RU2843309C2 - Катионное липидное соединение, содержащая его композиция и его применение - Google Patents

Abstract

Группа изобретений относится к химии и фармацевтике, а именно к соединению формулы

Description

[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет китайской патентной заявки №202210034449.4, поданной 13 января 2022 г., содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки как часть настоящей заявки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0002] Настоящее изобретение относится к области медицины. Настоящее изобретение конкретно относится к катионному липидному соединению, содержащей его композиции и го применению.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Эффективная таргетная доставка биологически активных веществ, таких как низкомолекулярные лекарственные средства, пептиды, белки и нуклеиновые кислоты, особенно нуклеиновые кислоты, является постоянной медицинской проблемой. Терапия нуклеиновыми кислотами сталкивается с серьезными проблемами из-за низкой клеточной проницаемости и высокой восприимчивости к деградации определенных молекул нуклеиновых кислот, включая РНК.

[0004] Композиции, липосомы и липосомальные комплексы (липоплексы), содержащие катионный липид, были продемонстрированы в качестве носителей доставки для эффективной доставки биологически активных веществ, таких как низкомолекулярные лекарственные средства, полипептиды, белки и нуклеиновые кислоты, в клетки и/или внутриклеточные компартменты. Эти композиции обычно содержат один или несколько «катионных» и/или амино(ионизируемых) липидов, а также содержат нейтральный липид, структурированный липид и липид, конъюгированный с полимером. Катионные и/или ионизируемые липиды включают, например, амин-содержащие липиды, которые легко протонируются. Хотя было продемонстрировано множество таких композиций наночастиц, содержащих липиды, безопасность, эффективность и специфичность еще предстоит улучшить. Примечательно, что повышенная сложность липидных наночастиц (LNP) усложняет их получение и может повысить их токсичность, что является серьезной проблемой, которая может ограничить их клиническое применение. Например, частицы киРНК LNP, такие как патисиран, требуют предварительного введения стероидов и антигистаминных препаратов для устранения нежелательных иммунных ответов (Т. Coelho, D. Adams, A. Silva, et al., Safety and efficacy of RNAi therapy for transthyretin amyloidosis, N Engl J Med, 369 (2013) 819-829). Соответственно, существует потребность в разработке улучшенных катионных липидных соединений и содержащих их композиций, которые облегчают доставку терапевтических и/или профилактических агентов, таких как нуклеиновые кислоты, к клеткам.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0005] Настоящее изобретение основано, по меньшей мере, на том открытии, что нет явного соответствия между структурой катионных липидных соединений и эффективностью внутриклеточной трансфекции, цитотоксичности, и высокой и пролонгированной экспрессии у животных. Соединения с небольшими структурными различиями могут иметь очень большие различия в эффективности трансфекции и/или цитотоксичности и высокой экспрессии в клетках. Например, соединения YK-009 и YK-010 по настоящей заявке имеют почти 60-кратную разницу в эффективности трансфекции клеток и 25% или более разницу в токсичности для трансфицированных клеток. В качестве другого примера, разница в экспрессии и пролонгированной экспрессии соединений YK-003 и YK-010 у мышей может составлять 50 раз.

[0006] Следовательно, очень сложно отобрать подходящие катионные липидные соединения, которые могут одновременно обладать высокой эффективностью трансфекции и низкой цитотоксичностью, и высокой экспрессией и пролонгированной экспрессией у мышей. Благодаря уникальному дизайну, в настоящем изобретении обнаружены некоторые соединения, такие как YK-009, YK-003, YK-006, YK-008 и YK-011, которые могут доставлять нуклеиновые кислоты с высокой эффективностью трансфекции клеток, низкой или нулевой цитотоксичностью и высокой и пролонгированной экспрессией у животных по сравнению с другими соединениями известного уровня техники, и достигают неожиданных технических эффектов.

[0007] В одном аспекте настоящего изобретения, предложено новое катионное липидное соединение, которое представляет собой соединение формулы (I)

или его N-оксид, сольват, фармацевтически приемлемую соль или стереоизомер, где:

G₁ представляет собой C_1-6 алкилен, предпочтительно, незамещенный С_1-5 алкилен, более предпочтительно, незамещенный С₃ алкилен; G₂ представляет собой С_2-8 алкилен, предпочтительно, незамещенный С_4-6 алкилен, более предпочтительно, незамещенный С₅ алкилен; G₃ представляет собой C_1-3 алкилен, предпочтительно, незамещенный С₂ алкилен; L₁ представляет собой С_6-15 линейный алкил, предпочтительно, незамещенный С_8-12 линейный алкил, более предпочтительно, незамещенный С₁₀ линейный алкил; L₂ представляет собой C_12-25 разветвленный алкил, предпочтительно, незамещенный C_14-22 разветвленный алкил, более предпочтительно, незамещенный С₁₈ разветвленный алкил. Например, L₂ представляет собой:

[0008] Например, соединение формулы (I) имеет одну из следующих структур:

[0009] Другой аспект настоящего изобретения предлагает композицию, содержащую носитель, содержащий катионный липид, описанный выше.

[0010] Например, молярное соотношение катионного липида к носителю составляет от 30% до 70%.

[0011] В одном варианте осуществления, носитель дополнительно содержит нейтральный липид. Например, молярное соотношение катионного липида к нейтральному липиду составляет от 1:1 до 10:1.

[0012] В одном варианте реализации нейтральный липид содержит один или несколько из фосфатидилхолина,

фосфатидилэтаноламина, сфингомиелина, церамида, стерина и их производных.

[0013] Например, нейтральный липид выбран из одного или нескольких из 1,2-дилинолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DLPC), 1,2-димиристоил-sn-глицеро-фосфохолин (DMPC), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC), 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DPPC), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DSPC), 1,2-диундеканоил-sn-глицеро-фосфохолин (DUPC), 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (РОРС), 1,2-ди-О-октадеценил-sn-глицеро-3-фосфохолин (18:0 Diether PC), 1-олеоил-2-холестерилгемисукциноил- sn-глицеро-3-фосфохолин (OChemsPC), 1-гексадецил-sn-глицеро-3-фосфохолин (С16 Lyso PC), 1,2-дилиноленоил-sn-глицеро-3-фосфохолин, 1,2-диарахидоноил-sn-глицеро-3-фосфохолин, 1,2-дидокозагексаеноил-sn-глицеро-3-фосфохолин, 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE), 1,2-дифитаноил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (ME 16.0 РЕ), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин, 1,2-дилинолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин, 1,2-дилиноленоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин, 1,2-диарахидоноил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин, 1,2-дидокозагексаеноил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин, натриевая соль 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфо-rac-(1-глицерина) (DOPG), дипальмитоил фосфатидилглицерин (DPPG), пальмитоил олеоил фосфатидилэтаноламин (POPE), дистеароил фосфатидилэтаноламин (DSPE), дипальмитоил фосфатидилэтаноламин (DPPE), димиристоил фосфоэтаноламин (DMPE), 1-стеарил-2-олеоил-стеароилэтаноламин (SOPE), 1-стеароил-2-олеоил-фосфатидилхолин (SOPC), сфингомиелин, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозит, фосфатидная кислота, пальмитоил олеоил фосфатидилхолин, лизофосфатидилхолин, лизофосфатидилэтаноламин (LPE) и их смеси.

[0014] В предпочтительном варианте осуществления, нейтральный липид представляет собой DOPE и/или DSPC.

[0015] В одном варианте осуществления, носитель дополнительно содержит структурированный липид. Например, молярное соотношение катионного липида к структурированному липиду составляет от 1:1 до 5:1.

[0016] В одном варианте осуществления, структурированный липид выбран из одного или нескольких из холестерина, нонстерина, ситостерина, эргостерина, кампестерина, стигмастерина, брассикастерина, томатина, томатина, урсоловой кислоты, альфа-токоферола и кортикостероида. В предпочтительном варианте осуществления, структурированный липид представляет собой холестерин.

[0017] В одном варианте осуществления, носитель дополнительно содержит липид, конъюгированный с полимером. Например, молярное отношение липида, конъюгированного с полимером, к носителю составляет от 0,5% до 5%.

[0018] В одном варианте осуществления, липид, конъюгированный с полимером выбран из одного или нескольких из ПЭГ-модифицированного фосфатидилэтаноламина, ПЭГ-модифицированной фосфатидной кислоты, ПЭГ-модифицированного церамида, ПЭГ-модифицированного диалкиламина, ПЭГ-модифицированного диацилглицерина и ПЭГ-модифицированного диалкилглицерина.

[0019] Например, липид, конъюгированный с полимером выбран из одного или нескольких из дистеароилфосфатидилэтаноламина, полиэтиленгликоля 2000 (DSPE-PEG2000), димиристоилглицеро-3-метоксиполиэтиленгликоля 2000 (DMG-PEG2000) и метоксиполиэтилен гликоль дитетрадецилацетамида (ALC-0159).

[0020] В одном варианте осуществления, носитель включает нейтральный липид, структурированный липид и липид, конъюгированный с полимером, где молярное отношение катионного липида, нейтрального липида, структурированного липида и липида, конъюгированного к полимеру, составляет (25~65):(5~25):(25~45):(0,5~5), предпочтительно, составляет 50:10: 38,5: 1,5.

[0021] В одном варианте осуществления, композиция представляет собой состав наночастиц, и средний размер частиц состава наночастиц составляет от 10 до 210 нм, предпочтительно, от 100 до 205 нм; коэффициент полидисперсности состава наночастиц составляет ≤50%, предпочтительно, ≤30%.

[0022] В одном варианте осуществления, катионный липид дополнительно содержит одно или несколько других ионизируемых липидных соединений.

[0023] В одном варианте осуществления, композиция дополнительно содержит терапевтический или профилактический агент.Например, массовое отношение носителя к лечебному или профилактическому агенту в композиции составляет от 10:1 до 30:1.

[0024] В одном варианте осуществления, массовое отношение носителя к терапевтическому или профилактическому агенту составляет от 15:1 до 25:1, предпочтительно, составляет 16:1.

[0025] В одном варианте осуществления, терапевтический или профилактический агент содержит одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты, низкомолекулярных соединений, полипептидов или белков.

[0026] Например, терапевтический или профилактический агент представляет собой вакцину или соединение, способное вызывать иммунный ответ.

[0027] В одном варианте осуществления, терапевтический или профилактический агент представляет собой нуклеиновую кислоту. Например, терапевтическим или профилактическим средством может быть дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК).

[0028] В одном варианте осуществления, терапевтический или профилактический агент представляет собой рибонуклеиновую кислоту (РНК).

[0029] В одном варианте осуществления, РНК выбрана из группы, состоящей из короткой интерферирующей РНК (киРНК), асимметричной интерферирующей РНК (аиРНК), микроРНК (миРНК), Dicer-субстратной РНК (дцРНК), короткой шпилечной РНК (кшРНК), информационной РНК (иРНК) и их смесей. Например, РНК представляет собой иРНК.

[0030] В одном варианте осуществления, композиция дополнительно включает один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов или разбавителей.

[0031] Другой аспект настоящего изобретения предлагает вышеуказанный катионный липид или композицию для применения в доставке терапевтического или профилактического агента пациенту, нуждающемуся в этом.

[0032] Другой аспект настоящего изобретения предлагает применение вышеуказанного катионного липида или композиции при производстве лекарственного средства на основе нуклеиновой кислоты, генной вакцины, низкомолекулярных лекарственных средств, полипептидных или белковых лекарственных средств.

[0033] Другой аспект настоящего изобретения предлагает применение вышеуказанного катионного липида или композиции при производстве лекарственного средства для лечения заболевания или состояния у млекопитающего, нуждающегося в этом.

[0034] Другой аспект настоящего изобретения предлагает вышеуказанный катионный липид или композицию для применения при лечении заболевания или состояния у млекопитающего, нуждающегося в этом.

[0035] Другой аспект настоящего изобретения предлагает способ лечения или профилактики заболевания или состояния, включающий введение терапевтически или профилактически эффективного количества указанной выше композиции пациенту или субъекту, нуждающемуся в этом.

[0036] В одном варианте осуществления, заболевание или состояние характеризуется дисфункциональной или аномальной активностью белка или полипептида.

[0037] Например, заболевание или состояние выбрано из группы, включающей инфекционные заболевания, раковые и пролиферативные заболевания, генетические заболевания, аутоиммунные заболевания, диабет, нейродегенеративные заболевания, сердечно-сосудистые и реноваскулярные заболевания и метаболические заболевания.

[0038] Например, инфекционное заболевание выбрано из заболеваний, вызванных коронавирусом, вирусом гриппа или вирусом ВИЧ, детской пневмонии, лихорадки долины Рифт, желтой лихорадки, бешенства и различных герпесов.

[0039] В предпочтительном варианте осуществления, млекопитающим является человек.

[0040] В одном варианте осуществления, композицию вводят внутривенно, внутримышечно, интрадермально, подкожно, интраназально или путем ингаляции. Например, композицию вводят подкожно.

[0041] В одном варианте осуществления, терапевтический или профилактический агент вводят млекопитающему в дозе от примерно 0,001 мг/кг до примерно 10 мг/кг.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0042] Чтобы более четко проиллюстрировать технические решения примеров настоящего изобретения, ниже кратко представлены чертежи примеров. Очевидно, чертежи в следующем описании относятся только к некоторым примерам настоящего изобретения, но не ограничивают настоящее изобретение.

[0043] На Фиг. 1 показаны результаты тестов на трансфекцию клеток с различными массовыми отношениями носителя (включая YK-009) к иРНК, использованными при приготовлении составов LNP, где а показывает отношение носитель:иРНК 4:1, b показывает отношение носитель:иРНК 16:1, и с показывает холостой контроль.

[0044] На Фиг. 2 показаны результаты тестов на трансфекцию клеток с различными молярными отношениями катионного липида YK-009 к нейтральному липиду DSPC, использованными при приготовлении составов LNP, где а показывает 1:1, b показывает 5:1, с показывает 10:1, и d показывает холостой контроль.

[0045] На Фиг. 3 показаны результаты тестов по трансфекции клеток с различными молярными отношениями липидов, конъюгированных с полимером, к носителю (включая YK-009) при получении составов LNP, где а показывает 5%, b показывает 1,5% и с показывает холостой контроль.

[0046] На Фиг. 4 показаны результаты тестов на трансфекцию клеток с различными отношениями катионного липида YK-009, нейтрального липида DSPC, структурированного липидного холестерина и липида, конъюгированного с полимером DMG-PEG2000 в носителе при получении составов LNP, где а показывает 65:8:25:2, b показывает 50:10:38,5:1,5, и с показывает холостой контроль.

[0047] На Фиг. 5 показана интенсивность абсорбции флуоресценции составов LNP Fluc-иРНК, приготовленных из различных катионных липидов.

[0048] На Фиг. 6 показана интенсивность абсорбции флуоресценции составов LNP Fluc-иРНК, полученных соответственно, для катионного липида YK-009 и соединения 25, где содержание Fluc-иРНК составляет 0, 075 мкг, 0,15 мкг, 0, 225 мкг и 0,3 мкг, соответственно.

[0049] На Фиг. 7 показана выживаемость клеток после введения составов LNP Fluc-иРНК, приготовленных из различных катионных липидов, в среду культуры клеток и культивирования в течение 24 часов.

[0050] На Фиг. 8 показана выживаемость клеток после введения составов LNP (содержание Fluc-иРНК 0,375 мкг, 0,75 мкг, 1,125 мкг и 1,5 мкг, соответственно) Fluc-иРНК, приготовленных из катионного липида YK-009 и соединения 25, в среду для культивирования клеток и культивирования в течение 24 часов.

[0051] На Фиг. 9 показаны результаты визуализирующих тестов на живых мышах составов LNP Fluc-иРНК, полученных из различных катионных липидов.

[0052] На Фиг. 10 показаны результаты визуализирующих тестов на живых мышах составов LNP Fluc-иРНК, полученных из катионного липида YK-009 и соединения 25, соответственно, где составы LNP имеют различное содержание Fluc-иРНК: а показывает 2,5 мкг, b показывает 5 мкг, с показывает 7,5 мкг и d показывает 10 мкг.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[0053] Чтобы сделать цель, технические решения и преимущества примеров настоящего изобретения более понятными, технические решения примеров настоящего изобретения будут ясно и полностью описаны ниже вместе с чертежами примеров настоящего изобретения. Очевидно, что описанные примеры представляют собой некоторые из примеров настоящего изобретения, а не все из них. На основе описанных примеров настоящего изобретения, все другие примеры, полученные специалистами в данной области техники без творческих усилий, подпадают под объем охраны настоящего изобретения.

[0054] Настоящее изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без отклонения от существенных атрибутов настоящего изобретения. Следует понимать, что любые и все варианты осуществления настоящего изобретения могут быть объединены с техническими характеристиками в любом(ых) другом(их) варианте(ах) осуществления для получения дополнительных вариантов осуществления при условии отсутствия конфликта. Настоящее изобретение включает дополнительные варианты осуществления, полученные из таких комбинаций.

[0055] Все публикации и патенты, упомянутые в данном раскрытии, полностью включены в настоящий документ посредством ссылки. Если применение или терминология, использованная в каких-либо публикациях и патентах, включенных посредством ссылки, противоречит применению или терминологии, используемой в настоящем раскрытии, применение и терминология в настоящем раскрытии имеют преимущественную силу.

[0056] Заголовки разделов, используемые в настоящем документе, предназначены только для организации текста и не должны рассматриваться как ограничения описываемого объекта.

[0057] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют свои обычные значения в области техники, к которой принадлежит заявленный объект. В случае, если для термина существует более одного определения, определение, данное в настоящем документе, имеет преимущественную силу.

[0058] За исключением рабочих примеров или случаев, когда не указано иное, все цифры, обозначающие количественные свойства, такие как дозировки, в описании и формуле изобретения, следует понимать как модифицированные во всех случаях термином «примерно». Также следует понимать, что любой числовой диапазон, указанный в настоящем документе, включает в себя все поддиапазоны внутри этого диапазона и любую комбинацию различных конечных точек таких диапазонов или поддиапазонов.

[0059] Слова «содержащий», «включающий» или «содержащий» и подобные слова, используемые в настоящем описании, означают, что элемент, появляющийся перед словом, охватывает элементы, перечисленные после слова, и их эквиваленты, и не исключает не перечисленные элементы. Термины «содержащий» или «включающий (содержащий)», используемые в настоящем документе, могут быть открытыми, полузакрытыми и закрытыми. Другими словами, термины также включают «состоящий по существу из» или «состоящий из».

[0060] Термин «фармацевтически приемлемый» в настоящей заявке означает, что соединение или композиция химически и/или токсикологически совместимы с другими ингредиентами, образующими состав, и/или с человеком или млекопитающим, у которых они используются для профилактики или лечения заболевания или состояния.

[0061] Термин «субъект» или «пациент» в данной заявке включает человека и млекопитающих.

[0062] Термин «лечение», используемый в настоящем документе, относится к введению одного или нескольких лекарственных веществ пациенту или субъекту, страдающему от заболевания или симптомов заболевания, с целью излечения, облегчения, ослабления, улучшения или воздействия на заболевание или симптомы заболевания. В контексте настоящей заявки, если специально не указано иное, термин «лечение» может также включать профилактику.

[0063] Термин «сольват» в данной заявке относится к комплексу, образованному путем объединения соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли с растворителем (например, этанолом или водой). Следует понимать, что любой сольват соединения формулы I для применения при лечении заболевания или состояния может обладать различными свойствами, включая фармакокинетические свойства, однако при абсорбции у субъекта дает соединение формулы I, так что применение соединения формулы I включает использование любого сольвата соединения формулы I, соответственно.

[0064] Термин «гидрат» относится к ситуации, когда растворителем в приведенном выше термине «сольват» является вода.

[0065] Следует также понимать, что соединение формулы I или его фармацевтически приемлемая соль могут быть выделены в форме сольвата, и поэтому любой такой сольват включен в объем настоящего изобретения. Например, соединение формулы I или его фармацевтически приемлемая соль может существовать в не сольватированной форме, а также в форме, сольватированной с фармацевтически приемлемым растворителем, таким как вода, этанол или подобный.

[0066] Термин «фармацевтически приемлемая соль» относится к относительно нетоксичной неорганической или органической кислотно-аддитивной соли соединения по настоящему изобретению. Например, см. S.M. Berge et al. "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 1977, 66, 1-19. Неорганическая кислота представляет собой, например, хлористоводородную, бромистоводородную, иодистоводородную, серную, фосфорную или азотную кислоту; и органическая кислота представляет собой, например, муравьиную, уксусную, ацетоуксусную, пировиноградную, трифторуксусную, пропионовую, масляную, гексановую, гептановую, ундекановую, лауриновую, бензойную, салициловую, 2-(4-гидроксибензоил)бензойную, камфорную, коричную, циклопентанпропионовую, диглюконовую, 3-гидрокси-2-нафтойную, никотиновую, памовую, пектиновую, 3-фенилпропионовую, пикриновую, пивалиновую, 2-гидроксиэтансульфоновую, итаконовую, сульфаминовую, трифторметансульфоновую, додецилсерную, этансульфоновую, бензолсульфоновую, пара-толуолсульфоновую, метансульфоновую, 2-нафталинсульфоновую, нафталиндисульфоновую, камфорсульфоновую кислоту, лимонную, винную, стеариновую, молочную, щавелевую, малоновую, янтарную, яблочную, адипиновую, альгиновую, малеиновую, фумаровую, D-глюконовую, миндальную, аскорбиновую, глюкогептановую, глицерофосфорную, аспарагиновую или сульфосалициловую кислоту. Например, фармацевтически приемлемая соль может быть образована с использованием соединения формулы I и НСl (или хлористоводородной кислоты), HBr (или бромистоводородной кислоты), метансульфоновой кислоты, серной кислоты, винной кислоты или фумаровой кислоты.

[0067] Азотсодержащие соединения формулы (I) настоящего изобретения могут быть превращены в N-оксиды путем обработки окислителем (например, м-хлорпербензойной кислотой, перекисью водорода, озоном). Следовательно, в условиях, допускаемых валентным состоянием и строением, заявленные в настоящей заявке соединения включают не только показанные в структурных формулах азотсодержащие соединения, но и их N-оксидные производные.

[0068] Некоторые соединения настоящего изобретения могут существовать в виде одного или нескольких стереоизомеров. Стереоизомеры включают геометрические изомеры, диастереомеры и энантиомеры. Соответственно, соединения, заявленные в настоящем описании, также включают рацемические смеси, отдельные стереоизомеры и оптически активные смеси. Специалистам в данной области техники будет понятно, что один стереоизомер может иметь лучшую эффективность и/или меньшие побочные эффекты, чем другие стереоизомеры. Отдельные стереоизомеры и оптически активные смеси могут быть получены такими способами, как синтез хирального источника, хиральный катализ и хиральное разделение. Рацемат можно хирально разделить с помощью хроматографического разделения или химического разрешения. Например, можно добавить хиральную винную кислоту, хиральную яблочную кислоту или другие реагенты для разделения хиральной кислоты с образованием соли с соединением по настоящему изобретению, и продукт можно разделить, используя различные физические и химические свойства продукта, такие как как растворимость.

[0069] Настоящее изобретение также включает все подходящие изотопные варианты раскрытых соединений. Изотопный вариант определен как соединение, в котором по меньшей мере один атом замещен атомом с тем же атомным номером, но с атомной массой, отличной от той, которая обычно встречается или преимущественно встречается в природе. Примеры изотопов, которые могут быть включены в соединения по настоящему изобретению, включают изотопы водорода, углерода, азота и кислорода, такие как ²Н (дейтерий), ³Н (тритий), ¹¹С, ¹³С, ¹⁴С, ¹⁵N, ¹⁷O и ¹⁸O, соответственно.

[0070] Термин «алкил» используется в данном описании для включения разветвленных и линейных насыщенных алифатических одновалентных углеводородных групп, имеющих указанное количество атомов углерода. Термин «алкилен» используется в данном описании для обозначения разветвленных и линейных насыщенных алифатических двухвалентных углеводородных групп, имеющих указанное количество атомов углерода. C_n-m относится к группам, имеющим от п до m атомов углерода. Например, С_2-5 алкилен включает С₂ алкилен, С₃ алкилен, С₄ алкилен и С₅ алкилен.

[0071] Алкильная (или алкиленовая) группа может быть не замещена, или алкильная (или алкиленовая) группа может быть замещена, при этом по меньшей мере один водород замещен другой химической группой.

[0072] «Терапевтически эффективное количество» представляет собой количество вводимого терапевтического агента, которое улучшит заболевание или состояние пациента. «Профилактически эффективное количество» представляет собой количество вводимого профилактического агента, которое предотвратит заболевание или состояние у субъекта. «Терапевтически эффективное количество» терапевтического агента или «профилактически эффективное количество» профилактического агента может варьироваться в зависимости от терапевтического/профилактического агента, состояния заболевания и его тяжести, возраста и веса пациента/субъекта, подлежащего лечению/профилактике и т.д. Терапевтически эффективное количество и профилактически эффективное количество могут быть определены обычным специалистом в данной области техники на основании его знаний и настоящего описания.

[0073] В настоящей заявке, если название соединения не соответствует структурной формуле, структурная формула имеет преимущественную силу.

[0074] Следует понимать, что термин «соединение по настоящему изобретению», используемый в настоящей заявке, может включать соединение формулы I, его N-оксид, его сольват, его фармацевтически приемлемую соль, его стереоизомер или их смесь в соответствии с контекстом.

[0075] Термин «катионный липид», используемый в настоящем документе, относится к липиду, который заряжен положительно при выбранном значении рН.

[0076] Катионные липиды склонны связываться с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами, то есть образовывать липидные наночастицы (LNP) путем взаимодействия с отрицательно заряженными фосфатными группами, присутствующими в нуклеиновых кислотах, посредством электростатических сил. LNP в настоящее время является одним из основных носителей доставки.

[0077] После скрининга большого количества соединений, авторы изобретения обнаружили, что очень сложно отобрать подходящие катионные липидные соединения, отвечающие следующим условиям: высокая эффективность трансфекции и низкая цитотоксичность, а также высокая и пролонгированная экспрессия у мышей. Авторы изобретения обнаружили, что некоторые соединения, такие как YK-009, YK-003, YK-006, YK-008 и YK-011, могут доставлять нуклеиновые кислоты с высокой эффективностью внутриклеточной трансфекции, низкой или нулевой цитотоксичностью, и высокой и пролонгированной экспрессией у животных по сравнению с соединениями известного уровня техники.

Соединения с небольшими структурными различиями могут иметь очень большие различия в эффективности трансфекции и/или цитотоксичности и высокой экспрессии в клетках. Например, соединения YK-009 и YK-010 по настоящей заявке имеют почти 60-кратную разницу в эффективности трансфекции клеток и 25% или более разницу в токсичности для трансфицированных клеток. В качестве другого примера, разница в экспрессии и пролонгированной экспрессии соединений YK-003 и YK-010 у мышей может составлять 50 раз.

[0078] В настоящем документе, катионный липид DLin-MC3-DMA (МСЗ), раскрытый Alnylam Pharmaceuticals, Inc. (NASDAQ: ALNY) в CN102625696 В, выбран для сравнения с разработанными нами соединениями. Помимо эффективной и безопасной доставки киРНК, DLin-MC3-DMA (МСЗ) в настоящее время также широко используется для доставки иРНК.

[0079] Структура катионного липида DLin-MC3-DMA (МСЗ):

[0080] Кроме того, соединения настоящего изобретения также сравнивают со структурно подобными соединениями 23, 25 (а именно, SM-102, номер CAS: 2089251-47-6, катионный липид, используемый в вакцине иРНК-1273 Moderna против covid 19), и 27 в патенте CN 110520409 А, поданном компанией Moderna.

Соединение 27.

[0081] Мы обнаружили, что соединения настоящего изобретения значительно улучшают эффективность трансфекции и/или цитотоксичность. Например, что касается трансфекции иРНК, эффективность трансфекции клеток соединением YK-009 в 40 раз, В раз и 13 раз выше, чем у МСЗ, соединения 23 и соединения 27, соответственно; токсичность для трансфицированных клеток соединения YK-009 на 12%, 13% и 16% ниже, чем у МСЗ, соединения 23 и соединения 27, соответственно; экспрессия у мышей соединения YK-009 более чем в 25 раз, 7 раз и 6 раз выше, чем для МСЗ, соединения 23 и соединения 27, соответственно; и экспрессия у мышей соединения YK-003 более чем в 18 раз, 8 раз и 7 раз выше, чем для МСЗ, соединения 23 и соединения 27, соответственно.

[0082] При трансфекции иРНК, соединение YK-009 по настоящему изобретению имеет 7-кратное увеличение эффективности трансфекции клеток, 9% снижение токсичности для трансфицированных клеток и 7-кратное увеличение экспрессии у мышей по сравнению с соединением 25.

[0083] Один аспект настоящего изобретения предлагает новые катионные липидные соединения для доставки терапевтического или профилактического агента. Катионные липидные соединения настоящего изобретения можно использовать для доставки молекул нуклеиновой кислоты, низкомолекулярных соединений, полипептидов или белков. По сравнению с известными катионными липидными соединениями, катионные липидные соединения настоящего изобретения демонстрируют более высокую эффективность трансфекции и меньшую цитотоксичность и, таким образом, улучшают эффективность и безопасность доставки.

[0084] Настоящее изобретение относится к катионному липиду, который представляет собой соединение формулы (I)

или его N-оксид, сольват, фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где

G₁ представляет собой С_1-6 алкилен, предпочтительно, незамещенный С_2-5 алкилен, более предпочтительно, незамещенный С₃ алкилен;

G₂ представляет собой С_2-8 алкилен, предпочтительно, незамещенный С_4-6 алкилен, более предпочтительно, незамещенный С₅ алкилен;

G₃ представляет собой C_1-3 алкилен, предпочтительно, незамещенный С₂ алкилен;

L₁ представляет собой C_6-15 линейный алкил, предпочтительно, незамещенный С_8-12 линейный алкил, более предпочтительно, незамещенный С₁₀ линейный алкил;

L₂ представляет собой С_12-25 разветвленный алкил, предпочтительно, незамещенный С_14-22 разветвленный алкил, более предпочтительно, незамещенный С₁₈ разветвленный алкил.

[0085] Б одном варианте осуществления, G₁ представляет собой незамещенный C_2-5 алкилен, предпочтительно, незамещенный С₃ алкилен, например, - (СН₂)₃-.

[0086] В одном варианте осуществления, G₂ представляет собой незамещенный С_4-6 алкилен, предпочтительно, незамещенный С₅ алкилен, например, - (СН₂)₅-.

[0087] В одном варианте осуществления, G₃ представляет собой незамещенный С₂ алкилен, т.е., -(С₂)₂-.

[0088] В одном варианте осуществления, L₁ представляет собой незамещенный C_8-12 линейный алкил, предпочтительно, незамещенный С₁₀ линейный алкил, например, -(СН₂)₉СН₃.

[0089] В одном варианте осуществления, L₂ представляет собой незамещенный С_14-22 разветвленный алкил, предпочтительно, незамещенный C₁₈ разветвленный алкил. Например, L₂ представляет собой:

[0090] В одном варианте осуществления, G₁ представляет собой -(СН₂)₃-, G₂ представляет собой -(СН₂)₅-, G₃ представляет собой -(СН₂)₂-, L₁ представляет собой -(СН₂)₃СН₃, L₂ представляет собой:

[0091] В типовых вариантах осуществления, соединение выбрано из следующих соединений или из N-оксидов, сольватов, фармацевтически приемлемых солей или стереоизомеров:

[0092] Другой аспект настоящего изобретения предлагает композицию, содержащую носитель, где носитель включает катионный липид, и катионный липид включает указанное выше соединение формулы (I) или его N-оксид, сольват, фармацевтически приемлемую соль или стереоизомер.

[0093] В одном варианте осуществления, композиция представляет собой состав наночастиц, где средний размер состава наночастиц составляет от 10 до 210 нм, предпочтительно, от 100 до 205 нм; и коэффициент полидисперсности состава наночастиц составляет ≤50%, предпочтительно, ≤30%, более предпочтительно, ≤25%.

[0094] Катионный липид

[0095] В одном варианте осуществления композиции/носителя по настоящему изобретению, катионный липид представляет собой одно или несколько соединений, выбранных из вышеуказанного соединения формулы (I) или его N-оксида, сольвата, фармацевтически приемлемой соли или стереоизомера. В одном варианте осуществления, катионный липид выбран из соединений формулы (I), описанных выше. Например, катионный липид представляет собой соединение YK-001, YK-002, YK-003, YK-004, YK-005, YK-006, YK-007, YK-008, YK-009, YK-010 или YK-011. В предпочтительном варианте осуществления, катионный липид представляет собой соединение YK-009.

[0096] В другом варианте осуществления композиции/носителя по настоящему изобретению, катионный липид содержит: (а) одно или несколько соединений, выбранных из вышеуказанного соединения формулы (I) или его N-оксида, сольвата, фармацевтически приемлемой соли или стереоизомера; и (b) одно или несколько других ионизируемых липидных соединений, отличных от (а). Катионное липидное соединение (b) может представлять собой коммерчески доступный катионный липид или катионное липидное соединение, описанное в литературе. Например, катионное липидное соединение (b) может представлять собой DLin-MC3-DMA (МСЗ). В качестве другого примера, катионное липидное соединение (b) может представлять собой соединение 23, 25 или 27 и т.д. из CN110520409A.

[0097] В одном варианте осуществления, молярное отношение катионного липида к носителю составляет от 30% до 70%, например 35%, 45%, 50%, 55%, 60% или 65%.

[0098] Носитель можно использовать для доставки активного ингредиента, такого как терапевтический или профилактический агент. Активный ингредиент может быть запечатан внутри носителя или связан с носителем.

[0099] Например, терапевтический или профилактический агент включает одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты, низкомолекулярных соединений, полипептидов или белков. Такие нуклеиновые кислоты включают, но не ограничены ими, одноцепочечную ДНК, двухцепочечную ДНК и РНК. Подходящие РНК включают, но не ограничены ими, короткую интерферирующую РНК (киРНК), асимметричную интерферирующую РНК (аиРНК), микроРНК (миРНК), Dicer-субстратную РНК (дцРНК), короткую шпилечную РНК (кшРНК), информационную РНК (иРНК) и их смеси.

[00100] Нейтральный липид

[00101] Носитель может содержать нейтральный липид. Нейтральный липид в данном описании относится к вспомогательному липиду, который не заряжен или существует в цвиттерионной форме при выбранном значении рН. Нейтральный липид может регулировать поток наночастиц в структуру липидного бислоя и повышать эффективность, способствуя фазовому переходу липидов, а также, возможно, влияя на специфичность к органу-мишени.

[00102] В одном варианте осуществления, молярное отношение катионного липида к нейтральному липиду составляет от примерно 1:1 до 10:1, например, примерно 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1 или 3:1. В предпочтительном варианте осуществление, молярное отношение катионного липида к нейтральному липиду составляет примерно 5: 1.

[00103] Например, нейтральные липиды могут включать один или несколько из фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, сфингомиелина, церамида, стерина и их производных.

[00104] Носитель композиции, содержащей катионный липид, может содержать один или несколько нейтральных липидов-фосфолипидов, таких как один или несколько (поли)ненасыщенных липидов. Фосфолипиды могут быть собраны в один или несколько липидных бислоев. В общем, фосфолипид может содержать фосфолипидный фрагмент и один или несколько фрагментов жирных кислот.

[00105] Нейтральный липидный фрагмент может быть выбран из неограничивающей группы, состоящей из фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилглицерина, фосфатидилсерина, фосфатидной кислоты, 2-лизофосфатидилхолина и сфингомиелина. Фрагмент жирной кислоты может быть выбран из неограничивающей группы, состоящей из лауриновой кислоты, миристиновой кислоты, миристолеиновой кислоты, пальмитиновой кислоты, пальмитолеиновой кислоты, стеариновой кислоты, олеиновой кислоты, линолевой кислоты, альфа-линоленовой кислоты, эруковой кислоты, фитановой кислоты, арахидиновой кислоты, арахидоновой кислоты, эйкозапентаеновой кислоты, бегеновой кислоты, докозапентаеновой кислоты и докозагексаеновой кислоты. Также рассматриваются виды не природного происхождения, которые включают виды природного происхождения с модификациями и заменами, такими как разветвление, окисление, циклизация и алкины. Например, фосфолипид может быть функционализирован или поперечно сшит с одним или несколькими алкинами (например, алкенильной группой, в котором одна или несколько двойных связей замещены тройной связью). В соответствующих условиях реакции, алкинильные группы могут подвергаться катализируемым медью реакциям циклоприсоединения под воздействием азидов. Эти реакции можно использовать для функционализации липидного бислоя композиции для облегчения проникновения через мембрану или распознавания клеток, или для сочетания композиции с полезными компонентами, такими как таргетные или визуализирующие фрагменты (например, красители).

[00106] Нейтральные липиды, применяемые в этих композициях, могут быть выбраны из неограничивающей группы, состоящей из: 1,2-дилинолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DLPC), 1,2-димиристоил-sn-глицеро-фосфохолина (DMPC), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DOPC), 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DPPC), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DSPC), 1,2-диундеканоил-sn-глицеро-фосфохолина (DUPC), 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (РОРС), 1,2-ди-О-октадеценил-sn-глицеро-3-фосфохолина (18:0 Diether PC), 1-олеоил-2-холестерилгемисукциноил-sn-глицеро-3-фосфохолина (OChemsPC), 1-гексадецил-sn-глицеро-3-фосфохолина (С16 Lyso PC), 1,2-дилиноленоил-sn-глицеро-3-фосфохолина, 1,2-диарахидоноил-sn-глицеро-3-фосфохолина, 1,2-дидокозагексаеноил-sn-глицеро-3-фосфохолина, 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина (DOPE), 1,2-дифитаноил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина (ME 16.0 РЕ), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина, 1,2-дилинолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина, 1,2-дилиноленоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина, 1,2-диарахидоноил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина, 1,2-дидокозагексаеноил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина, натриевой соли 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфо-rac-(1-глицерина) (DOPG), дипальмитоил фосфатидилглицерина (DPPG), пальмитоил олеоил фосфатидилэтаноламина (POPE), дистеароил-фосфатидил-этаноламина (DSPE), дипальмитоил фосфатидилэтаноламина (DPPE), димиристоил фосфоэтаноламина (DMPE), 1-стеарил-2-олеоил-стеароилэтаноламина (SOPE), 1-стеароил-2-олеоил-фосфатидилхолина (SOPC), сфингомиелина, фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозита, фосфатидной кислоты, пальмитоил олеоил фосфатидилхолина, лизофосфатидилхолина, лизофосфатидилэтаноламина (LPE) и их смесей.

[00107] В некоторых вариантах осуществления, нейтральный липид содержит DSPC. В некоторых вариантах осуществления, нейтральный липид содержит DOPE. В некоторых вариантах осуществления, нейтральный липид содержит как DSPC, так и DOPE.

[00108] Структурированный липид

[00109] Носитель композиции, включающей катионный липид, может также включать один или несколько структурированных липидов. Структурированные липиды в данном описании относятся к липидам, которые повышают стабильность наночастиц путем заполнения промежутков между липидами.

[00110] В одном варианте осуществления, молярное отношение катионного липида к структурированному липиду составляет от примерно 1:1 до 5:1, например, примерно 1,0:1, 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1, 1,6:1, 1,7:1, 1,8:1, 1,9:1, или 2,0:1.

[00111] Структурированные липиды могут быть выбраны, но не ограничены ими, из группы состоящей из холестерина, нонстерина, ситостерина, эргостерина, кампестерина, стигмастерина, брассикастерина, томатина, томатина, урсоловой кислоты, альфа-токоферола, кортикостероида и их смесей. В некоторых вариантах осуществления, структурированный липид представляет собой холестерин. В некоторых вариантах осуществления, структурированный липид включает холестерин, кортикостероид (например, преднизолон, дексаметазон, преднизон и гидрокортизон) или их комбинацию.

[00112] Липид, конъюгированный с полимером

[00113] Носитель композиции, включающей катионный липид, может также включать один или несколько липидов, конъюгированных с полимером. Липиды, конъюгированные с полимером в основном относятся к липидам, модифицированным полиэтиленгликолем (ПЭГ). Гидрофильный ПЭГ стабилизирует LNP, регулирует размер наночастиц за счет ограничения слияния липидов и увеличивает период полураспада наночастиц за счет уменьшения неспецифических взаимодействий с макрофагами.

[00114] В одном варианте осуществления, липид, конъюгированный с полимером, выбран из одного или нескольких из фосфатидилэтаноламина, модифицированного ПЭГ, фосфатидной кислоты, модифицированной ПЭГ, церамида, модифицированного ПЭГ, диалкиламина, модифицированного ПЭГ, диацилглицерина, модифицированного ПЭГ и диалкилглицерина, модифицированного ПЭГ. Молекулярная масса ПЭГ для модификации ПЭГ обычно составляет 350-5000 Да.

[00115] Например, липид, конъюгированный с полимером, выбран из одного или нескольких из дистеароил фосфатидилэтаноламин полиэтиленгликоля 2000 (DSPE-PEG2000), димиристоилглицеро-3-метоксиполиэтиленгликоля 2000 (DMG-PEG2000) и метоксиполиэтиленгликоль дитетрадецилацетамида (ALC-0159).

[00116] В одном варианте осуществления композиции/носителя по настоящему изобретению, липид, конъюгированный с полимером представляет собой DMG-PEG2000.

[00117] В одном варианте осуществления композиции/носителя по настоящему изобретению, носитель включает нейтральный липид, структурированный липид и липид, конъюгированный с полимером, где молярное отношение катионного липида, нейтрального липида, структурированного липида и липида, конъюгированного с полимером, составляет (25-65): (5-25): (25-45): (0,5-5), например, (45-55):(9-11):(34-43):(0,5-2,5).

[00118] В одном варианте осуществления композиции/носителя по настоящему изобретению, носитель включает нейтральный липид, структурированный липид и липид, конъюгированный с полимером, где молярное отношение катионного липида, нейтрального липида, структурированного липида и липида, конъюгированного с полимером составляет 50:10: 38,5:1,5.

[00119] Терапевтический и/или профилактический агент

[00120] Композиция может включать один или несколько терапевтических и/или профилактических агентов. В одном варианте осуществления, массовое отношение носителя к терапевтическому или профилактическому средству составляет от 10:1 до 30:1, например 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 1,9:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1 или 25:1.

[00121] В одном варианте осуществления, массовое отношение носителя и терапевтического или профилактического агента составляет от 15:1 до 25:1, предпочтительно, 16:1.

[00122] Терапевтический или профилактический агент включает, но не ограничен ими, одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты, низкомолекулярное соединение, полипептид или белок.

[00123] Например, терапевтический или профилактический агент представляет собой вакцину или соединение, способное вызывать иммунный ответ.

[00124] Носители настоящего изобретения могут доставлять терапевтические и/или профилактические агенты в клетки или органы млекопитающих, и, таким образом, настоящее изобретение также предлагает способы лечения заболеваний или состояний у млекопитающих, нуждающихся в этом, которые включают введение млекопитающему композиции, содержащей терапевтический и/или профилактический агент и/или контакт клеток млекопитающих с композицией.

[00125] Терапевтические и/или профилактические агенты включают биологически активные вещества и альтернативно называются «активными агентами». Терапевтическим и/или профилактическим агентом может быть вещество, которое, после доставки в клетку или орган, вызывает желаемое изменение в клетке или органе или в других тканях или системах организма. Такие виды можно использовать для лечения одного или нескольких заболеваний, нарушений или состояний. В некоторых вариантах осуществления, терапевтический и/или профилактический агент представляет собой низкомолекулярное лекарственное средство, пригодное для лечения конкретного заболевания, нарушения или состояния. Примеры лекарственных средств, которые можно использовать в композиции, включают, но не ограничены ими, противоопухолевые агенты (например, винкристин, доксорубицин, митоксантрон, камптотецин, цисплатин, блеомицин, циклофосфамид, метотрексат и стрептозотоцин), противоопухолевые агенты (например, актиномицин D, винкристин, винбластин, цитозин арабинозид, антрациклин, алкилирующие агенты, соединения платины, антиметаболиты и аналоги нуклеозидов, такие как метотрексат и аналоги пурина и пиримидина), противоинфекционные агенты, местные анестетики (например, дибукаин и хлорпромазин), бета-адренергические блокаторы (например, пропранолол, тимолол и лабеталол), антигипертензивные агенты (например, клонидин и гидралазин), антидепрессанты (например, имипрамин, амитриптилин и доксепин), противосудорожные агенты (например, фенитоин), антигистаминные агенты (например, димедрол, хлорфенирамин и прометазин), антибиотики/антибактериальные агенты (например, гентамицин, ципрофлоксацин и цефокситин), противогрибковые агенты (например, миконазол, терконазол, эконазол, изоконазол, бутаконазол, клотримазол, итраконазол, нистатин, нафтифин и амфотерицин В), противопаразитарные агенты, гормоны, антагонисты гормонов, иммуномодуляторы, антагонисты нейротрансмиттеров, противоглаукомные лекарственные средства, витамины, седативные агенты и агенты визуализации.

[00126] В некоторых вариантах осуществления, терапевтический и/или профилактический агент представляет собой цитотоксин, радиоактивный ион, химиотерапевтический агент, вакцину, соединение, вызывающее иммунный ответ, и/или другой терапевтический агент и/или профилактический агент.Цитотоксин или цитотоксический агент включает любой агент, вредный для клеток. Примеры включают, но не ограничены ими, таксол, цитохалазин В, грамицидин D, бромид этидия, эметин, митомицин, этопозид, тенипозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоид, новокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол, пуромицин, майтанзиноиды, такие как майтанзинол, рахелмицин (СС-1065), и их аналоги или гомологи. Радиоактивные ионы включают, но не ограничены ими, йод (например, йод 125 или йод 131), стронций 89, фосфор, палладий, цезий, иридий, фосфат, кобальт, иттрий 90, самарий 153 и празеодим. Вакцины включают соединения и составы, которые обеспечивают иммунитет против одного или нескольких состояний, связанных с инфекционными заболеваниями, такими как грипп, корь, вирус папилломы человека (HPV), бешенство, менингит, коклюш, столбняк, чума, гепатит и туберкулез, и могут включать иРНК, кодирующую антигены и/или эпитопы, полученные из инфекционных заболеваний. Вакцины могут также включать соединения и составы, которые вызывают иммунный ответ против раковых клеток, и могут включать иРНК, кодирующую антигены, эпитопы и/или неоэпитопы, полученные из опухолевых клеток. Соединения, вызывающие иммунный ответ, могут включать вакцины, кортикостероиды (например, дексаметазон) и другие виды. В некоторых вариантах осуществления, вакцины и/или соединения, способные вызывать иммунный ответ, вводят путем внутримышечного введения композиции, содержащей соединение формулы (I), (IA), (IB), (II), (IIa), (IIb), (IIe), (IId), (IIe), (IIf), (IIg) или (III) (например, соединение 3, 18, 20, 25, 26, 29, 30, 60, 108-112 или 122). Другие терапевтические и/или профилактические агенты включают, но не ограничены ими, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацил и дакарбазин), алканы (например, мехлоретамин, тиотепа, хлорамбуцил, лазитромицин (СС-1065), мелфалан, кармустин (BSNU), ломустин (CCNU), циклофосфамид, бусульфан, дибромманнит, стрептозотоцин, митомицин С и цис-дихлордиаминоплатину (II) (DDP), цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин (ранее известный как дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин (ранее известный как актиномицин), блеомицин, митрамицин и антрамицин (АМС)) и антимитотические агенты (например, винкристин, винбластин, паклитаксел и майтанзиноид).

[00127] В других вариантах осуществления, терапевтический и/или профилактический агент представляет собой белок. Терапевтические белки, которые можно использовать в наночастицах по настоящему изобретению, включают, но не ограничены ими, гентамицин, амикацин, инсулин, эритропоэтин (ЕРО), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), фактор VIR, аналоги лютеинизирующий гормон-рилизинг фактора (LHRH), интерферон, гепарин, поверхностный антиген гепатита В, вакцины против брюшного тифа и вакцины против холеры.

[00128] В некоторых вариантах осуществления, терапевтический агент представляет собой полинуклеотид или нуклеиновую кислоту (например, рибонуклеиновую кислоту или дезоксирибонуклеиновую кислоту). Термин «полинуклеотид» в самом широком смысле включает любое соединение и/или вещество, которое представляет собой олигонуклеотидную цепь или может быть включено в олигонуклеотидную цепь. Типовые полинуклеотиды для использования в соответствии с настоящим изобретением включают, но не ограничены ими, одну или несколько из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК); рибонуклеиновой кислоты (РНК), включая информационную иРНК (иРНК), ее гибриды; РНКи-индуцирующих факторов; РНКи факторов; киРНК; шРНК; миРНК; антисмысловой РНК; рибозима; каталитической ДНК; РНК, индуцирующей образование тройной спирали; аптамера и т.д. В некоторых вариантах осуществления, терапевтическим и/или профилактическим агентом является РНК. РНК, полезные в композициях и способах, описанных в настоящем документе, могут быть выбраны из группы состоящий из, но не ограниченной ими, шортмера, антагомира, антисмысловой РНК, рибозимов, короткой интерферирующей РНК (киРНК), асимметричной интерферирующей РНК (аиРНК), микроРНК (миРНК), Dicer-субстратной РНК (дцРНК), короткой шпилечной РНК (кшРНК), транспортной РНК (тРНК), информационной РНК (иРНК) и их смесей. В некоторых вариантах осуществления, РНК представляет собой иРНК.

[00129] В некоторых вариантах осуществления, терапевтический и/или профилактический агент представляет собой иРНК. иРНК может кодировать любой представляющий интерес полипептид, включая любой существующий в природе или не существующий в природе или иным образом модифицированный полипептид. Полипептид, кодируемый иРНК, может иметь любой размер и любую вторичную структуру или активность. В некоторых вариантах осуществления, полипептид, кодируемый иРНК, может оказывать терапевтический эффект при экспрессии в клетке.

[00130] В других вариантах осуществления, терапевтический и/или профилактический агент представляет собой киРНК. киРНК может селективно снижать экспрессию представляющего интерес гена или подавлять экспрессию этого гена. Например, киРНК можно выбрать таким образом, чтобы ген, связанный с конкретным заболеванием, нарушением или состоянием, подавлялся при введении композиции, содержащей киРНК, субъекту, нуждающемуся в этом. киРНК может содержать последовательность, которая комплементарна последовательности иРНК, кодирующей представляющий интерес ген или белок. В некоторых вариантах осуществления, киРНК может представлять собой иммуномодулирующую киРНК.

[00131] В некоторых вариантах осуществления, терапевтический и/или профилактический агент представляет собой енРНК и/или cas9 иРНК. енРНК и/или cas9 иРНК можно использовать в качестве инструментов редактирования генов. Например, комплексы eHPHK-cas9 могут влиять на трансляцию иРНК клеточных генов.

[00132] В некоторых вариантах осуществления, терапевтический и/или профилактический агент представляет собой кшРНК или вектор или плазмиду, кодирующую кшРНК. кшРНК может продуцироваться внутри клетки-мишени после доставки соответствующей конструкции в ядро. Конструкции и механизмы, связанные с кшРНК, хорошо известны в данной области техники.

[00133] Болезнь или состояние

[00134] Композиция/носитель по настоящему изобретению может доставлять терапевтический или профилактический агент субъекту или пациенту. Терапевтический или профилактический агент включает, но не ограничен ими, одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты, низкомолекулярных соединений, полипептидов или белков. Таким образом, композиция по настоящему изобретению может быть использована для приготовления лекарственных средств на основе нуклеиновых кислот, генной вакцины, низкомолекулярных лекарственных средств, полипептидных или белковых лекарственных средств. Благодаря широкому разнообразию терапевтических или профилактических агентов, описанных выше, композицию по настоящему изобретению можно использовать для лечения или профилактики различных заболеваний или состояний.

[00135] В одном варианте осуществления, заболевание или состояние характеризуется дисфункциональной или аномальной активностью белка или полипептида.

[00136] Например, заболевание или состояние выбрано из группы, включающей инфекционные заболевания, раковые и пролиферативные заболевания, генетические заболевания, аутоиммунные заболевания, диабет, нейродегенеративные заболевания, сердечно-сосудистые и реноваскулярные заболевания, и метаболические заболевания.

[00137] В одном варианте осуществления, инфекционное заболевание выбрано из заболеваний, вызванных коронавирусом, вирусом гриппа или вирусом ВИЧ, детской пневмонией, лихорадкой долины Рифт, желтой лихорадкой, бешенством и различными герпесами.

[00138] другие компоненты

[00139] Композиция может включать один или несколько компонентов, отличных от описанных в предыдущих разделах. Например, композиция может включать одну или несколько малых гидрофобных молекул, таких как витамины (например, витамин А или витамин Е) или стерины.

[00140] Композиция может также включать одну или несколько молекул, усиливающих проницаемость, углеводы, полимеры, агенты, изменяющие поверхность, или другие компоненты. Молекула, увеличивающая проницаемость, может представлять собой, например, молекулу, описанную в публикации патентной заявки США №2005/0222064. Углеводы могут включать простые сахара, такие как глюкоза, и полисахариды, такие как гликоген, а также их производные и аналоги.

[00141] Агенты, изменяющие поверхность, могут включать, но не ограничены ими, анионные белки, такие как альбумин бычьей сыворотки, поверхностно-активные вещества, например катионные поверхностно-активные вещества, такие как бромид диметилдиоктадециламмония, сахара или производные Сахаров (например, циклодекстрины), нуклеиновые кислоты, полимеры (например, гепарин, полиэтиленгликоль и полоксамеры), муколитики (например, ацетилцистеин, полынь, бромелайн, папаин, клеродендрум, бромгексин, карбоцистеин, эпразинон, месну, амброксол, собрерол, домиодол, летостеин, степронин, тиопронин, гельсолин, тимозин β4, дорназу альфа, нелтенексин и эрдостеин) и ДНКазы (например, рчДНКазу). Агенты, изменяющие поверхность, могут быть расположены внутри и/или на поверхности наночастиц композиции (например, путем нанесения покрытия, адсорбции, ковалентного присоединения или других способов).

[00142] Композиция также может содержать один или несколько функционализированных липидов. Например, липиды могут быть функционализированы алкиновыми группами, которые могут подвергаться реакциям циклоприсоединения при воздействии азида в соответствующих условиях реакции. В частности, липидные бислои могут быть функционализированы таким образом с одной или несколькими группами, которые эффективно облегчают проникновение через мембрану, распознавание клеток или визуализацию. Поверхность композиции также может быть связана с одним или несколькими полезными антителами. Функциональные группы и конъюгаты, полезные для таргетной доставки клеток, визуализации и проникновения через мембрану, хорошо известны в данной области техники.

[00143] В дополнение к этим компонентам, композиция может включать любой материал, который можно использовать в фармацевтических композициях. Например, композиция может включать один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов или вспомогательных ингредиентов, таких как, но не ограниченных ими, один или несколько растворителей, дисперсионные среды, разбавители, вспомогательные средства для диспергирования, вспомогательные агенты для суспендирования, вспомогательные агенты для гранулирования, разрыхлители, наполнители, глиданты, жидкие носители, связующие агенты, поверхностно-активные вещества, изотонические агенты, загустители, эмульгаторы, буферы, смазывающие агенты, масла, консерванты, ароматизаторы, красители и т.д. Эксципиенты включают, например, крахмал, лактозу или декстрин.

Фармацевтически приемлемые эксципиенты хорошо известны в данной области техники (см., например, Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro; Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006).

[00144] Примеры разбавителей могут включать, но не ограничены ими, карбонат кальция, карбонат натрия, фосфат кальция, фосфат дикальция, сульфат кальция, гидрофосфат кальция, фосфат натрия, лактозу, сахарозу, целлюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, каолин, маннит, сорбит, инозит, хлорид натрия, сухой крахмал, кукурузный крахмал, сахарную пудру и/или их комбинацию.

[00145] В некоторых вариантах осуществления, композиции, содержащие один или несколько липидов, описанных в настоящем документе, также могут включать один или несколько адъювантов, таких как глюкопиранозильный липидный адъювант (GLA), олигодезоксирибонуклеотид CpG (например, класса А или класса В), поли(1:С), гидроксид алюминия и Pam3CSK4.

[00146] Композиции настоящего изобретения могут быть составлены в твердой, полутвердой, жидкой или газообразной форме, например, в виде таблеток, капсул, мазей, эликсиров, сиропов, растворов, эмульсий, суспензий, инъекций и аэрозолей. Композиции настоящего изобретения могут быть приготовлены способами, хорошо известными в области фармации. Например, стерильные растворы для инъекций могут быть приготовлены путем включения в соответствующий растворитель, такой как стерильная дистиллированная вода, терапевтического или профилактического агента в необходимом количестве с различными другими ингредиентами, перечисленными выше, по мере необходимости, и затем стерилизации фильтрованием. Также могут быть добавлены поверхностно-активные вещества для содействия образованию однородного раствора или суспензии.

[00147] Например, композиции по настоящему изобретению можно вводить внутривенно, внутримышечно, интрадермально, подкожно, интраназально или путем ингаляции. В одном варианте осуществления, композицию вводят подкожно.

[00148] Композиции по настоящему изобретению вводят в терапевтически эффективных количествах, которые могут варьироваться не только в зависимости от конкретного выбранного агента, но также от пути введения, природы подлежащего лечению заболевания, возраста и состояния пациента, и могут в конечном итоге оставаться на усмотрение лечащего врача или клинициста. Например, млекопитающему (например, человеку) можно вводить дозу от примерно 0,001 мг/кг до примерно 10 мг/кг терапевтического или профилактического агента.

Пример

[00149] Настоящее раскрытие будет дополнительно описано ниже вместе с примерами, но настоящее раскрытие не ограничено следующими примерами. Примеры без конкретных условий проводят в обычных условиях или условиях, предложенных производителем. Реагенты и инструменты, производители которых не указаны, представляют собой обычные коммерчески доступные продукты.

Пример 1: Синтез катионных липидных соединений

[00150] 1. Синтез 2-октилдецил 6-((4-(ундецилокси)-4-оксобутил)(2-гидроксиэтил)амино)гексаноата (YK-001)

[00151] Путь синтеза следующий:

[00152] Стадия 1: Синтез н-ундецил 4-бромбутирата (YK-001-РМ1)

[00153] н-Ундециловый спирт (5,00 г, 29,02 ммоль) и 4-бромбутановую кислоту (5,14 г, 30.78 ммоль) растворяют в дихлорметане (40 мл). К вышеуказанному раствору добавляют гидрохлорид 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (6,67 г, 34,82 ммоль) и 4-диметиламинопиридин (177 мг, 1,45 ммоль). Смесь перемешивают и подвергают реакции при 30~35°С в течение 8 часов. После завершения реакции, реакционный раствор последовательно промывают насыщенным карбонатом натрия и насыщенным раствором соли, и сушат над Na₂SO₄. Смесь фильтруют, и фильтрат концентрируют при пониженном давлении в вакууме. Остаток очищают хроматографией на силикагеле с получением н-ундецил 4-бромбутирата (6,68 г, 20,79 ммоль, 71,64%).

[00154] ¹Н ЯМР (400 МГц, CDC1₃) δ 4, 08 (т, J=6, 8 Гц, 2Н), 3,47 (т, J=6,5 Гц, 2Н), 2,50 (т, J=7, 2 Гц, 2Н), 2,18 (п, J=6, 8 Гц, 2Н), 1,61 (дд,,7=14,2, 7,0 Гц, 2Н), 1,39-1,19 (м, 16Н), 0,88 (т, J=6,9 Гц, 3Н).

[00155] Стадия 2: Синтез н-ундецил 4-((2-гидроксиэтил)амино)бутирата (YK-001-РМ2)

[00156] н-Ундецил 4-бромбутират (2,71 г, 8,43 ммоль) и этаноламин (1,40 г, 22,92 ммоль) растворяют в ацетонитриле (50 мл). В вышеуказанную систему добавляют карбонат калия (3,17 г, 22,92 ммоль). Смесь нагревают до 70°С и подвергают реакции при перемешивании в течение 2 часов. После завершения реакции, реакционный раствор охлаждают до комнатной температуры и фильтруют, и фильтрат концентрируют при пониженном давлении в вакууме для удаления растворителя. Остаток очищают хроматографией на силикагеле с получением н-ундецил 4-((2-гидроксиэтил)амино)бутирата (1,47 г, 4,88 ммоль, 57,89%). C17H35NO3, МС (ЭР): m/z (М+Н⁺) 302,2.

[00157] ¹Н ЯМР (400 МГц, CDC1₃) δ 4, 06 (т, J=6,8 Гц, 2Н), 3, 67-3, 60 (м, 3Н), 2, 82-2, 77 (м, 2Н), 2,69 (т, J=7,0 Гц, 2Н), 2,38 (т, J=7,3 Гц, 2Н), 2,13-2,02 (м, 3Н), 1,84 (п, J=7, 2 Гц, 2Н), 1,66-1,53 (м, 2Н), 1,28 (д, J=15,5 Гц, 14Н), 0,89 (д, J=6,7 Гц, 3Н).

[00158] Стадия 3: Синтез 2-октилдецил 6-бромгексаноат (YK-001-РМ3)

[00159] Согласно способу получения YK-001-PM1, 6-бромгексановую кислоту (2,60 г, 13,33 ммоль) и 2-октилдеканол (3,00 г, 11,09 ммоль) используют в качестве исходных материалов с получением 2-октилдецил 6-бромгексаноата (3,05 г, 6,82 ммоль, 61,50%).

[00160] ¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 3, 97 (д, J=5,8 Гц, 2Н), 3,40 (т, J=6,8 Гц, 2Н), 2,33 (т, J=l, 4 Гц, 2Н), 1, 93-1, 84 (м, 2Н), 1,66 (дт, J=20,5, 7,4 Гц, 3Н), 1,48 (м, J=8,6, 6,9, 4,2 Гц, 2Н), 1,35-1,19 (м, 28Н), 0,88 (т, J=6,9 Гц, 6Н).

[00161] Стадия 4: Синтез 2-октилдецил 6-((4-(ундецилокси)-4-оксобутил) (2-гидроксиэтил)амино)гексаноата (YK-001)

[00162] 2-Октилдецил 6-бромгексаноат (200 мг, 0,45 ммоль) и н-ундецил 4-((2-гидроксиэтил)амино)бутират (102 мг, 0,34 ммоль) растворяют в ацетонитриле (10 мл). В вышеуказанную систему добавляют карбонат калия (188 мг, 1,36 ммоль) и йодид калия (5 мг, 0,03 ммоль). Смесь нагревают до 70°С и подвергают реакции при перемешивании в течение 20 часов. Реакционный раствор охлаждают до комнатной температуры и фильтруют, и фильтрат концентрируют в вакууме для удаления растворителя. Остаток очищают хроматографией на силикагеле с получением указанного в заголовке соединения (36 мг, 0, 054 ммоль, 14,7%). C₄₁H₈₁NO₅, МС(ЭР): m/z (М+Н⁺) 668,6.

[00163] ¹Н ЯМР (400 МГц, CDC1₃) δ 4,06 (т, J=6,8 Гц, 2Н), 3,97 (д, J=5,8 Гц, 2Н), 3,84-3,72 (м, 1Н), 3,53-3,48 (м, 1Н), 3,46-3,40 (м, 1Н), 2,42 (д, J=8,3 Гц, 1Н), 2,32 (дд, J=15,2, 7,6 Гц, 4Н), 2,13-2,04 (м, 1Н), 1,70-1,57 (м, 6Н), 1,39-1,18 (м, 53Н), 0,88 (т, J=6,8 Гц, 9Н).

[00164] 2. Синтез 2-октилдецил 6-((5-(децилокси)-5-оксопентил)(2-гидроксиэтил)амино)гексаноата (YK-002)

[00165] Путь синтеза следующий:

[00166] Стадия 1: Синтез н-децил 5-бромпентаноата (YK-002-РМ1)

[00167] Согласно способу получения YK-001-PM1, 5-бромпентановую кислоту (1,81 г, 10,00 ммоль) и н-деканол (1,45 г, 9,16 ммоль) используют в качестве исходных материалов с получением н-децил 5-бромпентаноата (2,50 г, 7,78 ммоль, 84, 93%).

[00168] ¹Н ЯМР (400 МГц, CDC1₃) δ 4,07 (т, J=6,8 Гц, 2Н), 3,41 (т, J=6, 6 Гц, 2Н), 2,34 (т, J=7,3 Гц, 2Н), 1,96-1,85 (м, 2Н), 1,83-1,73 (м, 2Н), 1,69-1,54 (м, 2Н), 1,31 (дд, J=18,9, 15,6 Гц, 14Н), 0,88 (т, J=6,9 Гц, 3Н).

[00169] Стадия 2: Синтез н-децил 5-((2-гидроксиэтил)амино)пентаноата (YK-002-РМ2)

[00170] Согласно способу получения YK-001-PM2, н-децил 5-бромпентаноат (1,92 г, 5,98 ммоль) и этаноламин (0,31 г, 5,07 ммоль) используют в качестве исходных материалов с получением н-децил 5-((2-гидроксиэтил)амино)пентаноата (0,34 г, 1,13 ммоль, 18,90%). C₁₇H₃₅NO₃, МС(ЭР): т/ z (М+Н⁺) 302,3.

[00171] ¹Н ЯМР (400 МГц, CDl₃) δ 4,05 (дд, J=8,9, 4,7 Гц, 1Н), 4,00-3,92 (м, 1Н), 3,82-3,77 (м, 2Н), 3,63 (т, J=6,7 Гц, 2Н), 3,58-3,51 (м, 2Н), 3,37 (т, J=5,3 Гц, 2Н), 2,41 (м, 2Н), 1, 84-1,76 (м, 4Н), 1,66-1,51 (м, 4Н), 1,28 (д, J=14,2 Гц, 12Н), 0,88 (т, J=6,8 Гц, 3Н).

[00172] Стадия 3: Синтез 2-октилдецил 6-((5-(децилокси)-5 -оксопентил)(2-гидроксиэтил)амино)гексаноата (YK-002)

[00173] Согласно способу получения YK-001, н-децил 5-((2-гидроксиэтил)амино)пентаноат (151 мг, 0,50 ммоль) и 2-октилдецил 6-бромгексаноат (226 мг, 0,50 ммоль) используют в качестве исходных материалов с получением целевого соединения (216 мг, 0,32 ммоль, 64,0%). C₄₁H₈₁NO₅, МС(ЭР): m/z (М+Н⁺) 668,5.

[00174] ¹Н ЯМР (400 МГц, CDC1₃) δ 4,06 (т, J=6,8 Гц, 2Н), 3,97 (д, J=5,8 Гц, 2Н), 3,66-3, 64 (м, 2Н), 2,42 (т, J=6,2 Гц, 6Н), 2,32 (q, J=7,l Гц, 4Н), 1, 88-1,76 (м, 5Н), 1,68-1,58 (м, 7Н), 1,37-1,20 (м, 44Н), 0,88 (т, J=6,8 Гц, 9Н).

[00175] 3. Синтез 2-октилдецил 6-((6-(децилокси)-6-оксогексил)(2-гидроксиэтил)амино)гексаноата (YK-003)

[00176] Путь синтеза следующий:

[00177] Стадия 1: Синтез н-децил 6-бромгексаноата (YK-003-РМ1)

[00178] Согласно способу получения YK-001-PM1, 6-бромгексановую кислоту (1,95 г, 10,00 ммоль) и н-деканол (1,45 г, 9,16 ммоль) используют в качестве исходных материалов с получением н-децил 6-бромгексаноата (2,41 г, 7,19 ммоль, 78, 49%).

[00179] ¹Н ЯМР (400 МГц, CDC1₃) δ 4,06 (т, J=6,7 Гц, 2Н), 3,41 (т, J=6,8 Гц, 2Н), 2,32 (т, J=l,4 Гц, 2Н), 1,94-1,81 (м, 2Н), 1,73-1,56 (м, 3Н), 1,54-1,41 (м, 2Н), 1,39-1,19 (м, 15Н), О,88 (т, J=6,9 Гц, 3Н).

[00180] Стадия 2: Синтез н-децил 6-((2-гидроксиэтил)амино)гексаноата (YK-003-PM2)

[00181] н-Децил 6-бромгексаноат (1,12 г, 3,34 ммоль) и этаноламин (8,20 г, 134,25 ммоль) растворяют в этаноле (15 мл), и подвергают реакции при перемешивании при комнатной температуре в течение 16 часов. Реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении в вакууме для удаления растворителя, затем разбавляют этилацетатом (80 мл), и промывают насыщенным раствором соли (50 мл × 3). Органическую фазу концентрируют при пониженном давлении и очищают хроматографией на силикагеле с получением н-децил 6-((2-гидроксиэтил)амино)гексаноата (0,66 г, 2,09 ммоль, 62,6%). C₁₈H₃7NO₃, МС(ЭР): та/ z (М+Н⁺)316,3.

[00182] ¹Н ЯМР (400 МГц, CDC1₃₎ δ 4,05 (т, J=6,8 Гц, 2Н), 3,93-3,88 (м, 1Н), 3,72-3,70 (м, 1Н), 3,66-3,56 (м, 1Н), 3,55-3,50 (м, 1Н), 3,34 (с, 2Н), 2,83 (д, J=5,l Гц, 1Н), 2,72-2,68 (м, 1Н), 2,31 (т, J=7,4 Гц, 2Н), 1,69-1,54 (м, 6Н), 1,35-1,21 (м, 16Н), 0,88 (т, J=6,9 Гц, 3Н).

[00183] Стадия 3: Синтез 2-октилдецил 6-((6-(децилокси)-6-оксогексил)(2-гидроксиэтил)амино)гексаноата (YK-003)

[00184] Согласно способу получения YK-001, н-децил 6-((2-гидроксиэтил)амино)гексаноат (157 мг, 0,50 ммоль) и 2-октилдецил 6-бромгексаноат (226 мг, 0,50 ммоль) используют в качестве исходных материалов с получением целевого соединения (140 мг, 0,21 ммоль, 42,00%). C₄₂H₈₃NO₅, МС(ЭР): m/z (М+Н⁺) 682,8.

[00185] ¹Н ЯМР (400 МГц, CDC1₃) δ 4, 06 (т, J=6,8 Гц, 2Н), 3,97 (д, J=5,8 Гц, 2Н), 3,72 (кв, J=l, 0 Гц, 1Н), 3,64 (т, J=6,6 Гц, 1Н), 2,32 (тд, J=7,4, 2,4 Гц, 5Н), 1, 73-1,54 (м, 14Н), 1,41-1,19 (м, 49Н), 0,89 (д, J=6,6 Гц, 9Н).

[00186] 4. Синтез 2-октилдецил 4-((4-(децилокси)-4-оксобутил)(2-гидроксиэтил)амино)бутирата (YK-004)

[00187] Путь синтеза следующий:

[00188] Стадия 1: Синтез н-децил 4-бромбутирата (YK-004-РМ1)

[00189] Согласно способу получения YK-001-PM1, 4-броммасляную кислоту (15,00 г, 89,82 ммоль) и 1-деканол (12,90 г, 81,50 ммоль) используют в качестве исходных материалов с получением н-децил 4-бромбутирата (10,52 г, 34,2 ммоль, 42,0%).

[00190] ¹Н ЯМР (400 МГц, CDC1₃) δ4, 07 (д, J=6, 8 Гц, 2Н), 3,47 (т, J 6,5 Гц, 2Н), 2,50 (т, J=l, 2 Гц, 2Н), 2,18 (дд, J=12,5, 5,5 Гц, 2Н), 1,62 (т, J=7,2 Гц, 2Н), 1,30-1,20 (м, 14Н), 0, 88 (т, J=6,9 Гц, 3Н).

[00191] Стадия 2: Синтез н-децил 4-((2-гидроксиэтил)амино)бутирата (YK-004-РМ2)

[00192] Согласно способу получения YK-001-PM2, н-децил 4-бромбутират (8,00 г, 26,04 ммоль) и этаноламин (4,78 г, 78,26 ммоль) используют в качестве исходных материалов с получением н-децил 4-((2-гидроксиэтил)амино)бутирата (4,40 г, 15,3 ммоль, 58,8%). C1₆H₃₃NO₃, МС (ЭР): т/z (М+Н⁺) 288, 2.

[00193] ¹Н ЯМР (400 МГц, CDC1₃) δ 3,76 (т, J=5,2 Гц, 2Н), 3,62 (дд, J=8,3, 4,9 Гц, 4Н), 3,50 (т, J=7,1 Гц, 2Н), 3,45-3,36 (м, 2Н), 2,91-2,76 (м, 2Н), 2,44 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 2,08 (дд, J=15,l, 7,5 Гц, 2Н), 1,67-1,51 (м, 2Н), 1,27 (с, 12Н), 0,88 (т, J=6, 5 Гц, 3Н).

[00194] Стадия 3: Синтез 2-гептилнонил 4-бромбутирата (YK-004-РМ3)

[00195] Согласно способу получения YK-001-PM1, 2-гептилнонанол (390 мг, 1,45 ммоль) и 4-броммасляную кислоту (265 мг, 1,59 ммоль) используют в качестве исходных материалов с получением 2-гептилнонил 4-бромбутирата (500 мг, 1,19 ммоль, 82,07%).

[00196] ¹Н ЯМР (400 МГц, CDC1₃) δ 3, 99 (д, J=5,8 Гц, 2Н), 3,47 (т, J=6,5 Гц, 2Н), 2,51 (т, J=1,2 Гц, 2Н), 2,18 (т, J=6,9 Гц, 2Н), 1,29 (д, J=21,2 Гц, 29Н), 0,88 (т, J=6,8 Гц, 6Н).

[00197] Стадия 4: Синтез 2-октилдецил 4 - ((4-(децилокси)-4-оксобутил)(2-гидроксиэтил)амино)бутирата (YK-004)

[00198] Согласно способу получения YK-001, 2-гептилнонил 4-бромбутират (250 мг, 0,60 ммоль) и н-децил 4-((2-гидроксиэтил)амино)бутират (172 мг, 0,60 ммоль) используют в качестве исходных материалов с получением целевого соединения (50 мг, 0,081 ммоль, 13,3%). C₃₈H₇₅NO₅, МС(ЭР): т/ z (М+Н⁺)626,6.

[00199] ¹Н ЯМР (400 МГц, CDC1₃) δ 4, 06 (т, J=6,8 Гц, 2Н), 3,97 (д, J=5,9 Гц, 2Н), 3,61-3,58 (м, 2Н), 2,33 (т, J=6,9 Гц, 4Н), 1,81 (с, 3Н), 1,65-1, 55 (м, 3Н), 1,35-1,18 (м, 50Н), 0,87 (д, J=7,0 Гц, 9Н).

[00200] 5. Синтез 9-гептадецил 8-((4-(децилокси)-4-оксобутил)(2-гидроксиэтил)амино)октаноата (YK-005)

[00201] Путь синтеза следующий:

[00202] Стадия 1: Синтез 9-гептадецил 8-бромоктаноата (YK-005-РМ1)

[00203] Согласно способу получения YK-001-PM1, 8-бромоктановую кислоту (2,87 г, 12,86 ммоль) и 9-гептадеканол (3,00 г, 11,70 ммоль) используют в качестве исходных материалов с получением 9-гептадецил 8-бромоктаноата (3,15 г, 6,82 ммоль, 58,3%).

[00204] Стадия 2: Синтез 9-гептадецил 8-((4-(децилокси)-4-оксобутил)(2-гидроксиэтил)амино)октаноата (YK-005)

[00205] Согласно способу получения YK-001, н-децил 4-((2-гидроксиэтил)амино)бутират (150 мг, 0,52 ммоль) и 9-гептадецил 8-бромоктаноат (285 мг, 0,62 ммоль) используют в качестве исходных материалов с получением целевого соединения (140 мг, 0,21 ммоль, 40,4%). C₄₁H₈₁NO₅, МС(ЭР): m/z (М+Н⁺) 668,6.

[00206] ¹Н ЯМР (400 МГц, CDC1₃) δ 4, 06 (т, J=6, 8 Гц, 2Н), 3,63 (т, J=5,0 Гц, 2Н), 2,71 (т, J=A, 8 Гц, 2Н), 2, 67-2,54 (м, 4Н), 2,35 (т, J=7,l Гц, 2Н), 2,28 (т, J=7,5 Гц, 2Н), 1,89-1,80 (м, 2Н), 1,61 (дд, J=12,7, 5,9 Гц, 5Н), 1,50 (д, J=5,9 Гц, 6Н), 1,38-1,18 (м, 45Н), 0, 90-0,84 (м, 9Н).

[00207] 6. Синтез 2-октилдецил 5-((4-(децилокси)-4-оксобутил)(2-гидроксиэтил)амино)пентаноата (YK-006)

[00208] Путь синтеза следующий:

[00209] Стадия 1: Синтез 2-гептилнонил 5-бромпентаноата (YK-006-PM1)

[00210] Согласно способу получения YK-001-PM1, 2-гептилнонанол (300 мг, 1,11 ммоль) и 5-бромпентановую кислоту (220 мг, 1,22 ммоль) используют в качестве исходных материалов с получением 2-гептилнонил 5-бромпентаноата (438 мг, 1,01 ммоль, 91,0%).

[00211] ¹Н ЯМР (400 МГц, CDC1₃) δ 3, 98 (д, J=5, 8 Гц, 2Н), 3,41 (т, J=6,6 Гц, 2Н), 2,35 (т, J=7,2 Гц, 2Н), 1,90 (ддд, J=13,6, 7,7, 3,7 Гц, 2Н), 1, 84-1, 72 (м, 2Н), 1,29 (д, J=21,6 Гц, 29Н), 0,88 (т, J=6,8 Гц, 6Н).

[00212] Стадия 2: Синтез 2-октилдецил 5-((4-(децилокси)-4-оксобутил)(2-гидроксиэтил)амино)пентаноата (YK-006)

[00213] Согласно способу получения YK-001, 2-гептилнонил 5-бромпентаноат (200 мг, 0,46 ммоль) и н-децил 4-((2-гидроксиэтил)амино)бутират (133 мг, 0,46 ммоль) используют в качестве исходных материалов с получением целевого соединения (65 мг, 0,10 ммоль, 21,7%). C₃₉H₇₇NO₅, МС (ЭР): m/z (М+Н⁺) 640, 6.

[00214] ¹Я ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 4, 06 (т, J=6 _г 8 Гц, 2Н), 3,97 (д, J=5,8 Гц, 2Н), 3, 55-3, 50 (м, 2Н), 2, 65-2,45 (м, 3Н) 2,33 (т, J=6,7 Гц, 4Н), 2,01 (с, 1Н), 1,61 (д, J=6 _г 8 Гц, 10Н), 1,39-1,10 (м, 44Н), 0,88 (т, J=6,8 Гц, 9Н).

[00215] 7. Синтез 2-октилдецил 6-((2-гидроксиэтил)(6-оксо-6- (ундецилокси)гексил)амино)гексаноата (YK-007)

[00216] Путь синтеза следующий:

[00217] Стадия 1: Синтез 1-ундецил 6-бромгексаноата (YK-007- РМ1)

[00218] Согласно способу получения YK-001-PM1, 6-бромгексановую кислоту (2,50 г, 12,82 ммоль) и 1-ундецил спирт (2,00 г, 11,61 ммоль) используют в качестве исходных материалов с получением 1-ундецил 6-бромгексаноата (2,40 г, 6,87 ммоль, 59,2%).

[00219] Стадия 2: Синтез ундецил 6-((2-гидроксиэтил)амино)гексаноата (YK-007-PM2)

[00220] Согласно способу получения YK-001-PM2, 1-ундецил 6-бромгексаноат (2,25 г, 6,44 ммоль) и этаноламин (1,18 г, 19,29 ммоль) используют в качестве исходных материалов с получением ундецил 6-((2-гидроксиэтил)амино)гексаноата (855 мг, 2,59 ммоль, 40,2%). C₁₉H₃₉NO₃, МС(ЭР): m/z (М+Н⁺) 330,3.

[00221] Стадия 3: Синтез 2-октилдецил 6-((2-гидроксиэтил) (б-оксо-6-(ундецилокси)гексил)амино)гексаноата (YK-007)

[00222] Согласно способу получения YK-001, ундецил 6-((2-гидроксиэтил)амино)гексаноат (300 мг, 0,91 ммоль) и 2-октилдецил 6-бромгексаноат (488 мг, 1,09 ммоль) используют в качестве исходных материалов с получением целевого соединения (260 мг, 0,37 ммоль, 41,1%). C₄₃H₈₅NO₅, МС(ЭР): m/z (М+Н⁺) 696,6.

[00223] ¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 4,09-4, 02 (м, 2Н), 3,97 (д, J=5,8 Гц, 2Н), 3,53 -3,48 (м, 2Н), 2,35-2,29 (м, 4Н), 2,01 (дд, J=12,6, 6,9 Гц, 2Н), 1,74-1,55 (м, 6Н), 1,28 (д, J=l4,7 Гц, 58Н), 0,89 (д, J=6,5 Гц, 9Н).

[00224] 8. Синтез 2-октилдецил 6-((4-(нонилокси)-4-оксобутил)(2-гидроксиэтил)амино)гексаноата (YK-008)

[00225] Путь синтеза следующий:

[00226] Стадия 1: Синтез н-нонил 4-бромбутирата (YK-008-РМ1)

[00227] Согласно способу получения YK-001-PM1, н-нонанол (5,00 г, 34,66 ммоль) и 4-броммасляную кислоту (6,11 г, 36,59 ммоль) используют в качестве исходных материалов с получением н-нонил 4-бромбутирата (3,66 г, 12,5 ммоль, 36,0%).

[00228] ¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ4, 08 (т, J=6,8 Гц, 2Н), 3,47 (т, J=6,5 Гц, 2Н), 2,50 (т, J=7,2 Гц, 2Н), 2,18 (п, J=6,7 Гц, 2Н), 1,61 (дд, J=14,l, 7,0 Гц, 2Н), 1,40-1,19 (м, 12Н), 0,88 (т, J=6,9 Гц, 3Н).

[00229] Стадия 2: Синтез н-нонил 4-((2-гидроксиэтил)амино)бутирата (YK-008-РМ2)

[00230] Согласно способу получения YK-001-PM2, н-нонил 4-бромбутират (2,46 г, 8,39 ммоль) и этаноламин (1,28 г, 20,96 ммоль) используют в качестве исходных материалов с получением н-нонил 4-((2-гидроксиэтил)амино)бутирата (1,22 г, 4,46 ммоль, 53,2%), C₁₅H₃₁NO₃, МС (ЭР): m/z (М+Н⁺) 274,2.

[00231] ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 4,06 (т, J=6,8 Гц, 2Н), 3,53-3,47 (м, 3Н), 2,68 (т, J=7,0 Гц, 2Н), 2,43 (т, J=8,1 Гц, 2Н), 2,37 (с, 1Н), 2,12-2,01 (м, 2Н), 1,83 (м, 2Н), 1,67-1,51 (м, 2Н), 1,40-1,21 (м, 10Н), 0,88 (т, J=6, 9 Гц, 3Н).

[00232] Стадия 3: Синтез 2-октилдецил 6-((4-(нонилокси)-4-оксобутил)(2-гидроксиэтил)амино)гексаноата (YK-008)

[00233] Согласно способу получения YK-001, 2-октилдецил 6-бромгексаноат (200 мг, 0,45 ммоль) и н-нонил 4-((2-гидроксиэтил)амино)бутират (102 мг, 0,37 ммоль) используют в качестве исходных материалов с получением целевого соединения (30 мг, 0, 047 ммоль, 13,5%). C₃₉H₇₇NO₅, МС(ЭР): m/z (М+Н⁺) 640,6.

[00234] ¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 4, 06 (т, J=6,8 Гц, 2Н), 3,97 (д, J=5,8 Гц, 2Н), 3,68-3,62 (м, 2Н), 2,32 (дд, J=15,2, 7,6 Гц, 4Н), 1,63 (дд, J=15,l, 7,6 Гц, 6Н), 1,39-1,17 (м, 52Н), 0,87 (д, J=7,0 Гц, 9Н).

[00235] 9. Синтез 2-октилдецил 6-((4-(децилокси)-4-оксобутил)(2-гидроксиэтил)амино)гексаноата (YK-009)

[00236] Путь синтеза следующий:

[00237] Стадия 1: Синтез 2-октилдецил 6-((4-(децилокси)-4-оксобутил)(2-гидроксиэтил)амино)гексаноата (YK-009)

[00238] Согласно способу получения YK-001, н-децил 4-((2-гидроксиэтил)амино)бутират (1,00 г, 3,48 ммоль) и 2-октилдецил 6-бромгексаноат (1,87 г, 4,18 ммоль) используют в качестве исходных материалов с получением целевого соединения (0,92 г, 1,41 ммоль, 40,5%). C₄₀H₇₉NO₅, МС(ЭР): m/z (М+Н⁺) 654,6.

[00239] ¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 4, 07 (т, J=6,8 Гц, 4Н), 3,96 (д, J=5,8 Гц, 2Н), 2,49 (т, J=5,7 Гц, 2Н), 2,34 (т, J=7,3 Гц, 2Н), 2,27-2,17 (м, 2Н), 2,01 (д, J=5,7 Гц, 2Н), 1,68-1,62 (м, 9Н), 1, 46-1,43 (м, 3Н), 1,36-1,15 (м, 44Н), 0,87 (д, J=7,0 Гц, 9Н).

[00240] 10. Синтез 2-гептилнонил 6-((4-(децилокси)-4-оксобутил)(2-гидроксиэтил)амино)гексаноата (YK-010)

[00241] Путь синтеза следующий:

[00242] Стадия 1: Синтез 2-гептилнонил 6-бромгексаноата (YK-010-PM1)

[00243] Согласно способу получения YK-001-PM1, 6-бромгексановую кислоту (290 мг, 1,49 ммоль) и 2-гептилнонанол (300 мг, 1,24 ммоль) используют в качестве исходных материалов с получением 2-гептилнонил 6-бромгексаноат (280 мг, 0,67 ммоль, 54,0%).

[00244] ¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 3, 97 (д, J=5,8 Гц, 2Н), 3,41 (т, J=6,8 Гц, 2Н), 2,33 (т, J=7, 4 Гц, 2Н), 1, 93-1, 84 (м, 2Н), 1,66 (дт, J=20,5, 7,4 Гц, 3Н), 1, 52-1, 43 (м, 2Н), 1,36-1,20 (м, 24Н), 0,88 (т, 0=6,9 Гц, 6Н).

[00245] Стадия 2: Синтез 2-гептилнонил 6-((4-(децилокси)-4-оксобутил)(2-гидроксиэтил)амино)гексаноата (YK-010)

[00246] Согласно способу получения YK-001, н-децил 4-((2-гидроксиэтил)амино)бутират (150 мг, 0,52 ммоль) и 2-гептилнонил 6-бромгексаноат (260 мг, 0,62 ммоль) используют в качестве исходных материалов с получением целевого соединения (150 мг, 0,24 ммоль, 46,2%). C₃₈H₇₅NO₅, МС(ЭР): m/z (М+Н⁺) 626,7.

[00247] ¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 4,27 (квд, J=11,0, 5,8 Гц, 2Н), 4,13-4,01 (м, 2Н), 3,97 (д, J=5,8 Гц, 2Н), 2,33 (дт, J=12,5, 7,3 Гц, 4Н), 1,86-1,81 (м, 1Н), 1, 78-1, 68 (м, 2Н), 1,67-1,59 (м, 4Н), 1,33-1,17 (м, 49Н), 0,88 (т, J=1,6 Гц, 9Н).

[00248] 11. Синтез 2-гексилоктил 6-((4-(децилокси)-4-оксобутил)(2-гидроксиэтил)амино)гексаноата (YK-011)

[00249] Путь синтеза следующий:

[00250] Стадия 1: Синтез 2-гексилоктил 6-бромгексаноата (YK-011-PM1)

[00251] Согласно способу получения YK-001-PM1, 6-бромгексановую кислоту (290 мг, 1,49 ммоль) и 2-гексилоктанол (300 мг, 1,40 ммоль) используют в качестве исходных материалов с получением 2-гексилоктил 6-бромгексаноата (240 мг, 0,61 ммоль, 41,6%).

[00252] ¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 3,97 (д, J=5, 8 Гц, 2Н), 3,41 (т, J=6,8 Гц, 2Н), 2,33 (т, J=7,4 Гц, 2Н), 1, 92-1,83 (м, 2Н), 1,66 (дт, J=20,5, 7,4 Гц, 3Н), 1,48 (ддд, J=8,6, 6,8, 4,2 Гц, 2Н), 1,37-1,20 (м, 20Н), 0,88 (т, J=6,8 Гц, 6Н).

[00253] Стадия 2: Синтез 2-гексилоктил 6-((4-(децилокси)-4-оксобутил) (2-гидроксиэтил)амино)гексаноата (YK-011)

[00254] Согласно способу получения YK-001, н-децил 4-((2-гидроксиэтил)амино)бутират (150 мг, 0,52 ммоль) и 2-гексилоктил 6-бромгексаноат (240 мг, 0,61 ммоль) используют в качестве исходных материалов с получением целевого соединения (120 мг, 0,20 ммоль, 38,5%). C₃₆H₇₁NO₅, МС (ЭР): m/z (М+Н⁺)598,5.

[00255] ¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 4, 09-4, 03 (м, 4Н), 3,56-3,53 (м, 2Н), 2,41 (т, J=6,8 Гц, 2Н), 2,22 (т, J=7, 1 Гц, 2Н), 1,71-1,63 (м, 3Н), 1,58-1,54 (м, 2Н), 1,42-1,19 (м, 47Н), 0,88 (т, J=6,8 Гц, 9Н).

[00256] 12. Синтез нонил 8-((2-гидроксиэтил)(10-((9-гептадецил)окси)-10-оксодецил)амино)октаноат (соединение 23)

[00257] Путь синтеза следующий:

Стадия 1: Синтез н-нонил 8-бромоктаноата (соединение 23-РМ1)

[00258] Согласно способу получения YK-001-PM1, 8-бромоктановую кислоту (2,50 г, 11,21 ммоль) и н-нонанол (1,47 г, 10,19 ммоль) используют в качестве исходных материалов с получением н-нонил 8-бромоктаноата (1,85 г, 5,30 ммоль, 52,0%).

[00259] Стадия 2: Синтез нонил 8-((2-гидроксиэтил)амино)октаноата (соединение 23-РМ2)

[00260] Согласно способу получения YK-001-PM2, н-нонил 8-бромоктаноат (1,50 г, 4,29 ммоль), полученный выше, и этаноламин (7,96 г, 130,32 ммоль) используют в качестве исходных материалов с получением нонил 8-((2-гидроксиэтил)амино)октаноата (610 мг, 1,85 ммоль, 43,1%). C₁₉H₃₉NO₃, МС (ЭР): m/z (М+Н⁺)330,3.

[00261] Стадия 3: Синтез 9-гептадецил 10-бромдеканоата (соединение 23-РМ3)

[00262] Согласно способу получения YK-001-PM1, 10-бромдекановую кислоту (3,23 г, 12,86 ммоль) и 9-гептадеканол (3,00 г, 11,70 ммоль) используют в качестве исходных материалов с получением 9-гептадецил 10-бромдеканоата (3,10 г, 6,72 ммоль, 57,4%).

[00263] Стадия 4: Синтез нонил 8-(10-((9-гептадецил)окси)-10-оксодецил)амино)октаноата (соединение 23)

[00264] Согласно способу получения YK-001, нонил 8-((2-гидроксиэтил)амино)октаноат (500 мг, 1,52 ммоль) и 9-гептадецил 10-бромдеканоат (840 мг, 1,72 ммоль) используют в качестве исходных материалов с получением целевого соединения (520 мг, 0,70 ммоль, 46,1%). C₄₆H₉₁N_O, МС (ЭР): m/z (М+Н⁺) 738, 8.

[00265] ¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 4, 88-4, 86(м, 1Н), 4,05 (т, J=6,8 Гц, 2Н), 3,97 (д, J=5,8 Гц, 2Н), 2,77-2,69(м, 5Н), 2,25(м,4Н), 1,61 (дд, J=13,5, 6,6 Гц, 13Н), 1,38-1,18 (м, 55Н), 0,88 (т, J=6,8 Гц, 9Н).

[00266] 13. Синтез нонил 8-((2-гидроксиэтил)(6-((9-гептадецил)окси)-6-оксогексил)амино)октаноата (соединение 27)

[00267] Путь синтеза следующий:

[00268] Стадия 1: Синтез 9-гептадецил 6-бромгексаноата (соединение 27-РМ1)

[00269] Согласно способу получения YK-001-PM1, 6-бромгексановую кислоту (2,51 г, 12,87 ммоль) и 9-гептадеканол (3,00 г, 11,70 ммоль) используют в качестве исходных материалов с получением 9-гептадецил 6-бромгексаноата (2,77 г, 6,39 ммоль, 54,6%).

[00270] Стадия 2: Синтез нонил 8-(6-((9-гептадецил)окси)-6-оксогексил)амино)октаноата (соединение 27)

[00271] Согласно способу получения YK-001, нонил 8-((2-гидроксиэтил)амино)октаноат (500 мг, 1,52 ммоль) и 9-гептадецил 6-бромгексаноат (760 мг, 1,75 ммоль) используют в качестве исходных материалов с получением целевого соединения (471 мг, 0,69 ммоль, 45,4%). C^HssNOs, МС (ЭР): m/z (М+Н+) 682,6.

[00272] ¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 4,83-4, 81 (м, 1Н), 4,05-4,00 (м, 2Н), 3,77-3,69 (м, 2Н), 2,75-2,59(м, 5Н), 2,25-2,19 (м, 4Н), 1,59 (дд, J=13,3, 6,3 Гц, 13Н), 1,34-1,03 (м, 47Н), 0,87 (т, J=6,7 Гц, 9Н).

Пример 2: Оптимизация условий получения липидных наночастиц (составов LNP)

[00273] 1. Оптимизация отношения носителя (липосомы) к иРНК.

[00274] Катионное липидное соединение YK-009, синтезированное в Примере 1, растворяют в этаноле с DSPC (AVT (Shanghai) Pharmaceutical Technology Co., Ltd.), холестерином (AVT (Shanghai) Pharmaceutical Technology Co., Ltd.) и DMG-PEG2000 в молярном отношении 50:10:38,5:1,5, соответственно, для приготовления раствора липида в этаноле. Раствор липида в этаноле быстро добавляют к цитратному буферу (рН=4~5) способом инъекции этанола и перемешивают при встряхивании в течение 30 секунд для последующего использования. eGFP-иРНК (приобретенную у Shanghai Biohub International Trade Co., Ltd) разводят в цитратном буфере (рН=4~5) с получением водного раствора иРНК. Для приготовления липосом используют определенный объем раствора липосом и водного раствора иРНК при массовом отношении общих липидов к иРНК 4:1, 10:1, 16:1, 24:1 и 30:1, соответственно. Смеси обрабатывают ультразвуком при 25°С в течение 15 минут (частота ультразвука 40 кГц и мощность ультразвука 800 Вт). Полученные липосомы разводят в 10 раз по объему PBS, и затем подвергают ультрафильтрации с помощью ультрафильтрационной трубки 300 кДа для удаления этанола. Затем объем фиксируют до определенного объема с PBS, чтобы получить состав LNP, инкапсулирующий eGFP-иРНК с использованием катионного липида YK-009/БЗРС/холестерина/БМ&-РЕС2000 (50:10:38,5:1,5 в молярных долях).

[00275] Результаты теста на трансфекцию клеток показывают, что когда массовое соотношение носителя и иРНК находится в диапазоне 10:1-30:1, все эффекты трансфекции являются хорошими, где соотношение 16:1 дает наилучший эффект трансфекции, и когда массовое отношение носителя и иРНК составляет 4:1, эффект трансфекции является плохим, и это соотношение нельзя использовать для переноса иРНК. (Фиг. 1)

[00276] 2. Оптимизация отношения катионного липида к нейтральному липиду

[00277] Состав LNP, инкапсулирующий eGFP-иРНК, получают в соответствии со способом в 1, где молярные отношения катионного липида YK-009 к нейтральному липиду DSPC составляют 1:1, 5:1 и 10:1, соответственно.

[00278] Из теста на трансфекцию клеток видно, что когда молярное отношение катионного липида к нейтральному липиду составляет 1:1-10:1, можно достичь эффекта трансфекции, где эффективность трансфекции самая высокая при молярном отношении катионного липида к нейтральному липиду 5:1. (Фиг. 2)

[00279] 3. Оптимизация отношения липида, конъюгированного с полимером, к носителю (липосоме).

[00280] Состав LNP, инкапсулирующий eGFP-иРНК, получают в соответствии со способом в 1, где катионный липид в носителе представляет собой YK-009, и молярные отношения липида, конъюгированного с полимером, DMG-PEG2000 к носителю составляют 0,5%, 1,5%, 2,5%, 3,5% и 5%, соответственно.

[00281] Результаты теста на трансфекцию клеток показывают, что когда молярное отношение липида, конъюгированного с полимером, к носителю находится в диапазоне от 0,5% до 5%, можно достичь эффекта трансфекции, где эффективность трансфекции самая высокая, когда молярное соотношение составляет 1,5%, и самая низкая, когда молярное соотношение составляет 5%. (Фиг. 3)

[00282] 4. Оптимизация пропорции компонентов в носителе (липосоме)

[00283] Состав LNP, инкапсулирующий eGFP-иРНК, получают в соответствии со способом в 1, где молярные отношения катионного липида YK-009, нейтрального липида DSPC, структурированного липидного холестерина и липида, конъюгированного с полимером, DMG-PEG2000 составляют 65:8:25:2, 50:10:38,5:1,5, 40:17,5:40:2,5 и 25:35:35:5, соответственно.

[00284] Из теста на трансфекцию клеток видно, что, когда молярное отношение катионного липида, нейтрального липида, структурированного липида и липида, конъюгированного с полимером, составляет 50:10:38,5:1,5, эффект трансфекции является лучшим, и когда молярное отношение составляет 65:8:25:2, эффект трансфекции хуже, но его все же можно достичь. (Фиг. 4)/

Примеры 3: Тест на клеточную трансфекцию состава LNP eGFP-иРНК

[00285] Выделение и пассирование клеток: клетки 293Т восстанавливают, культивируют в культуральной чашке и пассируют до необходимого количества клеток.

[00286] Планшет для посева: Клетки в культуральной чашке переваривают и подсчитывают.Клетки распределяют в 96-луночном планшете по 10000 клеток на лунку и в 12-луночном планшете по 150000 клеток на лунку. Клетки культивируют в течение ночи до тех пор, пока клетки не прикрепятся к стенке.

[00287] Тест на трансфекцию клеток: состав LNP, содержащий 1,5 мкг eGFP-иРНК, полученный в Примере 2 (катионный липид в носителе представляет собой YK-009), и состав eGFP-иРНК Lipofectamin2000 добавляют, соответственно, в среду для культивирования клеток в 12-луночный планшет и далее инкубируют в течение 24 часов. Затем эффективность трансфекции различных образцов исследуют по интенсивности флуоресценции путем наблюдения с помощью флуоресцентного микроскопа.

[00288] По результатам теста окончательно определены условия получения липидных наночастиц (состав LNP): отношение носителя к иРНК составляет 16:1; молярное отношение катионного липида к нейтральному липиду составляет 5:1; липид, конъюгированный с полимером, составляет 1,5% липосомы; молярное отношение катионного липида, нейтрального липида, структурированного липида и липида, конъюгированного с полимером, составляет 50:10:38,5:1,5, и это условие используют для приготовления липидных наночастиц (состава LNP) в последующих тестах.

Пример 4: Получение липидных наночастиц (состава LNP) (оптимальная пропорция)

[00289] Таблица 1: Структура катионных липидов

[00290] Катионные липиды, перечисленные в Таблице 1, растворяют в этаноле с DSPC. (AVT (Shanghai) Pharmaceutical Technology Co., Ltd.), холестерином (AVT (Shanghai) Pharmaceutical Technology Co., Ltd.) и DMG-PEG2000 в молярном отношении 50:10:38,5:1,5, соответственно, для приготовления раствора липида в этаноле. Раствор липида в этаноле быстро добавляют к цитратному буферу (рН=4~5) способом инъекции этанола и перемешивают при встряхивании в течение 30 секунд для последующего использования. eGFP-иРНК (приобретенную у Shanghai Biohub International Trade Co., Ltd) или Fluc-иРНК (приобретенную у Shanghai Biohub International Trade Co., Ltd) разводят в цитратном буфере (рН=4~5) с получением водного раствора иРНК. Для приготовления липосом используют определенный объем раствора липосом и водного раствора иРНК при массовом отношении общих липидов к иРНК 16:1. Смеси обрабатывают ультразвуком при 25°С в течение 15 минут (частота ультразвука 40 кГц и мощность ультразвука 800 Вт). Полученные липосомы разводят в 10 раз по объему PBS, и затем подвергают ультрафильтрации с помощью ультрафильтрационной трубки 300 кДа для удаления этанола. Затем объем фиксируют до определенного объема с PBS, чтобы получить состав LNP, инкапсулирующий eGFP-иРНК или Fluc-иРНК, используя катионный липид/ОЗРС/холестерин/иМ6-РЕ62000 (50:10:38,5:1,5 в молярных долях).

Пример 5: Определение размера частиц и индекса полидисперсности (PDI) липидных наночастиц

[00291] Размер частиц и индекс полидисперсности (PDI) определяют способом динамического рассеяния света с использованием лазерного анализатора размера частиц Malvern.

[00292] 10 мкл раствора липосом взвешивают, разводят до 1 мл деионизированной водой, не содержащей РНКазу, и добавляют к пулу образцов. Каждый образец измеряют в трех повторах. Условия измерения следующие: угол рассеяния 90° и 25°С. Результаты тестирования следующие:

[00293] Таблица 2: Размер частиц и индекс полидисперсности (PDI)

[00294] Липидные наночастицы, полученные в Примере 4, имеют размер частиц от 110 до 210 нм, и все липидные наночастицы можно использовать для доставки иРНК, при этом частицы, полученные с соединением 23 и YK-003, имеют наименьшие размеры частиц, которые составляют 114,12 нм. и 119,91 нм, соответственно, и частицы, полученные с YK-008 и МСЗ, имеют наибольшие размеры частиц, которые составляют 205,00 нм и 205,20 нм, соответственно. Все липидные наночастицы имеют индекс полидисперсности от 5% до 30%, при этом YK-004 имеет наименьший индекс полидисперсности 9,7%, и YK-002 имеет наибольший индекс полидисперсности 27,7%.

Пример 6: In vitro верификация эффективности носителей доставки LNP

[00295] Выделение и пассирование клеток: способ такой же, как в Примере 3.

[00296] Планшет для посева: способ такой же, что и в Примере 3.

[00297] 1. Обнаружение флуоресценции Fluc-иРНК

[00298] Состав LNP, содержащий 0,3 мкг Fluc-иРНК (компонентами-носителями состава LNP являются катионный липид, нейтральный липид, структурированный липид и липид, конъюгированный с полимером в молярном отношении 50:10:38,5:1,5, где катионный липид указан в Таблице 1), добавляют в среду для культуры клеток в 96-луночном планшете и дополнительно инкубируют в течение 24 часов. Соответствующий реагент добавляют в соответствии с инструкциями набора Gaussia Luciferase Assay Kit, и интенсивность экспрессии флуоресценции в каждой лунке определяют с помощью системы обнаружения флуоресценции IVIS. Этот тест подтверждает эффективность трансфекции составов LNP в клетках. Результаты показаны в Таблице 3.

[00299] Для дальнейшего сравнения эффективности внутриклеточной трансфекции составов LNP, полученных из катионного липида YK-009 и соединения 25, готовят составы LNP с содержанием Fluc-иРНК 0,3 мкг, 0,225 мкг, 0,15 мкг и 0,075 мкг, соответственно (компоненты носителя состава LNP представляют собой катионный липид, нейтральный липид, структурированный липид и липид, конъюгированный с полимером в молярном отношении 50:10:38,5:1,5, где катионный липид представляет собой YK-009 или соединение 25). Обнаружена внутриклеточная активность трансфекции приготовленных составов LNP, и способ обнаружения такой же, как указано выше. Результаты показаны в Таблице 4.

[00300] Таблица 3: Результаты флуоресцентного обнаружения Fluc-иРНК

[00301] Таблица 4: Результаты обнаружения флуоресценции при разном содержании Fluc-иРНК

[00302] Из Таблицы 3 и Фиг. 5 видно, что среди составов LNP Fluc-иРНК, полученных из различных катионных липидов, YK-009 имеет самую сильную абсорбцию флуоресценции со значением RLU 5479373; YK-001, YK-002, YK-005, YK-006 и YK-008 также имеют очень высокие значения абсорбции флуоресценции, все из которых находятся в диапазоне от 10⁶ до 10⁷; и значения RLU YK-009, YK-006, YK-001, YK-005, YK-002 и YK-008 в 8,4 раза, 4,1 раза, 3,4 раза, 2,2 раза, 2,0 раза и 1,9 раза больше, чем у соединения 23, соответственно; YK-010 имеет самую слабую абсорбцию флуоресценции со значением RLU 93801; YK-004, соединение 23, соединение 27 и МСЗ также имеют очень слабую абсорбцию флуоресценции, и значения RLU YK-009 в 58 раз, 39 раз, 8 раз, 13 раз и 42 раза больше, чем у YK-010, YK-004, соединения 23, соединения 27 и МСЗ, соответственно.

[00303] Из Таблицы 4 и Фиг. 6 видно, что составы LNP, полученные с YK-009 и соединением 25, имеют очень разную абсорбцию флуоресценции, и для составов LNP, содержащих 0,075 мкг, 0,15 мкг, 0,225 мкг и 0,3 мкг Fluc-иРНК, абсорбция флуоресценции состава YK-009 в 3,7 раза, 4,0 раза, 7,0 раза и 4,4 раза больше, чем у состава соединения 25, соответственно.

[00304] Данные анализируют с помощью программного обеспечения GraphPad Prism, где данные YK-009, YK-006, YK-001, YK-005, YK-002 и YK-008 значительно отличаются от данных соединения 23, и данные YK-009, YK-006, YK-001, YK-005, YK-002 и YK-008 достоверно отличаются от соединения 27. За исключением YK-004 и YK-010, данные всех соединений достоверно отличаются от МС3; для составов LNP, содержащих 0,075 мкг, 0,15 мкг, 0,225 мкг и 0,3 мкг Fluc-иРНК, данные YK-009 значительно отличаются от данных для соединения 25.

[00305] Со структурной точки зрения, по сравнению с YK-009, группа L₁ у YK-001 имеет на один С больше, и остальные структуры абсолютно идентичны; группа G₁ у YK-002 имеет на один С больше, и остальные структуры абсолютно идентичны; группа G₂ у YK-004 имеет на два С меньше, и остальные структуры абсолютно идентичны; группа G₂ у YK-006 имеет на один С меньше, и остальные структуры абсолютно идентичны; каждая из двух цепей группы L₂ YK-010 имеет на один С меньше, и остальные структуры абсолютно идентичны; соединение 23 имеет на четыре С больше в группе G₁, на один С меньше в группе L₁, на четыре С больше в группе G₂ и на один С меньше в одинарной цепи группы L₂, и остальные структуры абсолютно идентичны; соединение 25 имеет на два С больше в группе G₁, на один С больше в группе L₁, на два С больше в группе G₂ и на один С меньше в одинарной цепи группы L₂, и остальные структуры абсолютно идентичны; соединение 27 имеет на четыре С больше в группе G₁, на один С меньше в группе L₁ и на один С меньше в одинарной цепи группы L₂, и остальные структуры абсолютно идентичны.

[00306] Можно видеть, что не существует соответствующей взаимосвязи между структурой соединения и эффективностью внутриклеточной трансфекции, и соединения с небольшими структурными различиями могут иметь высокую вероятность очень большой разницы в эффективности трансфекции. Например, по сравнению с YK-009, структуры YK-010, YK-004, соединения 23 и соединения 27 отличаются незначительно, но эффективность трансфекции клеток YK-009 в 58 раз, 39 раз, 8 раз и 13 раз больше, чем у этих катионных липидных соединений, соответственно. Существует лишь небольшая разница в структуре между YK-009 и соединением 25, но разница в эффективности трансфекции клеток может достигать 7 раз. Следовательно, дело не в том, что соединения со схожими структурами должны иметь одинаковую эффективность трансфекции, но вероятно, имеют сильно различающуюся эффективность трансфекции. Скрининг катионных липидных соединений с высокой эффективностью трансфекции является непростым и требует различных дизайнов и большой творческой работы.

[00307] 2. Анализ выживаемости клеток

[00308] Состав LNP, содержащий 1,5 мкг Fluc-иРНК (компонент-носитель состава LNP представляет собой катионный липид, нейтральный липид, структурированный липид и липид, конъюгированный с полимером с молярным отношением 50:10:38,5:1,5, где катионный липид указан в Таблице 1), добавляют в среду для культивирования клеток 96-луночного планшета и далее культивируют в течение 24 часов. Затем в каждую лунку добавляют по 10 мкл раствора ССК-8 и культуральный планшет инкубируют в инкубаторе в течение 1 часа. Абсорбцию при 450 нм измеряют с помощью микропланшетного ридера. Результаты показаны в Таблице 4.

[00309] Для сравнения цитотоксичности составов LNP, приготовленных из катионного липида YK-009 и соединения 25, готовят составы LNP с содержанием Fluc-иРНК 1,5 мкг, 1,125 мкг, 0,75 мкг и 0,375 мкг (компонентами-носителями составов LNP являются катионный липид, нейтральный липид, структурированный липид и липид, конъюгированный с полимером, с молярным отношением 50:10:38,5:1,5, где катионный липид представляет собой YK-009 или соединение 25). Способ анализа выживаемости клеток такой же, как указано выше. Результаты показаны в Таблице 6.

[00310] Таблица 5: Выживаемость клеток

[00311] Таблица 6: Степень выживаемости клеток с разным содержанием Fluc-иРНК

[00312] Из Таблицы 5 и Фиг. 7 видно, что составы LNP Fluc-иРНК, полученные с использованием разных катионных липидов, имеют очень разную цитотоксичность, при этом степень выживаемости клеток для YK-009 является самой высокой и составляет 100%, и для YK-011 составляет 98%; однако для YK-010 составляет 77%, для YK-003 составляет 84%, для YK-001 составляет 85%, для соединения 23 составляет 87%, для соединения 27 составляет 84% и для МСЗ составляет 88%; они явно ниже, чем для YK-009.

[00313] Из Таблицы 6 и Фиг. 8 видно, что составы LNP, полученные с YK-009 и соединения 25, обладают очень разной ингибирующей активностью в отношении клеток, при этом для составов LNP с содержанием Fluc-иРНК 1,5 мкг, 1,125 мкг, 0,75 мкг и 0,375 мкг, выживаемость клеток всех составов YK-009 составляет 100%, и ингибирующая активность составов соединения 25 в отношении клеток составляет вплоть до 9% ниже, чем для составов YK-009.

[00314] Данные анализируют с помощью программного обеспечения GraphPad Prism, и YK-009, YK-011, YK-006 и YK-007 имеют значительные различия в цитотоксичности по сравнению с соединением 23, соединением 27 и МС3.

[00315] Из приведенных выше результатов тестирования видно, что не существует соответствующей взаимосвязи между структурой катионных липидных соединений и их цитотоксичностью, и соединения с небольшими структурными различиями могут иметь большие различия в цитотоксичности. Например, по сравнению с YK-009, YK-010 имеет на один С меньше в каждой из двух цепей группы L₂ при абсолютно идентичных остальных структурах, но имеет снижение степени выживаемости клеток на 23%; YK-002 имеет на один С больше в группе G₁ при абсолютно идентичных остальных структурах, но имеет снижение степени выживаемости клеток на 11%; соединение 23 имеет на четыре С больше в группе G₁, на один С меньше в группе L₁, на четыре С больше в группе G₂, на один С меньше в одинарной цепи группы L₂ при абсолютно идентичных остальных структурах, но имеет снижение степени выживаемости клеток на 13%; соединение 25 имеет на два С больше в группе G₁, на один С больше в группе L_l, на два С больше в группе G₂, на один С меньше в одинарной цепи группы L₂ при абсолютно идентичных остальных структурах, но имеет снижение степени выживаемости клеток на 9%. Соединение 27 имеет на четыре С больше в группе G₁, на один С меньше в группе Li, на один С меньше в одинарной цепи группы L₂ при абсолютно идентичных остальных структурах, но имеет снижение степени выживаемости клеток на 16%. Хотя YK-009 по структуре аналогичен YK-010, YK-002, соединению 23, соединению 27 и соединению 25, его цитотоксичность на 23%, 11%, 13%, 16% и 9% меньше, соответственно. Можно видеть, что небольшие структурные различия в катионных липидах могут приводить к заметно разной цитотоксичности.

Пример 7: In vivo верификация эффективности носителей для доставки катионных липидов (LNP)

[00316] Кроме того, также проверяют экспрессию белка и продолжительность иРНК, доставляемой мышам с помощью сконструированного носителя для доставки катионных липидов. Испытания in vivo также доказывают, что носитель доставки LNP может эффективно доставлять иРНК в организм и экспрессировать ее эффективно и пролонгированно.

[00317] Состав LNP, содержащий 10 мкг Fluc-иРНК, внутримышечно вводят самкам мышей BALB/C в возрасте 4-6 недель и массой 17-19 г, и в определенные моменты времени (3 часа, 6 часов, 24 часа, 48 часов и 72 часа) после введения, мышам внутрибрюшинно вводят субстрат для флуоресцентной визуализации. Мыши свободно двигаются в течение 5 минут, и затем среднюю интенсивность излучения (соответствующую интенсивности экспрессии флуоресценции) белка, экспрессируемого иРНК, переносимой LNP у мышей определяют с помощью устройства визуализации для живых мелких животных IVIS Spectrum. Результаты тестирования представлены в Таблице 5 и на Фиг. 7.

[00318] Чтобы сравнить экспрессию белка и продолжительность у мышей составов LNP, полученных из катионного липида YK-009 и соединения 25, готовят составы LNP с содержанием Fluc-иРНК 10 мкг, 7,5 мкг, 5 мкг и 2,5 мкг (компоненты-носители составов LNP представляют собой катионные липиды, нейтральные липиды, структурированный липид и липид, конъюгированный с полимером, с молярным отношением 50:10:38,5:1,5, где катионный липид представляет собой YK-009 или соединение 25). Способ тестирования изображения на живых мышах такой же, как описано выше. Результаты показаны в Таблице 8.

[00319] Таблица 7: Данные тестирования изображения на живых мышах

[00320] Таблица 8: Данные тестирования изображений на живых мышах при разном содержании Fluc-иРНК

[00321] Из Таблицы 7 и Фиг. 9 видно, что интенсивность экспрессии составов LNP Fluc-иРНК, приготовленных из различных катионных липидов, сильно различается у мышей. С 3 ч до 72 ч, YK-003 и YK-009 имеют самую высокую интенсивность экспрессии, что указывает на то, что составы LNP, приготовленные из них, имеют высокую и пролонгированную экспрессию in vivo; через 3 часа, средняя интенсивность излучения YK-003 и YK-009 составляет 1500820 и 1234280, соответственно; YK-004 и YK-010 имеют самые низкие значения, 69640 и 60100, соответственно; иРНК, переносимая этими четырьмя, различается более чем в 20 раз между самой высокой и самой низкой экспрессией Fluc-иРНК у животных; через 72 часа, средние интенсивности излучения YK-003 и YK-009 составляют 39538 и 29435, соответственно, и самые низкие имеют YK-004 и YK-010 со средней интенсивностью излучения 2066 и 810,2 соответственно; разница между самой высокой и самой низкой экспрессией иРНК этими четырьмя у животных составляет до 50 раз. Средняя интенсивность излучения соединений 23 и 27 составляет 554600 и 632450 через 3 часа, соответственно, но быстро снижается между 6 ч и 48 ч и составляет только 4801 и 5512 через 72 ч, что указывает на то, что иРНК, переносимая полученными из них составами LNP, быстро разрушается или метаболизируется у мышей. Экспрессия иРНК, переносимой МС3, каждый раз является очень низкой, что указывает на то, что иРНК, переносимая МС3, экспрессируется на низком уровне in vivo, и ее экспрессия не является пролонгированной.

[00322] Из Таблицы 8 и Фиг. 10 видно, что составы LNP, полученные с YK-009 и соединения 25, у мышей имеют совершенно разную экспрессию. Что касается составов LNP с содержанием Fluc-иРНК 2,5 мкг, 5,0 мкг, 7,5 мкг и 10 мкг, экспрессия YK-009 в 1,6-2,1 раза выше, чем для соединения 25 через 3 часа, в 1,4-1,7 раза выше, чем для соединения 25 через 6 часов, в 5,2-5,5 раза выше, чем для соединения 25 через 24 часа, в 6,5-7,1 раза выше, чем для соединения 25 через 48 часов, и в 6,1-6,8 раза выше, чем для соединения 25 через 72 часа. Что касается составов LNP с различным содержанием Fluc-иРНК, все составы YK-009 могут поддерживать высокую экспрессию in vivo в течение длительного времени, и составы соединения 25 могут поддерживать высокую экспрессию в течение 3 ч и 6 ч, но быстро снижаются через 6-48 ч.

[00323] Данные анализируют с помощью программного обеспечения GraphPad Prism. С точки зрения высокой экспрессии и пролонгированной экспрессии иРНК, переносимой LNP, у животных, YK-003 и YK-009 существенно отличаются от соединения 23, соединения 25, соединения 27 и МС3.

[00324] Из приведенных выше результатов испытаний можно видеть, что не существует соответствующей взаимосвязи между структурой катионных липидных соединений и высокой экспрессией и пролонгированной экспрессией иРНК, переносимой LNP, у животных. Катионные липидные соединения с небольшими структурными различиями могут существенно способствовать экспрессии иРНК у мышей. Например, по сравнению с YK-009, YK-004 имеет только на два С меньше в группе G₂, и остальные структуры абсолютно идентичны; YK-010 имеет на один С меньше в каждой из двойных цепей группы L₂, и остальные структуры абсолютно идентичны; соединение 23 имеет на четыре С больше в группе G₁, на один С меньше в группе L₁, на четыре С больше в группе G₂, на один С меньше в одинарной цепи группы L₂, и остальные структуры абсолютно идентичны; соединение 27 имеет на четыре С больше в группе G₁, на один С меньше в группе L₁, на один С меньше в одинарной цепи группы L₂, и остальные структуры абсолютно идентичны; но через 3 часа, экспрессия иРНК, которую несут эти четыре, у животных отличается более чем в 20 раз между самой высокой и самой низкой; и через 72 часа, экспрессия иРНК, которую несут эти четыре, у животных отличается вплоть до 50 раз между самой высокой и самой низкой.

[00325] По сравнению с YK-009, соединение 25 имеет на два С больше в группе G₁, на один больше С в группе L₁, на два больше С в группе G₂, на один С меньше в одинарной цепи группы L₂, и остальные структуры абсолютно идентичны; но что касается составов LNP, полученных с YK-009 и соединением 25 с содержанием Fluc-иРНК 2,5 мкг, 5,0 мкг, 7,5 мкг и 10 мкг, экспрессия иРНК для YK-009 может быть вплоть до 2,1 раз выше, чем для соединения 25 через 3 часа, может быть вплоть до 1,7 раза выше, чем для соединения 25 через 6 часов, может быть вплоть до 5,5 раз выше, чем для соединения 25 через 24 часа, может быть вплоть до 7,1 раза выше, чем для соединения 25 через 48 часов, и для YK-009 может быть вплоть до 7,2 раза больше, чем для соединения 25 через 72 часа.

[00326] В заключение

[00327] Вышеупомянутые тесты in vitro и in vivo для проверки эффективности носителей доставки LNP показывают, что структура катионных липидных соединений не имеет очевидной соответствующей связи с эффективностью внутриклеточной трансфекции, цитотоксичностью, а также высокой экспрессией и пролонгированной экспрессией у животных. Соединения с очень небольшими структурными различиями могут иметь очень большие различия в эффективности трансфекции и/или цитотоксичности и высокой экспрессии в клетках. Например, соединения YK-009 и YK-010 по настоящей заявке различаются почти в 60 раз по эффективности трансфекции клеток и различаются на 25% или более по токсичности для трансфицированных клеток; и соединения YK-003 и YK-010 различаются по экспрессии и пролонгированной экспрессии у мышей до 50 раз. Следовательно, очень сложно отобрать подходящие катионные липидные соединения, которые могут одновременно обладать высокой эффективностью трансфекции, низкой цитотоксичностью и высокой и пролонгированной экспрессией у мышей.

[00328] В настоящей заявке были обнаружены некоторые соединения, такие как YK-009, YK-003, YK-006, YK-008 и YK-011, благодаря уникальному дизайну и большому количеству испытаний. По сравнению с другими соединениями известного уровня техники, эти соединения могут доставлять нуклеиновые кислоты с высокой эффективностью трансфекции клеток, низкой цитотоксичностью или ее отсутствием, а также высокой и пролонгированной экспрессией у животных, достигая неожиданных технических эффектов.

[00329] Приведенные выше описания являются лишь типовыми вариантами осуществления настоящего изобретения и не предназначены для ограничения объема защиты настоящего изобретения, который определяется прилагаемой формулой изобретения.

Claims (34)

1. Соединение следующей формулы или его фармацевтически приемлемая соль:

2. Композиция для доставки нуклеиновых кислот, содержащая нуклеиновую кислоту в качестве терапевтического или профилактического агента, и носитель, где носитель содержит катионный липид, и катионный липид представляет собой соединение или его фармацевтически приемлемую соль по п. 1;

нейтральный липид;

структурированный липид; и

ПЭГ-конъюгированный липид;

где молярное содержание катионного липида в носителе составляет от 30% до 70%;

молярное отношение катионного липида к нейтральному липиду составляет от 1:1 до 10:1;

молярное содержание ПЭГ-конъюгированного липида в носителе составляет от 0,5% до 5%;

массовое отношение носителя к терапевтическому или профилактическому агенту составляет от 10:1 до 30:1.

3. Композиция по п. 2, где нейтральный липид выбран из одного или нескольких из фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, сфингомиелина, церамида, стерина и их производных.

4. Композиция по п. 3, где нейтральный липид выбран из одного или нескольких из 1,2-дилинолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DLPC), 1,2-димиристоил-sn-глицеро-фосфохолина (DMPC), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DOPC), 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DPPC), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DSPC), 1,2-диундеканоил-sn-глицеро-фосфохолина (DUPC), 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (POPC), 1,2-ди-O-октадеценил-sn-глицеро-3-фосфохолина (18:0 Diether PC), 1-олеоил-2-холестерилгемисукциноил-sn-глицеро-3-фосфохолина (OChemsPC), 1-гексадецил-sn-глицеро-3-фосфохолина (C16 Lyso PC), 1,2-дилиноленоил-sn-глицеро-3-фосфохолина, 1,2-диарахидоноил-sn-глицеро-3-фосфохолина, 1,2-дидокозагексаеноил-sn-глицеро-3-фосфохолина, 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина (DOPE), 1,2-дифитаноил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина (ME 16,0 PE), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина, 1,2-дилинолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина, 1,2-дилиноленоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина, 1,2-диарахидоноил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина, 1,2-дидокозагексаеноил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина, натриевой соли 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфо-rac-(1-глицерина) (DOPG), дипальмитоил фосфатидилглицерина (DPPG), пальмитоил олеоил фосфатидилэтаноламина (POPE), дистеароил-фосфатидил-этаноламина (DSPE), дипальмитоил фосфатидилэтаноламина (DPPE), димиристоил фосфоэтаноламина (DMPE), 1-стеарил-2-олеоил-стеароилэтаноламина (SOPE), 1-стеароил-2-олеоил-фосфатидилхолина (SOPC), сфингомиелина, фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозита, фосфатидной кислоты, пальмитоил олеоил фосфатидилхолина, лизофосфатидилхолина, лизофосфатидилэтаноламина (LPE).

5. Композиция по п. 4, где нейтральный липид представляет собой DOPE и/или DSPC.

6. Композиция по любому из пп.2-5, где структурированный липид выбран из одного или нескольких из холестерина, нонстерина, ситостерина, эргостерина, кампестерина, стигмастерина, брассикастерина, томатина, урсоловой кислоты, альфа-токоферола и кортикостероида.

7. Композиция по п. 6, где структурированный липид представляет собой холестерин.

8. Композиция по любому из пп. 2-7, где ПЭГ-конъюгированный липид выбран из одного или нескольких из ПЭГ-модифицированного фосфатидилэтаноламина, ПЭГ-модифицированной фосфатидной кислоты, ПЭГ-модифицированного церамида, ПЭГ-модифицированного диалкиламина, ПЭГ-модифицированного диацилглицерина и ПЭГ-модифицированного диалкилглицерина; более предпочтительно, где ПЭГ-конъюгированный липид выбран из одного или нескольких из дистеароилфосфатидилэтаноламина, полиэтиленгликоля 2000 (DSPE-PEG2000), димиристоилглицеро-3-метоксиполиэтиленгликоля 2000 (DMG-PEG2000) и метоксиполиэтиленгликоль дитетрадецилацетамида (ALC-0159).

9. Композиция по любому из пп. 2-8, где молярное отношение катионного липида к структурированному липиду составляет от 1:1 до 5:1.

10. Композиция по любому из пп. 2-9, где молярное отношение катионного липида, нейтрального липида, структурированного липида и ПЭГ-конъюгированного липида составляет (25-65):(5-25):(25-45):(0,5-5).

11. Композиция по п. 10, где молярное отношение катионного липида, нейтрального липида, структурированного липида и ПЭГ-конъюгированного липида составляет 50:10:38,5:1,5.

12. Композиция по любому из пп. 2-11, где композиция представляет собой состав наночастиц, который имеет средний размер частиц от 10 нм до 210 нм и индекс полидисперсности менее или равный 50%.

13. Композиция по п. 12, где композиция представляет собой состав наночастиц, который имеет средний размер частиц от 100 нм до 205 нм и индекс полидисперсности менее или равный 30%.

14. Композиция по любому из пп. 2-13, где композиция дополнительно содержит одно или несколько других ионизируемых липидных соединений.

15. Композиция по любому из пп. 2-14, где массовое отношение носителя к терапевтическому или профилактическому агенту составляет от 15:1 до 25:1.

16. Композиция по п. 15, где массовое отношение носителя к терапевтическому или профилактическому агенту составляет 16:1.

17. Композиция по любому из пп. 2-16, где терапевтический или профилактический агент представляет собой рибонуклеиновую кислоту (РНК); и предпочтительно, где РНК выбрана из группы, состоящей из короткой интерферирующей РНК (киРНК), асимметричной интерферирующей РНК (аиРНК), микроРНК (миРНК), Dicer-субстратной РНК (дцРНК), короткой шпилечной РНК (кшРНК), информационной РНК (иРНК) и их смесей.

18. Композиция по п.17, где РНК представляет собой иРНК.

19. Композиция по любому из пп. 2-18, где композиция дополнительно содержит один или несколько из фармацевтически приемлемых эксципиентов и фармацевтически приемлемых разбавителей.

20. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по п. 1 или композиции по любому из пп. 2-19 в производстве лекарственного средства на основе нуклеиновой кислоты.

21. Применение композиции по любому из пп. 2-19 в производстве лекарственного средства для лечения заболевания или состояния у млекопитающего, нуждающегося в этом, где заболевание или состояние выбрано из группы, состоящей из инфекционных заболеваний, раковых и пролиферативных заболеваний, генетических заболеваний, аутоиммунных заболеваний, диабета, нейродегенеративных заболеваний, сердечно-сосудистых и реноваскулярных заболеваний и метаболических заболеваний.

22. Применение по п. 21, где инфекционное заболевание выбрано из заболеваний, вызванных коронавирусом, вирусом гриппа или вирусом ВИЧ, детской пневмонии, лихорадки долины Рифт, желтой лихорадки, бешенства и различных герпесов.

23. Применение по п. 21 или 22, где млекопитающее представляет собой человека.

24. Применение по любому из пп. 21-23, где лекарственное средство вводят внутривенно, внутримышечно, интрадермально, подкожно, интраназально или путем ингаляции.

25. Применение по п. 24, где лекарственное средство вводят подкожно.

26. Применение по любому из пп. 21-25, где лекарственное средство вводят млекопитающему в дозе от 0,001 мг/кг до 10 мг/кг.