SE467410B - Analoger av cyklolinopeptid a och anvaendning daerav - Google Patents

Description

“A67 410 10 15 20 25 30 35 2 som ett immunosuppressivt medel, och detta har beskrivits i vår tidigare svenska patentansökan nr 8804640-4 inlämnad den 23 december 1988 (motsvarande PCT-ansökan PCT/SE89/00732).

Immunosuppressiv behandling av en patient som är i behov därav kräver att stora mängder av det immunosuppres- siva medlet används. När cyklolinopeptid A syntetiseras i enlighet med den metod som användes i var tidigare patent- ansökan gär 60-70% av den linjära peptiden förlorad under cykliseringen. Det är uppenbart att storskalig produktion av cyklolinopeptid A är mycket dyr, och industriell pro- duktion av cyklolinopeptid A har därför skjutits upp.

Vi fann emellertid överraskande att den immuno- suppressiva aktiviteten hos cyklolinopeptid A bibehålls när dess sekvens utökas med en cystinderivatrest. De nya analogerna av cyklolinopeptid A möjliggör storskalig pro- duktion därav, eftersom praktiskt taget ingen linjär pep- tid går förlorad vid cykliseringssteget.

Beskrivning av uppfinningen I en aspekt av uppfinningen àstadkommes nya analoger av cyklolinopeptid A som har en cyklisk formel som härrör fràn cyklolinopeptid A-sekvensen Val-Pro-Pro-Phe ha Lau-Ile-Ile-Lau*//I vilken sekvens är utökad mellan vilka som helst tvà amino- syrarester med följande cystinderivatrest c-o NH | I x-c-H H-c-Y I I CHZ cnz 10 15 20 25 30 35 467 410 3 i vilken X är vald bland -H och -OH, och Y är vald bland -C=O och -H, "H2 vari aminosyraresterna har L- eller D-konfiguration.

I en föredragen utföringsform av denna aspekt av upp- finningen är den ovan angivna cystinderivatresten belägen mellan aminosyraresterna Leu och Phe i formeln för cyklo- linopeptid A. I själva verket var läget för nämnda cystin- derivatrest i cyklolinopeptid A-sekvensen vald pá máfà.

Sålunda kan man vänta sig att den immunosuppressiva akti- viteten hos cyklolinopeptid A bibehålls oberoende av mellan vilka tvâ aminosyrarester i sekvensen därav cystin- derivatresten införs. ' I en ytterligare aspekt av uppfinningen àstadkommes en analog enligt uppfinningen för användning som ett läke- medel.

I en annan aspekt av uppfinningen åstadkommas använd- ning av en analog enligt uppfinningen för framställning av ett läkemedel för immunosuppressiv behandling.

I ytterligare en annan aspekt av uppfinningen åstad- kommes ett sätt att behandla ett däggdjur, inbegripet människan, som är i behov av immunosuppressiv behandling, vilket omfattar administrering åt nämnda däggdjur av en farmakologiskt effektiv mängd av en analog enligt upp- finningen.

I ännu en annan aspekt av uppfinningen àstadkommes ett farmaceutiskt preparat som omfattar en analog enligt uppfinningen tillsammans med en eller flera farmaceutiskt acceptabla bärare, konstituenter och/eller spädmedel.

Den mängd av en analog enligt uppfinningen som skall administreras àt ett däggdjur som är i behov av immuno- suppressiv behandling måste avgöras av en läkare som har erfarenhet av immunosuppressiv terapi. .ré- O\ -q 10 15 20 25 30 35 ...._\ 4 Den farmaceutiska beredningen som omfattar en analog enligt uppfinningen kan formuleras till orala preparat eller preparat för infusion med användning av en eller flera farmaceutiskt acceptabla bärare, konstituenter och/eller spädmedel som är lämpliga för sådana preparat, varvid man bör komma ihág att nämnda analog är olöslig i vatten. Det farmaceutiska preparatet kan t ex omfatta en analog enligt uppfinningen i en farmakologiskt effektiv mängd suspenderad i en olivolja.

Föreliggande uppfinning avslöjar att analogerna en- ligt uppfinningen har immunosuppressiv aktivitet, vilken är jämförbar med den hos Ciclosporin (även kallad Cyclo- sporin A) och Cyklolinopeptid A. Följaktligen skall analo- gerna enligt uppfinningen användas i läkemedel för immuno- suppressiv behandling av däggdjur, inbegripet människan, för alla de indikationer där immunosuppressiv behandling är motiverad. Exempel på när immunosuppressiv behandling är motiverad är för förebyggande av allograft-avstötning efter organtransplantation och benmärgstransplantation, profylaktisk eller terapeutisk behandling av graft-versus- host-disease (GVHD), och autoimmuna sjukdomar, såsom systemisk lupus erythematosus (SLE), reumatoid artrit (RA) och diabetes mellitus.

Kort beskrivningkav ritningarna Fig 1 visar ett diagram avseende inhibering av PPIas aktivitet genom Cyklosporin A.

Fig 2 visar ett diagram avseende inhibering av PPIas aktivitet genom CLA, LA och 1-Mpa-LA-Cys-NH L___| Syntes av CLA-analgger enligt uppfinningen 20 CLA-analogerna enligt uppfinningen kan framställas genom vilken som helst känd metod på peptidkemiomràdet, varigenom en linjär peptid bildas, vilken sedan underkas- tas ett oxidationssteg för att cyklisera tvà cysteinbe- släktade rester, varigenom en svavelbrygga bildas mellan nämnda rester, sålunda bildande en cystinderivatrest. ä!! 10 15 20 25 30 35 467 410 5 De linjära linopeptid(LA)-analogerna enligt uppfin- ningen kan sålunda syntetiseras på konventionellt sätt, t ex genom stegvis koppling av en aminosyrarest till nästa i vätskefas, t ex i enlighet med metoden enligt Law, H.B. & Du Vigneaud, V.:J. Am. Chem. Soc. §g (1960) 4579-4581; Zhuze, A.L., Jost, K. Kasafirek, E. & Rudinger, J.: Coll. Czechslovak Chem Commun. 22 (1964) 2648-2662, modifierad av Larsson L.-E., Lindeberg, G., Melin, P. & Pliska, V.: J. Med. Chem. gl (1978) 352-356. Kopplingen av aminosyrarester till varandra, varigenom s k peptidbind- ningar bildas, kan också utföras utgående från en fast fas (vanligen ett harts) till vilken den första aminosyrans C-terminal kopplas, varpå nästa aminosyras C-terminal kopplas till den första aminosyrans N-terminal, etc, och slutligen frisätts den uppbyggda peptiden från den fasta fasen. I de nedan angivna exemplen har den s k fastfas- tekniken utnyttjats i enlighet med metoden enligt Merri- field, R.B.: J. Am. Chem. Soc. §§ 1963) 2149; Merrifield, R.B.: Biochem. § (1964) 1385 och König, W, & Geiger, R.: Chem. Ber. lQ§ (1970) 788.

Generell syntesbeskrivning Alla peptiderna i de nedan angivna exemplen synteti- serades på en Applied Biosystems 430A Peptide Synthesizer med användning av ett dubbelkopplingsprogram med termine- ringssteg efter den andra kopplingen. Det harts som använ- des var av 4-metyl-benshydrylamintyp med en teoretisk be- lastning av 0,66 meq/g (Peptides International, Louis- ville, KY, USA). Syntesslutprodukten torkades i vakuum över natten. Sedan spjälkades peptiden från hartset genom behandling med flytande vätefluorid i närvaro av anisol och etyl-metyl-sulfid som scavangers (katjonfångare) (HF:anisol:EMS-10:05:05). Efter avlägsnande av vätefluo- riden genom avdunstning suspenderades återstoden i etyl- acetat (100 ml) och filtrerades. Fastämnet tvättades på filter med ytterligare etylacetat (3 x 100 ml) och den spjälkade peptiden extraherades med ättiksyra (100 ml).

Extraktet spåddes genast till en volym av 2 cma med 20% ¶Å4e7 410 10 15 20 25 30 35 6 ättiksyra i metanol och behandlades med 0,1 M lösning av jod i metanol tills en svagt brun färg kvarstod. Sedan tillsattes Dowex 1 x 8 jonbytare i acetatform (3 g) (Bio-Rad, Richmond, CA, USA) och blandningen filtrerades.

Filtratet indunstades och återstoden frystorkades ur 1% ättiksyra i vatten. Produkten renades sedan genom "reversed phase" vätskekromatografi på en kolonn som var fylld med Vydac 20-25 p (Separation Group, CA, USA) i ett lämpligt system innehållande acetonitril i O,1% trifluoro- ättiksyra-vattenlösning. Proverna som uppsamlades från kolonnen analyserades genom analytisk HPLC (Varian 5500, Sunnyvale, CA, USA) som var utrustad med en Bondapak C18 kolonn (Millipore, Milford, Mass., USA). Fraktioner som innehöll ren substans sammanfördes, lösningsmedlet av- dunstades och produkten frystorkades ur 1% ättiksyra i vatten. Den slutliga HPLC-analysen utfördes pà färdig pro- dukt och strukturen för peptiden ifråga bekräftades genom aminosyraanalys samt FAB-MS (Fast atom bombardment spect- rometry). FAB-MS-analyserna utfördes av M-Scan Ltd.

Sunninghill, Ascot, Berkshire, England.

Alla aminosyror som användes under syntesen skyddades med tert-butoxikarbonylgrupp vid a-aminofunktionen. Tiol- funktionen hos Mpa, Hmp och Cys skyddades med 4-metoxiben- sylgrupp. Aminosyraderivaten levererades av Bachem AG, Schweiz.

I de nedanstående exemplen används förkortningen LA för den linjära peptiden Leu-Ile-Ile-Leu-Val-Pro-Pro- -Phe-Phe.

EXEMPEL 1 1-Mpa-LA-Cys-NH L___| Peptiden framställdes i enlighet med den allmänna syntesbeskrivningen. 3-merkaptopropionsyra [S-(p-me- 2 toxi-)bensyl] användes för position 1. 10 15 20 25 30 35 4657 4'1Û Renhet (HPLC):99,8% Strukturen bekräftades genom aminosyraanalys och genom FAB-Ms. [M+u]*- 1246.

EXEMPEL II 1-Mpa-LA-D-Cys-NH l_____| Peptiden framställdes i enlighet med den allmänna syntesbeskrivningen. 3-merkaptopropionsyra[S-(p-me- toxi-)bensyl] användes för position 1 och Boc-D-cys- 2 tein[-(p-metoxi-)-bensyl] för position 2.

Renhet (HPLC):95,7% Strukturen bekräftades genom aminosyraanalys och genom FAB-MS. [M+H]+- 1246.

EXEPEL III 1-Hmp-LA-Cys-NH2 Peptiden framställdes i enlighet med den allmänna syntesbeskrivningen. 2-hydroxi-3-merkaptopropionsyra an- vändes för position 1.

Renhet (HPLC):97,5% Strukturen bekräftades genom aminosyraanalys och genom FAB-MS. [M+H]+- 1262.

EXEMPEL IV 1-Mpa-D-LA-D-Cys-NH l__| Peptiden framställdes i enlighet med den allmänna syntesbeskrivningen med användning av aminosyror med 2 D-konfiguration. '4-67 410 8 3-merkaptopropionsyra[S-(p-metoxi-)bensyl] användes för position 1.

Renhet (HPLC):98,0% Strukturen bekräftades genom aminosyraanalys och 5 genom FAB-MS: [M+H]+= 1246.

Lista pà föreningar som använts som enzyminhibitorer och som immunosuppressiva medel CS-A = Cyklosporin A (Referens) 10 CLA = Cyklolinopeptid A (Referens) 1fMpa-LA-Cys-NH2 Lau-Val-Pro-Pro-Phe = /Pfi-xe 15 . Ile~Ile-Leu-Mpa Cys-NH2 (Förening enligt exempel 1) 1-Mpa-LA-D-Cys-NH2 Leu-Val-Pro-Pro-Phe \ = Phe 20 Ile-Ile-Lau-Mpa D-Cys-NH2 (Förening enligt exempel 2) 25 1-Hmp-LA-Cys-NH2 Lau-Val-Pro-Pro-Phe Phe ll Ile-Ile-Leu-Hmp Cys-NH2 30 (Förening enligt exempel 3) 1-Mpa-D-LA-D-Cys-NH2 D-Leu-D-Val-D-Pro-D-Pro-D-PQÉ = D-Phe 35 D-Ile-D-Ile-D-Leu-Mpa D-Cys-NH (Förening enligt exempel 4) 10 15 20 25 30 35 467 410 9 där Mpa är 3-merkapropropionylrest (-S-CH2-CH2-CO-) och Hmp är 2-hydroxi-3-merkaptopropionylrest OH (-S-CH2-CH-CO-) Inhibering av enzymet PPIas Det är känt att peptidyl-prolyl-cis-trans-isomeras (PPIas) katalyserar cis-trans-isomeriseringen av prolin- imid-peptid-bindningar i oligopeptider och Nobuhiro Takahashi, et al (Nature vol. 337, Letters to Nature, pp 473-475, 1989) föreslog att PPIasets peptidyl-prolyl- cis-trans-isomeriserande aktivitet kan vara involverad i i T-cellakti- Gunter företeelser, såsom de som förekommer tidigt vering, vilka undertrycks av cyklosporin A.

Fischer, et al (Nature vol. 337, Letters to pp 476-478, 1989) rapporterade att PPIas antagligen är identiskt med cyklofilin, ett nyligen upptäckt däggdjurs- protein som starkt binder till cyklosporin A. Vi har renat Nature, PPIas och testat analoger enligt uppfinningen som PPIas- inhibitorer.

Rening av PPIas Cortex frán grisnjure homogeniserades i lika volym sackaros (0,2 M) och centrifugerades 60 min vid 10 000 x g. Supernatanten justerades till PH 5,5 genom tillsättning av l M acetatbuffert, pH 4,0. Fällningen kasserades och supernatanten brinades till pH 7,0.

Extraktet bringades till 40% mättnad av ammoniumsul- fat. Till supernatanten som erhölls efter 15 min centrifu- gering vid 20 000 x g sattes fast natriumsulfat för erhål- lande av en slutlig mättnad av 60%. Fällningen som erhölls genom centrifugering löstes i en liten volym 10 mM tris- buffert, pH 7,6 och dialyserades 24 h mot samma buffert.

Den dialyserade lösningen sattes pà en DEAE-Sephadex A-50 kolonn, vilken i förväg hade jämviktsinställts med samma buffert, och eluerades utan att bufferten ändrades. Elua- tet som var rikt pà PPIas-aktivitet passerade genom kolonnen i en aktiv topp. -467 410 10 15 20 25 30 35 10 De aktiva fraktionerna sattes på en CM-Sephadex C-50 kolonn och eluerades med en linjär gradient av KCl (0-1,2 M) som en aktiv topp.

Enzymet lagrades som suspension 1 60% mättat ammo- niumsulfat. Efter 5 månader uppvisade enzymet full ezyma- tisk aktivitet.

Bestämning av PPIas-aktivitet Cis-transisomerisering av Ala-Pro-peptidbindningen hos peptiden N-succinyl-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilid mättes i en kopplad analys med kymotrypsin. Substrat (50 pM), i förväg upplöst i DMSO, jämviktsinställdes vid l0°C med den lämpliga mängden PPIas i termostaterad elektrofotometer- cell. Reaktionen påbörjades vid tillsättning av kymotryp- sin (slutlig koncentration 21 pM). Trans-peptiden spjälka- des inom dödtiden. Cis-transisomeriseringshastigheten följdes genom minskningen av transmittans vid 390 nm.

Spektrofotometern Specord UV-Vis (Jena, GDR) som var ut- rustad med en cellomrörare användes.

Inhibitorernas effekt på PPIas undersöktes genom blandning av den studerade substansen med PPIas under 1 min före inkubering av substratet. Substanserna som testades löstes i dioxan som innehöll 0,5-1% Triton X-100 eller i DMSO. Ingen skillnad observerades ifråga om effekt pà PPIas-aktivitet beroende pá typen av lösningsmedel.

Resultaten ges i fig 1 och fig 2, där log av skill- naden mellan transmittans vid stationärt tillstànd Ax och transmittans vid en given tidpunkt At plottades mot tiden.

Hastighetskonstanten av första ordningen k (s_1) beräk- nades fràn de resulterande räta linjerna.

Immunosuppressiv aktivitet hos CLA, CS-A och analogerna enligt uppfinningen Material och metoder Djur: CBA/Iiw möss 8-10 veckor gamla Antigen: SRBC (röda blodkroppar fràn får) 1-Mpa-LA-Cys-NH2, 1-Mpa-D-La-D-Cys-NH |__||___| Reagens: 2, 10 15 20 25 30 35 467 410 11 1-Mpa-LA-D-Cys-NH2, och CLA framställdes av l___| FERRING AB, Sverige, och cyklosporin A (CS-A), Sandimmun Sandoz, Basel, Schweiz Lösningsmedel: Blandning av Cremophor El (SIGMA) och 94% etanol (6,5 : 3,5), etanol 96%, olivolja, intralipid och PBS (fosfatbuffertlösning) Behandling av möss med reagens intraperitonealt (ip) eller intravenöst (iv): Reagensen lösta i ett av lösningsmedlen späddes till den önskade koncentrationen i PBS eller i intralipid, och 0,2 ml därav infördes ip i tvâ doser. Den första 3 h före antigenet, den andra 24 h senare. Aktiviteten hos de stu- derade analogerna jämfördes med aktiviteten hos CLA och CS-A.

Behandling av möss med reagens per os (po), direkt i EEHÉE* Reagensen lösta i ett av lösningsmedlen, spädda till den önskade koncentrationen i olivolja, PBS eller i intra- lipid, infördes i volymen 0,2 ml i djuret. Första dosen 3 h före antigenet, andra dosen 24 h eller 48 h senare.

De studerade derivatens aktivitet jämfördes med akti- viteten hos CLA och CS-A.

Effekt av CLA-analoger pá humoral immun respons 1 möss som immuniserats med SRBC Möss injicerades intraperitonealt med 0,2 ml av en 10% suspension av SRBC i PBS, 3 h före antigenet infördes den första dosen av reagenset ip, po eller iv. Efter 4 da- gar bestämdes antalet plackbildande celler (PFC) i mjälten i enlighet med Mishell-Dutton (Mishell R.I., Dutton R.W.: J. Exp. Med., 1967, 126, 423). Den humorala immunrespon- sens magnitud uttrycktes som antalet PFC per 106 spleno- cyter. De erhållna resultaten ges i tabellerna A, B och C.

Effekt av CLA-analoger pà humoral immunrespons till SRBC in vitro Grundning av möss och isolering av mjältceller: Möss 7467 410 10 15 20 25 30 35 12 grundades intravenöst med 0,2 ml av en 1% suspension av SRBC i PBS. Fyra dagar senare dödades djuren och deras mjältar finhackades, pressades genom en plastsikt in i 0-83% NH4Cl som var buffrad med 0,017 M trisbuffert för avlägsnande av erytrocyter. Sedan tvättades cellerna tre ggr med PBS och àtersuspenderades slutligen i RPMI-medium som var utökat med 10% fetalt kalvserum.

Odlingsbetingelser och bestämning av PFC-antal: Till 1 ml mjältcellsuspension (5 x 106 celler/ml) sattes 0,1 ml av reagenset, följt av tillsättning av 0,1 ml av en 0,005% suspension av SRBC i cellodlingsmediet, och inkube- rades under 4 dagar vid 37°C, 5% C02 och 100% fuktighet.

Antalet PFC mättes med användning av förfarandet enligt Mishell-Dutton. Som en kontroll användes PBS eller lämplig koncentration av lösningsmedlet. Experimenten utfördes med användning av NUNC 24-well Tissue Culture Plate. Resulta- ten visas i tabellerna D och E.

Effekt av CLA-analgger pá hypersensitivitet av fördröjd typ (DTH) Resultaten och beskrivning av testet ges i tabell F.

Immunosuppressiv aktivitet hos CLA-analoger i Graft- versus-host-reakton (GvH) Djur: Hybrid Fl (C33/Iiw x B6/Iiw) och B6-honmöss, 8-10 veckor gamla.

Preparering av parenterala celler: B6-honmöss dödades, deras nodus popliteus pressades genom en plastsikt i PBS. Sedan tvättades cellerna tre ggr med PBS och àtersuspenderades i RPMI medium.

GvH-test: GVH-reaktion utfördes i enlighet med Twist and Barnes (Twist V.S., Barnes R.D.: Transplantation, 1973, 15, 1982). Hybridmöss, Fl (C3H x B6) injicerades subkutant i vänstra baktrampdynan med 5 x 106 parenterala lymfoid- celler (B). Éfter 7 dagar isolerades och vägdes dränerande lymfknutor. Som en kontroll mättes vikten hos nodus popli- teus som isolerats från det högra benet. 10 15 20 25 30 35 467 410 13 GVH-reaktionens intensitet uttrycktes som ett förhål- lande mellan vikten hos popliteuslymfknutor isolerade fràn vänster och höger ben (GvH-reaktionsindex). Resultaten ges i tabell G.

Tabell A Antalet PFC i mjåltcell hos möss som behandlats intraperi- tonealt med tvà doser (-3 h och + 24 h efter SRBC) av 1-Mpa-LA-D-Cys-NH2, 1-Mpa-LA-Cys-NH2 och CLA löst i Intralipidß (int.) (Fettemulsion för intravenös nutrition från Kabi, Stockholm, Sverige) Reagens P pm/mus PFC/106 1 SE Studenttest Kontroll int. 3047 358 - 1-Mpa-LA-D-Cys-NH2 1,0 1139 162 0,01 I I 10,0 586 77 0,001 1-Mpa-LA-Cys-NH2 1,0 860 64 0,001 I I 10,0 798 32 0,001 CLA 1,0 1649 339 0,05 10,0 864 74 0,001 Preparering och introduktion av substansen, se för- klaring efter tabell C.

Resultaten är uttryckta som ett medeltal 1 SE (stan- dardfel) av 6 möss. 10 15 20 25 30 35 '3467 4.10 14 Tabell B Antalet PFC 1 mjälte hos möss som behandlats med tvá doser (-3 h och 24 h efter SRBC) av CLA, CS-A och analoger en- ligt uppfinningen lösta i olivolja, infört per os (po).

Reagens P pm/mus PFC/106 1 SE Studenttest Kontroll olivolja 2183 166 - CLA 10 1016 125 0,05 100 314 73 0,001 CS-A 10 1092 209 0,01 100 753 51 0,001 1-Mpa-D-LA-D-Cys-NH2 10 802 112 0,01 I I 100 680 86 0,001 1-Mpa-LA-D-Cys-NH2 10 764 60 0,01 I I 100 477 45 0,001 1-Mpa-LA-Cys-NH2 10 687 136 0,01 I I 100 501 109 0,001 Resultaten är uttryckta som ett medeltal 1 SE av 6 möss. f), 10 15 20 25 30 35 467 410 15 Tabell C Antalet PFC i mjälte hos möss som behandlats intravenöst (iv) med tvà doser av 1-Mpa-LA-Cys-NH CLA och CS-A L___| 2! lösta i intralipid (int) Reagens P pm/mus PFC/106 1 SE Studenttest Kontroll PBS 1985 82 - Kontroll int 2326 67 NS 1-Mpa-LA-Cys-NH2 0,01 1649 126 0,05 I I 0,1 1364 43 0,01 1,0 903 39 0,001 CLA 0,01 1943 77 NS 0,1 1475 97 0,02 1,0 1203 85 0,01 CS-A 0,01 1842 122 NS 0,1 1633 181 0,05 1,0 1158 50 0,01 Preparaten i en volym av 0,2 ml infördes tvà ggr, första dosen 3 h före sensibilisering med antigen, den andra 24 h senare. Preparering av CLA och 1-Mpa-LA-Cys-NH2: L___| 2 mg av substansen löstes i 0,15 ml het etanol och 0,35 ml intralipid, och späddes sedan till den önskade koncentra- tionen i intralipid.

CS-A späddes direkt i intralipid till den önskade koncentrationen. I kontrollen infördes 0,2 ml PBS eller intralipid.

Resultaten är uttryckta som ett medeltal 1 SE av 6 möss. _7467 410 10 15 20 25 30 35 16 Tabell D Antalet PFC i mjältcellkulturer som behandlats med CLA, CS-A och analoger enligt uppfinningen lösta i intralipid (int) Reagens P um/brunn PFC/106 1 SE Studenttest Kontroll PBS 4212 404 - Kontroll int 4495 268 NS CLA 0,01 2879 236 NS 0,1 865 27 0,001 1,0 537 80 0,001 CS-A 0,01 3020 184 NS 0,1 892 31 0,001 1,0 569 84 0,001 1-Mpa-D-LA-D-Cys-NH2 0,01 3047 370 NS I I 0,1 2178 306 0,05 1,0 841 89 0,001 1-Mpa-LA-D-Cys-NH2 0,01 2985 272 NS | o, 1 3100 279 ns Z 1,0 119 45 0,001 1-Mpa-CLA-Cys-NH2 0,01 2388 226 0,05 I I 0,1 2286 301 0,05 1,0 436 70 0,001 Bg - 65 17 - Resultaten är uttryckta som ett medeltal t SE av 6 brunnar.

Bg - bakgrund 10 15 20 25 30 35 467 410 17 Tabell E Immunosuppressiv aktivitet hos CS-A och analoger enligt uppfinningen mätt genom antalet PFC. I in vivo studier be- handlades möss med två doser av preparaten lösta i Cremo- phor eller olivolja. Första dosen 3 h före immunisering, andra 24 h senare.

Reagens Administre- P pm/mus ringssätt PFC/106 i SE Kontroll "C" i.p. 1330 109 - 1-Mpa-LA-Cys-NH2 1 pg i.p. 1263 124 NS l I 10 pg i.p. 700 90 0,01 1-Hmp-LA-Cys-NH2 1 pg i.p. 1178 111 NS | I 10 pg i.p. 831 58 0,05 Kontroll PBS i.p. 1186 109 - CS-A 1 pg i.p. 1350 120 NS 10 pg i.p. 839 105 0,05 Kontroll "C" i.p. 1122 144 - 1-Mpa-LA-Cys-NH2 10 pg i.p. 238 23 0,001 Kontroll PBS i.p. 1056 95 - CS-A 10 pg i.p. 124 36 0,001 Kontroll "C" - cremophor i lämplig koncentration som krävs för preparering av 10 pg av peptiden.

CS-A - löst i PBS. 4-67 410 18 Forts.

Kontroll "0l" p.o. 2428 329 - 5 1-Mpa-LA-Cys-NH 10 pg p.o. 1214 91 0,02 2 I I 100 pg p.o. 406 73 0,001 CS-A 10 pg p.o. 1888 272 NS lo 100 pg p.o. 834 142 0,01 Kontroll "01" p.o. 1693 133 - 1-Mpa-LA-Cys-NH2 100 pg p.o. 444 66 0,001 15 I I 1-Hmp-LA-Cys-NH2 100 pg p.o. 672 74 0,001 20 Kontroll PBS p.o. 1788 219 - CS-A 100 pg p.o. 561 88 0,001 25 Kontroll "C" in vitro 3690 321 - 1-Mpa-LA-Cys-NH2 1 pg/ml in vitro 65 11 0,001 30 CS-A 1 pg/ml in vitro 20 12 0,001 Kontroll "01" - olivolja 35 10 15 20 25 30 35 4-67 410 19 Tabell F Effekten av CLA, CS-A och analoger enligt uppfinningen lösta i olivolja pà hypersensitivitet av fördröjd typ (DTH) i möss. Preparaten infördes per os (po) två ggr, första dosen 3 h före sensibilisering, andra 48 h senare.

Reagens P pm/mus Enheter 1 SE Studenttest Kontroll olivolja 22,50 1,60 - CLA 10 15,20 1,26 0,05 100 10,90 0,62 0,001 CS-A 10 13,5 0,86 0,01 100 10,2 0,95 0,001 1-Mpa-D-LA-D-Cys-NH2 10 12,6 0,70 0,01 I I 100 10,00 0,71 0,001 1-Mpa-LA-D-Cys-NH2 10 13,70 0,94 0,02 I I 100 11,20 0,65 0,001 1-Mpa-LA-Cys-NH2 10 11,7 0,50 0,01 I I 100 8,50 0,71 0,001 En enhet - 0,1 mm DTH introducerades i möss i enlighet med Lagrange et al (Lagrange P.H., Mackaness G.B., Miller T.E., Pardon P: J. Immunol., 1975, 114, 447). Möss sensibiliserades intra- venöst med 105 SRBC. Efter 4 dagar framkallades reaktionen 8 SRBC i vänstra baktrampdynan. Reaktionens magnitud mättes som ökning av genom en intradermal introduktion av 10 trampdynans tjocklek vid 24 h efter administrering av den retande dosen.

Resultaten är uttryckta som ett medeltal i SE av 10 möss. 1467 410 10 15 20 25 30 35 20 Tabell G Immunosuppressiv aktivitet hos 1-Mpa-LA-Cys-NH2 och 1-Hmp-LA-Cïs-NH2 i GvH-reaktion (celllulär immunitet). fl L__J x? Preparaten lösta i cremophor gavs i.p. -4 och 48 h före respektive efter introduktion av parenterala celler.

Reagens Administre- GVH 1 SE P pm/mus ringssätt (index) Kontroll "C" i.p. 3,17 0,36 - 1-Mpa-LA-Cys-NH2 10 pg i.p. 1,96 0,27 0,05 1-Hmp-LA-Cys-NH2 10 pg i.p. 1,54 0,22 0,01 Kontroll PBS i.p. 3,09 0,42 - CS-A 10 pg i.p. 1,41 0,16 0,001 Kontroll PBS - fosfatbuffertlösning Kontroll "C" cremophor vid en koncentration som krävs för att lösa 10 pg av peptiderna eller 1 pg (i in vitro) Kontroll "0l" - olivolja I)

Claims (10)

10 15 20 25 30 35 467 410 21 PATENTKRAV
1. l. Analog av cyklolinopeptid A, k ä n n e t e c k - n a d av en cyklisk formel som härrör från cyklolinpep- tid A-sekvensen Val-Pro-Pro-Phe he I,/f Leu-Ile-Ile-Leu vilken sekvens är utökad mellan vilka som helst tvá amino- syrarester med följande cystinderivatrest c-o nu I I X-C-H H-C-Y I I cnz cnz 1 vilken X är vald bland -H och -OH, och Y är vald bland -C-0 och -H, NH2 vari aminosyraresterna har L- eller D-konfiguration.
2. 2. Analog enligt kravet l, vari nämnda cystinderivat- rest år belägen mellan aminosyraresterna Leu och Phe i formeln för cyklolinopeptid A.
3. 3. Analog enligt kravet 2, vari X är -H och Y är -C-O, och I "H2 alla aminosyrarester har L-konfiguration. '467 410 10 15 20 25 30 35 22
4. 4. Analog enligt kravet 2, vari X är -H och Y är -C=O, och I “H2 cystinderivatresten har D-konfiguration och resten av aminosyraresterna har L-konfiguration.
5. 5. Analog enligt kravet 2, vari X är -OH och Y är -C=0, och I NH2 alla aminosyrarester har L-konfiguration.
6. 6. Analog enligt kravet 2, vari X är -H och Y är -C-0, och I NH2 alla aminosyrarester har D-konfiguration.
7. 7. Analog enligt nagot av kraven 1-6 för användning som ett läkemedel.
8. 8. Analog enligt något av kraven 1-6 för användning som ett immunosuppressivt medel.
9. 9. Användning av en analog enligt något av kraven l-6 för framställning av ett läkemedel för immunosuppressiv behandling.
10. 10. Farmaceutiskt preparat omfattande, som en aktiv ingrediens, en analog enligt något av kraven l-6, till- sammans med en eller flera farmaceutiskt acceptabla bärare, konstituenter och/eller spädmedel. g»