SE467410B - Analoger av cyklolinopeptid a och anvaendning daerav - Google Patents
Analoger av cyklolinopeptid a och anvaendning daeravInfo
- Publication number
- SE467410B SE467410B SE9003040A SE9003040A SE467410B SE 467410 B SE467410 B SE 467410B SE 9003040 A SE9003040 A SE 9003040A SE 9003040 A SE9003040 A SE 9003040A SE 467410 B SE467410 B SE 467410B
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- amino acid
- cys
- mpa
- acid residues
- configuration
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
“A67 410
10
15
20
25
30
35
2
som ett immunosuppressivt medel, och detta har beskrivits
i vår tidigare svenska patentansökan nr 8804640-4 inlämnad
den 23 december 1988 (motsvarande PCT-ansökan
PCT/SE89/00732).
Immunosuppressiv behandling av en patient som är i
behov därav kräver att stora mängder av det immunosuppres-
siva medlet används. När cyklolinopeptid A syntetiseras i
enlighet med den metod som användes i var tidigare patent-
ansökan gär 60-70% av den linjära peptiden förlorad under
cykliseringen. Det är uppenbart att storskalig produktion
av cyklolinopeptid A är mycket dyr, och industriell pro-
duktion av cyklolinopeptid A har därför skjutits upp.
Vi fann emellertid överraskande att den immuno-
suppressiva aktiviteten hos cyklolinopeptid A bibehålls
när dess sekvens utökas med en cystinderivatrest. De nya
analogerna av cyklolinopeptid A möjliggör storskalig pro-
duktion därav, eftersom praktiskt taget ingen linjär pep-
tid går förlorad vid cykliseringssteget.
Beskrivning av uppfinningen
I en aspekt av uppfinningen àstadkommes nya analoger
av cyklolinopeptid A som har en cyklisk formel som härrör
fràn cyklolinopeptid A-sekvensen
Val-Pro-Pro-Phe
ha
Lau-Ile-Ile-Lau*//I
vilken sekvens är utökad mellan vilka som helst tvà amino-
syrarester med följande cystinderivatrest
c-o NH
| I
x-c-H H-c-Y
I I
CHZ cnz
10
15
20
25
30
35
467 410
3
i vilken X är vald bland -H och -OH, och
Y är vald bland -C=O och -H,
"H2
vari aminosyraresterna har L- eller D-konfiguration.
I en föredragen utföringsform av denna aspekt av upp-
finningen är den ovan angivna cystinderivatresten belägen
mellan aminosyraresterna Leu och Phe i formeln för cyklo-
linopeptid A. I själva verket var läget för nämnda cystin-
derivatrest i cyklolinopeptid A-sekvensen vald pá máfà.
Sålunda kan man vänta sig att den immunosuppressiva akti-
viteten hos cyklolinopeptid A bibehålls oberoende av
mellan vilka tvâ aminosyrarester i sekvensen därav cystin-
derivatresten införs. '
I en ytterligare aspekt av uppfinningen àstadkommes
en analog enligt uppfinningen för användning som ett läke-
medel.
I en annan aspekt av uppfinningen åstadkommas använd-
ning av en analog enligt uppfinningen för framställning av
ett läkemedel för immunosuppressiv behandling.
I ytterligare en annan aspekt av uppfinningen åstad-
kommes ett sätt att behandla ett däggdjur, inbegripet
människan, som är i behov av immunosuppressiv behandling,
vilket omfattar administrering åt nämnda däggdjur av en
farmakologiskt effektiv mängd av en analog enligt upp-
finningen.
I ännu en annan aspekt av uppfinningen àstadkommes
ett farmaceutiskt preparat som omfattar en analog enligt
uppfinningen tillsammans med en eller flera farmaceutiskt
acceptabla bärare, konstituenter och/eller spädmedel.
Den mängd av en analog enligt uppfinningen som skall
administreras àt ett däggdjur som är i behov av immuno-
suppressiv behandling måste avgöras av en läkare som har
erfarenhet av immunosuppressiv terapi.
.ré-
O\
-q
10
15
20
25
30
35
...._\
4
Den farmaceutiska beredningen som omfattar en analog
enligt uppfinningen kan formuleras till orala preparat
eller preparat för infusion med användning av en eller
flera farmaceutiskt acceptabla bärare, konstituenter
och/eller spädmedel som är lämpliga för sådana preparat,
varvid man bör komma ihág att nämnda analog är olöslig i
vatten. Det farmaceutiska preparatet kan t ex omfatta en
analog enligt uppfinningen i en farmakologiskt effektiv
mängd suspenderad i en olivolja.
Föreliggande uppfinning avslöjar att analogerna en-
ligt uppfinningen har immunosuppressiv aktivitet, vilken
är jämförbar med den hos Ciclosporin (även kallad Cyclo-
sporin A) och Cyklolinopeptid A. Följaktligen skall analo-
gerna enligt uppfinningen användas i läkemedel för immuno-
suppressiv behandling av däggdjur, inbegripet människan,
för alla de indikationer där immunosuppressiv behandling
är motiverad. Exempel på när immunosuppressiv behandling
är motiverad är för förebyggande av allograft-avstötning
efter organtransplantation och benmärgstransplantation,
profylaktisk eller terapeutisk behandling av graft-versus-
host-disease (GVHD), och autoimmuna sjukdomar, såsom
systemisk lupus erythematosus (SLE), reumatoid artrit (RA)
och diabetes mellitus.
Kort beskrivningkav ritningarna
Fig 1 visar ett diagram avseende inhibering av PPIas
aktivitet genom Cyklosporin A.
Fig 2 visar ett diagram avseende inhibering av PPIas
aktivitet genom CLA, LA och 1-Mpa-LA-Cys-NH
L___|
Syntes av CLA-analgger enligt uppfinningen
20
CLA-analogerna enligt uppfinningen kan framställas
genom vilken som helst känd metod på peptidkemiomràdet,
varigenom en linjär peptid bildas, vilken sedan underkas-
tas ett oxidationssteg för att cyklisera tvà cysteinbe-
släktade rester, varigenom en svavelbrygga bildas mellan
nämnda rester, sålunda bildande en cystinderivatrest.
ä!!
10
15
20
25
30
35
467 410
5
De linjära linopeptid(LA)-analogerna enligt uppfin-
ningen kan sålunda syntetiseras på konventionellt sätt,
t ex genom stegvis koppling av en aminosyrarest till nästa
i vätskefas, t ex i enlighet med metoden enligt
Law, H.B. & Du Vigneaud, V.:J. Am. Chem. Soc. §g (1960)
4579-4581; Zhuze, A.L., Jost, K. Kasafirek, E. & Rudinger,
J.: Coll. Czechslovak Chem Commun. 22 (1964) 2648-2662,
modifierad av Larsson L.-E., Lindeberg, G., Melin, P. &
Pliska, V.: J. Med. Chem. gl (1978) 352-356. Kopplingen av
aminosyrarester till varandra, varigenom s k peptidbind-
ningar bildas, kan också utföras utgående från en fast fas
(vanligen ett harts) till vilken den första aminosyrans
C-terminal kopplas, varpå nästa aminosyras C-terminal
kopplas till den första aminosyrans N-terminal, etc, och
slutligen frisätts den uppbyggda peptiden från den fasta
fasen. I de nedan angivna exemplen har den s k fastfas-
tekniken utnyttjats i enlighet med metoden enligt Merri-
field, R.B.: J. Am. Chem. Soc. §§ 1963) 2149; Merrifield,
R.B.: Biochem. § (1964) 1385 och König, W, & Geiger, R.:
Chem. Ber. lQ§ (1970) 788.
Generell syntesbeskrivning
Alla peptiderna i de nedan angivna exemplen synteti-
serades på en Applied Biosystems 430A Peptide Synthesizer
med användning av ett dubbelkopplingsprogram med termine-
ringssteg efter den andra kopplingen. Det harts som använ-
des var av 4-metyl-benshydrylamintyp med en teoretisk be-
lastning av 0,66 meq/g (Peptides International, Louis-
ville, KY, USA). Syntesslutprodukten torkades i vakuum
över natten. Sedan spjälkades peptiden från hartset genom
behandling med flytande vätefluorid i närvaro av anisol
och etyl-metyl-sulfid som scavangers (katjonfångare)
(HF:anisol:EMS-10:05:05). Efter avlägsnande av vätefluo-
riden genom avdunstning suspenderades återstoden i etyl-
acetat (100 ml) och filtrerades. Fastämnet tvättades på
filter med ytterligare etylacetat (3 x 100 ml) och den
spjälkade peptiden extraherades med ättiksyra (100 ml).
Extraktet spåddes genast till en volym av 2 cma med 20%
¶Å4e7 410
10
15
20
25
30
35
6
ättiksyra i metanol och behandlades med 0,1 M lösning av
jod i metanol tills en svagt brun färg kvarstod. Sedan
tillsattes Dowex 1 x 8 jonbytare i acetatform (3 g)
(Bio-Rad, Richmond, CA, USA) och blandningen filtrerades.
Filtratet indunstades och återstoden frystorkades ur 1%
ättiksyra i vatten. Produkten renades sedan genom
"reversed phase" vätskekromatografi på en kolonn som var
fylld med Vydac 20-25 p (Separation Group, CA, USA) i ett
lämpligt system innehållande acetonitril i O,1% trifluoro-
ättiksyra-vattenlösning. Proverna som uppsamlades från
kolonnen analyserades genom analytisk HPLC (Varian 5500,
Sunnyvale, CA, USA) som var utrustad med en Bondapak C18
kolonn (Millipore, Milford, Mass., USA). Fraktioner som
innehöll ren substans sammanfördes, lösningsmedlet av-
dunstades och produkten frystorkades ur 1% ättiksyra i
vatten. Den slutliga HPLC-analysen utfördes pà färdig pro-
dukt och strukturen för peptiden ifråga bekräftades genom
aminosyraanalys samt FAB-MS (Fast atom bombardment spect-
rometry). FAB-MS-analyserna utfördes av M-Scan Ltd.
Sunninghill, Ascot, Berkshire, England.
Alla aminosyror som användes under syntesen skyddades
med tert-butoxikarbonylgrupp vid a-aminofunktionen. Tiol-
funktionen hos Mpa, Hmp och Cys skyddades med 4-metoxiben-
sylgrupp. Aminosyraderivaten levererades av Bachem AG,
Schweiz.
I de nedanstående exemplen används förkortningen LA
för den linjära peptiden Leu-Ile-Ile-Leu-Val-Pro-Pro-
-Phe-Phe.
EXEMPEL 1
1-Mpa-LA-Cys-NH
L___|
Peptiden framställdes i enlighet med den allmänna
syntesbeskrivningen. 3-merkaptopropionsyra [S-(p-me-
2
toxi-)bensyl] användes för position 1.
10
15
20
25
30
35
4657 4'1Û
Renhet (HPLC):99,8%
Strukturen bekräftades genom aminosyraanalys och genom
FAB-Ms. [M+u]*- 1246.
EXEMPEL II
1-Mpa-LA-D-Cys-NH
l_____|
Peptiden framställdes i enlighet med den allmänna
syntesbeskrivningen. 3-merkaptopropionsyra[S-(p-me-
toxi-)bensyl] användes för position 1 och Boc-D-cys-
2
tein[-(p-metoxi-)-bensyl] för position 2.
Renhet (HPLC):95,7%
Strukturen bekräftades genom aminosyraanalys och
genom FAB-MS. [M+H]+- 1246.
EXEPEL III
1-Hmp-LA-Cys-NH2
Peptiden framställdes i enlighet med den allmänna
syntesbeskrivningen. 2-hydroxi-3-merkaptopropionsyra an-
vändes för position 1.
Renhet (HPLC):97,5%
Strukturen bekräftades genom aminosyraanalys och
genom FAB-MS. [M+H]+- 1262.
EXEMPEL IV
1-Mpa-D-LA-D-Cys-NH
l__|
Peptiden framställdes i enlighet med den allmänna
syntesbeskrivningen med användning av aminosyror med
2
D-konfiguration.
'4-67 410
8
3-merkaptopropionsyra[S-(p-metoxi-)bensyl] användes för
position 1.
Renhet (HPLC):98,0%
Strukturen bekräftades genom aminosyraanalys och
5 genom FAB-MS: [M+H]+= 1246.
Lista pà föreningar som använts som enzyminhibitorer och
som immunosuppressiva medel
CS-A = Cyklosporin A (Referens)
10 CLA = Cyklolinopeptid A (Referens)
1fMpa-LA-Cys-NH2 Lau-Val-Pro-Pro-Phe
= /Pfi-xe
15 . Ile~Ile-Leu-Mpa Cys-NH2
(Förening enligt exempel 1)
1-Mpa-LA-D-Cys-NH2 Leu-Val-Pro-Pro-Phe
\
= Phe
20
Ile-Ile-Lau-Mpa D-Cys-NH2
(Förening enligt exempel 2)
25 1-Hmp-LA-Cys-NH2 Lau-Val-Pro-Pro-Phe
Phe
ll
Ile-Ile-Leu-Hmp Cys-NH2
30 (Förening enligt exempel 3)
1-Mpa-D-LA-D-Cys-NH2 D-Leu-D-Val-D-Pro-D-Pro-D-PQÉ
= D-Phe
35 D-Ile-D-Ile-D-Leu-Mpa D-Cys-NH
(Förening enligt exempel 4)
10
15
20
25
30
35
467 410
9
där Mpa är 3-merkapropropionylrest (-S-CH2-CH2-CO-) och
Hmp är 2-hydroxi-3-merkaptopropionylrest
OH
(-S-CH2-CH-CO-)
Inhibering av enzymet PPIas
Det är känt att peptidyl-prolyl-cis-trans-isomeras
(PPIas) katalyserar cis-trans-isomeriseringen av prolin-
imid-peptid-bindningar i oligopeptider och Nobuhiro
Takahashi, et al (Nature vol. 337, Letters to Nature,
pp 473-475, 1989) föreslog att PPIasets peptidyl-prolyl-
cis-trans-isomeriserande aktivitet kan vara involverad i
i T-cellakti-
Gunter
företeelser, såsom de som förekommer tidigt
vering, vilka undertrycks av cyklosporin A.
Fischer, et al (Nature vol. 337, Letters to
pp 476-478, 1989) rapporterade att PPIas antagligen är
identiskt med cyklofilin, ett nyligen upptäckt däggdjurs-
protein som starkt binder till cyklosporin A. Vi har renat
Nature,
PPIas och testat analoger enligt uppfinningen som PPIas-
inhibitorer.
Rening av PPIas
Cortex frán grisnjure homogeniserades i lika volym
sackaros (0,2 M) och centrifugerades 60 min vid
10 000 x g. Supernatanten justerades till PH 5,5 genom
tillsättning av l M acetatbuffert, pH 4,0. Fällningen
kasserades och supernatanten brinades till pH 7,0.
Extraktet bringades till 40% mättnad av ammoniumsul-
fat. Till supernatanten som erhölls efter 15 min centrifu-
gering vid 20 000 x g sattes fast natriumsulfat för erhål-
lande av en slutlig mättnad av 60%. Fällningen som erhölls
genom centrifugering löstes i en liten volym 10 mM tris-
buffert, pH 7,6 och dialyserades 24 h mot samma buffert.
Den dialyserade lösningen sattes pà en DEAE-Sephadex A-50
kolonn, vilken i förväg hade jämviktsinställts med samma
buffert, och eluerades utan att bufferten ändrades. Elua-
tet som var rikt pà PPIas-aktivitet passerade genom
kolonnen i en aktiv topp.
-467 410
10
15
20
25
30
35
10
De aktiva fraktionerna sattes på en CM-Sephadex C-50
kolonn och eluerades med en linjär gradient av KCl
(0-1,2 M) som en aktiv topp.
Enzymet lagrades som suspension 1 60% mättat ammo-
niumsulfat. Efter 5 månader uppvisade enzymet full ezyma-
tisk aktivitet.
Bestämning av PPIas-aktivitet
Cis-transisomerisering av Ala-Pro-peptidbindningen
hos peptiden N-succinyl-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilid mättes i
en kopplad analys med kymotrypsin. Substrat (50 pM), i
förväg upplöst i DMSO, jämviktsinställdes vid l0°C med den
lämpliga mängden PPIas i termostaterad elektrofotometer-
cell. Reaktionen påbörjades vid tillsättning av kymotryp-
sin (slutlig koncentration 21 pM). Trans-peptiden spjälka-
des inom dödtiden. Cis-transisomeriseringshastigheten
följdes genom minskningen av transmittans vid 390 nm.
Spektrofotometern Specord UV-Vis (Jena, GDR) som var ut-
rustad med en cellomrörare användes.
Inhibitorernas effekt på PPIas undersöktes genom
blandning av den studerade substansen med PPIas under
1 min före inkubering av substratet. Substanserna som
testades löstes i dioxan som innehöll 0,5-1% Triton X-100
eller i DMSO. Ingen skillnad observerades ifråga om effekt
pà PPIas-aktivitet beroende pá typen av lösningsmedel.
Resultaten ges i fig 1 och fig 2, där log av skill-
naden mellan transmittans vid stationärt tillstànd Ax och
transmittans vid en given tidpunkt At plottades mot tiden.
Hastighetskonstanten av första ordningen k (s_1) beräk-
nades fràn de resulterande räta linjerna.
Immunosuppressiv aktivitet hos CLA, CS-A och analogerna
enligt uppfinningen
Material och metoder
Djur: CBA/Iiw möss 8-10 veckor gamla
Antigen: SRBC (röda blodkroppar fràn får)
1-Mpa-LA-Cys-NH2, 1-Mpa-D-La-D-Cys-NH
|__||___|
Reagens: 2,
10
15
20
25
30
35
467 410
11
1-Mpa-LA-D-Cys-NH2, och CLA framställdes av
l___|
FERRING AB, Sverige, och cyklosporin A (CS-A), Sandimmun
Sandoz, Basel, Schweiz
Lösningsmedel: Blandning av Cremophor El (SIGMA) och 94%
etanol (6,5 : 3,5), etanol 96%, olivolja,
intralipid och PBS (fosfatbuffertlösning)
Behandling av möss med reagens intraperitonealt (ip) eller
intravenöst (iv):
Reagensen lösta i ett av lösningsmedlen späddes till
den önskade koncentrationen i PBS eller i intralipid, och
0,2 ml därav infördes ip i tvâ doser. Den första 3 h före
antigenet, den andra 24 h senare. Aktiviteten hos de stu-
derade analogerna jämfördes med aktiviteten hos CLA och
CS-A.
Behandling av möss med reagens per os (po), direkt i
EEHÉE*
Reagensen lösta i ett av lösningsmedlen, spädda till
den önskade koncentrationen i olivolja, PBS eller i intra-
lipid, infördes i volymen 0,2 ml i djuret. Första dosen
3 h före antigenet, andra dosen 24 h eller 48 h senare.
De studerade derivatens aktivitet jämfördes med akti-
viteten hos CLA och CS-A.
Effekt av CLA-analoger pá humoral immun respons 1 möss som
immuniserats med SRBC
Möss injicerades intraperitonealt med 0,2 ml av en
10% suspension av SRBC i PBS, 3 h före antigenet infördes
den första dosen av reagenset ip, po eller iv. Efter 4 da-
gar bestämdes antalet plackbildande celler (PFC) i mjälten
i enlighet med Mishell-Dutton (Mishell R.I., Dutton R.W.:
J. Exp. Med., 1967, 126, 423). Den humorala immunrespon-
sens magnitud uttrycktes som antalet PFC per 106 spleno-
cyter. De erhållna resultaten ges i tabellerna A, B och C.
Effekt av CLA-analoger pà humoral immunrespons till SRBC
in vitro
Grundning av möss och isolering av mjältceller: Möss
7467 410
10
15
20
25
30
35
12
grundades intravenöst med 0,2 ml av en 1% suspension av
SRBC i PBS. Fyra dagar senare dödades djuren och deras
mjältar finhackades, pressades genom en plastsikt in i
0-83% NH4Cl som var buffrad med 0,017 M trisbuffert för
avlägsnande av erytrocyter. Sedan tvättades cellerna tre
ggr med PBS och àtersuspenderades slutligen i RPMI-medium
som var utökat med 10% fetalt kalvserum.
Odlingsbetingelser och bestämning av PFC-antal:
Till 1 ml mjältcellsuspension (5 x 106 celler/ml) sattes
0,1 ml av reagenset, följt av tillsättning av 0,1 ml av en
0,005% suspension av SRBC i cellodlingsmediet, och inkube-
rades under 4 dagar vid 37°C, 5% C02 och 100% fuktighet.
Antalet PFC mättes med användning av förfarandet enligt
Mishell-Dutton. Som en kontroll användes PBS eller lämplig
koncentration av lösningsmedlet. Experimenten utfördes med
användning av NUNC 24-well Tissue Culture Plate. Resulta-
ten visas i tabellerna D och E.
Effekt av CLA-analgger pá hypersensitivitet av fördröjd
typ (DTH)
Resultaten och beskrivning av testet ges i tabell F.
Immunosuppressiv aktivitet hos CLA-analoger i Graft-
versus-host-reakton (GvH)
Djur: Hybrid Fl (C33/Iiw x B6/Iiw) och B6-honmöss,
8-10 veckor gamla.
Preparering av parenterala celler:
B6-honmöss dödades, deras nodus popliteus pressades
genom en plastsikt i PBS. Sedan tvättades cellerna tre ggr
med PBS och àtersuspenderades i RPMI medium.
GvH-test:
GVH-reaktion utfördes i enlighet med Twist and Barnes
(Twist V.S., Barnes R.D.: Transplantation, 1973, 15,
1982). Hybridmöss, Fl (C3H x B6) injicerades subkutant i
vänstra baktrampdynan med 5 x 106 parenterala lymfoid-
celler (B). Éfter 7 dagar isolerades och vägdes dränerande
lymfknutor. Som en kontroll mättes vikten hos nodus popli-
teus som isolerats från det högra benet.
10
15
20
25
30
35
467 410
13
GVH-reaktionens intensitet uttrycktes som ett förhål-
lande mellan vikten hos popliteuslymfknutor isolerade fràn
vänster och höger ben (GvH-reaktionsindex). Resultaten ges
i tabell G.
Tabell A
Antalet PFC i mjåltcell hos möss som behandlats intraperi-
tonealt med tvà doser (-3 h och + 24 h efter SRBC) av
1-Mpa-LA-D-Cys-NH2, 1-Mpa-LA-Cys-NH2 och CLA löst i
Intralipidß (int.) (Fettemulsion för intravenös nutrition
från Kabi, Stockholm, Sverige)
Reagens P
pm/mus PFC/106 1 SE Studenttest
Kontroll int. 3047 358 -
1-Mpa-LA-D-Cys-NH2 1,0 1139 162 0,01
I I 10,0 586 77 0,001
1-Mpa-LA-Cys-NH2 1,0 860 64 0,001
I I 10,0 798 32 0,001
CLA 1,0 1649 339 0,05
10,0 864 74 0,001
Preparering och introduktion av substansen, se för-
klaring efter tabell C.
Resultaten är uttryckta som ett medeltal 1 SE (stan-
dardfel) av 6 möss.
10
15
20
25
30
35
'3467 4.10
14
Tabell B
Antalet PFC 1 mjälte hos möss som behandlats med tvá doser
(-3 h och 24 h efter SRBC) av CLA, CS-A och analoger en-
ligt uppfinningen lösta i olivolja, infört per os (po).
Reagens P
pm/mus PFC/106 1 SE Studenttest
Kontroll olivolja 2183 166 -
CLA 10 1016 125 0,05
100 314 73 0,001
CS-A 10 1092 209 0,01
100 753 51 0,001
1-Mpa-D-LA-D-Cys-NH2 10 802 112 0,01
I I 100 680 86 0,001
1-Mpa-LA-D-Cys-NH2 10 764 60 0,01
I I 100 477 45 0,001
1-Mpa-LA-Cys-NH2 10 687 136 0,01
I I 100 501 109 0,001
Resultaten är uttryckta som ett medeltal 1 SE av 6 möss.
f),
10
15
20
25
30
35
467 410
15
Tabell C
Antalet PFC i mjälte hos möss som behandlats intravenöst
(iv) med tvà doser av 1-Mpa-LA-Cys-NH CLA och CS-A
L___|
2!
lösta i intralipid (int)
Reagens P
pm/mus PFC/106 1 SE Studenttest
Kontroll PBS 1985 82 -
Kontroll int 2326 67 NS
1-Mpa-LA-Cys-NH2 0,01 1649 126 0,05
I I 0,1 1364 43 0,01
1,0 903 39 0,001
CLA 0,01 1943 77 NS
0,1 1475 97 0,02
1,0 1203 85 0,01
CS-A 0,01 1842 122 NS
0,1 1633 181 0,05
1,0 1158 50 0,01
Preparaten i en volym av 0,2 ml infördes tvà ggr, första
dosen 3 h före sensibilisering med antigen, den andra 24 h
senare. Preparering av CLA och 1-Mpa-LA-Cys-NH2:
L___|
2 mg av substansen löstes i 0,15 ml het etanol och 0,35 ml
intralipid, och späddes sedan till den önskade koncentra-
tionen i intralipid.
CS-A späddes direkt i intralipid till den önskade
koncentrationen. I kontrollen infördes 0,2 ml PBS eller
intralipid.
Resultaten är uttryckta som ett medeltal 1 SE av 6 möss.
_7467 410
10
15
20
25
30
35
16
Tabell D
Antalet PFC i mjältcellkulturer som behandlats med CLA,
CS-A och analoger enligt uppfinningen lösta i intralipid
(int)
Reagens P
um/brunn PFC/106 1 SE Studenttest
Kontroll PBS 4212 404 -
Kontroll int 4495 268 NS
CLA 0,01 2879 236 NS
0,1 865 27 0,001
1,0 537 80 0,001
CS-A 0,01 3020 184 NS
0,1 892 31 0,001
1,0 569 84 0,001
1-Mpa-D-LA-D-Cys-NH2 0,01 3047 370 NS
I I 0,1 2178 306 0,05
1,0 841 89 0,001
1-Mpa-LA-D-Cys-NH2 0,01 2985 272 NS
| o, 1 3100 279 ns
Z 1,0 119 45 0,001
1-Mpa-CLA-Cys-NH2 0,01 2388 226 0,05
I I 0,1 2286 301 0,05
1,0 436 70 0,001
Bg - 65 17 -
Resultaten är uttryckta som ett medeltal t SE av 6 brunnar.
Bg - bakgrund
10
15
20
25
30
35
467 410
17
Tabell E
Immunosuppressiv aktivitet hos CS-A och analoger enligt
uppfinningen mätt genom antalet PFC. I in vivo studier be-
handlades möss med två doser av preparaten lösta i Cremo-
phor eller olivolja. Första dosen 3 h före immunisering,
andra 24 h senare.
Reagens Administre- P
pm/mus ringssätt PFC/106 i SE
Kontroll "C" i.p. 1330 109 -
1-Mpa-LA-Cys-NH2 1 pg i.p. 1263 124 NS
l I 10 pg i.p. 700 90 0,01
1-Hmp-LA-Cys-NH2 1 pg i.p. 1178 111 NS
| I 10 pg i.p. 831 58 0,05
Kontroll PBS i.p. 1186 109 -
CS-A 1 pg i.p. 1350 120 NS
10 pg i.p. 839 105 0,05
Kontroll "C" i.p. 1122 144 -
1-Mpa-LA-Cys-NH2 10 pg i.p. 238 23 0,001
Kontroll PBS i.p. 1056 95 -
CS-A 10 pg i.p. 124 36 0,001
Kontroll "C" - cremophor i lämplig koncentration som krävs
för preparering av 10 pg av peptiden.
CS-A - löst i PBS.
4-67 410
18
Forts.
Kontroll "0l" p.o. 2428 329 -
5 1-Mpa-LA-Cys-NH 10 pg p.o. 1214 91 0,02
2
I I 100 pg p.o. 406 73 0,001
CS-A 10 pg p.o. 1888 272 NS
lo 100 pg p.o. 834 142 0,01
Kontroll "01" p.o. 1693 133 -
1-Mpa-LA-Cys-NH2 100 pg p.o. 444 66 0,001
15 I I
1-Hmp-LA-Cys-NH2 100 pg p.o. 672 74 0,001
20
Kontroll PBS p.o. 1788 219 -
CS-A 100 pg p.o. 561 88 0,001
25 Kontroll "C" in vitro 3690 321 -
1-Mpa-LA-Cys-NH2 1 pg/ml in vitro 65 11 0,001
30
CS-A 1 pg/ml in vitro 20 12 0,001
Kontroll "01" - olivolja
35
10
15
20
25
30
35
4-67 410
19
Tabell F
Effekten av CLA, CS-A och analoger enligt uppfinningen
lösta i olivolja pà hypersensitivitet av fördröjd typ
(DTH) i möss. Preparaten infördes per os (po) två ggr,
första dosen 3 h före sensibilisering, andra 48 h senare.
Reagens P
pm/mus Enheter 1 SE Studenttest
Kontroll olivolja 22,50 1,60 -
CLA 10 15,20 1,26 0,05
100 10,90 0,62 0,001
CS-A 10 13,5 0,86 0,01
100 10,2 0,95 0,001
1-Mpa-D-LA-D-Cys-NH2 10 12,6 0,70 0,01
I I 100 10,00 0,71 0,001
1-Mpa-LA-D-Cys-NH2 10 13,70 0,94 0,02
I I 100 11,20 0,65 0,001
1-Mpa-LA-Cys-NH2 10 11,7 0,50 0,01
I I 100 8,50 0,71 0,001
En enhet - 0,1 mm
DTH introducerades i möss i enlighet med Lagrange et
al (Lagrange P.H., Mackaness G.B., Miller T.E., Pardon P:
J. Immunol., 1975, 114, 447). Möss sensibiliserades intra-
venöst med 105 SRBC. Efter 4 dagar framkallades reaktionen
8 SRBC i vänstra
baktrampdynan. Reaktionens magnitud mättes som ökning av
genom en intradermal introduktion av 10
trampdynans tjocklek vid 24 h efter administrering av den
retande dosen.
Resultaten är uttryckta som ett medeltal i SE av 10 möss.
1467 410
10
15
20
25
30
35
20
Tabell G
Immunosuppressiv aktivitet hos 1-Mpa-LA-Cys-NH2 och
1-Hmp-LA-Cïs-NH2 i GvH-reaktion (celllulär immunitet).
fl
L__J
x?
Preparaten lösta i cremophor gavs i.p. -4 och 48 h före
respektive efter introduktion av parenterala celler.
Reagens Administre- GVH 1 SE P
pm/mus ringssätt (index)
Kontroll "C" i.p. 3,17 0,36 -
1-Mpa-LA-Cys-NH2 10 pg i.p. 1,96 0,27 0,05
1-Hmp-LA-Cys-NH2 10 pg i.p. 1,54 0,22 0,01
Kontroll PBS i.p. 3,09 0,42 -
CS-A 10 pg i.p. 1,41 0,16 0,001
Kontroll PBS - fosfatbuffertlösning
Kontroll "C"
cremophor vid en koncentration som krävs
för att lösa 10 pg av peptiderna eller
1 pg (i in vitro)
Kontroll "0l" - olivolja
I)
Claims (10)
- l. Analog av cyklolinopeptid A, k ä n n e t e c k - n a d av en cyklisk formel som härrör från cyklolinpep- tid A-sekvensen Val-Pro-Pro-Phe he I,/f Leu-Ile-Ile-Leu vilken sekvens är utökad mellan vilka som helst tvá amino- syrarester med följande cystinderivatrest c-o nu I I X-C-H H-C-Y I I cnz cnz 1 vilken X är vald bland -H och -OH, och Y är vald bland -C-0 och -H, NH2 vari aminosyraresterna har L- eller D-konfiguration.
- 2. Analog enligt kravet l, vari nämnda cystinderivat- rest år belägen mellan aminosyraresterna Leu och Phe i formeln för cyklolinopeptid A.
- 3. Analog enligt kravet 2, vari X är -H och Y är -C-O, och I "H2 alla aminosyrarester har L-konfiguration. '467 410 10 15 20 25 30 35 22
- 4. Analog enligt kravet 2, vari X är -H och Y är -C=O, och I “H2 cystinderivatresten har D-konfiguration och resten av aminosyraresterna har L-konfiguration.
- 5. Analog enligt kravet 2, vari X är -OH och Y är -C=0, och I NH2 alla aminosyrarester har L-konfiguration.
- 6. Analog enligt kravet 2, vari X är -H och Y är -C-0, och I NH2 alla aminosyrarester har D-konfiguration.
- 7. Analog enligt nagot av kraven 1-6 för användning som ett läkemedel.
- 8. Analog enligt något av kraven 1-6 för användning som ett immunosuppressivt medel.
- 9. Användning av en analog enligt något av kraven l-6 för framställning av ett läkemedel för immunosuppressiv behandling.
- 10. Farmaceutiskt preparat omfattande, som en aktiv ingrediens, en analog enligt något av kraven l-6, till- sammans med en eller flera farmaceutiskt acceptabla bärare, konstituenter och/eller spädmedel. g»
Priority Applications (8)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SE9003040A SE467410B (sv) | 1990-09-25 | 1990-09-25 | Analoger av cyklolinopeptid a och anvaendning daerav |
AU86531/91A AU8653191A (en) | 1990-09-25 | 1991-09-18 | Analogues of cyclolinopeptide a and the use thereof |
CA 2090859 CA2090859A1 (en) | 1990-09-25 | 1991-09-18 | Analogues of cyclolinopeptide a and the use thereof |
EP19910917536 EP0553133A1 (en) | 1990-09-25 | 1991-09-18 | Analogues of cyclolinopeptide a and the use thereof |
HU93847A HU9300847D0 (en) | 1990-09-25 | 1991-09-18 | Cyclolinopeptone a-analogues and their utilization |
PCT/SE1991/000628 WO1992005189A1 (en) | 1990-09-25 | 1991-09-18 | Analogues of cyclolinopeptide a and the use thereof |
FI931259A FI931259A0 (fi) | 1990-09-25 | 1993-03-22 | Analoger av cyklolinopeptid a och deras framstaellning |
NO931091A NO931091D0 (no) | 1990-09-25 | 1993-03-24 | Analoger av cycloinpeptid a og anvendelse derav |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SE9003040A SE467410B (sv) | 1990-09-25 | 1990-09-25 | Analoger av cyklolinopeptid a och anvaendning daerav |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SE9003040D0 SE9003040D0 (sv) | 1990-09-25 |
SE9003040L SE9003040L (sv) | 1992-03-26 |
SE467410B true SE467410B (sv) | 1992-07-13 |
Family
ID=20380440
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SE9003040A SE467410B (sv) | 1990-09-25 | 1990-09-25 | Analoger av cyklolinopeptid a och anvaendning daerav |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0553133A1 (sv) |
AU (1) | AU8653191A (sv) |
CA (1) | CA2090859A1 (sv) |
FI (1) | FI931259A0 (sv) |
HU (1) | HU9300847D0 (sv) |
SE (1) | SE467410B (sv) |
WO (1) | WO1992005189A1 (sv) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2571710A1 (en) | 2004-06-24 | 2006-11-02 | Nicholas Valiante | Small molecule immunopotentiators and assays for their detection |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE8804640L (sv) * | 1988-12-23 | 1990-06-24 | Ferring Ab | Laekemedel omfattande cyklolinopeptide a |
-
1990
- 1990-09-25 SE SE9003040A patent/SE467410B/sv not_active IP Right Cessation
-
1991
- 1991-09-18 CA CA 2090859 patent/CA2090859A1/en not_active Abandoned
- 1991-09-18 AU AU86531/91A patent/AU8653191A/en not_active Abandoned
- 1991-09-18 HU HU93847A patent/HU9300847D0/hu unknown
- 1991-09-18 WO PCT/SE1991/000628 patent/WO1992005189A1/en not_active Application Discontinuation
- 1991-09-18 EP EP19910917536 patent/EP0553133A1/en not_active Withdrawn
-
1993
- 1993-03-22 FI FI931259A patent/FI931259A0/fi not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
SE9003040D0 (sv) | 1990-09-25 |
FI931259A (fi) | 1993-03-22 |
SE9003040L (sv) | 1992-03-26 |
HU9300847D0 (en) | 1993-06-28 |
FI931259A0 (fi) | 1993-03-22 |
EP0553133A1 (en) | 1993-08-04 |
WO1992005189A1 (en) | 1992-04-02 |
AU8653191A (en) | 1992-04-15 |
CA2090859A1 (en) | 1992-03-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5780021A (en) | Method for treating type 1 diabetes using α-interferon and/or β-i | |
JP4350898B2 (ja) | 活性の特徴が改善された新規のシクロスポリン | |
US9879047B2 (en) | Template-fixed peptidomimetics | |
US5177189A (en) | Polypeptide analogs of Apolipoprotein E | |
US5464816A (en) | Method and pharmaceutical compositions for treating immunodeficiencies | |
US10357537B2 (en) | Cyclotides as immunosuppressive agents | |
JPH07507330A (ja) | ポリペプチドのボンベシン拮抗物質 | |
SE501677C2 (sv) | Biologiskt aktiva vasopressinanaloger, farmaceutiska preparat innehållande dem samt deras användning för framställning av läkemedel | |
JPH02504274A (ja) | ヒトインシユリンアナログ類 | |
SE467410B (sv) | Analoger av cyklolinopeptid a och anvaendning daerav | |
US4347242A (en) | Hypocalcaemic peptides and process for their manufacture | |
JPH04500363A (ja) | 心房ペプチド誘導体 | |
Marastoni et al. | Structure–activity relationships of cyclic and linear peptide T analogues | |
Ciardelli et al. | Activity of synthetic thymosin. alpha. 1 C-terminal peptides in the azathioprine E-rosette inhibition assay | |
WO1990007523A1 (en) | Medicament comprising cyclolinopeptide a | |
JPH09502175A (ja) | 免疫およびcns療法に有用な新規トリペプチド | |
USRE32347E (en) | Hypocalcaemic peptides and process for their manufacture | |
KR0141973B1 (ko) | 신규의 생리활성 펩티드 및 이를 유효성분으로서 함유한 칼슘대사 조절제 | |
JP2628082B2 (ja) | 免疫抑制剤 | |
EP1937710B1 (en) | Kinin b1 receptor peptide agonists and uses thereof | |
Choy et al. | The effect of ethanol anesthesia on the accumulation of 3H‐lysine into different brain regions, plasma, muscle and liver in the rat | |
KR820000188B1 (ko) | 티모신(Thymosin) α₁의 제조방법 | |
Różycki et al. | New cyclosporin a analogue: Synthesis and immunosuppressive activity | |
IE903416A1 (en) | Medicament comprising antamanide | |
JPH04321699A (ja) | 新規な利尿ペプチド |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
NUG | Patent has lapsed |
Ref document number: 9003040-4 Effective date: 19940410 Format of ref document f/p: F |