SE464911B - Anti-inflammatoriskt medel, baserat paa reaktionsprodukten mellan h?712o?712 och titan, foerfarande foer dess framstaellning samt anvaendning daerav - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 464 911 därför varit att undersöka mera detaljerat hur metaller växelverkar med väteperoxid i vattenmiljö. Härvid har ° mer specifikt växelverkan mellan titan och H55 stude- rats. Dessa undersökningar har lett till några intres- - santa slutsatser om en möjlig aktiv roll för titanim- plantat under det inflammatoriska svar som uppstår på grund av det kirurgiska ingreppet vid inoperation av implantatet“*. Dessa studier, vilka har utförts i samarbete med Dr Lars-Magnus Bjursten, Anatomiska Institutionen, Göteborgs Universitet, har visat att titan kan ha en antiinflammatorisk verkan genom passan- de oxidationsfenomen och genom katalytisk sönderdelning av Hkg (vilket produceras enzymatiskt av superoxid- dismutas in_giyg) pà ett sådant sätt att inga ytterli- gare fria syreradikaler (0Hy 0;) produceras. "oxid- skiktet", som bildas under denna växelverkan, tycks dessutom vara en Ti00H-matris eller gel som infángar och oxiderar Q; radikaler. Denna matris skulle in_yiyg vara några tiotal nm tjockt. Det är emellertid möjligt att tillverka stora mängder av titan-geler genom att använda t.ex. titanpulver som utgàngsmaterial. Denna gel tycks ha antiinflammatoriska egenskaper enligt nyligen gjorda experiment i Linköping och Göteborg.

Titangeler tillverkade genom reaktioner mellan t.ex ammoniumsalter och titanklorid är vâlkända**, men såvitt vi vet har titangeler producerade från metal- liskt titan och väteperoxid inte rapporterats tidigare.

Det är här av intresse att lägga märke till att man enligt uppfinningen kan erhålla en klar genomskinlig gel om reaktionsförhàllandena är de rätta (se fig. 1), medan geler producerade från saltlösningar alltid har ett mjölkigt utseende liknande den i fig. 1 (a) pá grund av närvaron av kollodiala gelpartiklar och inte av en homogen gel. Förutom att vara en ny typ av in- organisk gel erbjuder genomskinligheten (hos den aktu- ella galen) möjligheter till spektroskopiska under- sökningar av fysikaliska och kemiska fenomen i gelen. 10 15 20 25 30 35 464 911 Preliminära resultat har givit upphov till ett flertal möjliga delprojekt, nämligen: (a) Undersökning av verkliga implantat med avseende på den möjliga roll implantatet har under en inflam- matorisk reaktion. Undersökning av (avsaknaden av) systemiska (systemic) effekter på grund av degra- dationsprodukter (joner). (b) Modellstudier av växelverkan mellan olika implan- tatmaterial och Hgm, 0; och andra fria radikaler. (c) Framställning och karakterisering av titan- (och andra metall-) geler. (d) Användning av (titan) geler som antiinflammatoris- ka medel, för kromatografi för analytiska ändamål o.s.v.

Punkterna (b) och (c) ovan kommer att ge nödvändig grundläggande kunskap för forskningen under (a) och (d). Medicinskt orienterade undersökningar kommer emellertid att utföras parallellt i samarbete med Lars- Magnus Bjursten, Anatomiska Institutionen och the Institute for Applied Biotechnology, Göteborg. Några av de biologiska övervägandena beskrivs nedan.

Klinisk erfarenhet visar att titan är väl lämpad för implantation i levande vävnad. En intressant tillämp- ning, utvecklad av professor P-I Brànemark i Göteborg, är att implantering av titanskruvar i käkbenet tjänst- görande som fästpunkter för tandproteser. Titan upp- visar en total biologisk - eller "osseo" integration och tycks vara ett mycket användbart material i detta avseendel. Egenskaper hos oxidlagret på titanytan såsom ytenergi, dielectricitetskonstant, korrosionsmotstànd, pK, och hydrationsgrad har föreslagits vara viktiga för osseointegration även om deras betydelse inte har bevisats på ett entydigt sätt. Det står dock klart att fenomen, vilka uppträder under tidsperioden alldeles 10 15 20 25 30 35 464 911 efter implantationen, är ytterst viktiga för att en biointegration ska ske. Under denna period måste den oundvikliga inflammatoriska reaktionen, förorsakad av det kirurgiska ingreppet, övergå till en lämplig in- . läkningsprocess. Den ursprungliga inflammatoriska l reaktionen vid implantatet karakteriseras av närvaron av celler som neutraliserar och förgör främmande före- mål. Dessa celler (polymorfonukelära leukocyter (PNL) och makrofager) kännetecknas av att de producerar vävnadsförstörande enzymer, fria syreradikaler och H43 samt har förmågan att omsluta främmande partiklar. Av dessa egenskaper visas produktionen av syreradikaler ett stort intresse. En del av syreradikalerna är yt- terst farliga för levande vävnad; de kan attackera metaller och de deltar i produktionen av biologiskt aktiva mediatorer.

Enligt uppfinningen har det visat sig möjligt, att anvisa ett antiinflammatoriskt medel som befunnits inhibera inflammatoriska celler genom en minskning av frigörandet av syreradikaler från PUL-celler och genom en minskning av deras fagocytos.

Det enligt uppfinningen föreslagna medlet kännetecknas av att det som aktiv beståndsdel innehåller reaktions- produkten av H45 och metallisk titan varvid reaktions- produkten har formen av en gel i vars struktur en Tiperoxyradikal och titanperoxid tillsammans med titan- hydroxid ingår.

Bildandet av ett gellikt skikt (pà en implantatyta) in yiyg kan vara viktigt för skapandet av kemiska bind- ningar mellan implantatet och den omgivande vävnaden.

Detta kan också vara orsaken till att titan uppträder i * fagocyterande celler i närheten av verkliga titanim- plantat. Dessa möjligheter motiverar också ytterligare undersökningar. 10 15 20 25 30 35 464 911 Inorganiska titangeler framställda under olika reak- tionsförhållanden kan ha formen av (a) kolloidal, ogenomskinlig gel (b) homogen, gencr.kinlig gel Inflammatoriska celler, såsom poly-morfo-nukelära leukocyter (PNL-celler) frigör både superoxid (0;) och vätepercxid (H45) som svar på en inflammatorisk retning, t.ex. det kirurgiska trauma som uppstår vid en implantation. Ett resultat av växelverkan mellan ett implantat och de inflammatoriska cellerna kan därför bli bildandet av hydroxyl-radikaler (0H'). Dessa är mycket reaktiva och tillsammans med O? kan de förorsa- ka skador på både extra- och intracellulâra bestånds- delar. De kan också åstadkomma nedbrytning av lipider i cellväggarna, vilket kan döda cellerna. Hur olika implantatmaterial kommer att uppträda i en sådan situa- tion beror på de fysikaliska och kemiska egenskaperna hos materialet. En eventuell bildning av radikaler vid implantatet kan t.ex. vidmakthålla en inflammatorisk reaktion. Detta k n vara speciellt viktigt vid en metallyta eftersom H¿L kan sönderdelas av metalljoner genom den s.k. Fenton-reaktionenñ -i-HZO, ~=> OH'+OH'+M“*”* (1) Û2-+M(n+1)+ _, 02+Hn+ ( 2 ) I vilken den reaktiva OH' radikalen bildas.

Det var d rför av stort intresse när man enligt uppfin- ningen kunde konstatera att metalliskt titan växelver- kar mycket kraftigt med HJL men utan att det produce- ras OH'radikaler. Dessutom observerades att superoxid (0;) fångades i det gelliknande skikt som bildades vid denna växelverkan. 10 15 20 25 30 35 464 911 Dessa resultat presenteras i ref. 6, där också en första jämförelse mellan titan och några andra metaller är gjord. De experimentella tekniker som användes var elektrospinnresonans (ESR) och optisk spektroskopi tillsammans med lämpliga spinn“fällor" (traps).

Mer specifikt - planeras att genom modellexperiment undersöka om fria syreradikaler bildas vid växelverkan mellan olika material och Hng genom en oxidations/ reduktionsprocess. Härvid skall inte bara titan utan också andra material som rostfritt stål, aluminium, zirkon, tallium, niob, hydroxylapatit och biopolymerer av olika slag undersökas, - skall undersökas hur ytan hos materialen ovan ändras genom växelverkan med H43, - planeras också en undersökning av växelverkan med andra radikaler och radikalbildare än Hgg, t.ex. halogenradikaler.

De två viktigaste försvarssystemen i blod, baserade på lösbara blodproteiner, är koagulation- och komplement- systemet. Båda dessa system kan aktiveras vid fasta ytor. Vi har erfarenhet av studier av proteinadsorp- tionsfenomen förknippade med ytaktivering av systemen ovan med hjälp av ellipsometri och kiselytor med en gradient i vätbarhetenm. Ett speciellt fenomen som uppträder vid fasta ytor i kontakt med blod är den s.k.

Vroman-effekten, där adsorberad fibrinogen gradvis byts ut mot "hög molekylvikt kininogen" (HHWK). HMWK tjänst- gör som substrat för faktor XII (Hageman-faktorn) som är den första faktorn som aktiveras vid en fast yta genom den s.k. intrinsiska vägen. Det har föreslagits att detta ytaktiveringsfenomen kan öka hastigheten för 10 15 20 25 30 35 464 911 kontaktaktivering av koagulationssystemet mer än 1000 gånger”. En viktig detalj i ytaktivering av komple- mentsystemet är möjligheten för komplementfaktor 3 (C3) att binda (konvalent) till och eventuellt ändra kon- formation på en yta. Sådana ytinducerade konformations- förändringar har observerats på kvdrofoba kiselytorw där också komplementaktiveringen är hög. En preliminär studie har visat att komplementaktiveringen är låg på titanytor”.

I ljuset av diskussionen ovan borde det vara av in- tresse att jämföra olika (bio-)material avseende de två fenomenen beskrivna ovan. Vi planerar därför at: - undersöka Vroman-effekten och komplementaktivering på titanytor med och utan den modifiering som orsakas genom växelverkan med H43, - testa andra material än titan med avseende på dessa fenomen.

En viktig biologisk fråga, vilken förhoppningsvis kommer att besvaras genom samarbetet med Anatomiska Institutionen och the Institute for Applied Biotech- nology, Göteborg, är om det finns ett direkt samband mellan en hög grad av vävnadsíntegration och en liten fri radikalbildning i närvaron av H¿L genom specifika oxidationsmekanismer. t” ' a te ' ' v Vi har tidigare nämnt att joner som läcker ut från metalliskt titan reagerar med HJL och formar ett gel- liknande lager på titanytan. Det är emellertid möjligt att tillverka stora mängder av titangel genom att använda t.ex. titanpulver som utgångsmaterial. Under speciella förhållanden är det möjligt att erhålla en klar, genomskinlig gel. 10 15 20 25 30 35 464 911 Ti:H¿L-gelen tros ha sammansättningen (Ti00H),. Vi har dessutom identifierat superoxid (0;), förmodligen koordinerad till Ti“, i den inorganiska gelen. Den i gelen infángade superoxidradikalen är mycket stabil; den detekteras (med ESR) efter torkning av gelen och den verkar finnas kvar i gelen i veckor. Gelen bildad från metalliskt titan har i detta fall liknande egen- skaper som geler bildade frán ammoniak och titanklo- rid”°. Dessa geler är emellertid alltid partikulära. En skillnad i kemin är att i det metalliska systemet behövs inga motjoner (i lösning) och att reaktionsför- hàllandena är helt olika.

En klar gel erhålles om väteperoxidkoncentrationen är lägre än en viss koncentration bestämd av den mängd titan som används under reaktionen med H43. Det exakta konsentrationsförhállandet och reaktionsmekanismerna för gelbildandet är inte kända och kommer att under- sökas vidare.

Preliminära experiment med PMNZ-celler har indikerat att titangelen har antiinflammatoriska egenskaper.

Dessa kan bero på det faktum att (det cykliska) skapan- det av 0H'nánskas på grund av gelen och pá att O; fångas i gelen.

Det visar sig också att det är en aktiv växelverkan mellan proteiner och Ti0OH-matrisen. Om proteiner till- sätts en Ti00H-lösning alldeles innan den bildar en gel, inducerar proteinerna denna gelbildning.

Iakttagelserna ovan gör en noggrann undersökning av titangelens egenskaper meningsfull. va 10 15 20 25 30 35 464 91% 9 I denna del skall - undersökas under vilka förhållanden den transpa- renta inorganiska gelen bildas, _ - undersökas binetiken hos gelbildningsprocessen, t.ex. genom studiet av pH- och optiska förändring- ar och genom matematiska modeller, - undersökas de kemiska egenskaperna hos gelen; redox-potential, jonbytaregenskaper...., - de elekt ka egenskaperna hos gelen studeras, - växelverkan mellan gelen och Hgg och 0; studeras, - uppträdandet av proteiner (enzymer) i gelen under- sökas, och - undersökas om liknande geler kan framställas från andra metaller (zirkon, niob,...). metoder De experimentella metoder och utrustningar som kommer att användas är tillgängliga vid vår avdelning eller genom samarbete med andra grupper i Linköping, de inkluderar - ESR (och spinnfällor), - optisk spektroskopi (med och utan spinnfällor), - ellipsometri (för att mäta optiska förändringar i ytan av olika material; för att studera protein- adsorption etc.), - potentiostat och impedansbrygga (för att undersöka förändringarna i de elektriska egenskaperna hos Ti-elektrolytmellanytan vid växelverkan med Hgy; för att mäta de elektriska egenskap :na hos geler- na), - enzymindikationer för 0; (t.ex. cytokrom C), - ESCA; Anger-spektroskopi (för ytanalys), - Fouriertransform - IR (för att studera den moleky- lära strukturen hos gelerna), 10 15 20 25 30 35 464 911 10 specifika antikroppar, immunologiska metoder och ellipsometri (för att erhålla information om de proteiner som adsorberas till de ytor som stude- ras), pH-mätningar kemiska titreringar.

Dessutom skall undersökas om det är möjligt att använda en titanelektrod för att mäta halten H43 i en elektro- lyt (med också tänkbara in_yigg-tillämpningar). Om detta visar sig omöjligt planerar vi att utveckla en Clark-elektrod (Pt eller Au (-KCl) AgCl/Ag) elektrod för mätning av Hg;-koncentrationen nära en (implantat) yta.

I 1. . u Il. _! ! I En ! ä à . å 1989/99: 1) Ytterligare studier av växelverkan mellan Hg; och titan, 2) samma som ovan men med zirkon istället för titan, 3) studier av växelverkan mellan Ti0, och Zr0, och H43 med avseende på syreradikal bildning, 4) kartläggning av syreradikal bildning frán H¿g och O; vid olika (bio)material. 1989/90 1) Studier av växelverkan mellan proteiner och Ti, Ti0, och (Ti0OH) matrisen (speciellt den s.k. Vro- man-effekten och adsorption av komplementfaktor 3), 2) utveckling av en liten Egüp-elektrod för j¿L¿¿L;rg och om möjligt in_yiyg-bruk, 3) studium av de elektriska egenskaperna hos titange- len, Oï Om 10 15 20 25 30 464 911 11 4) undersökning av möjligheten att göra inorganiska geler direkt från andra metaller än titan, 5) studium av växelverkan mellan proteiner och ti- tangelen.

Aktivitetsplanen omfattar bara två àr. Vi tror, emel- lertid, att den pågående forskningen kommer att ge resultat och möjligheter av intresse för ytterligare forskning (som kommer att vara innehållet i vår nästa ansökan).

Parallellt med arbetet ovan (men finansierat av andra anslag) kommer det att utföras biologiskt inriktade undersökningar såsom - generering av H4; med zantin-zantinoxidas vid Ti- och Zr-ytor. Användning av cytokrom C för att studera superoxid infångning vid dessa ytor, - undersökning av de antiinflammatoriska egenskaper- na hos titangeler och eventuellt experiment på djur,(modell)experiment för växelverkan mellan titangeler och benvävnad avseende mekanismerna för osseointegrering. 464 911 f* Re ergnse 1. Albrektsson et al., 'The interface zone of inorganic implants in vivgz Titanium implants in bone", Ann. Biomed. Eng. vol ll, 1 (1983). 2. Sundgren, J.-E., Bodö, P., Lundström, I., “Auger elec- ¿ tron spectroscopic studies of the interface between human tissue and implants of titanium and stainless steel", J. Coll. Interf. Sci. vol 11Q, 9 (1986). 3. Sundgren, J.-E., Bodö, P., Lundström, I., Berggren, A., and Hellem, S., "Auger electron spectroscopic studies of stainless steel implants", J. Biomed. Mat. Res. Vol 12, 663 (1985). 4. Tengvall, P., Bjursten, L.-M., Elwing, H., and Lund- ström, I., "Free radicals. Oxidation of metal implants and biocompatibility", presented at 2nd International Conference on Biointeractions, Cambridge, 1987. 5. Tengvall, P., Elwing, H., Sjökvist, L., Bjursten, L.-M., and Lundström, I., "Interaction between hydrogen peroxide and titanium: A possible role in the biocom- patibility of titanium“, accepted for publication in Biomaterials. 6. Tengvall, P., Lundström, I., Sjökvist, L., Elwing, H., and Bjursten, L.-M., "Titanium-hydrogen peroxide inter- action. Model studies of the influence of the inflamma- tory response on titanium implants“, submitted to Bio- materials (enclosure 2). 7. Ragai, J., and Sing, K.S.W., “Pore structure and bulk properties of titania gels prepared from titaneous 2 chloride", J. Coll. Interf. Sci., vol 101, 369 (1984). 10. 11. 12. 13. 'ö 464 911111 Munuera, G., Gonzales-Elipe, A.K., and Soria, J., "Pho- toadsorption and photodesorption of oxygen on highly hydroxylated TiOg-surfaces“, J. Chem. Soc. Faraday Trans. I., vol l§, 1535 (1980).

Bielski. B.H.J., "Fast kinetic studies of dioxygen- derived species and their metal-complexes“, Phil.

Trans. R. Soc. Lond., B, vol Q11, 473 (1985).

Elwing, H., Askendal, A., and Lundström, I., “Competi- tion between adsorbed fibrinogen and high-molecular- weight kininogen on solid surfaces incubated in human plasma (the Vroman effect). Influence of solid surface wettability“, J. Biomed. Mater. Res. vol 21, 1023 (1987).

Vroman, L., Adams, A.L., Fischer, G.C., and Munoz, P.C., "Interaction of high molecular weight kininogen factor XII and fibrinogen in plasma at interfaces“, Blood, vol gg, 156 (1980).

Schmaier, A.H., Silver, L., Adams, A.L., Fischer, G.C., Munoz, P.C., Vroman, L., and Colman, R.W., "The effect of high molecular weight kininogen on surface-adsorbed fibrinogen, Tromb. Res., vol åå, 51 (1984).

Elwing, H., Ivarsson, B., and Lundström, I., "Serum com- plement deposition on platinum and titanium oxide surfaces measured by ellipsometry at the liquid solid interface", J. Biomed. Mater. Res., vol gl, 263 (1987). 464 911 H Som antytts kommer titangel att finna användning som ett brett anti-inflammatoriskt medel, t.ex. som en salva för hud- och ögonsjukdomar. i leder eller på hud (som ett substitut för cortison) och i kosmetika. Dessutom kan den användas i analytiska tillämpningar i laboratorier, där den kan användas som en biokompatibel oxidant t.ex. i cellbiologisk forskning.

Ett annat användningsområde är för cellodling.

Tillverkning: Ti-gel göres fràn metalliskt titan i bulk- el- ler pulverform som inkuberas i 1%-30% väteperoxid tills dess att ett grön-gult eller gul-brunfärgat material erhålles. In- kubationstiden för detta första steg kan vara upp till en vecka vid 1 derdelas till mindre än 1 mM antingen genom uppvärmning eller katalytiskt; med platina, silver eller andra katalysatorer.

Efter sönderdelning av väteperoxiden består det färgade mate- rialet av àtminstone tre Ti-syre-mellanformer och den därvid bildade gelen har bland annat anti-inflammatoriska egenskaper på grund av sin oxiderande förmåga, vilken är större än 0.8 V relativt en vätgaselektrod vid pH 3.0-4.5.

De oxiderande Ti-syre-mellanformerna kan också framställas genom oxidation av Ti (III)- och Ti (IV)-lösningar med till- sats av överskott av väteperoxid (mer än equimolar) átföljd av en katalytisk nedbrytning som ovan. Ti-gelerna eller det oxiderande Ti-syre-färgämnet kan torkas och pulveriseras vid temperaturer under 20°C. Det kan nu lagras under en läng tid utan att dess aktiva komponenter sönderdelas.

Grupp IV, V och VI metallgeler kan göras med metoden beskri- ven ovan, eller med en liknande metod, och de geler som är användbara i en eller flera av de ovan nämnda sammanhangen ianspråktas.

Uppfinningen består också av produkter vilka in vitrg har försetts med den uppfunna reaktionsprodukten. Den uppfunna I) '5 464 911 produkten kan således appliceras på ett implantat innan im- plan ering av detsamma. Om åtminstone ytlagret hos implanta- tet består av titan eller liknande material kan den uppfunna produkten framställas genom att behandla implantatets yta med HZO2 för att bilda den uppfunna gelen pà densamma. Natur- ligtvis kan implantatet först täckas med ett titanskikt eller liknande innan bildandet eller applicering av den uppfunna gelen pà implantatet före implantering. Uppfinningen avser således också tekniken att in_yit1g förse t.ex. ett implantat med den uppfunna reaktionsprodukten mellan H2O2 och de nämnda metallerna.

Olika aspekter av uppfinningen belyses av de bifogade patent- kraven.

Claims (8)

464 911 16 P a t e n t k r a v

1. l. Anti-.inflanmatoriskt oxiderande medel, k ä n n e - t e c k n at av att det som aktiv beståndsdel innehåller reaktionsprodukten av H202 och metallisk titan varvid reak- tionsprodukten har formen av en gel i vars struktur en Ti- peroxyradikal och titanperoxid tillsammans med titanhydr- oxid ingår.

2. Medel enligt krav l, k ä n n e t e c k n a t av att den ingående Ti-peroxyradikalen utgöres av (Ti (IV) Og).

3. Medel enligt krav l och 2, k ä n n e t e c k n a t av att reaktionsprodukten har formen av en torkad gel.

4. Förfarande för framställning av ett medel enligt något av kraven 1 - 3, k ä n n e t e c k n a t av att metallisk titan inkuberas i väteperoxid till bildning av en reaktions- produkt.

5. Förfarande enligt krav 4, k ä n n e t e c k n a t av att metallisk titan nedlägges i en 1 - 30 %-ig H2O2-lösning varpå den på titanen bildade gelformiga reaktionsprodukten avlägsnas när reaktionsblandningen har slutat att avge syrgas.

6. Förfarande enligt krav 4 eller 5, k ä n n e t e c k - n a t av att överskjutande väteperoxid nedbrytes, före- trädesvis katalytiskt.

7. Förfarande enligt något av kraven 4 - 6, k ä n n e - t e c k n a t av att den gelformiga reaktionsprodukten torkas vid en temperatur understigande ZOOOC och bibringas pulverform.

8. Användning av medlet enligt något av kraven 1 - 3 såsom anti-inflammatoriskt medel.