RU2823309C1 - Антитела против рецептора стабилин-1 (stabilin-1) человека - Google Patents
Антитела против рецептора стабилин-1 (stabilin-1) человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2823309C1 RU2823309C1 RU2023135667A RU2023135667A RU2823309C1 RU 2823309 C1 RU2823309 C1 RU 2823309C1 RU 2023135667 A RU2023135667 A RU 2023135667A RU 2023135667 A RU2023135667 A RU 2023135667A RU 2823309 C1 RU2823309 C1 RU 2823309C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- stabilin
- insdseq
- insdqualifier
- insdfeature
- human
- Prior art date
Links
- 101000832225 Homo sapiens Stabilin-1 Proteins 0.000 title claims abstract description 30
- 102000058040 human STAB1 Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 20
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 101710164042 Stabilin-1 Proteins 0.000 abstract description 48
- 102100024471 Stabilin-1 Human genes 0.000 abstract description 48
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 abstract description 25
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 19
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 abstract description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 abstract 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 20
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 20
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 20
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 14
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 9
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 9
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 8
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000005658 nuclear physics Effects 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 4
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000005016 Intestinal Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 101000832211 Mus musculus Stabilin-1 Proteins 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 229940053879 bexmarilimab Drugs 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 description 3
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 210000004322 M2 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000003024 peritoneal macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012217 radiopharmaceutical Substances 0.000 description 2
- 229940121896 radiopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 230000002799 radiopharmaceutical effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 239000012321 sodium triacetoxyborohydride Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 239000010755 BS 2869 Class G Substances 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 208000022072 Gallbladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000408710 Hansa Species 0.000 description 1
- 101000616435 Homo sapiens Gamma-sarcoglycan Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 208000037844 advanced solid tumor Diseases 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 208000006990 cholangiocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001728 clone cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 208000030381 cutaneous melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 102000015694 estrogen receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 201000010175 gallbladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000003284 homeostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005934 immune activation Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000005305 interferometry Methods 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 210000005073 lymphatic endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000013630 prepared media Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 102000014452 scavenger receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010078070 scavenger receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 201000003708 skin melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 210000004981 tumor-associated macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биохимии, в частности к моноклональному антителу, способному специфически связываться с рецептором стабилин-1 человека, а именно мышиным моноклональным антителам против стабилин-1. Антитела против рецептора стабилин-1 человека с высокой аффинностью с KD=2.23×10-12 М связывают рекомбинантный белок стабилин-1 человека и нативный стабилин-1 на поверхности макрофагов человека, обеспечивая накапливание антител в опухолевом узле. Изобретение может быть эффективно использовано для лечения заболеваний, ассоциированных со стабилин-1 человека. 4 ил.
Description
Изобретение относится к области биохимии, в частности к моноклональному антителу, способному специфически связываться с рецептором стабилин-1 человека, а именно мышиным моноклональным антителам против стабилин-1. Изобретение может быть использовано для лечения заболеваний, ассоциированных со стабилин-1 человека.
Моноклональные антитела (МАТ) к стабилин-1 представляют собой перспективный класс биологически активных веществ. Они выступают в качестве эффективных инструментов в лечении различных заболеваний, особенно онкологических, благодаря своей способности регулировать сигнальные пути, вовлеченные в ангиогенез и иммунный ответ.
Стабилин-1 (stabilin-1, также известный как Clever-1 и FEEL-1) представляет собой рецептор, экспрессируемый на лимфатических эндотелиальных клетках, синусоидальных эндотелиальных клетках и иммуносупрессивных моноцитах и макрофагах [Kzhyshkowska J. Gratchev А. Goerdt S. Stabilin-1, a homeostatic scavenger receptor with multiple functions J. Cell. Mol. Med.2006 10 635 649]. Выделяют две субпопуляции макрофагов: воспалительные Ml- макрофаги, отвечающие за уничтожение чужеродных агентов как напрямую, так и за счет привлечения и активации других клеток иммунной системы и М2-макрофаги, выполняющие адаптивную, регенераторную и противовоспалительную функции. Одним из ключевых маркеров М2-макрофагов является мембранный гликопротеин, способный химически связывать модифицированные липопротеиды низкой плотности и модулировать регуляторные свойства макрофагов - стабилин-1.
Макрофаги, помимо различия в выполняемых функциях, обладают свойством пластичности, которое позволяет им изменять свой фенотип и функции в ответ на сигналы микроокружения, в частности опухолевой стромы при злокачественных заболеваниях. Роль опухолевой стромы в патогенезе злокачественных опухолей не подвергается сомнению. Макрофаги - одни из ключевых элементов опухолевой стромы. Макрофаги, ассоциированные с опухолью (МАО), являются макрофагами 2-го типа активации, которые обладают выраженной противовоспалительной активностью и отвечают за подавление воспалительной реакции и восстановления ткани в очаге воспаления. МАО вносят значительный вклад в прогрессию опухолей за счет стимуляции пролиферации клеток, ангиогенеза и подавления противоопухолевого иммунного ответа. К их маркерам относится и стабилин-1. Анализ различных форм рака у человека выявил заметную связь между количеством стабилин-1-положительных макрофагов и исходом заболевания.
Роль стабилин-1 в росте и распространении рака впервые была показана на моделях мышей с нокаутом Stab 1 -/-, у которых развивались первичные опухоли и метастазы меньшего размера. Последующие исследования на мышах и людях показали, что иммунотерапевтическая блокада стабилин-1 может активировать Т-клеточные ответы, и что этот ответ в основном опосредован фенотипическим изменением макрофагов и моноцитов с иммуносупрессивных на провоспалительные [Dunkel, J., Viitala, М., Karikoski, М., Rantakari, P., Virtakoivu, R., Elima, K. et al. Enhanced antibody production in Clever-1/Stabilin-1-deficient mice. Front. Immunol. 9,2257 (2018)].
Известно одно терапевтическое антитело против стабилина-1 (Stabilin-1, Clever-1) человека, которое в настоящее время находится на стадии клинических испытаний (MATINS, NCT03733990). Бексмарилимаб (FP-1305) - гуманизированное моноклональное антитело изотипа IgG4, которое продемонстрировало значимую противоопухолевую активность в доклинических и одном клиническом исследованиях. Исследование FP-1305, NCT03733990) - это первое открытое адаптивное клиническое исследование фазы 1/2 с участием избранных метастатических или неоперабельных солидных опухолей с целью изучения безопасности и эффективности Бексмарилимаба. Выбранные опухоли включают кожную меланому, поджелудочную железу, яичники, эстроген-рецептор-положительные опухоли молочной железы, колоректальный рак, рак желудка, рак желчного пузыря и холангиокарциному, все из которых, как известно, содержат большое количество стабилин-1-положительных макрофагов. Ранние результаты исследования Бексмарилимаба, в которую вошли 11 пациентов, получавших лечение, показывают многообещающую переносимость, клиническую противоопухолевую активность и мобилизацию естественных клеток-киллеров, В-клеток и Т-клеток после лечения [Bono, P., Hollmen, М., Jaakkola, P., Shetty, S., Thibault, A., de Jonge, М. et al. LBA29 Immune activation with a novel immune switch anti-macrophage antibody (anti-Clever-1 mAb; FP-1305) in phase I/II first-in-human MATINS trial in patients with advanced solid tumours. Ann. Oncol. 30, mdz394-018 (2019)]. Данные тестирования препарата, успешно проходящего клинические испытания, подчеркивают актуальность и востребованность разработки новых молекул в данной области.
Технической задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является расширение спектра моноклональных антител против стабилин-1.
Технический результат - получение нового моноклонального мышиного антитела (МАТ) ТШК 10, которое с высокой аффинностью (KD=2,23×1012 М) связывает рекомбинантный белок стабилин-1 человека и нативный стабилин-1 на поверхности макрофагов человека, обеспечивая накапливание антитела в опухолевом узле.
Поставленная задача решается созданием моноклонального антитела мыши способного специфически связываться с рецептором стабилин-1 человека, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 1, вариабельный домен легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 2 и гипервариабельные участки тяжелой и легкой цепей с последовательностями SEQ ID NO: 3-8.
В настоящем изобретении технический результат достигнут получением нового моноклонального мышиного антитела (МАТ) ТШК 10, изотипа IgG2a, специфически связывающего рекомбинантный белок стабилин-1 человека с высокой аффинностью (KD=2.23×10-12 М), а также связывающего нативный стабилин-1 на поверхности макрофагов человека. При этом, МАТ ТШК 10 накапливалось в области опухолевого узла перевитых клеток рака кишечника мыши в экспериментах in vivo. Полученное МАТ ТШК 10 может быть использовано для получения химерных и гуманизированных антител и адресной доставки с их помощью тераностического радиофармацевтического препарата или цитотоксических веществ к опухоли.
Способ получения антител
Технология получения мышиных антител включала в себя иммунизацию мышей антигеном рекомбинантного белка стабилин-1 человека, получение и отбор позитивных гибридомных клонов - продуцентов моноклональных антител с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), наработку антител в асцитах мышей, выделение и очистку антител на белок А-сефарозе и разноплановые исследования полученных антител. Нуклеотидные последовательности вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей полученного мышиного моноклонального антитела были изучены с помощью генетического секвенирования.
Заявленное изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами:
На Фиг. 1 показаны результаты электрофореза моноклонального антитела ТШК10. А - не восстанавливающие условия, Б - восстанавливающие условия. 1 - белковый маркер молекулярного веса, 2 -моноклональное антитело ТШК 10.
На Фиг. 2 показаны результаты иммуноферментного анализа (ИФА) моноклонального антитела ТШК 10 к антигену-мишени стабилин-1 человека (А) и мыши (Б).
На Фиг. 3 показаны данные проточной цитометрии при визуализации нативного стабилин-1 моноклональными антителами ТШК 10 на поверхности макрофагов человека.
На Фиг. 4 показан флуоресцентный прижизненный имиджинг мышей с привитыми опухолями СТ-26 (верхний ряд) и здоровых лабораторных мышей (нижний ряд) через 48 часов после внутривенного введения МАТ ТШК 10 к рецептору стабилин-1, меченных флюорохромом Cyanine7.
Сущность и промышленная применимость изобретения поясняются следующими примерами:
Пример 1.1. Получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела мыши к белку стабилин-1 человека
На первом этапе проведена 1-я иммунизация шести мышей Balb/c препаратом рекомбинантного стабилин-1 человека (Recombinant Stabilin 1 (STAB 1 человека), RPC872Hu01, Cloud-CloneCorp.). Мыши иммунизировались в апоневроз задних конечностей в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ). Для иммунизации раствор препарата смешивали с равным объемом ПАФ (100 мкл/мышь) из расчета 20 мкг антигена на мышь. Через 2 недели после первой иммунизации все мыши были повторно иммунизированы раствором препарата рекомбинантного СТАБИЛИН-1 человека в смеси с неполным адъювантом Фрейнда (1:1), в объеме 100 мкл/мышь, в апоневроз задних конечностей, из расчета 20 мкг антигена на мышь. На четвертый день после последней иммунизации у наркотизированных и умерщвленных животных забирали лимфоциты паховых и брюшных лимфоузлов для гибридизации с миеломой SP2/0. Полученные лимфоциты смешивали с клетками миеломы в соотношении 1:1. Гибридизацию проводили по методу Мильштейна-Келлера [Kohler G. and Milstein С.Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity // Nature, 1975, 256 (5517): 495-497] инкубацией клеток в 50% растворе полиэтиленгликоля (ПЭГ) (молекулярная масса 1500 Да) в течение 1,5 мин, после чего к суспензии последовательно с интервалом 1 мин добавляли среду RPMI-1640 объемами, равными первоначальному объему раствора ПЭГ. После гибридизации клетки дважды отмывали культуральной средой и высевали в 96-луночные культуральные планшеты с суточными перитонеальными макрофагами, вносили гибридные клетки в количестве 1,5×105 клеток на лунку. Селекцию гибридов проводили в среде RPMI-1640 с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки, содержащей 10-4 М гипоксантина, 4×10-7 М аминоптерина и 1,6×10-5 М тимидина. Итого в гибридизацию пошло 50 млн. лимфоцитов и 50 млн. клеток SP2/0, которые после гибридизации рассеяли на 10 плат. Через 10 дней платы исследовали под микроскопом. В платах с клетками лимфоузлов было от 1 до 4 клонов, поэтому платы скринировали целиком. Скрининг позитивных клонов, секретирующих моноклональные антитела (мАТ) проводили методом непрямого твердофазного ИФА, регистрируя связывание антител с антигеном, иммобилизованным в лунках планшета с высокой сорбционной емкостью. Для иммобилизации антигена в лунки 96-луночного планшета для ИФА вносили антиген стабилин-1 (Recombinant Stabilin 1 (STAB1 человека), RPC872Hu01, Cloud-CloneCorp.) в концентрации 5 мкг/мл, приготовленный на 0,01 М карбонатном буферном растворе, рН 9,6 в объеме 100 мкл (Буфер А) и выдерживали при комнатной температуре в течение 16 ч. Лунки планшета отмывали забуференным физиологическим раствором, содержащим 0,05% Твин-20 (ЗФР-Т) и вносили в них супернатант культуральной жидкости гибридных клеток в объеме 50 мкл и 100 мкл ЗФР-Т. Планшет инкубировали при температуре плюс 37°С в течение 1 ч. После этого лунки планшета трижды отмывали раствором ЗФР-Т и добавляли в лунки антитела против иммуноглобулинов мыши, меченные пероксидазой хрена, в рабочем разведении. Планшет инкубировали при температуре плюс 37°С в течение 1 ч, затем пятикратно отмывали раствором ЗФР-Т, после чего добавляли хромогенный субстрат тетраметилбензидин (ТМБ). Клоны клеток, продуцирующие моноклональные антитела к препарату рекомбинантного стабилин-1 человека, отбирали на основании положительной иммуноферментной реакции, которая проявлялась в виде окрашивания продукта хромогена - ТМБ. Реакцию останавливали добавлением в лунки по 50 мкл 4N серной кислоты. Планшеты сканировали на планшетном ридере, измеряя поглощение при 450 нм. В результате была отобрана гибридома, продуцирующая МАТ к рекомбинантному стабилин-1 человека, которая была обозначена как: ТШК 10.
Отобранный положительный клон многократно клонировали методом конечных разбавлений с отбором наиболее продуктивных и стабильных клонов. Клетки высевали в ячейки планшетов, содержащие перитонеальные макрофаги нормальных мышей (фидер), в концентрациях приблизительно 2 клетки на ячейку с тем расчетом, чтобы в большинстве ячеек вырос единственный клон. Полученные одиночные клоны скринировали посредством ИФА, алгоритм проведения скрининга был аналогичным алгоритму первичного скринига клонов. Если все клоны каждого типа антител оказывались положительными, то клетки любого положительного клона нарабатывали в культуральных флаконах путем культивирования при температуре плюс 37°С в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. В качестве среды для культивирования использовали RPMI-1640, содержащую 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина. Культивирование проводили до получения необходимого количества клеток для введения в мышей (с целью наработки антител в асцитах) и для криоконсервации, из расчета 2 млн на мышьи 5 млн на ампулу. На 10 день после посева на клонирование платы с клетками клонов исследовали под микроскопом и отмечали лунки, в которых присутствовал только один клон. Культуральные жидкости одиночных клонов отбирали для анализа методом ИФА.
Пример 1.2. Изотипирование МАТ ТШК 10
Для клона ТШК 10 было проведено изотипирование, с целью установления класса иммуноглобулинов. Изотипирование проводили методом непрямого твердофазного ИФА с использованием набора реактивов Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents (SigmaAldrich, кат.№IS02-1KT), регистрируя связывание антител с антигеном, иммобилизованным в лунках планшета с высокой сорбционной емкостью. Для иммобилизации антигена в лунки 96-луночного планшета для ИФА вносили антиген стабилин-1 в концентрации 5 мкг/мл, приготовленный на 0,01 М карбонатном буферном растворе, рН 9,6 в объеме 100 мкл (БуферА) и выдерживали при комнатной температуре в течение 16 ч. Лунки планшета отмывали забуференным физиологическим раствором, содержащим 0,05% Твин-20 (ЗФР-Т) и вносили в них супернатант культуральной жидкости гибридных клеток в объеме 50 мкл и 100 мкл (ЗФР-Т). Планшет инкубировали при температуре плюс 37°С в течение 1 ч. После этого лунки планшета вновь трижды отмывали раствором ЗФР-Т и добавляли в лунки антитела против изотипов иммуноглобулинов мыши IgG1, IgG2a IgG2b, IgG3, IgGM, IgGA, меченные пероксидазой хрена, в рабочем разведении. Планшет инкубировали при температуре плюс 37°С в течение 1 ч, затем пятикратно отмывали раствором ЗФР-Т, после чего добавляли хромогенный субстрат тетраметилбензидин (ТМБ). Изотип иммуноглобулинов, продуцируемых клоном, определяли на основании положительной иммуноферментной реакции на антитела к определенному анти-изотипическому антителу, которая проявлялась в виде окрашивания продукта хромогена - ТМБ. Реакцию останавливали добавлением в лунки по 50 мкл 4N серной кислоты. Планшеты сканировали на планшетном ридере, измеряя поглощение при 450 нм. В результате изотипирования полученных моноклональных антител было выявлено, что МАТ ТШК 10 представляют собой изотип IgG2a.
Пример 1.3. Наработка моноклональных антител
Наработку моноклональных антител ТШК 10 для изучения их свойств осуществляли в организме инбредных мышей линии BALB/c, которым до введения клеток гибридомы внутрибрюшинно (в/бр) вводили 0,5 мл 14-тетраметиленпентадекана (пристана). Через 14 дней этим животным также в/бр вводили прививочную дозу 2×106 гибридных клеток на мышь. Через 10 дней после этого мышей переводили на питьевую диету физиологическим раствором и в течение последующих 2-8 дней наблюдали за ростом объема брюшной полости с асцитической жидкостью. При достижении брюшной полостью заметного объема асцитическую жидкость (объемом 3-5 мл), содержащую моноклональные антитела, отбирали и определяли в ней титр антител методом ИФА. Продукция МАТ в асцитических жидкостях мышей варьировала от 1 до 2 мг/мл.
Пример 1.4. Выделение и очистка моноклональных антител
Полученную асцитическую жидкость осветляли центрифугированием (30 мин, 20000 об/мин), после чего моноклональные антитела выделяли из супернатанта осаждением сульфатом аммония, и затем очищали методами аффинной хроматографии с использованием сорбента с белком А. Осаждение сульфатом аммония проводили добавлением к супернатанту порошка NH2SO4 до концентрации 45% от насыщения. Для формирования осадка раствор оставляли в холодильнике (плюс 2-6°С) на ночь. Осадок отделяли центрифугированием (15 мин, 10000 об/мин), растворяли в минимальном растворе 20 мМ Na-фосфатного буферного раствора с 0,15 М NaCl, рН 7,2 (ФСБ) и затем диализовали приблизительно 16 часов при плюс 2-6°С против 1,5 М глицина с 3 М NaCl, рН 8,6. Диализат с помощью насоса наносили со скоростью 1 мл/мин на колонку (10×50 мм), заполненную 5 мл сорбента с белком А и уравновешенную тем же буферным раствором. После сорбции сорбент промывали 50 мл этого же буферного раствора. Элюцию проводили 20 мл 20 мМ натрий-цитратного буферного раствора, рН 4,0 для элюции антител с изотипом IgG2. Элюат, содержащий антитела, собирали в емкость, контролируя процесс выхода белка с колонки с помощью УФ детектора хроматографа. Далее антитела концентрировали осаждением сульфатом аммония. Осаждение сульфатом аммония проводили добавлением к супернатанту порошка NH2SO4 до концентрации 45% от насыщения. Для формирования осадка раствор оставляли в холодильнике (плюс 2-6°С) на ночь. Осадок отделяли центрифугированием (15 мин, 10000 об/мин), растворяли в минимальном растворе 20 мМ Na-фосфатного буферного раствора с 0,15 М NaCl, рН 7,2 (ФСБ) и затем диализовали приблизительно 16 часов при плюс 2-6°С против 20 мМ Na-фосфатного буферного раствора с 0,15 М NaCl, рН 7,2. После диализа определяли содержание белка методом спектрофотометрии при длине волны 280 нм, используя молярный коэффициент экстинкции для мышиных IgG.
Пример 1.5. Оценка чистоты полученного препарата мАТ ТШК10
Оценку чистоты и гомогенности полученных препаратов антител проводили с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в не восстанавливающих и восстанавливающих условиях. По данным электрофореза в не восстанавливающих условиях препарат МАТ ТШК 10 демонстрирует одну мажорную зону, молекулярного веса более 150 кДа, что соответствует молекулярному весу иммуноглобулинов и свидетельствует о чистоте препарата. Результаты электрофореза в полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях свидетельствует о том, что антитело ТШК10 характеризуется типичным для иммуноглобулинов класса G наличием двух цепей - тяжелой и легкой, с молекулярными массами 55 и 25 кДа соответственно (Фиг. 1).
Пример 2. Исследование свойств моноклональных антител ТШК 10. Оценка эффективности связывания моноклонального антитела ТШК 10 с рекомбинантным белком стабилин-1
Для определения связывания моноклональных антител ТШК 10 к антигену-мишени стабилин-1 применяли твердофазный вариант ИФА. В качестве твердой фазы использовали полистироловые 96-ти луночные планшеты Corning (Costar). В качестве антигена для иммобилизации твердой фазы использовали рекомбинантные белки стабилин-1 человека (Recombinant Stabilin 1 (STAB1 человека), RPC872Hu01, Cloud-CloneCorp.) и мыши (Recombinant Stabilin 1 (STAB 1 мыши), RPC872Mu01, Cloud-CloneCorp.) в концентрации 2,5 мкг/мл. Адсорбцию антигена проводили в 20 мМ боратном буфере с рН 8,0, содержащем 0,15 М NaCl, в течение 20 часов во влажной камере при +4°С. Моноклональные антитела ТШК 10 наносили в 100 мкл промывочного буфера (фосфатно-солевой буфер, рН 7,4, 0,05% Tween-20), содержащего 1 мг/мл БСА с последовательным разбавлением антител в 2 раза, начиная со стартовой концентрации 2 мкг/мл. Планшеты инкубировали 1 час при 37°С и перемешивании. По окончании инкубации проводили отмывку не связавшихся с антигеном антител промывочным буфером и вносили в лунки раствор конъюгированных с пероксидазой хрена иммуноглобулинов козы к иммуноглобулинам мыши (Sigma-Aldrich, США) в разведении 1:20.000. Планшеты инкубировали 1 час при 37°С и перемешивании. По окончании инкубации проводили отмывку не связавшихся антител промывочным буфером. Проявление связавшихся вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, проводили с помощью раствора 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ). Реакцию останавливали добавлением 1М серной кислоты при этом ТМБ приобретает желтый цвет с максимальной поглощающей способностью при 450 нм. Количество преобразованного ТМВ детектировали с помощью планшетного ридера EnSpire Multimode Plate Reader (Perkin Elmer, USA) при длине волны 450 нм. Полученные результаты обрабатывали с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 9.4.0., фиттируя зависимость оптической плотности при длине волны 450 нм (OD450) от концентрации МАТ кривой Михаэлиса-Ментена [https://www.graphpad.com/guides/prisrn/latest/curve-fitting/reg_michaelis_menten_enzyme.htm] и определяя константу связывания Km как концентрацию МАТ, необходимую для достижения половины максимальной OD450.
Иммуноферментный анализ показал (Фиг. 2), что моноклональное антитело ТШК 10 против человеческого стабилин-1 обладает сильной связывающей активностью с человеческим стабилин-1 (кm=16 нМ), при этом демонстрировало невысокую связывающую активность с мышиным антигеном стабилин-1 (кm=33 мкМ). Результаты исследований приведены на Фиг. 2.
Для определения константы связывания Kd моноклонального антитела ТШК 10 проводили измерение параметров взаимодействия полученных МАТ ТШК 10 с человеческим и мышиными антигенами стабилин-1 методом бислойной интерферометрии (ВЫ) на приборе Octet® RED 96 Forte Bio (Sartorius) с использованием сенсоров Octet® Anti-Mouse IgG Fc Capture (АМС) и Anti-Human IgG Fc Capture (АНС) и двух рекомбинантных белков стабилин-1: рекомбинантный стабилин-1 человека (RPC872Hu01, Cloud-CloneCorp.) и рекомбинантный мышиный стабилин-1 (RPC872Mu01, Cloud-CloneCorp.). По результатам измерения кинетических свойств связывания антитела ТШК 10 с человеческим рекомбинантным антигеном стабилин-1 была определена Kd=2.23⋅10-12 М.
Пример 3. Исследование свойств моноклональных антител ТШК 10. Анализ связывания антител ТШК 10 с нативным антигеном стабилин-1 на поверхности макрофагов человека
Целью этого этапа исследований была проверка связывания нативного антигена на поверхности клеток человека полученными моноклональными антителами ТШК 10. В качестве клеточной модели экспрессии рецептора стабилин-1, согласно имеющейся на литературе, была использована первичная культура макрофагов человека [Julia Kzhyshkowska. Multifunctional Receptor Stabilin-1 in Homeostasis and Disease. Ehe Scientific World JOURNAL (2010) 10, 2039-2053 DOI 10.1100/tsw.2010.189]. Получение макрофагов человека проводили по следующей методике. Для получения моноцитарной фракции использовался метод градиентного центрифугирования (400g, 40 минут), смешанной с PBS, свежесобранной цельной крови здоровых доноров в растворе фиколла плотностью 1.077 (Биолот, Россия). Отобранная средняя лимфоцитарная фракция культивировалась на чашках Петри в приготовленной среде для макрофагов (RPMI-1640 (Биолот, Россия), 10% сыворотка крови человека, 20 мкг/мл Гентамицин (Биолот, Россия)) в течение 2-х часов в инкубаторе при 37°С и 5% СО2 с последующей сменой среды. Дифференцировка моноцитов в макрофаги осуществлялась в течение четырех суток с ежедневной сменой среды в инкубаторе при 37°С и 5% CO2. Для дальнейших экспериментов на пятые сутки макрофаги были сняты с подложки чашки Петри при помощи стерильного одноразового шпателя и зафиксированы в 4%-м формальдегиде. Далее макрофаги человека инкубировали с МАТ ТШК 10 в количестве 2 мкг на 106 клеток. Окрашивали вторичными антителами anti-mouse-Alexa488 (17 с01220, Hansa BioMedLife Science, Эстония, 1нг/мл) 1 ч, 4°С и визуализировали на проточном цитометре CytoFlex (Beckman Coulter, США) при лазере 480 нм, накапливая 20000 событий.
На Фиг. 3 показаны данные проточной цитометрии при визуализации стабилин-1 МАТ ТШК 10 на поверхности макрофагов человека. Представленные на цитограммах интенсивности флюоресценции макрофагов человека, связавших тестируемые МАТ ТШК 10, более чем в 100 раз превышают интенсивность флюоресценции макрофагов человека, не специфически окрашенных только вторичными антителами (контроль). Таким образом, результаты приведенные на Фиг. 3, свидетельствуют о том, что тестируемые антитела ТШК 10 связываются на поверхности клеток первичной культуры макрофагов человека.
Пример 4. Анализ связывания антител ТШК 10 с антигеном стабилин-1 в клетках опухолевого узла в модели лабораторных животных
Для оценки биораспределения МАТ ТШК 10 к рецептору стабилин-1 в организме здоровых животных и животных с формировавшимся опухолевым узлом использовали самцов линии DBA/BALB. Исследование проводилось в соответствии с правилами проведения манипуляций с лабораторными животными и с соблюдением биоэтики. Соответствующие протоколы экспериментов были одобрены комитетом по биоэтике Отделения молекулярной и радиационной биофизики НИЦ «Курчатовский институт» -ПИЯФ. Мышам подкожно вводили 2×105 клеток рака кишечника мыши СТ-26 на мышь. Через 5 дней после прививки опухоли проводили внутривенное введение МАТ ТШК 10 (80 мкг/мышь). Флуоресцентный прижизненный имиджинг лабораторных мышей линии DBA/BALB через 48 часов после внутривенного введения мАТ ТШК10 к рецептору стабилин-1 (80 мкг/мышь), меченных флюорохромом Cyanine7 (Люмипроб РУС, Россия), проводили на системе доклинической визуализации люминесценции и флуоресценции LumoTrace FLUO (Abisense, Сириус, Россия). Результаты проведенного анализа, представленные на Фиг. 4, показывают, что тестируемые антитела ТШК 10 связываются и накапливаются в клетках опухолевого узла в модели рака кишечника СТ-26 in vivo.
Пример 5. Определение нуклеотидных последовательностей и анализ генов вариабельных областей легкой и тяжелой цепей мышиного моноклонального антитела ТШК 10
Рибонуклеиновую кислоту (РНК) из клеток клона ТШК 10 выделяли с помощью набора GeneJET RNA Purification kit (Thermo scientific, Lithuania) и затем на матрице данной РНК методом обратной транскрипции получали кДНК с помощью праймера oligo(dT)18 и обратной транскриптазы MMLV (ЗАО «Евроген», Росссия) по инструкции изготовителя. Далее с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПНР) с использованием известных наборов праймеров и высокоточной смеси ДНК- полимераз High Fidelity PCR Enzyme Mix (Thermo scientific, Lithuania) получали фрагменты ДНК, кодирующие вариабельные участки тяжелой и легкой цепей антитела. ПЦР-продукты вариабельных фрагментов легкой и тяжелой цепей иммуноглобулинов анализировали с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле. Полосы продуктов ожидаемого размера в районе 450 пар оснований вырезали из геля, элюировали с помощью набора реагентов для выделения ДНК из агарозного геля (ЗАО «Евроген», Россия). После этого полученные ПЦР-продукты анализировали секвенированием. Секвенирование проводили на капиллярном секвенаторе АВ3500 (Applied Biosystems, США) с помощью коммерческого набора BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США), очистку образцов перед анализом проводили с помощью набора BigDye® XTerminator™ Purification Kit (Applied Biosystems, США).
Найденные последовательности полученных фрагментов ДНК, кодирующих вариабельные области тяжелой и легкой цепей моноклонального антитела ТШК 10 представлены в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 соответственно.
Функциональный и структурный анализ вариабельных фрагментов легкой и тяжелой цепи исследуемого антитела, проведенный с помощью инструмента IMGT/V-QUEST и базы данных IMGT [www.imgt.org], показал расположение рамочных и образующих комплементарность участков (CDR-участков). Найденные последовательности CDR-участков представлены в SEQ ID NO: 3-5 и SEQ ID NO: 6-8 для тяжелой и легкой цепей соответственно.
Таким образом, заявляемые антитела против рецептора стабилин-1 человека, являются новыми моноклональными мышиными антителами МАТ ТШК 10 с полученной аминокислотной последовательностью, имеющими изотип IgG2a и обладающими при этом специфичностью и высокой аффинностью к стабилин-1 человека (Kd=2.23*10-12 М), а также связывающего нативный стабилин-1 на поверхности макрофагов человека. Вместе с тем, МАТ ТШК 10 эффективно накапливается в области опухолевого узла перевитых клеток рака кишечника мыши в экспериментах in vivo. Полученное МАТ ТШК 10 может быть использовано для получения химерных и гуманизированных антител и адресной доставки с их помощью тераностического радиофармацевтического препарата или цитотоксических веществ к опухоли.
Финансирование: работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, соглашение №075-15-2021-1360 от 12.10.2021.
Антитела против рецептора стабилин-1 (stabilin-1) человека
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра (НИЦ «Курчатовский институт» - ПИЯФ)
Petersburg Nuclear Physics Institute named by B.P. Konstantinov of National Research Centre «Kurchatov Institute)) (NRC «Kurchatov Institute)) - PNPI)
Перечень последовательностей антитела против рецептора стабилин-1 (stabilin-1) человека
Последовательность ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела к стабилину-1 - ТШК 10
Последовательность ДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи мышиного моноклонального антитела к стабилину-1 - ТШК 10
Последовательность аминокислот участка CDR-1 вариабельной области тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела к стабилину-1 - ТШК 10
Последовательность аминокислот участка CDR-2 вариабельной области тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела к стабилину-1 -ТШК 10
Последовательность аминокислот участка CDR-3 вариабельной области тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела к стабилину-1 -ТШК 10
Последовательность аминокислот участка CDR-1 вариабельной области легкой цепи мышиного моноклонального антитела к стабилину-1 - ТШК 10.
Последовательность аминокислот участка CDR-2 вариабельной области легкой цепи мышиного моноклонального антитела к стабилину-1 - ТШК 10
Последовательность аминокислот участка CDR-3 вариабельной области легкой цепи мышиного моноклонального антитела к стабилину-1 - ТШК 10
--->
Перечень последовательностей
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"
dtdVersion="V1_3" fileName="ТШК10.xml" softwareName="WIPO Sequence"
softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-04-19">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>2023135667/20(077963)</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2023-12-28</FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantNamelanguageCode="ru">Федеральное государственное
бюджетное учреждение «Петербургский институт ядерной физики им. Б. П.
Константинова Национального исследовательского центра «Курчатовский
институт»</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Petersburg Nuclear Physics Institute named by
B.P. Konstantinov of National Research Centre "Kurchatov
Institute" (NRC "KurchatovInstitute" -
PNPI)</ApplicantNameLatin>
<InventionTitlelanguageCode="ru">Антителапротиврецептора
cтабилин-1 (stabilin-1) человека</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>8</SequenceTotalQuantity>
<SequenceDatasequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>360</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..360</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Musmusculus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>caggtgcagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacaga
gcctgtccatcacatgcactgtctcagggttctcattaactagcgatggtgtaagctggtttcgccagcc
tccaggaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtgacgggagcacaaattatcattcagctctc
atatccagactgagcatcagcaaggataactccaagagccaagttttcttaaaactgaacagtctgcaaa
ctgatgacacagccacgtactactgtgccaaaccttattactacggtagtaggtggtacttcgatgtctg
gggcgcagggaccacggtcaccgtctcctca</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceDatasequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>321</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..321</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Musmusculus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gatatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggag
acagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagcaattatttaaactggtttcagcagaaacc
agatggaactgttaaactcctgatctactacacatcaagattacactcaggagtcccagcaaggttcagt
ggcagtgggtctggaacagattactctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttact
tttgccaacagggtaaaacgcttccgctcacgttcggagctgggaccaagctggggctgaaa</INSDSe
q_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceDatasequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Musmusculus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>GFSLTSDG</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceDatasequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>7</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..7</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Musmusculus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>IWGDGST</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceDatasequenceIDNumber="5">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>14</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..14</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q10">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Musmusculus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>AKPYYYGSRWYFDV</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceDatasequenceIDNumber="6">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>6</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..6</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q12">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Musmusculus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>QDISNY</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceDatasequenceIDNumber="7">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length/>
<INSDSeq_moltype/>
<INSDSeq_division/>
<INSDSeq_sequence>000</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceDatasequenceIDNumber="8">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>9</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..9</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q16">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Musmusculus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>QQGKTLPLT</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Claims (1)
- Моноклональное антитело, способное специфически связываться со стабилин-1 человека, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 1, вариабельный домен легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 2, гипервариабельные участки тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 3-5 и гипервариабельные участки легкой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 6-8.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2823309C1 true RU2823309C1 (ru) | 2024-07-22 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3445785A1 (en) * | 2016-04-18 | 2019-02-27 | Faron Pharmaceuticals OY | Humanized anti clever-1 antibodies and their use |
| US20230235046A1 (en) * | 2020-06-15 | 2023-07-27 | Faron Pharmaceuticals Oy | Stable anti-clever-1 antibody formulation |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3445785A1 (en) * | 2016-04-18 | 2019-02-27 | Faron Pharmaceuticals OY | Humanized anti clever-1 antibodies and their use |
| EP3445785B1 (en) * | 2016-04-18 | 2022-06-22 | Faron Pharmaceuticals OY | Humanized anti clever-1 antibodies and their use |
| US20230235046A1 (en) * | 2020-06-15 | 2023-07-27 | Faron Pharmaceuticals Oy | Stable anti-clever-1 antibody formulation |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Dunkel J., Viitala M., Karikoski M., Rantakari P., Virtakoivu R., Elima K., Hollmén M., Jalkanen S., Salmi M. Enhanced Antibody Production in Clever-1/Stabilin-1-Deficient Mice. Front Immunol. 2018 Oct 8;9:2257. doi: 10.3389/fimmu.2018.02257. PMID: 30349531; PMCID: PMC6187969. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TWI845767B (zh) | 抗人Claudin18.2抗體及其應用 | |
| CN109963591B (zh) | B7h3抗体-药物偶联物及其医药用途 | |
| JP6983371B2 (ja) | 抗ｐｄ−ｌ１抗体、その抗原結合フラグメントおよびその医療用途 | |
| CN108124445B (zh) | Ctla4抗体、其药物组合物及其用途 | |
| JP6336696B2 (ja) | がんおよび自己免疫疾患の診断および治療に使用するためのモノクローナル抗体 | |
| WO2019062832A1 (zh) | Tigit抗体、其抗原结合片段及医药用途 | |
| JP7257971B2 (ja) | 抗ｃｄ４０抗体、その抗原結合フラグメント、およびその医学的使用 | |
| CN114773473A (zh) | 抗cd39抗体及其制备方法和用途 | |
| TWI836070B (zh) | 抗trop-2抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途 | |
| JP2022542088A (ja) | 抗ｂｃｍａ抗体、その抗原結合断片、及びそれらの医療用途 | |
| JP2020532279A (ja) | 抗ｇｉｔｒ抗体、その抗原結合性断片、およびその医薬用途 | |
| RU2741802C2 (ru) | АНТИТЕЛО К Myl9 | |
| CN119060184B (zh) | 抗rage抗体及其应用 | |
| RU2823309C1 (ru) | Антитела против рецептора стабилин-1 (stabilin-1) человека | |
| CN118063612B (zh) | 抗ror1抗体或其抗原结合片段及其用途 | |
| Starnes et al. | Heterogeneity of a murine B cell lymphoma. Isolation and characterization of idiotypic variants. | |
| JPH0246297A (ja) | モノクローナル抗体、抗体産生ハイブリドーマおよび抗体の製造法 | |
| CN119285778A (zh) | 抗rage抗体及其应用 | |
| RU2838680C1 (ru) | Антитела против рецептора фактора роста эндотелия сосудов 1 (VEGFR1) человека | |
| RU2640259C2 (ru) | Антитело МАТ40, которое связывается с доменом I экстраклеточной части рецептора эпидермального фактора роста HER2/CD340, и его применение для лечения рака | |
| JPH04501061A (ja) | 抗イディオタイプ抗体による抗腫瘍応答の誘導 | |
| Apte et al. | Characteristics of a poly (LTyr, LGlu)‐poly (DLAla)–poly (LLys)‐specific helper factor derived from a T cell hybridoma | |
| JP2024511871A (ja) | 新規多重特異性抗体 | |
| CN117999284A (zh) | 靶向tigit的单克隆抗体 | |
| CN119371542B (zh) | 抗rage抗体及其应用 |