SE201617C1 - - Google Patents

Description

KLASS INTERNATIONELLSVENSK A61 k3/56 30 h:2/36 PATENT- OCH REGISTRERINGSVERKET Ans. 11114/1956 inkom den 7/12 1956 utlagd den 3/5 196 CHAS. PFIZER & Co., INC., BROOKLYN, N.Y. USA Sift att forhiija verkan av ett antibiotikum av tetraeyklintyp Upplinnare: A R English och T J McBride Prioritet begard frein den 7 december 1955 (USA) Foreliggande uppfinning avser ett satt att forhifija verkan av ett antibiotikum av tetracyklintyp, namligen tetracyklin, oxitetracyklin eller klortetracyklin i terapeutiskt anvandbar form.

Det utmarkande for forfarandet dr att man blandar namnda antibiotikum med ett antibiotikum, ursprungligen benamnt amimycin, senare kallat oleandomycin, vilket bildas genom odling av en stain av Streptomyces antibioticus (ATCC nr 11891) under aeroba betingelser i ett naringsmedium, varvid oleandomycinmangden utgor 10-90 viktprocent av den totala mangden antibiotikum i den erhallna blandningen.

Oleandomycin är det generiska namnet for antibiotikum PA-105, som beskrives i den amerikanska patentskriften 2 757 123. Detta antibiotikum dr mycket effektivt mot ett stort antal mikroorganismer. Det bildas genom odling av en stam av Streptomyces antibioticus (inlamnat till The American Type Culture Collection under nr 11891) under aeroba betingelser i ett naringsmedium och utvinnes ur den erhallna odlingsvatskan pa olika satt, t. ex. genom extraktion med losningsmedel.

Oleandomycinet utgor en basisk, vit, amorf organisk forening, som är loslig i utspadda vattenhaltiga syror och uppvisar en moderat loslighet i vatten. Den är mycket loslig i ett flertal organiska losningsmedel, sasom metylalkohol, etylalkohol, aceton och butanol, medan den är oloslig i hexan, koltetraklorid och di-n-butyleter. En va tLenlosning av foreningen bibehaller sin bestandighet under atskilliga timmar vid rumstemperatur Mom ett brett pH-intervall. Oleandomycinen Sr emellertid helt obestandig vid kokning i sur losning. F6reningen är bestandig i torrt tillstand eller nar den Or lost i vattenfria losningsmedel. Den kristallina vattenfria antibiotikumhydrokloriden har den ungefarliga smaltpunkten 134-135° C. Bade oleandomycin och dess hydroklorid uppvisa ett brett, lagt intensitetsmaximum i det ultravioletta omra.clet vid ungefar 286-289 mg (10 mg i 10 ml metanol). Lost i kloroform uppvisar antibiotikumbasen karakteristiska maxima i det infraroda omradet, av vilka de mera signifikanta ha foljande frekvenser (i cm-I): 3510, 2910, 2890, 2840, 2790, 1710, 1460, 1385, 1335, 1305, 1280, 1180, 1160, 1110, 1075, 1050, 1005, 985, 960, 935, 895, 885 och 860. Basen liar analyserats och visat sig ha fOljande sammansattning i viktprocent: kol 60,36 vate 9,21 kvave 1,98 syre (skillnad) 28, Ndr den vattenfria hydrokloriden Or dispergerad i en kaliumbromidtablett uppvisar Oven den ett antal karakterisLiska maxima i det infraroda omradet, varav det mera signifikanta ha foljande frekvenser: 3380, 2940, 2890, 1710, 1640, 1465, 1380, 1330, 1190, 1160, 1115, 1075, 1055, 1010, 985, 935, 865 och 828. Hydrokloridens a2,; = - 54° (1 i metanol).

Molekylvikten av oleandomycin har visat sig vara ungefar 715, bestamd enligt ebullioskopisk meto (1.

Nar ett prov av kristallin oleandomycinhydroklorid, som kristalliserats ur etylacetat, torkas 18 timmar vid 100° C, observeras en viktforlust av 5,0 %. Det torkade materialet visade sig yid analys ha foljande sammansattning i viktprocent: Dupl. kl. 30 h: 2/03 2 201 kol 57,63 vate ' 8,73 kvave 1,87 klor (jonisk) 4, syre (skillnad) 27,47 Detta motsvarar den sannolika empiriska formeln C1163N0 I2HCI f6r den vattenfria hydrokloriden. Denna är mycket lOslig i vatten och forekommer aven i olika hydratiserade former, exempelvis i form av dihydratet, vilket motsvarar den sannolika empiriska formeln C1-303N012HC1• 2F120.

Tetracyklin, oxitetracyklin och klortetracyklin utgora valkanda antibiotika, som ha beskrivits i ett stort antal artiklar i den kemiska och medicinska litteraturen. Oxitetracyklin (forsaljes under beteckningen »terramycin0 kan isoleras ur amnesomsattningsprodukterna av Streptomyces rimosus sasom beskrives i den amerikanska patentskriften 2 516 080. Klortetracyklin kan isoleras ur amnesornsattningsprodukterna av Streptomyces aureofaciens sasom beskrives i den amerikanska patentskriften 2 482 055, i vilken detta antibiotikum omnamnes med sin varubeteckning »Aureomycin». Tetracyklin bildas latt genom katalytisk dehalogenering av klortetraeyklin sasom beskrives i den amerikanska patentskriften 2 699 054 men kan ocksa framstallas direkt genom odling av utvalda stammar av mikroorganismer av slaktet Streptomyces.

- Uttrycket »oleandomycin » skall i foreliggande sammanhang beteekna nagon av de olika terapeutiskt aktiva formerna av detta antibiotikum, exempelvis den fria basen, hydrokloriden, fosfatet och salter mod andra farmaccutiskt godtagna syror.

Med uttrycket »antibiotikum av tetracyklintyp» avses tetracyklin, oxitetracyklin och ldortetracyldin i de olika terapeutiskt aktiva former, som finnas av dessa antibiotika, t. ex. hydrokloriden, salter med andra farmaceutiskt godtagna syror och metallsalter av oxitetracyklin, t. ex. natrium-, kalium- och liknande salter.

Ett av de viktigaste anvandningsomradena for antibiotika Or sasom medel mot patogena mikroorganismer, som orsaka patogena tillstand. Den .speciella aktiviteten av de enligt uppfinningen framstallda blandningarna for bekampning av patogena organismer framgar av foljande exem.pel. En slam av Micrococcus pyogenes var. aureus, som Or typisk for de organismer av detta slakte, vilka orsaka manga patogena tillstand (t. ex. spikbolder, varb Older, halsinfektioner, benmargsinflammation, blodforgiftning och lunginflammalion) isolerades fran ett kliniskt fall och visade sig vara mycket resistent mot vanliga antibiotika. Det visade sig exempelvis, att den minsta hammande koncentrationen (MHK) av oxitetracyklin, som erfordrades for att framgangsrikt bekampa dessa organismer var Over 100 mikrogram per 617 milliliter, ndr behandlingen agde rum med enbart detta antibiotikum. En blandning av oleandomycia och oxitetracyklin visade sig emellertid hogaktiv vid ett mycket varierande blandningsforhallande, namligen mellan 90 och 10 viktpro- cent oleandomycin. En sarskilt effektiv blandning innehaller 50 viktprocent oleandomycin och 50 viktprocent oxitetracyklin. Denna blandning har ett MHK-varde av 1,56 mikrogram/ml mot mikroorganismen Micrococcus pyogenes var. aureus.

Det har visat sig, att enligt foreliggande uppfinning framstallda blandningar ha en synergistisk verkan vid bekampning av manga mikro- organismer. Mot mikroorganismen Streptococcus faecalis Oro salunda blandningar av ett antibiotikum av oleandomycintyp med ett antibiotikum av oxitetracyklintyp mer effektiva On nagot av dessa antibiotika enbart. Denna verkan har Oven iakttagits vid blandningar av oleandomycin och klor- tetracyklin mot mikroorganismen Micrococcus pyogenes var. aureus och Streptococcus faecalis. Dessa fors& ha utforts in vitro. Den synergistiska effekten har Oven iakttagits vid in vivo-forsok med moss, som infekterats med stammar av Micro-coccus pyogenes var. aureus. Den synergistiska effekten uppkommer, nar blandningen innehaller mellan 90 och 10 viktprocent oleandomycin.

De ovan angivna forsoken med moss utgora standardfOrsok, vid vilka ett experimentellt till- fredsstallande antal moss givas en injektion med en patogen mikroorganism, varefter den uppkomna infektionen bekampas med ett antibioti- kum i varierande dosering. Antalet Overlevande moss vid vale doseringsniva observeras och utgor ett matt pa verkan av ifragavarande antibiotikum.

Vid bestamning av verkan av ett antibiotikum maste man taga hansyn till benagenheten hos n8gra mikroorganismer att utveckla resistenta stammar eller varianter, som visa minskad kanslighet for antibiotikumet. Blandningarna en- ligt foreliggande uppfinning aro sarsIdlt effektiva genom att de undvika denna svarighet. Ett belysande exempel harpa askadliggores i foljande exempel 4, som beskriver formagan hos en blandning av oxitetracyklin och oleandomycin att fordroja utveckling av resistenta stammar av mikroorganismen Micrococcus pyogenes var. aureus genom passage ph spadningsserier i ror.

Enligt denna metod utsattes mikroorganismen for inverkan av en okande mangd av ett antibioti- kum. Vid vane enskilt prov Or mangden anvant antibiotikum nagot lagre an den mangd, som erfordras for att fullstandigt forhindra mikroor- ganismens tillvOxt, och efter det forsta provet an- vandes den overlevande kulturen for det darph foljande provet. P0 detta satt erhalles och under- sokes en mot ifragavarande antibiotikum alltmer resistent slam av, den ursprungliga mikroorganismen. 3 FOrutom i de foljande exernplen askadliggdres den enligt uppfinningen erhallna synergistiska verkan aven genom de forsok som beskrivas i Antibiotics & Chemotherapy, vol. VI, no. 8, aug. 1956, p 511-522. Dessa fors& avse bestamning in vitro av den synergistiska verkan av en blandning av 67 % tetracyklinbas och 33 % oleandomycinbas. De darvid erhallna resultaten framga av foljande tabell, vad namnda antibiotikumblandning betecknas »PA 775» och varav det framgar att denna blandning uppvisar en markant synergistisk effekt vad betraffar saval vissa laboratoriestammar som vanligen antibiotikumresistenta kliniska isolat.

Organism och kitila Laboratoriestam Micrococcus pyo- Minsta inhiberande koncentration, pg/ml.

PA 77Tetra-Oleando- eyklinmyeln genes var. aureus 0,19 0,1,04 Streptococcus pyogenes 0,09 0,0, Diplococcus pneumoniae 0,19 0,1,02 Corynebacterium diphthsriae 1,56 4,18 4,12 Listeria monocytogenes 0,19 0,1,02 Bacillus subtilis 0,09 0,10,51 Vibrio comma 0,09 0,18, Kliniska isolat, an-tibiotikumresisten-ta stammar av Micrococcus pyogenes var. aureus Nebraska101 0,78 2,09 4,12 107 3,12 67 4,12 111 1,56 33,4,12 136 0,09 2,09 0,51 Minnesota961 3,12 33,4,12 California18 0,78 1,04 2,06 >100 >100 0,78 1,04 2,06 32 0,78 1,04 2,06 Canada1483 0,39 8,3 2,06 1470,19 8,3 4,12 1484 1,56 8,3 2,06 1780 6,67 8, 1793 1,56 16,7 2,06 1433-1 0,39 8,3 2,06 1433-2 3,12 > 67 3,12 1457 0,78 8,3 4,1 New Brunswick 13W 3,12 67 4,1 15 Y 3,12 > 67 4,1 16 3,12 67 4,1 17 0,39 8,2 2,06 FOrhallandet mellan de hada antibiotika kan variera fran 90 till 10 viktprocent oleandomycin, raknat pa aktivitetsbasis. Det ãr emellertid mest lampligt att anvanda oleandomycinet i lagre mangd an det andra antibiotikumet. Salunda anvandes enligt uppfinningen foretradesvis mellan 80 och 10 viktprocent oleandomycin, raknat pa aktivitetsbasis. En sarskilt lamplig blandning innehaller 2 viktdelar av ett oxitetracyklinantibiotikurn och en viktdel av ett oleandomycinantibiotikum. Detta forhallande kan givetvis variera alltefter vad som erfordras i varje sarskilt fall. Ifragavarande antibiotika kunna anvandas i rent tillstand, i utspadd form eller i form av raa koncentrat, sa lange som varje form anvandes i en mangd, som är tillracklig for att astadkomma biologiskt aktiva material i de angivna mangderna.

Blandningarna enligt uppfinningen kunna administreras enbart eller tillsammans med farmaceutiskt godtagbara barare. Halten barare bestammes av dess lamplighet och kemiska natur, det valda administrationssattet och vanlig farmaceutisk praxis. For bekampning av olika infektioner, sarskilt i intestinaltrakten, kan blandningen exempelvis tillforas omit i form av tabletter eller kapslar, vilka innehalla sadana barare som starkelse, mjolksocker, vissa slags leror, etc. For intraventis och intramuskular administration kan blandningen anvandas i form av en steril losning, som innehaller andra losta amnen, t. ex. tillracklig mangd koksalt eller glykos for att losningen skall bli isotonisk.

Den dosering, som dr mest lamplig i varje sarskilt fall, bestammes av lakaren eller veterinaren. Den vanligen mest anvandbara doseringen är 1-4 g per dag av en av blandningarna, vilken heist administreras genom uppdelning i mindre doser, som givas med lampliga mellanrum.

Uppfinningen askadliggores narmare medelst foljande exempel, van i temperaturerna angivas i Celciusgrader.

Exem.pel 1. En slam av Streptococcus faecalis. lick i ror tillvaxa i ett naringsmedium, som inneholl ett kommersiellt hjarn-hjartinfusionsmedium, varefter separata portioner behandlades med oleandomycin och oxitetracyklin saval enbart som i blandning. Floren inkuberades vid 37° under 21 timmar och MHK-vardet for de enskilda antibiotika och for blandningarna bestamdes. Det visade sig, att MHK-vardet for oleandomycin enbart var 0,78 mikrogram per ml och for oxitetracyklin enbart avenledes 0,78 mikrogram per ml. Vid anvandning av en blandning, som innehiill 1 viktdel oleandomycin och 1 viktdel oxitetracyklin, sanktes emellertid MHK-vardet till 0,39 mikrogram per ml.

Exempel 2. Moss med en vikt av 11 till g uppdelades i grupper och infekterades med en i vanliga fall dtidlig dos av suspensioner av en resistent stam av Micrococcus pyogenes var. 4'201 617 aureus genom intraperitonal injektion och behandlades sedan subkutant med enbart oxitetracyklin, enbart oleandomycin, och med en blandning, som inneholl 1 viktdel oxitetracyklin och 1 viktdel oleandomycin. Det procentuella antalet .overlevande moss vid olika doseringsnivaer bestamdes. Det visade sig, att oxitetracyklin var helt overksamt vid sa hog dosering som 200 mg/kg kroppsvikt. Det visade sig dven, att antalet Overlevande moss var 58 % vid en dosering av 12,5 mg oleandomycin per kg. Vid anvandning av 25 mg/kg av en blandning av oleandomycin och oxitetracyklin, innehallande 12,5 mg/kg oleandomycin och 12,5 mg/kg oxitetracyklin, visade det sig emellertid att 75 % av mossen bverlevde.

. Exempel 3. Moss med en vikt av 11 till 15 g uppdelades i grupper och infekterades genom Intraperitoneal injektion med en i vanliga fall dodlig dos av suspensioner av en resistent stam av Micrococcus pyogenes var. aureus och behandlades sedan oralt med enbart oxitetracyklin, enbart oleandomycin och med en blandning, som inneholl 1 viktdel oleandomycin och 2 viktdelar oxitetracyklin. Det procentuella antalet Overlevande moss vid de olika doseringsnivderna bestdmdes. Det visade sig, att oxitetracyklin var fullstandigt overksamt vid sh hog dosering som 200 mg/kg kroppsvikt. Vidare visade det sig, att antalet Overlevande moss var 5 % vid en dosering av 12,5 mg/oleandomycin per kg kroppsvikt. Vid anvdndning av 25 mg per kg av en blandning av oleandomycin ,och oxitetracyklin i fOrhallandet 16 mg oxitetracyklin per kg och 8 mg oleandomycin per kg visade det sig emellertid, att antalet overlevande moss bkade till 20 %. Detta är sarskilt anmarkningsvart, eftersom den mangd oleandomycin, som till-forts blandningen, iikade antalet overlevande moss med 15 %, fastan den administrerade mangden var ldgre an vid administrering av enbart oleandomycin.

Exempel 4. En stam av Micrococcus pyogenes var. aureus fick tillvaxa i ror i ett naringsmedium, ..som inneholl ett kommersiellt hjarn-hjartinfusionsmedium, och uppdelades i olika portioner, som behandlades med en viss mangd oleandomyoch oxitetracyklin enbart saval som i blandothg, varvid den tillforda mangden antibiotikum .var just otillracklig for att hstadkomma fullstandig hamning av tillvaxten av mikroorganismerna. Roren inkuberades 24 timmar vid 370 och mang- den tillfort antibiotikum antecknades. Prov av kulturen overfordes till ett nytt medium, varefter behandlingen upprepades och den mangd antibiotikum, som nastan helt forhindrade tillvaxten efter overforingen, antecknades. Vid anvandning av oxitetracyklin sdsom antibiotikum visade det sig, att den lagsta koncentration, som erfordrades for fullstandig hamning, var 250 mikrogram/ml efter 18 OverfOringar. Vid anvandning av oleandomycin var den ldgsta koncentrationen 5000 mikrogram/ml efter 18 overforingar. Ndr en blandning innehallande 2 viktdelar oxitetracyklin och 1 viktdel oleandomycin anvandes, visade det sig emellertid, att den lagsta koncentration, som erfordrades for fullstdndig hamming av tillvaxten, endast var 0,312 mikrogram/ml efter 18 Overforingar.

Claims (2)

Patentansprak:

1. Sd.tt att forhOja verkan av ett antibiotikum av tetracyklintyp, namligen tetracyklin, oxitetracyklin eller klortetracyklin i terapeutiskt anyandbar form, kannetecknat ddrav, att man blandar namnda antibiotikum med ett antibiotikum, ursprungligen bendmnt amimycin, senare kallat oleandomycin, vilket bildas genom odling av en stam av Streptomyces antibioticus (ATCC nr 11891) under aeroba betingelser i ett naringsmedium, varvid oleandomycinmangden utgor 10-90 viktprocent av den totala mangden antibiotikum i den erhallna blandningen.

2. Satt enligt patentanspraket 1, kannetecknat ddray, att oleandomycinmangden utgiir 1/3-1/2 av den totala viktmangden antibiotikum, varvid resten utgores av oxitetracyklin. Anforda publikationer: Patentskrifter fran Storbritannien 690 721, 704 038; USA 2 594 374. Andre publikationer: Antibiotics and chemotherapy. 6 (1956), p. 511-522.