NO175854B - Glassmikrokuler med bakteriostatiske egenskaper ogseng for behandling av pasienter med forbrenning, omfattende et fluidiseringssystem. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører glassmikrokuler med bakteriostatiske egenskaper, og deres anvendelse i svevesenger i sykehus beregnet for behandling av pasienter med forbrenninger.

De bakteriostatiske og baktericide egenskapene til en rekke syntetiske og naturlige produkter er blitt studert i lang tid, og noen av disse produktene utgjør en del av den tradisjonelle farmakope, slik som antibiotika eller des-infeksjonsmidler .

I noen år har spesielle senger for behandling av personer som har sterke forbrenninger, blitt benyttet i sykehus. Disse sengene omfatter fluidisert sengeutstyr, dvs. en madrass eller puter bestående av partikler bragt til fluidisert tilstand i en gass slik som luft og holdt på plass under et gasspermeabelt klede. Noen ganger består sengen ganske enkelt av en stålbeholder inneholdende fine, faste partikler. Underdelen omfatter en blåseanordning som suger luft fra rommet gjennom et filter. Luften komprimeres og oppvarmes til en temperatur av 31-38°C. Luften kommer inn i laget av fine partikler, f.eks. av en tykkelse på 25 cm, og bringer dem til fluidisert tilstand. Partiklene er fanget under et gasspermeabelt klede fremstilt f.eks. av polyester. Alle fluider som dreneres fra pasienten, kan passere gjennom et slikt klede til dannelse av agglomerater med noen partikler, og slike agglomerater fjernes periodisk ved hjelp av en sikt plassert ved bunnen av beholderen.

Det er åpenbart at sengeutstyr av denne typen ikke bør inne-holde eller fremme tilstedeværelsen av mikrobielle eller bakterielle stammer. Ifølge FR patentsøknad 2.523.841 har det således blitt foreslått at det til partikler slik som glassmikrokuler som utgjør det fluidiserte medium, tilsettes partikler av et annet materiale som har baktericide egenskaper. De foreslåtte partiklene er partikler av metall, slik som kalsium- eller magnesium- eller aluminium- eller vismut- eller silisiumpartikler. Bortsett fra vanskeligheter som kan oppstå fra valget av størrelsen av slike partikler for å gjøre dem i stand til fluidisering uten segregering fra glassmikrokulene, er det åpenbart at et forslag av denne type representerer en avgjort risiko ved bruk. Det er risiko for antennelse av partiklene i nærvær av fuktighet eller av en varm flekk, eller endog ved romtemperatur i tilfelle for kalsium. Det er derfor ønskelig å finne andre midler som er enklere og tryggere med henblikk på å gi nevnte sengeutstyr baktericide eller bakteriostatiske egenskaper.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt glassmikrokuler som er kjennetegnet ved at kulene er belagt med proteiner som er bundet kovalent med et koblingsmiddel til glasset og gir kulene bakteriostatiske egenskaper, og at kulene er hydrofobe.

Foreliggende oppfinnelse representerer derfor et svar på problemet med å gi sengeutstyr bakteriocide eller bakteriostatiske egenskaper fordi den muliggjør at enkeltpartikler kan innføres i fluidiserte eller svevesenger på sykehus, nemlig glassmikrokuler som i seg selv er i besittelse av bakteriostatiske egenskaper. Videre kan slike partikler resirkuleres og regenereres.

Foreliggende mikrokuler hvortil proteiner som gir dem en bakteriostatisk evne, er bundet på kovalent måte, bibeholder deres egenskaper med tiden, og disse egenskapene opprettholdes i flere måneder før bruk dersom kulene lagres under gode betingelser, i tørr, tett forpakning, og de bibeholder deres bakteriostatiske evne i en periode som er forenlig med deres bruk i svevesenger, dvs.i flere dagers eller endog flere ukers utsettelse for luften. Denne bakteriostatiske evne opprettholdes når kulene befinner seg i en fuktig atmosfære, eller når de utsettes for en moderat temperatur (f. eks. under 60 eller. 70°C). Den bakterostatiske evnen bevares selv når kulene utsettes i hverandres omgivelse for slitasje under deres håndtering og bruk. Dette antas å skyldes den kovalente binding som forekommer mellom proteinene og glasset. Det er uventet funnet at til tross for det faktum at nevnte proteiner er bundet til glasset via en kovalent binding, så bibeholder proteinene deres bakteriostatiske egenskaper, og er i stand til å gi slike egenskaper til mikrokulene som understøtter dem.

Som allerede nevnt ovenfor er mikrokulene i besittelse av bakteriostatiske egenskaper, og i mange tilfeller er de også bakteriocide, avhengig av proteinenes beskaffenhet og deres konsentrasjon. Som eksempel er det meget lett å gjøre dem i stand til å drepe eller begrense veksten og formeringen av bakterier slik som Escherichia coli, Salmonellae, Pseudo-monas, Legionellae og Staphylococcus aureus.

Foreliggende mikrokuler kan benyttes i direkte kontakt med huden, f. eks. i bandasjer, og i dette tilfelle vil et spesielt bionedbrytbart glass fortrinnsvis velges. Det er også mulig å tenke seg binding til mikrokulene av proteiner som gjør dem aktive, sett fra et baktericid synspunkt, i for-døyelseskanalen hos mennesker og dyr. Det er også mulig å benytte dem for å danne et sterilt medium som ikke er i kontakt med legemet, som tilfellet er for fluidisert sengeutstyr. I betraktning av viktigheten av denne sistnevnte anvendelse refereres det i foreliggende sammenheng spesielt til denne, men det skal forstås at oppfinnelsen ikke kun er begrenset til slik bruk.

Etter at foreliggende mikrokuler har vært i bruk i et visst tidsrom kan det være nødvendig eller ønskelig å regenerere dem for ny bruk. Det vil f.eks. vanligvis være nødvendig å skifte kulene i fluidisert sengeutstyr for behandling av pasienter med forbrenninger når en ny pasient overføres til sengen. Brukte kuler kan lett steriliseres ved en varmebehandling. De kan f.eks. behandles ved en temperatur på ca. 100°C i et tilstrekkelig langt tidsrom. En slik behandling fjerner også proteinbelegget fra kulene, men et friskt belegg av protein kan lett bindes kovalent til kulene slik at de kan brukes på nytt.

I de mest foretrukne utførelser av oppfinnelsen har nevnte mikrokuler en ikke-porøs overflate. Dette trekk representerer betydelige fordeler ut fra et hygienisk synspunkt. Enhver kroppsvæske, eller andre fluider, som kommer i kontakt med kuler som har porøse overflater, kan lett adsorberes. Selv om dette adsorberte materiale lett kan steriliseres som nevnt ovenfor, er det meget vanskelig å fjerne fra porøse kuler slik at det blir tilbake som en mulig helsefare, selv etter sterilisering og binding av bakteriostatiske proteiner til kulene. Dersom det bakteriostatiske belegget på en slik porøs kule skulle feile eller svikte, kan det adsorberte materiale være et fruktbart mikrobiologisk formeringssted. Dette er ikke tilfelle med kuler som har ikke-porøse overflater. Meget lite, om i det hele tatt noe, av materialet av nevnte type finnes å bli adsorbert, og det som adsorberes, kan lett fjernes ved sterilisering slik at det er mulig å bruke kulene på nytt med mye mindre risiko for fare for pasienten. Kuler som har ikke-porøse overflater, har den ytterligere fordel i forhold til kule med porøse overflater at de generelt er lettere å produsere, og derfor mindre kostbare.

Proteinene som er bundet til glassmikrokulene, er fortrinnsvis enzymer. Valget av enzymer muliggjør at veksten eller formeringen av bakterier kan undertrykkes eller hindres i overensstemmelse med en samlet selektiv, spesifikk mekanisme som muligjør dannelsen in situ av en selvstendig helhet som er skadelig for bakterier. De foretrukne enzymene for anvendelse i forbindelse med svevesenger er peroksydaser som kata-lyserer oksydasjonen av forskjellige ioner som er til stede i fluider slik som plasma eller serum, og skaper baktericide elementer.

Proteiner slik som transferin eller myeloperoksydase kan bindes til kulene, men det er foretrukket å velge proteiner slik som laktoferin eller laktoperoksydase. Laktoferin opptar jernioner og skaper derved et medium som er uegnet for bakterievekst. Laktoperoksydase, med et oksydasjonsmiddel slik som hydrogenperoksyd, tilveiebragt på metabolisk måte eller ved innvirkning av glukoseoksydase på glykose (og SCN" ioner danner et medium inneholdende OSCN- ioner som ødelegger bakterier.

Siden den bakteriostatiske virkning av proteiner er meget effektiv, er det ikke nødvendig å belegge kulenes overflater fullstendig med proteiner. Proteinene er fortrinnsvis til stede i en mengde på 0,1 vekt-# i forhold til vekten av glasset. En mengde så liten som 0,05 vekt-# er effektiv, og det er ofte tilstrekkelig å benytte en mengde på 0,02$.

Som angitt ovenfor ligger en stor fordel ved foreliggende mikrokuler i det faktum at disse bibeholder sine bakteriostatiske eller baktericide egenskaper til tross for mekaniske og mekaniske påvirkninger som de kan utsettes for. Dette skyldes sannsynligvis forekomsten av en kovalent binding mellom proteinene og glasset. For å lette kovalent festing av proteinene til glasset er det foretrukket å benytte et koblingsmiddel som ved glassoverflaten kan skape selektive festesteder for de reaktiv gruppene i proteinene. Disse reaktive gruppene består av aminosyrer. Som et koblingsmiddel er det mulig å benytte et organisk titånat, men det er foretrukket å velge et koblingsmiddel av silantypen fordi mengden av silaner tilbyr et omfattende valg av stoffer som kan reagere direkte med aminosyrer.

Som en variant kan det være foretrukket å binde proteinene ved hjelp av en silanforbindelse og et annet koblingsmiddel. I dette tilfelle skaper silanforbindelsen en aminert glass-overflate som er bundet til proteinene via en kobling av "Michael"-typen med glutaraldehyd, eller av amidtypen, f.eks. med ravsyreanhydrid, eller av azotypen, f.eks. med nitro-benzoylklorid. Det er også mulig å danne en tioesterbinding i koblingskjeden, hvilket har den fordel at den lett kan spaltes dersom det er ønskelig å skille kulene fra proteinene for resirkuleringsformål. Kobling med glutaraldehyd er fordelaktig fordi det tillater hurtig binding av en rekke forskjellige proteiner eller forskjellige enzymer til glasset.

Foreliggende mikrokuler er fortrinnsvis hydrofobe. Denne egenskap muliggjør at de kan beholde sin integritet i nærvær av fuktighet eller av forskjellige fysiologiske fluider , og gjør det fremfor alt mulig å hindre dem i å agglomerere i nærvær av disse fluider. Foreliggende hydrofobe mikrokuler skylder fortrinnsvis sin hydrofobe natur tilstedeværelsen av et silikonbelegg. Det velges fortrinnsvis et silikonmateriale som polymeriserer ved den frie glassoverflaten uten å bindes dertil via kovalente bindinger. Det kan f.eks. anvendes en aminogruppeholdig polydimetyl-siloksan-kopolymer slik som produktet Dow Corning MDX4-4159, som polymeriserer ved romtemperatur eller moderat temperatur. Et silikon-materiaie av denne typen er forenlig med tilstedeværelsen av proteiner og modifiserer overraskende nok ikke eller modifiserer bare ubetydelig mikrokulenes bakteriostatiske aktivitet i forhold til identiske mikrokuler belagt bare med proteiner.

Foreliggende glassmikrokuler er massive glassmikrokuler eller hulemikrokuler. For bruk i svevesenger for sykehus er det foretrukket at disse mikrokulene har en relativ densitet som er større enn 1 for å lette understøttelsen av pasienten, skjønt hule mikrokuler har den fordel at de krever en mindre mengde av fluidiserende luft, hvilket resulterer i mindre ut-tørking av fluidiseringsatmosfæren.

Det velges fortrinnsvis mikrokuler hvis partikkelstørrelses-fordeling er snever, hvilket letter deres fluidisering uten segregering. Det velges f.eks. glassmikrokuler hvis diameter ligger mellom 65 og 110 mikrometer. Det er mulig å benytte mikrokuler som har en gjennomsnittlig diameter som ligger mellom 80 og 100 mikrometer, og fortrinnvis mellom 85 og 90 mikrometer. Slike kuler krever ikke for mye energi for deres fluidisering, og er ikke i stand til å passere gjennom nettverket i kledematerialer som normalt benyttes for svevesenger i sykehus. For denne spesielle anvendelse kan massive glassmikrokuler eller hule mikrokuler velges.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således også en seng for behandling av pasienter med forbrenning, omfattende et fluidiseringssystem, kjennetegnet ved at den inneholder foreliggende mikrokuler som definert i det ovenstående og som er suspendert i en fluidiserende gass.

Ved festing av et belegg av proteiner som er bundet kovalent til glasset for fremstilling av glassmikrokulene oppnås et findelt partikkelformig materiale som lett kan fluidiseres, og er i besittelse av og bibeholder effektive bakteriostatiske egenskaper. Mikrokulene bringes i kontakt med proteiner, f.eks. i suspensjon eller i pulverform.

Trinnet med å bringe mikrokulene i kontakt med proteinene forutgås av et trinn med binding av koblingsmidlet til glassoverflaten. Koblingsmidlet er fortrinnsvis en silanforbindelse som lett avsettes på glassoverflaten fra en oppløsning, suspensjon eller pulver, ved romtemperatur. Det er f.eks. også mulig at det til glassoverflaten podes amino-eller oksyrangrupper som kan reagere med aminosyrene i proteinene.

I noen tilfeller kan det være nyttig å behandle glasset med et annet koblingsmiddel. Dette er tilfellet f.eks. dersom silanbehandlingen av glasset danner aminogrupper ved glassoverflaten. I dette tilfelle bringes proteinet via en kobling av " Michael"-typen med glutaraldehyd, eller av amidtypen eller azotypen. For å unngå denaturering av proteinene j anbefales det å foreta bindingen av proteinene til glasset ved å bringe sistnevnte i kontakt med et medium som inneholder nevnte proteiner, hvori pH-verdien ikke overskrider 7. Et medium inneholdende proteinene og hvori pH-verdien er mellom 4 og 5, blir fortrinnsvis valgt.

Etter at nevnte proteiner har blitt bundet til glasset blir mikrokulene fortrinnsvis bragt i kontakt med et medium inneholdende en silikonforbindelse for å avsette et silikonbelegg på kulene. De således behandlede kulene er hydrofobe, og har ingen tendens til å agglomerere. Mediet inneholdende silikonforbindelsen har fortrinnsvis en pE-verdi mellom 4 og 5. Avsetningen av silikon utføres ved romtemperatur eller moderat temperatur. For ikke å denaturere proteinene anbefales det generelt og avsette og, der det passer, polymerisere silikonmateriaiet ved en temperatur som ikke overskrider 60-70°C.

Når mikrokulene har blitt benyttet i et visst tidsrom, f.eks. i løpet av en skifting av pasienter i en sveveseng f or behandling av forbrenninger, kan det vise seg nødvendig å regenerere mikrokulene. For å gjøre dette er det ønskelig først å sterilisere de brukte kulene. Slike kuler kan lett steriliseres ved en varmebehandling, f.eks. ved å behandle dem ved en temperatur av 100°C i flere timer. Denne behandling fjerner de kovalent bundede proteinene, men bibeholder silikonmateriaiet ved glassoverflaten.

Oppfinnelsen skal i det følgende forklares mer detaljert under henvisning til nedenstående eksempler.

Eksempel 1

Massive alkali-kalk-glassmikrokuler velges ved sikting for å fjerne kuler som er mindre enn 65 mikrometer og større enn 106 mikrometer. Den gjennomsnittlige diameteren (beregnet på vekt) av kulene som velges, er 85 mikrometer. Mikrokulene behandles med (gamma-glycidoksypropyl)trimetoksysilan (A 187 fra Union Carbide) i alkoholisk oppløsning ved romtemperatur, i en mengde på 0,1 cm<3> silan pr. kg kuler, hvilket tilsvarer ca. 100 mg silan pr. kg kuler.

Laktoferin bindes deretter kovalent til kulene. Laktoferinet bindes via dets aminosyrer til epoksygruppene i silanet. Denne operasjon finner sted ved romtemperatur ved å bringe de silanbehandlede kulene i kontakt med en 10% vandig oppløsning av bovin-laktoferin (markedsført av Oléofina) ved en pH-verdi mellom 4 og 5. Det oppnås således ca. 0,01 vekt-$ aktivt produkt beregnet på glassets vekt.

Mikrokulene blir deretter forsiktig oppvarmet ved å sørge for ikke å overskride 60°C, og de bringes deretter i kontakt med en silikonvæske. Silikonen som velges, er en aminogruppeholdig polydimetylsiloksan-kopolymer MDX4-4159 fra Dow Corning, som anvendes i en mengde på 0,2 cm<3> pr. kg glass, hvilket tilsvarer ca. 200 mg silan pr. kg kuler.

Den bakteriostatiske evnen til disse mikrokulene er identisk med en til laktoferin i oppløsning, dvs. ikke immobilisert. Det er f.ek. funnet at disse mikrokulene inhiberer veksten av en E. coli-stamme.

Disse mikrokulene er hydrofobe, og kan lagres, manipuleres og benyttes uten noen risiko for agglomerering.

Eksempel 2

Alkali-kalk-glassmikrokuler lik de i eksempel 1 behandles ved bruk av (gamma-aminopropyl)trimetoksysilan A1100 fra Union Carbide i en alkoholisk oppløsning i en mengde på 0,1 cm<3> silan pr. kg glass, hvilket tilsvarer 100 mg silan pr. kg glass. Overflaten til kulene aktiveres deretter ved å reagere silanen med glutaraldehyd ved en pH-verdi under 6,5 i støkiometriske mengdeforhold.

Laktoperoksydase bindes deretter til kulene ved å bringe disse i kontakt med en vandig oppløsning av laktoperoksydase (markedsført av Oléofina). 0^02 vekt-# laktoperoksydase, beregnet på glasset, bindes deretter på kovalent måte. Et silikonmateriale identisk med det i eksempel 1 avsettes deretter på kulenes overflate.

Det ble funnet at laktoperoksydasen bibeholdt sin enzymatiske aktivitet til tross for dets kovalente binding til glasset. Denne enzymatiske aktiviteten ble analysert ved o-fenylen-diaminmetoden og en verdi på 350 U/mg av laktoperoksydase bundet til glasset ble observert, mens den samme metoden benyttet på en ekvivalent mengde laktoperoksydase i opp-løsning hadde en aktivitet på ca. 400 U/mg av enzym (U/mg = enhet for spesifikk aktivitet til proteinet pr. mg; en aktivitetsenhet er den mengde enzym som i løpet av 1 min. gir en økning i absorbans ved bølgelengde 490 nm på 0,1, ved 37°C og ved pH 5, og med o-fenylendiamin og HgOg som substrat).

Den bakteriostatiske virkningsgraden til mikrokulene ble også undersøkt. Denne bakteriostatiske virkningsgraden ble analysert m.h.t. en E. coli-stamme som var følsom overfor innvirkningen av 0SCN~ioner. Endringen med tid av den optiske densiteten til slik kultur ved bølgelengde 660 nm ble undersøkt. En økning i optisk densitet er bevis for bakterie-formering. I fravær av laktoperoksydase viser en kontroll-prøve en økning i optisk densitet tilsvarende en multi-plikasjon av den innledende verdi med en faktor av størrel-sesorden på 100 etter 6 timer ved 37°C. I motsetning til dette forblir den optiske densiteten i nærvær av 8 g pr. liter av kuler behandlet ifølge foreliggende eksempel (hvilket tilsvarer 500 U laktoperoksydase pr. liter kulturmedium), uendret etter 6 timer, og dette demonstrerer blokkering av bakterieveksten.

For sammenligning ble mikrokuler behandlet som bekrevet ovenfor, men ikke omfattende silikon, bragt i kontakt med den samme E coli-stammen. For en identisk mengde laktoperoksydase bundet til kulene ble det funnet at aktiviteten til kulene belagt med laktoperoksydase og silikon praktisk talt er identisk med den til de ikke-silikonbehandlede kulene. Det er således overraskende nok ingen forstyrrelse mellom aktiviteten til det immobiliserte enzym og tilstedeværelsen av silikonmateriale.

Lignende resultater finnes med andre bakterier slik som Pseu-domonas og Staphylococcus aureus.

Eksempel 3

Først bindes (gamma-glycidoksypropyl)trimetoksysilan som beskrevet i eksempel 1 til glassmikrokuler identisk med dem i eksempel 1, og 0,5 vekt-# laktoperoksydase bindes deretter direkte til mikrokulene. Behandlingen fullføres ved avsetning av silikon identisk med det som er angitt i eksemplene 1 og '2. Testen med dyrking av bakterier som i eksempel 2 ble gjen-tatt, og det ble funnet at 7 g kuler pr. liter kulturmedium var tilstrekkelig til å blokkere bakterievekst.

Claims (12)

1 Glassmikrokuler, karakterisert ved at kulene er belagt med proteiner som er bundet kovalent med et koblingsmiddel til glasset og gir kulene bakteriostatiske egenskaper, og at kulene er hydrofobe.

2. Mikrokuler ifølge krav 1, karakterisert ved at de har en ikke-porøs overflate.

3. Mikrokuler ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at belegget omfatter et enzym.

4. Mikrokuler ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at proteinene er valgt fra laktoferin eller laktoperoksydase.

5 . Mikrokuler ifølge hvilket som helst av kravne 1-4, karakterisert ved at proteinene er til stede i en mengde på mindre enn 0,1 vekt-# beregnet på mikrokulene, og fortrinnsvis mindre enn 0,05 vekt-#.

6. Mikrokuler ifølge hvilket som helst avkravene 1-5, karakterisert ved at proteinene er bundet til glasset via et koblingsmiddel av silantypen.

7. Mikrokuler ifølge krav 6, karakterisert ved at proteinene er bundet til glasset via et silan og et annet koblingsmiddel.

8. Mikrokuler ifølge krav 7, karakterisert ved at det andre koblingsmiddelet er glutaraldehyd.

9. Mikrokuler ifølge krav 1,. karakterisert ved at de bærer et silikonbelegg.

10. Mikrokuler ifølge hvilket som helst av kravene 1-9, karakterisert ved at deres gjennomsnittlige diameter ligger mellom 80 og 100 mikrometer, og fortrinnsvis mellom 85 og 90 mikrometer.

11. Mikrokuler ifølge hvilket som helst av kravene 1-10, karakterisert ved at de er suspendert i en fluidiserende gass.

12. Seng for behandling av pasienter med forbrenning, omfattende et fluidiseringssystem, karakterisert ved at den inneholder mikrokuler ifølge krav 11.