RU99121660A

RU99121660A - Способ интеграции генов в специфических сайтах в клетках млекопитающих посредством гомологичной рекомбинации и векторы для осуществления этого способа

Info

Publication number: RU99121660A
Application number: RU99121660/13A
Authority: RU
Inventors: Митчелл Е. РЕФФ; Ричард Спенс БАРНЕТТ; Карен Ретта МакЛАКЛАН
Original assignee: Айдек Фармасьютикалз Корпорейшн
Priority date: 1997-03-14
Filing date: 1998-03-09
Publication date: 2001-12-20

Claims

1. Способ встраивания нужной ДНК в целевой сайт в геноме клетки млекопитающего, включающий следующие стадии;
(i) трансфекцию или трансформацию клеток млекопитающих первой плазмидой ("маркерной плазмидой"), содержащей следующие последовательности:
(а) область ДНК, которая является гетерологичной геному клетки млекопитающего, и которая, при ее интеграции в геном клетки млекопитающего, дает уникальный сайт для гомологичной рекомбинации;
(b) ДНК-фрагмент, кодирующий часть первого селективного маркерного белка; и
(с) по крайней мере, одну другую селективную маркерную ДНК, обеспечивающую отбор клеток млекопитающих, в которые была успешно интегрирована маркерная плазмида;
(ii) отбор клетки, которая содержит маркерную плазмиду, интегрированную в ее геном;
(iii) трансфекцию или трансформацию указанных отобранных клеток млекопитающих второй плазмидой ("целевой плазмидой"), содержащей следующие последовательности:
(а) область ДНК, которая идентична или достаточно гомологична уникальной области в маркерной плазмиде, так, что эта область ДНК может рекомбинировать с указанной ДНК посредством гомологичной рекомбинации;
(b) ДНК-фрагмент, кодирующий часть того же самого селективного маркера, содержащегося в маркерной плазмиде, где активный селективный маркерный белок, кодированный указанной ДНК, продуцируется только в том случае, если указанный фрагмент экспрессируется совместно с фрагментом указанной селективной маркерной ДНК, содержащейся в маркерной плазмиде; и
(iv) отбор клеток, которые содержат целевую плазмиду, интегрированную в целевой сайт, путем скрининга на экспрессию первого селективного маркерного белка.

2. Способ по п.1, где ДНК-фрагментом, кодирующим фрагмент первого селективного маркера, является экзон доминантного селективного маркера.

3. Способ по п. 2, где вторая плазмида содержит остальные экзоны указанного первого селективного маркера.

4. Способ по п.3, где, по крайней мере, одна ДНК, кодирующая нужный белок, встроена между указанными экзонами указанного первого селективного маркера, содержащегося в целевой плазмиде.

5. Способ по п.4, где ДНК, кодирующая доминантный селективный маркер, кроме того, встроена между экзонами указанного первого селективного маркера, содержащегося в целевой плазмиде, для обеспечения ко-амплификации ДНК, кодирующей нужный белок.

6. Способ по п.3, где первый доминантный селективный маркер выбирают из группы, состоящей из неомицин-фосфотрансферазы, гистидинол-дегидрогеназы, дигидрофолат-редуктазы, гигромицин-фосфотрансферазы, тимидинкиназы вируса простого герпеса, аденозиндезаминазы, глутаминсинтетазы и гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы.

7. Способ по п.4, где нужным белком является белок млекопитающего.

8. Способ по п.7, где указанным белком является иммуноглобулин.

9. Способ по п.1, который, далее предусматривает определение уровней РНК селективного маркера (с), содержащейся в маркерной плазмиде, перед интеграцией в целевой вектор.

10. Способ по п. 9, где другим селективным маркером, содержащимся в маркерной плазмиде, является доминантный селективный маркер, выбранный из группы, состоящей из гистидинол-дегидрогеназы, тимидинкиназы вируса простого герпеса, гигромицин-фосфотрансферазы, аденозиндезаминазы и глутаминсинтетазы.

11. Способ по п.1, где клетку млекопитающего выбирают из группы, состоящей из клеток яичника китайского хомячка (СНО), миеломных клеток, клеток почки детеныша хомячка, клеток COS, клеток NSO, клеток HeLa и клеток NIH 3Т3.

12. Способ по п.11, где указанной клеткой является клетка СНО.

13. Способ по п. 1, где маркерная плазмида содержит третий экзон гена неомицин-фосфотрансферазы, а углевая плазмида содержит первые два экзона гена неомицин-фосфотрансферазы.

14. Способ по п.1, где маркерная плазмида, кроме того, содержит редкую рестрикционную эндонуклеазную последовательность, встроенную в область гомологии.

15. Способ по п.1, где уникальной областью ДНК, обеспечивающей гомологичную рекомбинацию, является бактериальная ДНК, вирусная ДНК или синтетическая ДНК.

16. Способ по п.1, где уникальная область ДНК, обеспечивающая гомологичную рекомбинацию, составляет, по крайней мере, 300 нуклеотидов.

17. Способ по п.16, где уникальная область ДНК имеет размер в пределах от около 300 нуклеотидов до 20 тысяч пар оснований.

18. Способ по п.17, где уникальная область ДНК имеет размер, предпочтительно, в пределах от 2 до 10 тысяч пар оснований.

19. Способ по п.1, где первая селективная маркерная ДНК расщеплена, по крайней мере, на три экзона.

20. Способ по п.1, где уникальной областью ДНК, обеспечивающей гомологичную рекомбинацию, является бактериальная ДНК, ДНК насекомого, вирусная ДНК или синтетическая ДНК.

21. Способ по п.20, где уникальная область ДНК не содержит никаких функциональных генов.

22. Векторная система для встраивания нужной ДНК в целевой сайт в геноме клетки млекопитающего, включающая, по крайней мере, следующие элементы:
(i) первую плазмиду ("маркерную плазмиду"), содержащую, по крайней мере, следующие последовательности:
(а) область ДНК, которая является гетерологичной геному клетки млекопитающего, и которая, при ее интеграции в геном клетки млекопитающего, обеспечивает уникальный сайт для гомологичной рекомбинации;
(b) ДНК-фрагмент, кодирующий часть первого селективного маркерного белка; и
(с) по крайней мере, одну другую селективную маркерную ДНК, обеспечивающую отбор клеток млекопитающих, в которые была успешно интегрирована маркерная плазмида;
(ii) вторую плазмиду ("целевую плазмиду"), содержащую, по крайней мере, следующие последовательности:
(а) область ДНК, которая идентична или достаточно гомологична уникальной области в маркерной плазмиде, так, что эта область ДНК может рекомбинировать с указанной ДНК посредством гомологичной рекомбинации;
(b) ДНК-фрагмент, кодирующий часть того же самого селективного маркера, находящегося в маркерной плазмиде, где указанный активный селективный маркерный белок, кодированный указанной ДНК, продуцируется только в том случае, если указанный фрагмент экспрессируется совместно с фрагментом указанной селективной маркерной ДНК, содержащейся в маркерной плазмиде.

23. Векторная система по п.22, где ДНК-фрагментом, кодирующим фрагмент первого селективного маркера, является экзон доминантного селективного маркера.

24. Векторная система по п.23, где вторая плазмида содержит остальные экзоны указанного первого селективного маркера.

25. Векторная система по п.24, где, по крайней мере, одна ДНК, кодирующая нужный белок, встроена между указанными экзонами указанного первого селективного маркера, содержащегося в целевой плазмиде.

26. Векторная система по п.24, где ДНК, кодирующая доминантный селективный маркер, кроме того, встроена между экзонами указанного первого селективного маркера, содержащегося в целевой плазмиде, для обеспечения ко-амплификации ДНК, кодирующей нужный белок.

27. Векторная система по п.24, где первый доминантный селективный маркер выбирают из группы, состоящей из неомицин-фосфотрансферазы, гистидинол-дегидрогеназы, дигидрофолат-редуктазы, гигромицин-фосфотрансферазы, тимидинкиназы вируса простого герпеса, аденозиндезаминазы, глутаминсинтетазы и гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы.

28. Векторная система по п.25, где нужным белком является белок млекопитающего.

29. Векторная система по п.28, где указанным белком является иммуноглобулин.

30. Векторная система по п.22, где другим селективным маркером, содержащимся в маркерной плазмиде, является доминантный селективный маркер, выбранный из группы, состоящей из гистидинол-дегидрогеназы, тимидинкиназы вируса простого герпеса, гигромицин-фосфотрансферазы, аденозиндезаминазы и глутаминсинтетазы.

31. Векторная система по п.22, которая обеспечивает встраивание нужной ДНК в целевой сайт в геноме клетки млекопитающего, выбранной из группы, состоящей из клеток яичника китайского хомячка (CНО), миеломных клеток, клеток почки детеныша хомячка, клеток COS, клеток NSO, клеток HeLa и клеток NIH 3Т3.

32. Векторная система по п.31, где указанной клеткой млекопитающего является клетка СНО.

33. Векторная система по п.22, где маркерная плазмида содержит третий экзон гена неомицин-фосфотрансферазы, а целевая плазмида содержит первых два экзона гена неомицин-фосфотрансферазы.

34. Векторная система по п.22, где маркерная плазмида далее содержит редкую рестрикционную эндонуклеазную последовательность, встроенную в область гомологии.

35. Векторная система по п.22, где уникальной областью ДНК, обеспечивающей гомологичную рекомбинацию, является бактериальная ДНК, вирусная ДНК или синтетическая ДНК.

36. Векторная система по п.22, где уникальная область ДНК (а), содержащаяся в маркерной плазмидной векторной системе, которая обеспечивает гомологичную рекомбинацию, составляет, по крайней мере, 300 нуклеотидов.

37. Векторная система по п.36, где уникальная область ДНК имеет размер в пределах от около 300 нуклеотидов до 20 тысяч пар оснований.

38. Векторная система по п.37, где уникальная область ДНК, предпочтительно, имеет размер в пределах от 2 до 10 тысяч пар оснований.

39. Векторная система по п. 22, где первая селективная маркерная ДНК расщеплена, по крайней мере, на три экзона.

40. Векторная система по п.22, где уникальной областью ДНК, обеспечивающей гомологичную рекомбинацию, является бактериальная ДНК, ДНК насекомого, вирусная ДНК или синтетическая ДНК.

41. Векторная система по п.40, где уникальная область ДНК не содержит функциональных генов.