RU2821574C1 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок, состоящий из растворимого внеклеточного фрагмента человеческого PDGFRa и константной части тяжелой цепи человеческого IgG4 - Google Patents
Нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок, состоящий из растворимого внеклеточного фрагмента человеческого PDGFRa и константной части тяжелой цепи человеческого IgG4 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2821574C1 RU2821574C1 RU2023121697A RU2023121697A RU2821574C1 RU 2821574 C1 RU2821574 C1 RU 2821574C1 RU 2023121697 A RU2023121697 A RU 2023121697A RU 2023121697 A RU2023121697 A RU 2023121697A RU 2821574 C1 RU2821574 C1 RU 2821574C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- insdseq
- insdqualifier
- insdfeature
- human
- sequence
- Prior art date
Links
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 title claims abstract description 26
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 28
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title abstract description 27
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title description 11
- 101150038994 PDGFRA gene Proteins 0.000 title description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 20
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims abstract description 9
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 101001126417 Homo sapiens Platelet-derived growth factor receptor alpha Proteins 0.000 claims abstract 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 27
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 26
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 20
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 12
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims description 3
- 102000001393 Platelet-Derived Growth Factor alpha Receptor Human genes 0.000 claims description 3
- 108010068588 Platelet-Derived Growth Factor alpha Receptor Proteins 0.000 claims description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 abstract description 8
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 abstract description 8
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 abstract description 6
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 23
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 20
- 101000692455 Homo sapiens Platelet-derived growth factor receptor beta Proteins 0.000 description 19
- 102100026547 Platelet-derived growth factor receptor beta Human genes 0.000 description 19
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 14
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 12
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 12
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 12
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 9
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 9
- 229950008516 olaratumab Drugs 0.000 description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 5
- 229940121358 tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 description 5
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 4
- 208000021712 Soft tissue sarcoma Diseases 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 239000005483 tyrosine kinase inhibitor Substances 0.000 description 4
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 3
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 3
- 239000005517 L01XE01 - Imatinib Substances 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- 102100033810 RAC-alpha serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 229960002411 imatinib Drugs 0.000 description 3
- KTUFNOKKBVMGRW-UHFFFAOYSA-N imatinib Chemical compound C1CN(C)CCN1CC1=CC=C(C(=O)NC=2C=C(NC=3N=C(C=CN=3)C=3C=NC=CC=3)C(C)=CC=2)C=C1 KTUFNOKKBVMGRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 108010017992 platelet-derived growth factor C Proteins 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 3
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 102000007665 Extracellular Signal-Regulated MAP Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108010007457 Extracellular Signal-Regulated MAP Kinases Proteins 0.000 description 2
- 102100037121 GSK-3-binding protein FRAT2 Human genes 0.000 description 2
- 206010051066 Gastrointestinal stromal tumour Diseases 0.000 description 2
- 101001029171 Homo sapiens GSK-3-binding protein FRAT2 Proteins 0.000 description 2
- 102000015617 Janus Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108010024121 Janus Kinases Proteins 0.000 description 2
- 239000005536 L01XE08 - Nilotinib Substances 0.000 description 2
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 2
- 108091008606 PDGF receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000038030 PI3Ks Human genes 0.000 description 2
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 2
- 102000011653 Platelet-Derived Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 2
- 102100040681 Platelet-derived growth factor C Human genes 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108091008611 Protein Kinase B Proteins 0.000 description 2
- 229940124639 Selective inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 2
- 201000011243 gastrointestinal stromal tumor Diseases 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229960001346 nilotinib Drugs 0.000 description 2
- HHZIURLSWUIHRB-UHFFFAOYSA-N nilotinib Chemical compound C1=NC(C)=CN1C1=CC(NC(=O)C=2C=C(NC=3N=C(C=CN=3)C=3C=NC=CC=3)C(C)=CC=2)=CC(C(F)(F)F)=C1 HHZIURLSWUIHRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 108010017843 platelet-derived growth factor A Proteins 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- -1 small molecule compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 108010058566 130-nm albumin-bound paclitaxel Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 229940088872 Apoptosis inhibitor Drugs 0.000 description 1
- IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N Arg-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 108010081589 Becaplermin Proteins 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000005417 Crk Associated Substrate Protein Human genes 0.000 description 1
- 108010031504 Crk Associated Substrate Protein Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108091008102 DNA aptamers Proteins 0.000 description 1
- ZBNZXTGUTAYRHI-UHFFFAOYSA-N Dasatinib Chemical compound C=1C(N2CCN(CCO)CC2)=NC(C)=NC=1NC(S1)=NC=C1C(=O)NC1=C(C)C=CC=C1Cl ZBNZXTGUTAYRHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000916644 Homo sapiens Macrophage colony-stimulating factor 1 receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000932478 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein kinase FLT3 Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 239000002147 L01XE04 - Sunitinib Substances 0.000 description 1
- 239000002067 L01XE06 - Dasatinib Substances 0.000 description 1
- 239000002137 L01XE24 - Ponatinib Substances 0.000 description 1
- 208000018142 Leiomyosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 1
- 102100028198 Macrophage colony-stimulating factor 1 receptor Human genes 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 108090000744 Mitogen-Activated Protein Kinase Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000005650 Notch Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010070047 Notch Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108090000430 Phosphatidylinositol 3-kinases Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100030485 Platelet-derived growth factor receptor alpha Human genes 0.000 description 1
- 101710148465 Platelet-derived growth factor receptor alpha Proteins 0.000 description 1
- 102100037596 Platelet-derived growth factor subunit A Human genes 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108091008103 RNA aptamers Proteins 0.000 description 1
- 108090000873 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000004278 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 102100020718 Receptor-type tyrosine-protein kinase FLT3 Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 102000050257 X-Linked Inhibitor of Apoptosis Human genes 0.000 description 1
- 108700031544 X-Linked Inhibitor of Apoptosis Proteins 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 239000000158 apoptosis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 1
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 229960002448 dasatinib Drugs 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000000447 dimerizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N gemcitabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1C(F)(F)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N 0.000 description 1
- 229960005277 gemcitabine Drugs 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004024 hepatic stellate cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 230000009681 mesenchymal cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000006548 oncogenic transformation Effects 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 238000009522 phase III clinical trial Methods 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229960001131 ponatinib Drugs 0.000 description 1
- PHXJVRSECIGDHY-UHFFFAOYSA-N ponatinib Chemical compound C1CN(C)CCN1CC(C(=C1)C(F)(F)F)=CC=C1NC(=O)C1=CC=C(C)C(C#CC=2N3N=CC=CC3=NC=2)=C1 PHXJVRSECIGDHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000037390 scarring Effects 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 230000009919 sequestration Effects 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 229960001796 sunitinib Drugs 0.000 description 1
- WINHZLLDWRZWRT-ATVHPVEESA-N sunitinib Chemical compound CCN(CC)CCNC(=O)C1=C(C)NC(\C=C/2C3=CC(F)=CC=C3NC\2=O)=C1C WINHZLLDWRZWRT-ATVHPVEESA-N 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 108091008578 transmembrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000027257 transmembrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Abstract
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, а именно к рекомбинантным слитым белкам - антагонистам PDGFRα, состоящим из фрагмента растворимой внеклеточной части белка PDGFRα человека и Fc-фрагмента IgG4 человека, соединенных линкерной последовательностью RS. Также раскрыты нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные белки, векторы экспрессии, содержащие указанные нуклеиновые кислоты, и клетки, экспрессирующие данные слитые белки. Получаемые рекомбинантные белки эффективны для блокирования тирозинкиназной активности PDGFR-путей. 4 н. и 4 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится к области биомолекулярной фармакологии, биотехнологии и генетической инженерии и касается молекул нуклеиновых кислот и кодируемых ими новых растворимых белков - функциональных антагонистов PDFRα (Platelet-derived growth factor receptor А) человека, способных блокировать сигнальные пути PDGFR, а также способа их получения.
Уровень техники
Сигнальный путь PDGFR является важным путем RTK (receptor tyrosine kinase, рецепторы с тирозин-киназной активностью), который активируется в различных опухолях и регулирует рост и васкуляризацию опухолевой ткани (Cavalcanti, Ignazzi, De Michele, & Caruso, 2019). Белки PDGFR являются трансмембранными рецепторами, которые способны димеризоваться и фосфорилироваться после связывания с лигандом PDGF (Kashishian, Kazlauskas, & Cooper, 1992), тем самым активируя различные нижележащие сигнальные пути, такие как PI3K/AKT/PKB (путь фосфатидилинозитол-3-киназы /протеинкиназы В), МАРК/ ERK (митоген-активируемая протеинкиназа/ внеклеточная сигнал-регулируемая киназа, JAK (янус-киназа), STAT (сигнальный путь преобразователей и активаторов транскрипции) и путь Notch (Huang et al., 2021; Zou et al., 2022).
К семейству тирозинкиназных рецепоторов PDGFR относятся два родственных рецептора: PDGFRα и PDGFRβ. Лиганды PDGF, связывающиеся с этими рецепторами, обладают различной специфичностью: в зависимости от конкретной изоформы PDGF будут образовываться различные гомо- или гетеродимеры рецепторов PDFRα и PDGFRβ (Reigstad, Varhaug, & Lillehaug, 2005). Пять изоформ PDGF различным и частично перекрывающимся образом экспрессируются в тканях. PDGF секретируются эндотелиальными клетками, макрофагами и эпителиальными клетками и присутствуют в тромбоцитах, высвобождаясь при дегрануляции. PDGF-C имеет большее структурное сходство с VEGF, чем с PDGF-B (Reigstad et al., 2003), в то время как VEGF имеет приблизительно 25% сходство последовательности со всеми PDGF, и, как сообщалось, связывает PDFRα, но не может эффективно его активировать (Pennock, Kazlauskas, et al., 2012).
Ингибирование PDGFR подавляет пролиферацию, метастазирование, инвазию и ангиогенез рака, а также улучшает действие противоопухолевых препаратов (Balamurugan et al., 2021; Thies et al., 2021). Существует ряд новых терапевтических стратегий, основанных на ингибировании пути PDGFR для лечения рака (Sun, Yue, Xu, & Ни, 2022). Передача сигналов PDGF также связана с фиброзными заболеваниями, которые включают прогрессирующее рубцевание и потерю функции ткани из-за пролиферации мезенхимальных клеток и отложения внеклеточного матрикса. Фиброз печени может развиваться по типу обратимой реакции в случае заживления ран после травмы, однако, если он становится хроническим, это может привести к циррозу печени с неблагоприятным прогнозом. Путь PDGFR считается одним из ключевых в инициации фиброза различного генеза (Zhao et al., 2022). Фиброз печени включает активацию звездчатых клеток печени и портальных фибробластов (Friedman, 2008, Gressner and Weiskirchen, 2006), пролиферация и миграция которых зависят от PDGF-B и -D (Borkham-Kamphorst et al., 2007, Pinzani et al., 1989). Однако экспрессия трансгенов PDGF-A или одиночной связи С в печени мышей также вызывала фиброз, который для PDGF-C также приводил к развитию опухолей (Thieringer et al., 2008). Повышенная экспрессия PDGF и PDGFR наблюдалась как в экспериментальных моделях, так и при заболеваниях человека (Borkham-Kamphorst et al., 2008).
Существует три основных подхода к ингибированию пути PDGF/PDGFR: 1) секвестрация лиганда нейтрализующими антителами, растворимыми внеклеточными частями рецепторов, действующими как ловушки лиганда, или аптамерами ДНК/РНК, 2) нарушение взаимодействия между лигандом и рецептором путем блокирования рецептора рецептор-специфическими антителами или низкомолекулярными ингибиторами, 3) использование низкомолекулярных ингибиторов для блокирования киназной активности PDGFR. Ниже более подробно рассматриваюся эти три направления.
Разработка селективных терапвтических антител, секвестирующих PDGF, проблематична за счет того, что существует функциональная избыточность в активации PDGFR их лигандами. Кроме того, PDFRα и PDGFRβ составляют группу рецепторных тирозинкиназ класса III, близких по структуре и функциям к рецепторам клеточной поверхности Kit, FLT3 и CSF1R (Blume-Jensen and Hunter, 2001). Имеются также структурные сходства с тирозинкиназами класса IV и класса V, что еще более затрудняет разработку специфических низкомолекулярных ингибиторов, нацеленных именно на PDGFR путь.
Более перспективным путем разработки селектичных ингибиторов PDGFR являются PDGFR-блокирующие антитела. Оларатумаб (IMC-3G3, Lartruvo™) представляет собой рекомбинантное моноклональное антитело IgG1 человека против PDFRα, которое специфически связывается с PDFRα, блокируя связывание PDGF-AA, PDGF-BB и PDGF-CC и активацию рецептора без перекрестного взаимодействия с PDGFRβ (Loizos et al., 2005). Оларатумаб снижает пролиферацию некоторых моделей опухолей как in vitro, так и in vivo (Gerber et al., 2012, Loizos et al., 2005, Matei et al., 2006, Russell et al., 2010, Stock et al., 2007).
Основываясь на результатах исследования Ib/II фазы распространенной саркомы мягких тканей, где комбинированная терапия оларатумабом и доксорубицином показала значимое улучшение средней общей выживаемости на 11,8 месяцев по сравнению с монотерапией доксорубицином (Тар et al., 2016), оралатумаб получил первое глобальное одобрение для лечения саркомы мягких тканей в США в октябре 2016 г. (Shirley, 2017). В настоящее время он проходит подтверждающие международные клинические испытания фазы III для лечения саркомы мягких тканей (исследование ANNOUNCE: NCT02451943), а также получил условное одобрение для использования в ЕС (Европейское агентство по лекарственным средствам, 2016 г.) для лечения пациентов с запущенной саркомой мягких тканей, которые не поддаются радикальному лечению с помощью хирургического вмешательства или лучевой терапии. Однако, несмотря на многообещающие результаты доклинических исследований ксенотрансплантатов глиобластомы и лейомиосаркомы (Loizos et al., 2005), оралатумаб оказался неэффективным для лечения других солидных опухолей, таких как глиома, рак предстательной железы или рак яичников. Более того, два исследования фазы II оларатумаба были прекращены: исследование распространенного немелкоклеточного рака легкого (NCT00918203) и нерезектабельных и/или метастатических стромальных опухолей желудочно-кишечного тракта (GIST) (NCT01316263), в которых не наблюдалось явного влияния на выживаемость без прогрессирования у пациентов без мутаций PDFRα (Wagner et al., 2017). В июне 2017 г. было начато новое исследование фазы I/II, в ходе которого проверялось влияние оралатумаба в комбинации с наб-паклитакселом и гемцитабином у пациентов с метастатическим раком поджелудочной железы (NCT03086369).
Эффективным подходом к блокированию передачи сигналов PDGFR является использование низкомолекулярных соединений, которые могут проникать в клетки и блокировать его ферментативную активность. Большинство современных противоопухолевых препаратов для ингибирования киназной активности PDGFR основаны на многоцелевых малых молекулах, которые в совокупности называются ингибиторами тирозинкиназы (ИТК, TKI, tyrosine kinase inhibitors), среди которых иматиниб был первым, одобренным для клинического применения в 2001 году (Iqbal и Iqbal)., 2014). Эти препараты связываются с АТФ-связывающим карманом киназ, таким образом конкурируя с АТФ и останавливая активацию и передачу сигналов рецептором. Из-за консервативной структуры кармана АТФ ингибитор обычно подавляет киназы и за пределами предполагаемой мишени. Кроме того, неблагоприятный клеточный ответ на лечение ИТК, такой как активация ингибитора апоптоза XIAP иматинибом, активация FAKn р130 Cas AbI-независимым образом с помощью иматиниба и нилотиниба (Frolov et al., 2016), также будет формировать ответ на ИТК и может объяснить неспособность лекарств ингибировать онкогенную трансформацию. К другим препаратам этого класса относятся нилотиниб, дазатиниб, понатиниб, сунитиниб. Примечательно, что все ИТК имеют несколько мишеней, и не существует селективного ингибитора, блокирующего только PDGFR.
Fc-слитые белки хорошо зарекомендовали себя в качестве терапевтических и профилактических средств. Полученные с помощью этой технологии протеины имеют большой терапевтический потенциал, так как они связаны с Fc-доменом, который заметно удлиняет период полувыведения белков из плазмы крови, что продлевает терапевтическую активность, а также приводит к более медленному почечному клиренсу для молекул большего размера. В последнее время ведется активная разработка терапевтических средств на основе Fc-слитых белков (см. например, RU 2689522, 28.05.2019; WO 2023063842, 20.04.2023).
Целью изобретения является разработка эффективных антагонистов PDFRα на основе технологии Fc-слитых белков.
Сущность изобретения
Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала технических средств для лечения онкологических и фиброзных заболеваний. В частности, задача касается получения новых высокоэффективных полипептидных препаратов - антагонистов PDFRα, обладающих высокой аффинностью к лигандам рецептора PDFRα; также задача касается разработки нуклеотидных последовательностей, кодирующих такие полипептиды и являющихся экспрессионной основой для их получения.
Решение поставленной задачи осуществляется путем создания слитого белка PDFRα -hFc, являющегося антагонистом PDFRα, в структуру которого входит (а) фрагмент растворимой внеклеточной части белка PDFRα человека, представленный аминокислотами 24-528 SEQ ID NO: 1 и включающий пять иммуноглобулин-подобных повторов С2 типа, входящих в естественную последовательность PDFRα, а также (б) константная часть тяжелой цепи (Fc-фрагмент) IgG4 человека. Слитый PDFRα-hFc белок не содержит тирозинкиназного домена PDFRα, а также других внутриклеточных доменов PDFRα. При этом Fc-фрагмент IgG4 человека присоединен к фрагменту белка PDFRα с С-конца непосредственно или посредством линкерной последовательности. В некоторых вариантах осуществления изобретения Fc-фрагмент IgG4 человека соединен с фрагментом белка PDFRα безлинкерно. В некоторых других вариантах осуществления изобретения Fc-фрагмент IgG4 человека соединен с фрагментом белка PDFRα через линкерный пептид. В некоторых частных вариантах осуществления изобретения линкерный пептид представляет собой дипептид RS.
В некоторых вариантах осуществления изобретения слитый белок дополнительно включает сигнальную последовательность, локализованную на N-конце слитого белка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения слитый белок имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.
Поставленная задача также решается путем создания изолированной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей такой слитый белок.
В некоторых частных вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты имеет последовательность SEQ ID NO: 3.
Указанная задача также решается путем создания экспрессирующего вектора, несущего нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности изолированной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей такой слитый белок, под контролем регуляторных элементов, необходимых для экспрессии данной нукпеотидной последовательности в клетке-хозяине; а также путем создания клетки-хозяина, включающей экспрессирующий вектор, описанный в настоящей заявке, обеспечивающей эффективную продукцию такого слитого белка с использованием вышеуказанной молекулы нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах воплощения изобретения в качестве таких клеток выступают клетки млекопитающих (в некоторых частных вариантах воплощения изобретения - клетки яичников китайского хомячка (СНО)).
Решение поставленной задачи может достигаться при применении вышеуказанного слитого белка для лечения широкого спектра онкологических и фиброзных заболеваний человека, где требуется ингибирование тирозинкиназной активности PDFRα. Результатом изобретения является создание селективного ингибитора PDGFR, что достигается за счет использования экстраклеточной части PDFRα в составе PDFRα-hFc, которая является лигандом-ловушкой, направленной на снижение способности лигандов PDGF взаимодествовать с клеточным рецептором PDFRα и активировать передачу сигнала. Белок PDFRα-hFc может вводиться пациенту в терапевтически эффективном количестве предпочтительно в составе фармацевтической композиции. Исходя из состава молекулы, разработанные гибридные конструкции обладают только минимальной эффекторной функцией антитело-зависимой клеточной цитотоксичности и не обладают комплемент-зависимой цитотоксичностью, что снижает возможный риск воспалительных реакций и сенсибилизацию при использовании терапевтического агента на основе слитого (гибридного) белка PDFRα-hFc.
При осуществлении изобретения достигаются следующие технические результаты: - создан вариант терапевтического агента на основе слитого (гибридного) белка PDFRα-hFc, содержащего функциональные домены экстра клеточной части PDFRα, слитые с константной частью (Fc-доменом) иммуноглобулина человека IgG4, и способного блокировать тирозинкиназную активность PDGFR путей, а также разработаны нуклеотидные последовательности, кодирующие такие слитые белки и являющиеся экспрессионной основой для их получения.
Краткое описание рисунков
Фиг. 1. Схема экспрессирующего вектора, содержащего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3, кодирующую слитый белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.
Определения и термины
Следующие термины и определения применяются в данном документе, если иное не указано явно. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.
В документах данного изобретения термины «включает», «включающий» и т.п., а также «содержит», «содержащий» и т.п.интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего» (или «содержит, помимо всего прочего»). Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».
Термин «и/или» означает один, несколько или все перечисленные элементы.
Термин «необязательный» / «необязательно» (или «опциональный» / «опционально»), используемый в данном документе, означает, что описываемое впоследствии событие или обстоятельство может, но не обязательно, произойти, и что описание включает случаи, когда событие или обстоятельство происходит, и случаи, в которых оно не происходит.
Термины «полипептид», «белок» и «пептид» используют в настоящем документе взаимозаменяемо, и все они означают полимер из аминокислотных остатков. Эти термины также могут использоваться в настоящем описании взаимозаменяемо при обозначении конечного продукта, получаемого в результате экспрессии в клетке-хозяине последовательности нуклеиновой кислоты.
Под «слитым белком» («гибридным белком», «рекомбинантным белком», «слитым полипептидом», «рекомбинантным полипептидом», «гибридной конструкцией») понимают конструкцию из двух или более частей полипептидной природы, ковалентно связанных между собой, образующейся в результате экспрессии рекомбинантной молекулы ДНК, в которой соединены друг с другом в одной рамке считывания кодирующие участки, соответственно, двух или нескольких разных генов или их фрагментов.
Термины «PDFRα», «PDFRα» и «PDGFR-альфа» - взаимозаменяемы и относятся к рецептору тромбоцитарного фактора роста А (от англ. Platelet-derived growth factor receptor А).
Сокращение «ак» означает «аминокислоты».
Термин «изолированный» («выделенный») имеет свое общепринятое значение, известное среднему специалисту в данной области техники, и при использовании в отношении выделенной нуклеиновой кислоты или выделенного полипептида используется без ограничения для обозначения нуклеиновой кислоты или полипептида, которые, благодаря человеку, существуют отдельно от своего нативного окружения и поэтому не являются продуктом природы. Выделенная нуклеиновая кислота или полипептид могут существовать в очищенной форме или могут существовать в ненативном окружении, в таком как, например, клетка-хозяин.
Термин «синонимичная замена» относится к нукпеотидной последовательности, имеющей последовательность нуклеотидов, которая может отличаться от референсной последовательности нуклеиновой кислоты на одну или более замен, которые не ведут к изменению аминокислотной последовательности белка, кодируемой данной молекулой нуклеиновой кислоты. В связи с тем, что генетический код является «вырожденным», то есть различные по нукпеотидной последовательности триплеты могут кодировать одну и ту же аминокислоту, синонимичные замены в нукпеотидной последовательности не приводят к изменению аминокислотной последовательности белка.
Термин «лиганд-ловушка» (от англ. Decoy ligand, также трап) относится к гибридным белкам, состоящим из внеклеточного домена лиганда молекулы-мишени (рецептора) и Fc-домена иммуноглобулина. Внеклеточный домен лиганда отвечает за связывание мишени, а Fc-домен осуществляет димеризацию гибридного белка. Последнее необходимо для увеличения эффективности связывания и обеспечения большей стабильности высокомолекулярного комплекса. В рамках настоящего изобретения «лиганд-ловушка» состоит из определенных фрагментов растворимого внеклеточного фрагмента человеческого белка PDFRα-hFc и константной части тяжелой цепи IgG4 человека.
Термин «лечение» означает излечение, замедление, остановку, либо реверсию прогрессирования заболевания или нарушения. В настоящем документе «лечение» также означает смягчение симптомов, ассоциированных с заболеванием или нарушением.
Под «терапевтически эффективным количеством (терапевтической дозой)» подразумевается количество лекарственного средства, вводимого пациенту, при котором у него с наибольшей вероятностью проявится ожидаемый терапевтический эффект. Точное требуемое количество может меняться от субъекта к субъекту в зависимости от многочисленных факторов, таких как тяжесть заболевания, возраст, масса тела, общее состояние организма, комбинированное лечение с другими препаратами и др. Введение лекарственного средства по изобретению субъекту, нуждающемуся в лечении и/или профилактике заболевания или состояния, осуществляется в дозе, достаточной для достижения терапевтического эффекта. При проведении лечения и/или профилактики введение может осуществляться как разово, так и несколько раз в день, чаще в виде курсового введения на протяжении времени, достаточного для достижения терапевтического эффекта (от нескольких дней до недели, нескольких недель и до месяцев), при этом курсы введения лекарственного средства могут проводиться повторно. В частности, при среднетяжелых формах заболевания разовая доза, кратность и/или длительность введения лекарственного средства по изобретению могут быть увеличены. Предпочтительно слитый белок по изобретению вводят пациенту в составе фармацевтической композиции, включающей, помимо активного компонента, фармацевтически приемлемые носители и/или наполнители.
Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.
Подробное описание изобретения
В настоящем изобретении предлагаются конструкции ДНК, кодирующие слитые белки (рекомбинантные полипептиды) - антагонисты PDFRα, блокирующие сигнальный путь PDFRα.
В частности, изобретение относится к нуклеотидным конструкциям, кодирующим полипептиды, содержащие экстраклеточную часть PDFRα (включающую пять иммуноглобулин-подобных повторов С2 типа), слитую с константной частью (Fc-доменом) иммуноглобулина человека IgG4, PDFRα-hFc.
Естественная последовательность белка PDFRα человека состоит из 1089 аминокислот (ак) (SEQ ID NO: 1). В состав нативного белка входит сигнальный пептид (1-23 ак SEQ ID N0:1), пять иммуноглобулин-подобных повторов С2 типа (24-113, 117-201, 202-306, 319-410, 414-517 ак), трансмембранный домен (529-549 ак), тирозинкиназный домен (593-954 ак). В составе белка выделяется экстраклеточная (внеклеточная) часть (24-528 ак SEQ ID NO: 1) и цитоплазматическая часть (550-1089 ак SEQ ID NO: 1).
В рамках настоящего изобретения в процессе разработки новых полипептидных препаратов - ингибиторов тирозинкиназной активности PDFRα было осуществлено клонирование последовательности, соответствующей экстраклеточному домену PDFRα и содержащей пять иммуноглобулин-подобных повторов С2 типа и ее слияние в одной рамке считывания с последовательностью, кодирующей константную часть тяжелой цепи IgG4 человека как непосредственно (т.е. безлинкерно), так и посредством линкерной последовательности. Слитый белок PDFRα-hFc по изобретению также может необязательно содержать сигнальную последовательность, которая может включать любую последовательность, известную квалифицированному специалисту в области управления секрецией полипептида или белка из клетки, и включать природные или синтетические последовательности. Обычно сигнальная последовательность размещается на N-конце слитого белка по настоящему изобретению.
Слитый белок (рекомбинантный полипептид), являющийся объектом настоящего изобретения, может быть получен следующим образом.
Растворимые рекомбинантные полипептиды-антагонисты PDFRα производят в результате экспрессии кодирующих их нуклеотидных последовательностей в эукариотических клеточных линиях, с последующей очисткой синтезированных рекомбинантных белков при помощи аффинной, ионобменной или гидрофобной хроматографии, применяемых по отдельности или в различных сочетаниях друг с другом, а также при помощи иных способов очистки белков. Соответствующие нуклеотидные последовательности получают при помощи комбинирования участков ДНК, кодирующих выбранные домены PDFRα, с последовательностью ДНК, кодирующей Fc-фрагмент IgG4 человека. В некоторых частных вариантах изобретения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие такие полипептиды-антагонисты PDFRα, имеют нуклеотидную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 3.
Также указанная задача решается путем создания экспрессирующего вектора, содержащего данную молекулу нуклеиновой кислоты под контролем регуляторных элементов, необходимых для экспрессии данной нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. В предпочтительных вариантах изобретения в качестве клетки-хозяина, включающей такой экспрессирующий вектор, могут выступать клетки яичников китайского хомячка СНО (например, клеточные линии СНО-К1 или СНО DG44), адаптированные для производства терапевтических белков. В настоящем изобретении экспрессирующий вектор предпочтительно подбирается для экспрессии гетерологичных последовательностей в клетках млекопитающих, но в некоторых вариантах изобретения экспрессирующий вектор может быть выбран для экспрессии в других системах, таких как, например, клетки насекомых, дрожжевые или бактериальные клетки. Соответственно, каждый экспрессирующий вектор имеет свой набор регуляторных элементов, позволяющих проводить экспрессию гетерологичной последовательности (продукта) в клетке-хозяине, таких как промоторы и/или энхансеры, последовательности Козак, polyA последовательности и другие регуляторные последовательности. А также может иметь последовательности, кодирующие лидерные (сигнальные) пептиды, обеспечивающие секрецию рекомбинантных полипептидов во внеклеточную среду. Терминация синтеза белка с заданной изолированной последовательности нуклеиновой кислоты определяется добавлением к ней с 3'-конца в одной рамке считывания одного или нескольких стоп-кодонов.
После трансфекции вектора в клетки эукариотической клеточной линии происходит синтез рекомбинантного полипептида и его секреция в культуральную бессывороточную среду. Полученный рекомбинантный полипептид очищают из среды при помощи, как правило, аффинной хроматографии на белок протеин-А или белок протеин-G, однако могут использоваться и другие методы очистки белков.
Нижеследующие примеры приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.
Пример 1. Конструирование плазмид
Для конструирования плазмид с заявляемыми нуклеотидными последовательностями была использована последовательность, кодирующая белок человека DII4, полученная из плазмиды RG211740 (OriGene, PDFRα, Human Tagged ORF clone). Фрагмент PDFRα был выбран на основе биоинформатического анализа последовательности и соответствующая кодирующая его нуклеотидная последовательность была использована для последующего клонирования. Для клонирования участка, соответствующему аминокислотам 24-528 SEQ ID NO: 1, (с целью получения в дальнейшем SEQ ID NO: 2) были подобраны следующие праймеры:
PDGFRA_S: p-CCAGCTTTCATTACCCTCTATCCTT (SEQ ID NO: 4)
PDGFRA_R: TAAGATCTAGCCACCGTGAGTTCAGAACGCA (SEQ ID NO: 5)
Проведена ПЦР со следующими условиями: 98°С 1 мин, 30 циклов (98°С 10 сек, 63°С 10 сек, 72°С 2 мин), 72°С 5 мин. Компоненты реакции: полимераза - Phusion (Thermo), буфер, содержащий Mg2+ для Phusion-полимеразы (Thermo), по 10 пкмоль каждого из праймеров и 0,25 мМ смеси трифосфатов нуклеотидов (Thermo). Амплификацию осуществляли с последовательности RG211740 (Origene). После ПЦР: ПЦР продукт очищали набором для очистки ПЦР продуктов GeneJet PCR purification kit (Fermentas). Концентрация и соответствие предсказанному молекулярному весу проверяли при помощи гель-электрофореза в 1% агарозе (ТАЕ буфер). Полученные ПЦР продукты были использованы для дальнейшего конструирования.
Для клонирования целевых последовательностей использовался вектор pFUSE-hIgG4e-Fc2 (InvivoGen), который позволяет получить слитые с Fc-доменом IgG4 последовательности и проводить исследование их свойств. В один из праймеров был включен сайт рестрикции Bglll (PDGFRA_R), что после амплификации и рестрикции позволило пулучить фрагмент ДНК с одним липким (Bglll) сайтом и одним тупым. Вектор обрабатывали рестриктазами EcoRV и Bglll (Thermo), а ПЦР-продукт обрабатывали рестриктазой Bglll (Thermo) в течение 1 часа при 37°С, затем очищали с помощью GeneJet PCR purification kit (Fermentas) и лигировали, используя 1 Ед (ME) лигазы (Thermo) по протоколу производителя. Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Е, coli XL1-Blue и высевали на среду LB, содержащую зеоцин.
Чашки инкубировали в термостате в течение ночи при 37°С. На следующий день проверяли по 20 колоний из каждой лигазной смеси на присутствие нужной вставки, для этого часть колонии разводили в 20 мкл воды и кипятили в течение 5 минут. После охлаждения смесь откручивали и использовали 1 мкл в качестве матрицы в реакции ПЦР. ПЦР осуществляли при помощи Taq ДНК-полимеразы (Fermentas) и праймеров PROMF2 и FRAT2. Присутствие вставки проверяли после электрофореза ПЦР продуктов. Из двух колоний, содержащих вставку, выделяли плазмидную ДНК, верифицировали длины рестрикционных фрагментов при помощи рестрикции с эндонуклеазами EcoRI и HindiII и секвенировали с использованием праймеров PROMF2 и FC на секвенаторе Applied Biosystems 3500 по инструкции производителя, используя праймеры PROMF2 (прямой) и FC (обратный).
PROMF2: GCCTGACCCTGCTTGCTCAACT (SEQ ID NO: 6)
FRAT2: CGAGGCACTGCTCACTTCCAAGA (SEQ ID NO: 7)
FC: CTCACGTCCACCACCACGCA (SEQ ID NO: 8)
Сконструированная в результате плазмида, содержащая целевые нуклеотидные последовательности, показана на Фиг. 1.
Таким образом, в результате проведенных исследований разработана нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок PDFRα-hFc и являющиеся экспрессионной основой для его получения, а также получен слитый белок PDFRα-hFc, содержащий функциональные домены экстра клеточной части PDFRα, слитые с константной частью (Fc-доменом) иммуноглобулина человека IgG4, способный эффективно блокировать тирозинкиназную активность PDGFR путей, который может быть использован в терапии онкологических и фиброзных заболеваний.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.
--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="PDGFRa.xml"
softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"
productionDate="2023-08-09">
<ApplicantFileReference>496234</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">Общество с ограниченной
ответственностью "Пальмира Биофарма" </ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>"PALMIRA BIOPHARMA" Limited Liability
Company</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">НУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ,
КОДИРУЮЩАЯ СЛИТЫЙ БЕЛОК, СОСТОЯЩИЙ ИЗ РАСТВОРИМОГО ВНЕКЛЕТОЧНОГО
ФРАГМЕНТА ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО PDGFRa И КОНСТАНТНОЙ ЧАСТИ ТЯЖЕЛОЙ ЦЕПИ
ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО IgG4</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>8</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>1089</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1089</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MGTSHPAFLVLGCLLTGLSLILCQLSLPSILPNENEKVVQLNSSFSLRC
FGESEVSWQYPMSEEESSDVEIRNEENNSGLFVTVLEVSSASAAHTGLYTCYYNHTQTEENELEGRHIYI
YVPDPDVAFVPLGMTDYLVIVEDDDSAIIPCRTTDPETPVTLHNSEGVVPASYDSRQGFNGTFTVGPYIC
EATVKGKKFQTIPFNVYALKATSELDLEMEALKTVYKSGETIVVTCAVFNNEVVDLQWTYPGEVKGKGIT
MLEEIKVPSIKLVYTLTVPEATVKDSGDYECAARQATREVKEMKKVTISVHEKGFIEIKPTFSQLEAVNL
HEVKHFVVEVRAYPPPRISWLKNNLTLIENLTEITTDVEKIQEIRYRSKLKLIRAKEEDSGHYTIVAQNE
DAVKSYTFELLTQVPSSILDLVDDHHGSTGGQTVRCTAEGTPLPDIEWMICKDIKKCNNETSWTILANNV
SNIITEIHSRDRSTVEGRVTFAKVEETIAVRCLAKNLLGAENRELKLVAPTLRSELTVAAAVLVLLVIVI
ISLIVLVVIWKQKPRYEIRWRVIESISPDGHEYIYVDPMQLPYDSRWEFPRDGLVLGRVLGSGAFGKVVE
GTAYGLSRSQPVMKVAVKMLKPTARSSEKQALMSELKIMTHLGPHLNIVNLLGACTKSGPIYIITEYCFY
GDLVNYLHKNRDSFLSHHPEKPKKELDIFGLNPADESTRSYVILSFENNGDYMDMKQADTTQYVPMLERK
EVSKYSDIQRSLYDRPASYKKKSMLDSEVKNLLSDDNSEGLTLLDLLSFTYQVARGMEFLASKNCVHRDL
AARNVLLAQGKIVKICDFGLARDIMHDSNYVSKGSTFLPVKWMAPESIFDNLYTTLSDVWSYGILLWEIF
SLGGTPYPGMMVDSTFYNKIKSGYRMAKPDHATSEVYEIMVKCWNSEPEKRPSFYHLSEIVENLLPGQYK
KSYEKIHLDFLKSDHPAVARMRVDSDNAYIGVTYKNEEDKLKDWEGGLDEQRLSADSGYIIPLPDIDPVP
EEEDLGKRNRHSSQTSEESAIETGSSSSTFIKREDETIEDIDMMDDIGIDSSDLVEDSFL</INSDSeq_
sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>754</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..754</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MYRMQLLSCIALSLALVTNSIQLSLPSILPNENEKVVQLNSSFSLRCFG
ESEVSWQYPMSEEESSDVEIRNEENNSGLFVTVLEVSSASAAHTGLYTCYYNHTQTEENELEGRHIYIYV
PDPDVAFVPLGMTDYLVIVEDDDSAIIPCRTTDPETPVTLHNSEGVVPASYDSRQGFNGTFTVGPYICEA
TVKGKKFQTIPFNVYALKATSELDLEMEALKTVYKSGETIVVTCAVFNNEVVDLQWTYPGEVKGKGITML
EEIKVPSIKLVYTLTVPEATVKDSGDYECAARQATREVKEMKKVTISVHEKGFIEIKPTFSQLEAVNLHE
VKHFVVEVRAYPPPRISWLKNNLTLIENLTEITTDVEKIQEIRYRSKLKLIRAKEEDSGHYTIVAQNEDA
VKSYTFELLTQVPSSILDLVDDHHGSTGGQTVRCTAEGTPLPDIEWMICKDIKKCNNETSWTILANNVSN
IITEIHSRDRSTVEGRVTFAKVEETIAVRCLAKNLLGAENRELKLVAPTLRSELTVARSYGPPCPPCPAP
EFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGF
YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS
LSPGK</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>2262</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..2262</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttg
tcacgaattcgatccagctttcattaccctctatccttccaaatgaaaatgaaaaggttgtgcagctgaa
ttcatccttttctctgagatgctttggggagagtgaagtgagctggcagtaccccatgtctgaagaagag
agctccgatgtggaaatcagaaatgaagaaaacaacagcggcctttttgtgacggtcttggaagtgagca
gtgcctcggcggcccacacagggttgtacacttgctattacaaccacactcagacagaagagaatgagct
tgaaggcaggcacatttacatctatgtgccagacccagatgtagcctttgtacctctaggaatgacggat
tatttagtcatcgtggaggatgatgattctgccattataccttgtcgcacaactgatcccgagactcctg
taaccttacacaacagtgagggggtggtacctgcctcctacgacagcagacagggctttaatgggacctt
cactgtagggccctatatctgtgaggccaccgtcaaaggaaagaagttccagaccatcccatttaatgtt
tatgctttaaaagcaacatcagagctggatctagaaatggaagctcttaaaaccgtgtataagtcagggg
aaacgattgtggtcacctgtgctgtttttaacaatgaggtggttgaccttcaatggacttaccctggaga
agtgaaaggcaaaggcatcacaatgctggaagaaatcaaagtcccatccatcaaattggtgtacactttg
acggtccccgaggccacggtgaaagacagtggagattacgaatgtgctgcccgccaggctaccagggagg
tcaaagaaatgaagaaagtcactatttctgtccatgagaaaggtttcattgaaatcaaacccaccttcag
ccagttggaagctgtcaacctgcatgaagtcaaacattttgttgtagaggtgcgggcctacccacctccc
aggatatcctggctgaaaaacaatctgactctgattgaaaatctcactgagatcaccactgatgtggaaa
agattcaggaaataaggtatcgaagcaaattaaagctgatccgtgctaaggaagaagacagtggccatta
tactattgtagctcaaaatgaagatgctgtgaagagctatacttttgaactgttaactcaagttccttca
tccattctggacttggtcgatgatcaccatggctcaactgggggacagacggtgaggtgcacagctgaag
gcacgccgcttcctgatattgagtggatgatatgcaaagatattaagaaatgtaataatgaaacttcctg
gactattttggccaacaatgtctcaaacatcatcacggagatccactcccgagacaggagtaccgtggag
ggccgtgtgactttcgccaaagtggaggagaccatcgccgtgcgatgcctggctaagaatctccttggag
ctgagaaccgagagctgaagctggtggctcccaccctgcgttctgaactcacggtggctagatcttatgg
tcccccatgcccaccatgcccagcacctgagttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaa
cccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaag
accccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcggga
ggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggc
aaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagcca
aagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggt
cagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcag
ccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggc
taaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgca
caaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ccagctttcattaccctctatcctt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>31</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..31</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q10">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>taagatctagccaccgtgagttcagaacgca</INSDSeq_sequence
>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q12">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gcctgaccctgcttgctcaact</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="7">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q14">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cgaggcactgctcacttccaaga</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="8">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q16">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ctcacgtccaccaccacgca</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Claims (8)
1. Слитый белок - антагонист PDGFRα, состоящий из фрагмента растворимой внеклеточной части белка PDGFRα человека, представленного аминокислотной последовательностью, соответствующей положениям 24-528 последовательности SEQ ID NO: 1, и Fc-фрагмента IgG4 человека, присоединенного к фрагменту белка PDGFRα с С-конца посредством линкерной последовательности RS.
2. Слитый белок по п. 1, дополнительно включающий сигнальную последовательность, локализованную на N-конце слитого белка.
3. Слитый белок по п. 1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.
4. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок по любому из пп. 1-3.
5. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты по п. 4, имеющая последовательность SEQ ID NO: 3.
6. Экспрессирующий вектор, имеющий в своем составе последовательность нуклеиновой кислоты по любому из пп. 4, 5 под контролем регуляторных элементов, необходимых для ее экспрессии в клетке-хозяине.
7. Клетка, способная экспрессировать слитый белок по любому из пп. 1-3, не являющаяся эмбриональной клеткой человека и трансфецированная экспрессирующим вектором по п. 6.
8. Клетка по п. 7, представляющая собой клетку яичников китайского хомячка (СНО).
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2821574C1 true RU2821574C1 (ru) | 2024-06-25 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007124308A2 (en) * | 2006-04-17 | 2007-11-01 | Ludwig Institute For Cancer Research | Methods and compositions for modulation of blood-neural barrier |
| WO2014160507A1 (en) * | 2013-03-13 | 2014-10-02 | Genzyme Corporation | Fusion proteins comprising pdgf and vegf binding portions and methods of using thereof |
| WO2015200905A2 (en) * | 2014-06-28 | 2015-12-30 | Oligasis, Llc | Dual pdgf/vegf antagonists |
| WO2016005381A1 (en) * | 2014-07-10 | 2016-01-14 | Bayer Pharma Aktiengesellschaft | Pdgfrbeta-fc fusion proteins and uses thereof |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007124308A2 (en) * | 2006-04-17 | 2007-11-01 | Ludwig Institute For Cancer Research | Methods and compositions for modulation of blood-neural barrier |
| WO2014160507A1 (en) * | 2013-03-13 | 2014-10-02 | Genzyme Corporation | Fusion proteins comprising pdgf and vegf binding portions and methods of using thereof |
| WO2015200905A2 (en) * | 2014-06-28 | 2015-12-30 | Oligasis, Llc | Dual pdgf/vegf antagonists |
| WO2016005381A1 (en) * | 2014-07-10 | 2016-01-14 | Bayer Pharma Aktiengesellschaft | Pdgfrbeta-fc fusion proteins and uses thereof |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ЗЕЙФМАН А.А. и др., Роль селективности ингибиторов тирозинкиназ в развитии побочных эффектов при терапии хронического миелолейкоза, Клиническая онкогематология, 2014, т. 7, номер 1, стр. 16-27. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5480488B2 (ja) | 血管内皮増殖因子の可溶性インヒビターおよびその使用 | |
| DK2970512T3 (en) | IMMUNO MODULATOR FUSION PROTEINS AND PROCEDURES FOR PRODUCING THEREOF | |
| US8926972B2 (en) | Anti-angiogenesis fusion proteins | |
| JP5567271B2 (ja) | Ｖｅｇｆ類縁体および使用方法 | |
| JP5858442B2 (ja) | Ｒｏｂｏ１−Ｆｃ融合タンパク質および腫瘍を治療するためのこの使用 | |
| CA2768360A1 (en) | Polypeptides selective for .alpha.v.beta.3 integrin conjugated with a variant of human serum albumin (hsa) and pharmaceutical uses thereof | |
| KR20190019220A (ko) | 항-전이성 요법에서 ａｘｌ 신호전달의 저해 | |
| CZ302303B6 (cs) | Homodimerní fúzní protein vykazující inhibicní aktivitu na angiogenezi, zpusob jeho produkce, molekula DNA a replikovatelný expresní vektor | |
| EP1038011B1 (en) | Methods of producing anti-angiogenic proteins; endostatin, angiostatin or restin, using a pichia yeast expression system | |
| JP2001505407A (ja) | 腫瘍壊死因子関連リガンド | |
| JP2022517920A (ja) | 血管内皮細胞の増殖をブロックし、ｔ細胞を活性化する多標的融合タンパク質、およびそれを含有する医薬組成物 | |
| WO2015172305A1 (zh) | 抑制taci-baff复合物形成的融合蛋白及其制法和用途 | |
| RU2821574C1 (ru) | Нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок, состоящий из растворимого внеклеточного фрагмента человеческого PDGFRa и константной части тяжелой цепи человеческого IgG4 | |
| JP5819439B2 (ja) | 修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片及びその製造方法 | |
| US6797488B1 (en) | Methods of producing anti-angiogenic proteins | |
| CA2768990C (en) | Broad spectrum erbb ligand binding molecules and methods for preparing and using them | |
| JP2003516110A (ja) | Ｃｏｍｐ／ｔｓｐ−１、ｃｏｍｐ／ｔｓｐ−２および他のｔｓｐキメラタンパク質 | |
| JP2003507337A (ja) | チロシンキナーゼｒａｆおよびｒａｓを用いて脈管形成を調節するために有用な方法および組成物 | |
| US20170166624A1 (en) | TGFß TYPE II-TYPE III RECEPTOR FUSIONS | |
| CA2377489A1 (en) | Chimeric proteins mediating targeted apoptosis | |
| JP2018510861A (ja) | インテグリン標的タンパク質およびその使用方法 | |
| JP2003528609A (ja) | バスコスタチンおよび他のニドゲンドメインの抗血管形成特性および抗腫瘍特性 | |
| JP2016036322A (ja) | 血管新生因子と結合するキメラタンパク質 |