 0,05 viktprocent är effektiv, och det är ofta tillräckligt att använda en mängd om 0,02 %.

Såsom nämnts ovan består en stor fördel med mikropärlorna enligt uppfinningen i det faktum att de senare bibehåller sina bakteriostatiska eller bakteriocida egenskaper trots de mekaniska och termiska påkänningar som de kan utsättas för. Detta är antagligen bundet till förekomsten av en kova- lent bindning mellan proteinerna och glaset. För att under- lätta kovalent vidhäftning av proteinerna vid glaset användes företrädesvis ett kopplingsmedel, som på glasytan kan alstra prioriterade vidhäftningsställen för reaktiva grupper på proteinerna. Dessa reaktiva grupper består av aminosyror.

Som ett kopplingsmedel är det möjligt att använda ett organiskt titanat, men företrädesvis väljes ett kopplingsmedel av silan- typ, eftersom gruppen silaner erbjuder ett brett val av subs- tanser, som kan omsättas direkt med aminosyror.

Som en variant kan det föredragas att binda proteinerna med en silan och ett andra kopplingsmedel. I detta fall alstrar silanen en aminerad glasyta, som binds till proteinerna via ett kopplingsmedel av "Michael"-typ med glutaraldehyd eller av amidtyp t.ex. med bärnstenssyraanhydrid eller av azotyp t.ex. med nitrobensoylklorid. Det är även möjligt att alstra en tioesterbindning i kopplingskedjan, som har fördelen att den lätt kan spaltas om så önskas för att separera pärlorna från proteinerna för recirkulering. Koppling med glutaralde- hyd är fördelaktig eftersom den medger snabb bindning av en stor mängd proteiner eller olika enzymer till glaset.

Företrädesvis är mikropärlorna enligt uppfinningen hydrofoba.

Denna egenskap gör det möjligt att de kan bevara sin inte- gritet i närvaro av fukt eller av olika fysiologiska vätskor 10 15 20 25 30 35 503 238 6 och gör det framförallt möjligt att förhindra att de agglomererar i närvaro av dessa vätskor. De hydrofoba mikropärlorna enligt uppfinningen får företrädesvis sin hydrofoba natur på grund av närvaron av ett silikonöverdrag. Ett silikon som polymeriserar vid den fria glasytan utan att binda därtill via kovalent bind- ning föredrages. T.ex. kan en aminogrupphaltig polydimetyl- siloxansampolymer såsom produkten Dow Corning MDX4-4159, som polymeriserar vid rumstemperatur eller moderat temperatur an- vändas. Ett silikon av detta slag är förenligt med närvaron av proteiner och modifierar förvånansvärt nog inte eller endast försumbart den bakteriostatiska effektiviteten hos mikropär- lorna i jämförelse med identiska mikropärlor överdragna endast med proteiner.

Glasmikropärlorna enligt uppfinningen är fasta glasmikropärlor eller ihåliga mikropärlor. För användning i fluidiserade bäddar på sjukhus föredrages det att dessa mikropärlor har en relativ densitet större än 1 för att underlätta att patienten bärs upp, även om ihåliga mikropärlor har fördelen att erfordra en mindre mängd fluidiseringsluft, vilket resulterar i mindre uttorkning av den fluidiserande atmosfären.

Mikropärlor väljs företrädesvis vars partikelstorleksfördelning är smal, vilket underlättar deras fluidisering utan separation.

Glasmikropärlor vars diameter ligger mellan 65 och 110/um väljs t.ex. Det är möjligt att använda mikropärlor med en medel- diameter, som ligger mellan 80 och 100/um och företrädesvis mellan 85 och 90/um. Sådana pärlor erfordrar inte alltför mycket fluidiseringsenergi och kan inte passera genom maskerna i de dukar, som normalt användes i fluidiserade bäddar på sjukhus.

För denna speciella tillämpning kan fasta glasmikropärlor eller ihåliga mikropärlor väljas.

Föreliggande uppfinning omfattar även mikropärlor med bakterio- statiska egenskaper, suspenderade i en fluidiserande gas och omfattar en säng för behandling av brännskadade patienter, vilken säng innehåller ett fluidiseringssystem, som innehåller mikropärlor såsom definierats ovan. 10 15 20 25 30 35 7 Föreliggande uppfinning avser även ett förfarande för att ge mikropärlor bakteriostatiska egenskaper, kännetecknat av att ett överdrag av proteiner, som är kovalent bundet till glaset, fästes vid dessa mikropärlor. Ett förfarande av detta slag har fördelen att man erhåller ett finfördelat partikelformigt material, som lätt kan fluidisera och har farandet omfattar ett steg under vilket mikropärlornas bringas i kontakt med proteiner, t.ex. i suspension eller pulverform. som lätt lägger sig på glasytan från en lösning, suspension eller ett pulver vid rumstemperatur. Det är även möjligt att ympa t.ex. på glasytan amino- eller oxirangrupper, som kan medel. Detta är fallet t.ex. om silaniseringen av glaset alstrar aminogrupper på ytan av det senare. I detta fall binds proteinet via koppling av typ "Michael" med glutar- aldehyd eller av amidtypen eller azotypen. För att undvika senare i kontakt med ett medium, som innehåller proteinerna, vari pH inte överskrider 7. Ett medium, som innehåller protei- nerna, vari pH ligger mellan 4 och 5 väljs företrädesvis.

Företrädesvis,sedan proteinerna bundits till glaset, bringas mikropärlorna i kontakt med ett medium, som innehåller en silikon, för att belägga ett silikonöverdrag på pärlorna.

De så behandlade pärlorna är hydrofoba och har ingen tendens att agglomerera. Mediumet, som innehåller silikonen, har före- trädesvis pH mellan 4 och 5. Beläggningen av silikon utföres vid rumstemperatur eller moderat temperatur. I allmänhet, för att inte denaturera proteinerna, rekommenderas det att belägga och, när så är lämpligt, polymerisera silikonet vid en temperatur, som ej överstiger 60 till 70°C. 10 15 20 25 30 35 503 238 När mikropärlorna används under en viss tidsperiod t.ex. under ett byte av patienter i en fluidiserad bädd för behandling av brännskadefall, kan det visa sig vara nödvändigt att regenerera mikropärlorna. För att göra detta är det önskvärt att först sterilisera de använda pärlorna. Sådana pärlor kan lätt steri- liseras genom värmebehandling t.ex. genom värmning av dem vid en temperatur av storleksordningen 100°C under flera timmar.

Behandlingen avlägsnar de kovalent bundna proteinerna men bibe- håller silikonet vid glasytan. Uppfinningen avser följaktligen även ett förfarande för att återupprätta bakteriostatiska egenskaper hos glasmikropärlor, kännetecknat av att mikro- pärlorna, som steriliserats genom en värmebehandling, sedan behandlas med ett förfarande för kovalent bindning av proteiner såsom beskrivits ovan.

Föreliggande uppfinning skall nu förklaras mer i detalj med referens till följande exempel.

Exempel 1 Fasta mikropärlor av alkalisk kalciumoxid väljs genom siktning för avlägsning av pärlor mindre än 65/um och större än 106/um.

Medeldiametern (viktbaserad) hos de utvalda pärlorna är 85/um.

Mikropärlorna behandlas med (gammaglycidoxipropyl)trimetoxi- silan (A 187 från Union Carbide) i alkoholisk lösning vid rumstemperatur i proportionen 0,1 cm3 silan per kg pärlor, vilket motsvarar ca 100 mg silan per kg pärlor.

Laktoferrin binds sedan kovalent till pärlorna. Laktoferrinet binds via dess aminosyror till epoxigrupperna i silanet. Detta förfarande äger rum vid rumstemperatur genom att bringa de silanbehandlade pärlorna i kontakt med en 10 procentig vatten- lösning av bovint laktoferrin, saluförd av Olëofina vid ett pH mellan 4 och 5. Det finns sålunda ca 0,01 viktprocent aktiv produkt i förhållande till glasets vikt.

Mikropärlorna värms sedan försiktigt, varvid man är noga med att inte överskrida 60oC, och de bringas i kontakt med 10 15 20 25 30 35 9 503 238 grupphaltig polydimetylsiloxansampolymer MDX4-4159, som an- vändes i proportionen 0,2 cm3 per kg glas, vilket motsvarar med den hos laktoferrin i lösning, dvs. icke immobiliserad.

Det har visat sig t.ex. att dessa mikropärlor inhiberar till- växten av en E. colistam.

Dessa mikropärlor är hydrofoba och kan lagras, manipuleras glas. Pärlornas yta aktiveras sedan genom att silanet omsättes peroxidas med avseende på glaset binds därvid kovalent.

En silikon identisk med den i exempel 1 överdrages sedan på pärlornas yta. aktivitet trots dess kovalenta bindning till glaset. Denna enzymatiska aktivitet säkerställdes med o-fenylen-diamin- metoden, och ett värde om 350 U/mg laktoperoxidas bundet till glaset observerades, under det att samma metod tillÄ' hade en aktivitet av ca 400 U/mg enzym (U/mg = enhet för specifik aktivitet hos proteinet per mg; en aktivitets- enhet är den mängd enzym, som på en minut producerar en 10 15 20 25 30 35 503 238 10 ökning i absorbansen vid våglängden 490 nm om 0,1 vid 37°C och ett pH av 5 och med o-fenylen-diamin och H2O2 som substrat).

Den bakteriostatiska förmågan hos mikropärlorna undersöktes också. Denna bakteriostatiska förmåga säkerställdes i förhållan- de till en E. colistam, känslig för inverkan av OSCN--joner.

Förändringen med referens till tiden av den optiska densiteten hos en sådan kultur vid våglängden 660 nm undersöktes. En ökning av den optiska densiteten är bevis för bakterieproli- feration. I frånvaro av laktoperoxidas visar ett kontrollprov en ökning i optisk densitet motsvarande en förökning av det ursprungliga värdet med en faktor av storleksordningen 100 efter 6 timmar vid 37°C. I motsats härtill, vid närvaro av 8 g per liter pärlor behandlade enligt föreliggande uppfinning (vilket motsvarar 500 U laktoperoxidas per liter odlingdmedium) är den optiska densiteten oförändrad efter 6 timmar, vilket visar blockering av bakterietillväxten.

Som jämförelse bringades mikropärlor behandlade som ovan men utan att de bar silikon i kontakt med samma E. colistam. Det visade sig för en identisk mängd laktoperoxidas bundet till pärlorna att aktiviteten hos pärlorna överdragna med lakto- peroxidas och silikon väsentligen är identisk med den för obehandlade pärlor. Det är sålunda förvånansvärt nog ingen störning mellan aktiviteten hos det immobiliserade enzymet och närvaron av silikonet.

Liknande resultat erhålles med andra bakterier såsom Pseudomonas och Staphylococcus aureus.

Exempel 3 I första hand binds (gamma-glycidoxipropyl)trimetoxisilan såsom beskrivits i exempel 1 till glasmikropärlor identiska med dem i exempel 1, och 0,05 viktprocent laktoperoxidas binds sedan direkt till mikropärlorna. Behandlingen avslutas genom överdragning av silikon identisk med det, som nämnes i exempel 1 oxh 2. 11 503 238 Testet med odling av bakterier i exempel 2 upprepades, och det visade sig att 7 g pärlor per liter odlingsmedium var tillräckligt för att blockera tillväxten av bakterierna.

Claims (12)

10 15 20 25 30 503 238 12 Patentkrav

1. Glasmikropärlor, k ä n n e t e c k n a d e av att mikro- pärlorna har en icke-porös yta, och att de är överdragna med proteiner, som är kovalent bundna vid glaset och ger pärlorna bakteriostatiska egenskaper.

2. Glasmikropärlor enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d e av att överdraget innehåller ett enzym.

3. Mikropärlor enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d e av att proteinerna väljs bland laktoferrin och laktoperoxidas.

4. Mikropärlor enligt något av krav 1 till 3, k ä n n e- t e c k n a d e av att proteinerna föreligger i propotionen mindre än 0,1 viktprocent av mikropärlorna , och företrädes- vis mindre än 0,05 viktprocent.

5. Mikropärlor enligt något av kraven 1 till 4, k ä n n e- t e c k n a d e av att proteinerna är bundna till glaset via ett kopplingsmedel av silantyp.

6. Mikropärlor enligt krav 5, k ä n n e t e c k n a d e av att proteinerna är bundna till glaset via en silan och ett andra kopplingsmedel.

7. Mikropärlor enligt krav 6, k ä n n e t e c k n a d e av att det andra kopplingsmedlet är glutaraldehyd.

8. Mikropärlor enligt ett av kraven 1 till 7, k ä n n e- t e c k n a d e av att de är hydrofoba.

9. Mikropärlor enligt krav 8, k ä n n e t e c k n a d e av att de bär ett silikonöverdrag. 10 12 503 238

10. Mikropärlor enligt något av kraven 1 till 9, k ä n n e- t e c k n a d e av att deras medeldiameter ligger mellan 80 och 100 pm, och företrädesvis mellan 85 och 90 pm.

11. Mikropärlor enligt ett av kraven 1 till 10, k ä n n e- t e c k n a d e av att de är suspenderade i en fluidisa- tionsgas.

12. Bädd för behandling av brännskadade patienter, inne- hållande ett fluidiseringssystem, k ä n n e t e c k n a d av att den innehåller mikropärlor enligt krav 11.