JP2022517920A - 血管内皮細胞の増殖をブロックし、ｔ細胞を活性化する多標的融合タンパク質、およびそれを含有する医薬組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、血管内皮増殖阻害剤ドメイン（ｉ）、免疫グロブリンＦｃドメイン（ｉｉ）、およびＣＤ８０細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ｉｉｉ）を含む、血管内皮細胞の増殖をブロックし、Ｔ細胞を活性化する多標的融合タンパク質を提供している。本発明は、前記多標的融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記ポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞、、及び前記多標的融合タンパク質と抗ＰＤ－１抗体とを含む医薬組成物をさらに提供している。本発明の前記多標的融合タンパク質および医薬組成物は、個体における癌性疾患を治療または予防することができる。【選択図】図４

Description

本発明は、概略的に、医薬バイオテクノロジーの分野に関する。具体的には、本発明は、血管内皮増殖阻害剤ドメイン（ｉ）、免疫グロブリンＦｃドメイン（ｉｉ）、およびＣＤ８０細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ｉｉｉ）を含む、多標的融合タンパク質、前記多標的融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記ポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞、ならびに前記多標的融合タンパク質と抗ＰＤ－１抗体とを含む医薬組成物に関する。本発明の前記多標的融合タンパク質および医薬組成物は、個体における癌性疾患を治療または予防することができる。

腫瘍微小環境は、腫瘍細胞が生存および進行する複雑な環境であり、細胞成分および非細胞成分からなり、細胞成分には、腫瘍細胞自体、免疫細胞、内皮細胞などが含まれ、非細胞成分には、サイトカイン、ケモカインなどが含まれる。腫瘍に対する研究に伴い、腫瘍の微小環境によって腫瘍の生成、成長、転移が制御されることが認識されている。腫瘍微小環境は、腫瘍細胞が優性に増殖するかどうかを決定する。

腫瘍微小環境では、Ｔリンパ球活性の阻害は、一般的には存在し、その結果、Ｔリンパ球が腫瘍に対する殺滅効果を効果的に発揮できないことをもたらし（Ｙａｏ Ｓ，Ｚｈｕ Ｙ及びＣｈｅｎ Ｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ，２０１３，１２（２）：１３０－１４６）、例えば、腫瘍細胞は、正常なヒト組織では発現しないＰＤ－Ｌ１を発現することによって、免疫チェックポイントの阻害性信号通路（すなわち、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害性信号通路）を利用してＴリンパ球活性を阻害する。

Ｔリンパ球活性化の阻害は、ＰＤ－１がそのリガンドＰＤ－Ｌ１と結合した後にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）／主要組織適合複合体（ＭＨＣ）を阻害することによって達成されると以前は考えられていたが、最近のＨｕｉらの研究は、ＰＤ－１およびＣＤ２８がＴリンパ球膜に共局在化され、ＰＤ－１によって媒介される免疫抑制作用標的がＴＣＲよりも主にＣＤ２８であり、具体的に言えば、ＰＤ－１がＰＤ－Ｌ１と結合した後にＳｈｐ２ホスホリパーゼが急速にリクルートされ、Ｓｈｐ２ホスホリパーゼがＴＣＲの脱リン酸化よりも強くＣＤ２８を優先的に脱リン酸化し、それによってＣＤ２８信号伝達を不活性化することによってＴ細胞機能を阻害することを示した（ＨｕｉＥ．ら、Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＤ２８ ｉｓ ａ ｐｒｉｍａｒｙ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ＰＤ－１－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１７，３５５（６３３２）：１４２８－１４３３）。

ＫａｍｐｈｏｒｓｔＡＯらは、ＣＤ２８共刺激信号の活性化がＴ細胞の「再活性化」の重要な条件の１つであることを実証した（Ｋａｍｐｈｏｒｓｔ ＡＯら、Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｅｘｈａｕｓｔｅｄ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＰＤ－１－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｉｓ ＣＤ２８－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１７，３５５（６３３２）：１４２３－１４２７）。ＣＤ２８／Ｂ７（すなわち、Ｔリンパ球表面の共刺激分子ＣＤ２８とＣＤ８６（Ｂ７－２とも呼ぶ）またはＣＤ８０（Ｂ７－１とも呼ぶ）に結合する）共刺激経路の活性化は、担癌マウスおよび慢性ウイルス感染中の抗ＰＤ－１抗体の治療効果にとって重要であり、抗Ｂ７抗体でＢ７分子のＣＤ２８への結合をブロックする場合、腫瘍に対する抗ＰＤ－１抗体の阻害効果は著しく低下する。別の研究は、可溶性ＣＤ８０がマウス腫瘍系においてインビボ治療効果を有することを示している（Ｈｏｒｎ ＬＡら、Ｓｏｌｕｂｌｅ ＣＤ８０ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌａｙｓ Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｔｕｍｏｒ－Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．２０１８；６（１）：５９－６８）。ＣＤ８０及びＣＤ８６は、腫瘍微小環境において低発現又は非発現であり、これも腫瘍免疫回避をもたらす重要なメカニズムの１つである。

また、Ｔ細胞表面に発現しているＣＴＬＡ－４とＴ細胞表面の共刺激分子ＣＤ２８とは、高度の相同性を有しており、同じリガンドＣＤ８６（Ｂ７－２）またはＣＤ８０（Ｂ７－１）を保有している。ＣＴＬＡ－４のＢ７分子への結合は、通常、Ｔ細胞の活性化を阻害するので、免疫チェックポイントＢ７／ＣＴＬＡ－４経路のブロックは、腫瘍特異的Ｔ細胞活性化作用を増強することができる。

一方、腫瘍微小環境において、腫瘍細胞はまた、血管内皮増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ））などの血管新生促進因子の放出によってＶＥＧＦの数の激増をもたらし、ＶＥＧＦはその細胞表面受容体ＶＥＧＦＲとの結合により血管内皮細胞の分裂増殖及び転移を媒介し、血管透過性を増加させ、腫瘍アポトーシスを阻害し、腫瘍の成長及び転移のための良好な微小環境を提供する。

現在、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害性信号通路のブロック、Ｂ７／ＣＴＬＡ－４通路のブロック、又はＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ通路のブロックのための単一標的腫瘍治療薬は販売承認され、それぞれは、例えば、抗ＰＤ－１抗体薬、例えば、ブリストル・マイヤーズ スクイブ社のニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）及びメルク社のペンブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ブリストル・マイヤーズ スクイブ社の抗ＣＴＬＡ－４抗体イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ、商品名Ｙｅｒｖｏｙ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社のヒトネズミキメラ抗ＶＥＧＦ抗体ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ、商品名Ａｖａｓｔｉｎ）、Ｓａｎｏｆｉ－ａｖｅｎｔｉｓ社やＲｅｇｅｎｅｒｏｎ社が開発したＶＥＧＦ－Ｔｒａｐであるａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔなどが挙げられる。しかしながら、腫瘍患者のかなりの部分は、単一標的腫瘍治療に非応答性であるか、又は耐性を示し、例えば、現在の抗ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１抗体薬物の平均的な治療有効率はわずか２０％程度であり、肺癌の５年生存率はわずか１６％である。したがって、多くの場合、単一標的腫瘍治療に対する患者の無応答性又は薬剤耐性の問題を回避するために、多標的療法を採用することが望ましい。

多標的融合タンパク質は、腫瘍の発生及び進行に関与する様々な信号伝達通路を同時に特異的に標的化することができるため、血管内皮細胞の増殖をブロックし、Ｔ細胞を活性化することによって腫瘍微小環境を改善することができる多標的融合タンパク質を開発し、及び多標的融合タンパク質を他の抗癌剤と併用する必要がある。

本発明者らは、鋭意研究により、血管内皮細胞の増殖をブロックし、Ｔ細胞を活性化する多標的融合タンパク質であって、血管内皮増殖阻害剤ドメイン（ｉ）、免疫グロブリンＦｃドメイン（ｉｉ）、およびＣＤ８０細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ｉｉｉ）を含む、多標的融合タンパク質を開発している。前記多標的融合タンパク質は２つの点から腫瘍微小環境を改善するとともに、腫瘍免疫治療効果を向上させることができ、ここで、腫瘍微小環境の改善の一つは、前記多標的融合タンパク質のＣＤ８０細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のＣＤ２８、ＰＤ－Ｌ１、およびＣＴＬＡ－４に対する特異的結合によって達成され、具体的に言えば、ＣＤ８０細胞外ドメインがＰＤ－Ｌ１という免疫チェックポイントに結合することによって、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害性信号通路を緩和し、免疫系に「ブレーキ緩め」を与え、ＣＤ８０細胞外ドメインがＣＴＬＡ－４に結合されることによって抗ＣＴＬＡ－４抗体イピリムマブと同じ制御調整性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の機能を発揮する。ＣＤ８０細胞外ドメインをＣＤ２８に結合させることによりＣＤ２８／Ｂ７共刺激経路を活性化し、Ｔリンパ球を活性化してリンパ球の活性化に「スロットル加え」を行う。腫瘍微小環境の改善のもう一つは、前記多標的融合タンパク質の血管内皮細胞増殖阻害剤ドメインがＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ通路をブロックすることにより、腫瘍新生血管の生成を抑制し、腫瘍組織血管を正常化し、それにより、より多くのリンパ球が腫瘍組織に浸潤し、ＶＥＧＦｓによる免疫細胞の阻害作用を解除することである。

一実施形態では、本発明の多標的融合タンパク質は、抗ＶＥＧＦ抗体及び／又は抗ＶＥＧＦＲ抗体から誘導される抗原結合断片及び／又はＶＥＧＦＲ細胞外受容体機能領域を含む（ｉ）、免疫グロブリンＦｃドメイン（ｉｉ）、およびＣＤ８０細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ｉｉｉ）を含む。

前記多標的融合タンパク質に含まれる抗ＶＥＧＦ抗体から誘導される抗原結合断片は、ＶＥＧＦに結合し、それによってＶＥＧＦのその受容体ＶＥＧＦＲへの結合をブロック又は阻害することができる抗体であれば、任意の抗ＶＥＧＦ抗体から誘導されることができる。前記抗ＶＥＧＦ抗体には、従来技術で知られていた抗ＶＥＧＦ抗体及び将来開発される抗ＶＥＧＦ抗体が含まれる。一実施形態では、前記抗ＶＥＧＦ抗体の抗原結合断片は、抗ＶＥＧＦ抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖであり、好ましくは、前記抗ＶＥＧＦ抗体の抗原結合断片は、配列番号１／２及び３／４から選択される、ペアとなる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列に含まれる重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲの６個全て、又は前記６個全ての重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲの１個以上と１、２、３、４、又は５個のアミノ酸変化（例えば、アミノ酸置換又は欠失）を有する配列を含み、より好ましくは、前記抗ＶＥＧＦ抗体の抗原結合断片は、配列番号１／２及び３／４から選択される、ペアとなる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列、又は前記ペアとなる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有する配列を含み、最も好ましくは、前記抗ＶＥＧＦ抗体の抗原結合断片は、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ又はＲａｎｉｂｉｚｕｍａｂのＦａｂである。

前記多標的融合タンパク質に含まれる抗ＶＥＧＦＲ抗体から誘導される抗原結合断片は、ＶＥＧＦＲに結合し、それによってＶＥＧＦのその受容体ＶＥＧＦＲへの結合をブロック又は阻害することができる抗体であれば、任意の抗ＶＥＧＦＲ抗体から誘導されることができる。前記抗ＶＥＧＦＲ抗体は、従来技術で知られていた抗ＶＥＧＦＲ抗体および将来開発される抗ＶＥＧＦＲ抗体を含む。一実施形態では、前記抗ＶＥＧＦＲ抗体の抗原結合断片は、抗ＶＥＧＦ抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖであり、好ましくは、前記抗ＶＥＧＦ抗体の抗原結合断片は、配列番号５／６の、ペアとなる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列に含まれる重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲの６個全て、又は前記６個全ての重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲの１個以上と１、２、３、４、又は５個のアミノ酸変化（例えば、アミノ酸置換又は欠失）を有する配列を含み、より好ましくは、前記抗ＶＥＧＦ抗体の抗原結合断片は、配列番号５／６の、ペアとなる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列、又は前記ペアとなる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有する配列を含み、最も好ましくは、前記抗ＶＥＧＦ抗体の抗原結合断片は、ＲａｍｕｃｉｒｕｍａｂのＦａｂである。

前記多標的融合タンパク質に含まれるＶＥＧＦＲ細胞外受容体機能領域は、ＶＥＧＦに結合し、それによってＶＥＧＦのその受容体ＶＥＧＦＲへの結合をブロックまたは阻害することができるＶＥＧＦＲ細胞外受容体機能領域であれば、任意のＶＥＧＦＲ細胞外受容体機能領域であってよい。好ましくは、前記ＶＥＧＦＲ細胞外受容体機能領域は、ＶＥＧＦＲ１の免疫グロブリン様ドメイン２およびＶＥＧＦＲ２の免疫グロブリン様ドメイン３を含み、または、前記ＶＥＧＦＲ細胞外受容体機能領域は、ＶＥＧＦＲ１の免疫グロブリン様ドメイン２、ＶＥＧＦＲ２の免疫グロブリン様ドメイン３およびＶＥＧＦＲ２の免疫グロブリン様ドメイン４を含み、または、前記ＶＥＧＦＲ細胞外受容体機能領域は、ＶＥＧＦＲ１の免疫グロブリン様ドメイン２を含み、より好ましくは、前記ＶＥＧＦＲ細胞外受容体機能領域は、配列番号７～９に示すアミノ酸配列から選択されるもの、または配列番号７～９に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を有する任意のアミノ酸配列を有する。

前記多標的融合タンパク質に含まれる免疫グロブリンＦｃドメイン（ｉｉ）は、任意の免疫グロブリンＦｃドメインであってもよく、特に、前記（ｉｉ）は、ヒト免疫グロブリンＦｃドメインである。一実施形態では、前記免疫グロブリンＦｃドメインは、ＩｇＧクラスの抗体のＦｃドメインであり、特にＩｇＧ_１サブクラス、ＩｇＧ_２サブクラス、ＩｇＧ_４サブクラスの抗体のＦｃドメインである。好ましい実施形態では、本発明の多標的融合タンパク質に含まれる前記免疫グロブリンＦｃドメインは、ＩｇＧ_１サブクラスの抗体のＦｃドメインであり、特にヒトＩｇＧ_１サブクラスの抗体のＦｃドメインである。好ましい実施形態では、本発明の多標的融合タンパク質に含まれる前記免疫グロブリンＦｃドメインは、ＩｇＧ_４サブクラスの抗体のＦｃドメインであり、特にヒトＩｇＧ_４サブクラスの抗体のＦｃドメインである。いくつかの実施形態では、本発明の多標的融合タンパク質における免疫グロブリンＦｃドメイン（ｉｉ）は、配列番号１０、１１または１２に示すアミノ酸配列のＦｃドメインを含み、または配列番号１０、１１または１２に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するＦｃドメインを含む。

前記多標的融合タンパク質に含まれるＣＤ８０ ＥＣＤ（ｉｉｉ）は、ＣＤ８０の細胞外ドメインの一部である。一実施形態では、前記ＣＤ８０ ＥＣＤは、ＣＤ８０免疫グロブリンＶ（ＩｇＶ）領域（ＣＤ８０－ＩｇＶ）を含む。一実施形態では、前記ＣＤ８０ ＥＣＤは、ＣＤ８０免疫グロブリンＶ領域及びＣ領域（ＣＤ８０－ＩｇＶＩｇＣ）を含む。一実施形態では、前記ＣＤ８０ ＥＣＤは、ヒトＣＤ８０ ＥＣＤであり、好ましくは、前記ＣＤ８０ ＥＣＤは、ヒトＣＤ８０ ＩｇＶを含む。ある実施形態において、前記ＣＤ８０－ＩｇＶは、配列番号１３に示すアミノ酸配列、または配列番号１３に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する。一実施形態では、前記ＣＤ８０－ＩｇＶＩｇＣは、配列番号１４に示すアミノ酸配列、または配列番号１４に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、前記多標的融合タンパク質は、前記（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の間のペプチドリンカーをさらに含み、好ましくは、前記ペプチドリンカーは、１つ以上のアミノ酸を含み、より好ましくは、少なくとも５つのアミノ酸を含み、最も好ましくは、配列番号２０～４６から選択されるペプチドリンカーを含む。

一実施形態では、前記多標的融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の順、（ｉｉｉ）、（ｉ）および（ｉｉ）の順、または（ｉｉｉ）、（ｉｉ）および（ｉ）の順で有効に連結される。

いくつかの実施形態では、本発明の多標的融合タンパク質は、
（ａ）完全長抗ＶＥＧＦ抗体、完全長抗ＶＥＧＦＲ抗体、又は完全長抗ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦＲ二重特異性抗体、および前記抗体の２本の重鎖のそれぞれのＣ末端において有効に連結された１つのＣＤ８０ ＥＣＤ、
（ｂ）完全長抗ＶＥＧＦ抗体、完全長抗ＶＥＧＦＲ抗体、又は完全長抗ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦＲ二重特異性抗体、前記抗体の２本の重鎖のそれぞれのＮ末端において有効に連結された１つのＣＤ８０ ＥＣＤ、および前記抗体の２つの軽鎖のそれぞれのＮ末端において有効に連結された１つのＣＤ８０ ＥＣＤ、
（ｃ）ＣＤ８０ ＥＣＤ、ＣＤ８０ ＥＣＤのＣ末端において有効に連結された二量体形態の免疫グロブリンＦｃドメイン、及び前記二量体形態の免疫グロブリンＦｃドメインのＣ末端において有効に連結された、抗ＶＥＧＦ抗体及び／又は抗ＶＥＧＦＲ抗体から誘導される抗原結合断片、
又は
（ｄ）ＣＤ８０ ＥＣＤ、ＣＤ８０ ＥＣＤのＣ末端において有効に連結された二量体形態の免疫グロブリンＦｃドメイン、および前記二量体形態の免疫グロブリンＦｃドメインのＣ末端において有効に連結されたＶＥＧＦＲ細胞外受容体機能領域を含み、
好ましくは、前記抗体は、ＩｇＧクラスの抗体、特にＩｇＧ_１サブクラス、ＩｇＧ_２サブクラス、ＩｇＧ_４サブクラスの抗体であり、より特にＩｇＧ_４サブクラスの抗体であり、さらに好ましくは、前記ＩｇＧ_４サブクラスの抗体は、Ｆｃドメイン中のＳ２２８位にアミノ酸による置換を含み、より好ましくはアミノ酸によるＳ２２８Ｐ置換であり、さらに好ましくは、前記抗体の軽鎖型は、それぞれκ型またはλ型であり、好ましくはκ型であり、
好ましくは、前記全長抗ＶＥＧＦ抗体は、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂであり、前記全長抗ＶＥＧＦＲ抗体は、Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂである。

いくつかの実施形態では、本発明の多標的融合タンパク質は、
配列番号８０の融合タンパク質の第１のサブユニットおよび配列番号８２の融合タンパク質の第２のサブユニットを含む融合タンパク質（１）と、
配列番号８４の融合タンパク質の第１のサブユニットおよび配列番号８６の融合タンパク質の第２のサブユニットを含む融合タンパク質（２）と、
配列番号８８の融合タンパク質サブユニットを含む融合タンパク質（３）とからなる群から選択される。

本発明はまた、本発明の多標的融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、本発明の多標的融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターであって、好ましくは発現ベクターであり、最も好ましくは二重発現カセットを有するグルタミンシンテターゼ発現ベクターを提供する。別の形態において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞を提供する。一実施形態では、前記宿主細胞は、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３又はＮＳＯ細胞である。本発明はまた、本発明の多標的融合タンパク質を生成するための方法であって、本発明の多標的融合タンパク質の発現に適した条件下で、本発明の宿主細胞を培養するステップ（ｉ）と、本発明の融合タンパク質を回収するステップ（ｉｉ）とを含む、方法。を提供する。

別の形態において、本発明はまた、本発明の多標的融合タンパク質と抗ＰＤ－１抗体との組み合わせの医薬組成物を提供する。本発明の多標的融合タンパク質は、抗ＰＤ－１抗体との併用で優れた相乗性を示し、それによって腫瘍増殖の抑制という目的をより良好に達成することができる。

本発明の多標的融合タンパク質と組み合わせて使用する場合、抗ＰＤ－１抗体は、ＰＤ－１のリガンドへの結合を阻害又は低減することができる抗体であれば、いずれの抗ＰＤ－１抗体であってもよく、従来技術で知られていた抗ＰＤ－１抗体及び将来開発される抗ＰＤ－１抗体を含む。いくつかの実施形態において、前記抗ＰＤ－１抗体が、、配列番号４７／４８、４９／５０、５１／５２、５３／５４、５５／５６、５７／５８、５９／６０、６１／６２、６３／６４、６５／６６、６７／６８、６９／７０および７１／７２からなる群より選択される、ペアとなる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列に含まれる重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲの６個全て、又は前記６個全ての重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲの１個以上と１、２、３、４、又は５個のアミノ酸変化（例えば、アミノ酸置換又は欠失）を有する配列を含み、さらに好ましくは前記抗ＰＤ－１抗体が、配列番号４７／４８、４９／５０、５１／５２、５３／５４、５５／５６、５７／５８、５９／６０、６１／６２、６３／６４、６５／６６、６７／６８、６９／７０および７１／７２からなる群より選択される、ペアとなる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列、又は前記ペアとなる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有する配列を含み、最も好ましくは前記抗ＰＤ－１抗体が、ニボルマブ、ピズマブ、およびツムマブからなる群より選択される。

さらに別の形態では、本発明は、個体における癌性疾患（例えば、固形腫瘍および軟組織腫瘍）の治療または予防のための医薬の製造に使用され、好ましくは、癌性疾患が、黒色腫、乳癌、結腸癌、食道癌、消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）、腎臓癌（例えば、腎細胞癌）、肝臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、頭頸部腫瘍、胃癌、血液悪性疾患（例えば、リンパ腫）であり、特に、前記疾患は、結腸癌またはトリプルネガティブ乳癌であり、好ましくは、前記個体は哺乳動物であり、より好ましくはヒトである、本発明の多標的融合タンパク質、医薬組成物の使用を提供する。

特に限定されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参考となるようにその全体が引用形式により本明細書に組み込まれる。さらに、本明細書で説明される材料、方法、および例は、単に例示的なものであり、限定することを意図していない。本発明の他の特徴、目的及び利点は、本明細書及び図面から、並びに添付の特許請求の範囲から明らかとなるであろう。

以下に詳細に説明する本発明の好ましい実施形態は、以下の図面と併せて読まれるとより良く理解されるであろう。本発明を説明する目的で、現在好ましい実施形態を図中に示す。しかしながら、本発明は、図中に示される実施形態の精確な配置及び手段に限定されないことが理解されるべきである。
図１Ａおよび図１Ｂは、本発明の多標的融合タンパク質の概略図を提供し、ここで図１Ａは、Ｎ末端からＣ末端に抗体の抗原結合断片、免疫グロブリンＦｃドメイン、およびＣＤ８０ ＥＣＤを含む多標的融合タンパク質の構造概略図を示し、図１Ｂは、Ｎ末端からＣ末端にＣＤ８０ ＥＣＤ、免疫グロブリンＦｃドメイン、およびＶＥＧＦＲ細胞外受容体機能領域を含む融合タンパク質の構造模式図を示す。 図２は、実施例２で調製、精製した本発明の各目的タンパク質を還元剤（５ｍＭ １，４－ジチオスレイトール）の存在下、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動でクマシーブルー染色した結果を示す。レーン１：タンパク質分子量標準マーカー、レーン２：融合タンパク質ＢＹ２４．４、レーン３：融合タンパク質ＢＹ２４．５、レーン４：融合タンパク質ＢＹ２４．１２、レーン５：融合タンパク質ＢＹ３１．１９、レーン６：抗体ＢＹ１８．１。 図３は、実施例５の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）における、本発明の多標的融合タンパク質、及び抗ＰＤ－１抗体と組み合わせた場合のＩＦＮ－γ分泌に対する影響を示す図である。カラム１：ＢＹ１８．１群、カラム２：ＢＹ２４．４群、カラム３：ＢＹ１８．１＋ＢＹ２４．４群、カラム４：ＢＹ２４．５群、カラム５：ＢＹ１８．１＋ＢＹ２４．５群、カラム６：ＢＹ２４．１２群、カラム７：ＢＹ１８．１＋ＢＹ２４．１２群。 図４は、実施例６の動物モデルにおける本発明の多標的融合タンパク質と、抗ＰＤ－１抗体と組み合わせた抗腫瘍増殖阻害作用を示す図である。

発明の詳細

本発明は、血管内皮細胞の増殖をブロックし、Ｔ細胞を活性化する多標的融合タンパク質、及び前記多標的融合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。本発明はまた、前記多標的融合タンパク質を生成するための方法、および個体における癌性疾患の治療または予防における前記多標的融合タンパク質または医薬組成物の使用を提供する。

本明細書における用語は、以下で別途定義されない限り、当該技術分野で通常使用されるように使用される。

Ｉ．定義
「約」という用語は、数字数値と共に使用される場合、指定した数字数値より５％小さい下限及び指定した数字数値より５％大きい上限を有する範囲内の数字数値を包含することを意味する。

本明細書で使用される場合、「包含」または「含む」という用語は、述べられた要素、整数、またはステップを含むことを意味するが、任意の他の要素、整数、またはステップを除外しない。

「ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害性信号通路」、「ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１信号通路」、「ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１信号伝達経路」、「ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路」は、本明細書では交換可能に使用でき、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合によって開始される任意の細胞内の信号伝達経路を指す。

本明細書で使用されるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害信号伝達経路に対する「軽減」、「干渉」、「阻害」又は「ブロック」は、互換的に使用され得、（ｉ）ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を干渉すること、および／または（ｉｉ）ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１信号伝達経路の少なくとも１つの生物学的機能の阻害をもたらすことをいう。本発明の多標的融合タンパク質のＰＤ－Ｌ１への特異的結合後によるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１信号伝達経路に対する「軽減」、「干渉」、「阻害」、又は「ブロック」は、必ずしも完全な軽減、干渉、阻害、又はブロックである必要はない。

本明細書において、「ＣＤ２８／Ｂ７信号伝達経路」、「ＣＤ２８／Ｂ７共刺激経路」、「ＣＤ２８／Ｂ７通路」は、互換的に使用され得、（ｉ）ＣＤ２８がＣＤ８０に結合することによって細胞活性化を刺激する信号伝達経路、及び／又は（ｉｉ）ＣＤ８６へのＣＤ２８の結合によって細胞活性化を刺激する信号伝達経路をいう。

「ＣＤ８０」および「ＣＤ８６」は、両方とも、構造的に非常に類似した免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）のメンバーである膜貫通糖タンパク質であり、Ｂ７分子とも総称される。ＣＤ８０およびＣＤ８６の細胞外領域は、免疫グロブリンＶ（ＩｇＶ）領域および免疫グロブリンＣ（ＩｇＣ）領域からなる。成熟ＣＤ８０分子は２５４個のアミノ酸からなり、そのうち、細胞外領域は２０８個のアミノ酸、膜貫通領域は２５個のアミノ酸、および細胞内領域は２１個のアミノ酸からなる。同様に、成熟ＣＤ８６分子は、３０３個のアミノ酸からなり、そのうち、細胞外領域は２２２個のアミノ酸、膜貫通領域は２０個のアミノ酸、および細胞内領域は６１個のアミノ酸からなる。ＣＤ８０はＢ７．１とも呼ばれ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞および単球の表面に発現し、その免疫グロブリンＶ（ＩｇＶ）領域を介してＣＤ２８、ＰＤ－Ｌ１およびＣＴＬＡ－４に低親和力で結合し、なかには、ＣＤ８０とＣＤ２８との結合親和力は４μＭである。ＣＤ８０とＰＤ－Ｌ１との結合親和力は～１．７μＭであり、ＣＤ８０とＣＴＬＡ－４との結合親和力は、０．２μＭである（ＢｕｔｔｅＭＪら、Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－１ ｌｉｇａｎｄ １ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｂ７－１ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｔｏ ｉｎｈｉｂｉｔ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００７年７月；２７（１）：１１１-１２２）。ＣＤ８６は、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ－４に結合するが、ＰＤ－Ｌ１には結合しない。

可溶性ＣＤ８０（例えば、ＣＤ８０－Ｆｃ）は、ＣＤ２８／Ｂ７共刺激経路を介してＴリンパ球に対する持続的活性作用を生じさせるとともに、インターフェロン産生の刺激を可能にする。試験は、ＣＤ８０－Ｆｃが、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体よりもさらに効果的にインビトロでのインターフェロン産生を維持することを示した。インビボでの腫瘍成長の阻害において、可溶性ＣＤ８０（例えば、ＣＤ８０－Ｆｃ）は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体よりも腫瘍抑制効果が高い（Ｏｓｔｒａｎｄ－ＲｏｓｅｎｂｅｒｇＳら、Ｎｏｖｅｌ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ＰＤ－１ ｐａｔｈｗａｙ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｈｉｌｅ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌｓ ｔｏ ｔｕｍｏｒ－ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌｓ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２０１５年１０月；６４（１０）：１２８７－９３）。ＣＤ８０－Ｆｃは、ＰＤ－Ｌ１に結合することによってＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路によって媒介される免疫抑制を阻害し、ＣＤ２８／Ｂ７共刺激経路によって活性化されるＴ細胞に共刺激信号を送達し、それによってＴリンパ球活性化を増強することができる。要するに、ＣＤ８０－Ｆｃは、腫瘍免疫反応性Ｔ細胞を活性化しながら、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路の免疫抑制作用を軽減することができる。可溶性ＣＤ８６（例えば、ＣＤ８６－Ｆｃ）はＣＤ２８をも活性化することができ、ＣＤ８０－Ｆｃの３～５倍の活性化効果をさえ生じさせることができるが、ＣＤ８６はＰＤ－Ｌ１に結合しないため、Ｔリンパ球に対するＣＤ８０－Ｆｃの最終的な活性化作用はＣＤ８６－Ｆｃよりも強い（ＨａｉｌｅＳＴら、Ｓｏｌｕｂｌｅ ＣＤ８０ ｒｅｓｔｏｒｅｓ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｖｅｒｃｏｍｅｓ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ １－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１３年９月１日；１９１（５）：２８２９－３６）。ＣＤ８０－Ｆｃは、以前の研究から、（ｉ）ＣＤ８０－Ｆｃ単独で使用した場合、ＰＤ－Ｌ１抗体よりも腫瘍抑制効果が優れていること（ＡＡＣＲ ＡＮＮＵＡＬ ＭＥＥＴＩＮＧ、２０１８年４月１４－１８日、米国、イリノイ州、シカゴウ）、（ｉｉ）ＣＤ８０－Ｆｃは、腫瘍組織へのリンパ球浸潤を促進し、ＰＤ－Ｌ１抗体よりも効果が優れていること（ＨｏｒｎＬＡら、Ｓｏｌｕｂｌｅ ＣＤ８０ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌａｙｓ Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｔｕｍｏｒ－Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．，２０１８年１月；６（１）：５９－６８）、（ｉｉｉ）ＣＤ８０－Ｆｃ単独で使用した場合、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路の阻害剤よりも腫瘍抑制効果が優れ、ＰＤ－１抗体との併用で相乗効果が見られることが示されている。Ｆｉｖｅ Ｐｒｉｍｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎは、ＣＤ８０－Ｆｃは、ＧＩＴＲＬ、ＯＸ４０Ｌ及び４－１ＢＢＬなどのＴ細胞アゴニストよりも優れているとさらに認識している。ＣＤ８０－Ｆｃの良好な免疫治療効果が認められたため、Ｆｉｖｅ Ｐｒｉｍｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．のＣＤ８０－ＦｃプロジェクトＦＰＴ１５５は、最近臨床試験を開発することを計画した。

本明細書において「Ｂ７／ＣＴＬＡ－４通路」、「Ｂ７／ＣＴＬＡ－４信号伝達経路」は、互換的に使用され得、（ｉ）ＣＴＬＡ－４へのＣＤ８０の結合によって引き起こされる信号伝達経路、および／または（ｉｉ）ＣＴＬＡ－４へのＣＤ８６の結合によって引き起こされる信号伝達経路をいう。

本明細書において、「ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ通路」、「ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ信号伝達経路」は、互換的に使用され得、細胞表面受容体ＶＥＧＦＲファミリーの１つ以上とのＶＥＧＦファミリーの１つ以上の結合によって媒介される信号伝達経路をいう。ＶＥＧＦファミリーは、６個の密接に関連したポリペプチドを含み、それぞれは、６個のサブタイプ：ＶＥＧＦ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、－Ｄ、－Ｅ、及び胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）を有する高度に保存されたホモ二量体糖タンパク質であり、分子量は、３５～４４ｋＤａで等しくない。ＶＥＧＦ－Ａ（そのスプライシング、例えば、ＶＥＧＦ_１６５を含む）の発現は、いくつかの固形腫瘍の微小血管密度と相関し、組織中のＶＥＧＦ－Ａの濃度は、乳癌、肺癌、前立腺癌、及び結腸癌などの固形腫瘍の予後と相関する。各ＶＥＧＦファミリーメンバーの生物学的活性は、細胞表面ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）ファミリーの１つ以上によって媒介され、前記ＶＥＧＦＲファミリーは、ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ－１ともいう）、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ、Ｆｌｋ－１ともいう）、ＶＥＧＦＲ３（Ｆｌｔ－４ともいう）などを含み、ここで、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２は血管の生成と密接に関連し、ＶＥＧＦ－Ｃ／Ｄ／ＶＥＧＦＲ３はリンパ管の生成と密接に関連する。ＶＥＧＦファミリーの主要な生物学的機能には、（１）血管内皮細胞の有糸分裂を選択的に促進し、内皮細胞増殖を刺激し、血管形成を促進し、（２）血管、特に微小血管の透過性を増大させ、血漿高分子を血管外マトリックスにアウトソーシングさせ、腫瘍細胞の増殖および新生毛細血管網の構築に栄養を提供し、（３）腫瘍の増殖および転移を促進し、前記腫瘍の増殖および転移は、ＶＥＧＦファミリーに依存しており、血管内皮細胞がコラゲナーゼやプラスミノーゲンを分泌することで血管基底膜が分解され、また腫瘍組織内部に新たに形成される微小血管基底膜が不完全であり、この性質により腫瘍が血液循環に入りやすく、（４）ＶＥＧＦは、身体の免疫応答を阻害し、悪性腫瘍の浸潤および転移を促進する免疫抑制分子としてもよく（Ｌａｐｅｙｒｅ－Ｐｒｏｓｔ Ａら，Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＶＥＧＦ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ，Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２０１７；３３０：２９５－３４２）、（５）他の効果：ＶＥＧＦファミリーは、上皮細胞のギャップ及び窓開き現象を誘導でき、上皮細胞の細胞質小胞及び細胞小器官を活性化でき、ＶＥＧＦファミリーが内皮細胞を直接刺激してタンパク質分解酵素を放出し、マトリックスを分解し、より多くのＶＥＧＦファミリー分子を放出し、腫瘍の進行を加速し、細胞外プロテアーゼがまた、細胞外基質の結合性及びＶＥＧＦファミリーの放出を活性化することができ、ＶＥＧＦファミリーは、血管透過性を増加させることによって、フィブリノーゲンを含む血漿タンパク質を放出して、セルロースネットワークを形成し、腫瘍の成長、進行、及び転移のための良好な基質を提供し、ＶＥＧＦファミリーは、異常な血管の生成を促進し、免疫細胞の浸潤を阻害するなどの効果を有する。

臨床研究は、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体、抗ＶＥＧＦＲモノクローナル抗体、又は可溶性ＶＥＧＦＲの使用が、ＶＥＧＦファミリーのその受容体への結合をブロックし、ＶＥＧＦファミリー信号通路の伝導を阻害することができることを示している。Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社が開発したベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ、商品名Ａｖａｓｔｉｎ）は、ＶＥＧＦ－ＡとＶＥＧＦＲとの結合をブロックすることによりＶＥＧＦＲを活性化不能にして抗血管新生作用を発揮する組み換えヒトネズミキメラ抗ＶＥＧＦ抗体である。ベバシズマブは、転移性結腸直腸癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、腎臓癌等の治療に現在用いられている。Ｓａｎｏｆｉ－ａｖｅｎｔｉｓ及びＲｅｇｅｎｅｒｏｎが開発したａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔは、ＶＥＧＦＲ１細胞外第２ドメインとＶＥＧＦＲ２細胞外第３ドメインとヒトＩｇＧ１定常領域とを融合した融合タンパク質であるＶＥＧＦ－Ｔｒａｐであり、血管新生を阻害することにより、腫瘍患者の一部に対して抗腫瘍作用を発揮することができる。

本明細書で使用されたように、「特異的に結合する」という用語は、抗原または目的分子の結合に選択性があり、望ましくないまたは非特異的な相互作用と区別され得ることを意味する。前記特異的結合は、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）または表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ装置での分析）などの当業者に公知の他の技術によって測定することができる（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄら、Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｇａｌａｃｔｏ－ＩｇＧ ｉｎ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｕｓｉｎｇ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，Ｇｌｙｃｏ Ｊ．，２０００，１７，３２３－３２９）。

「血管内皮増殖阻害剤ドメイン」という用語は、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ信号伝達をブロックする血管内皮増殖阻害剤の部分を指し、前記部分は血管内皮増殖の阻害を発揮する領域である。血管内皮増殖阻害剤ドメインは、例えば、１つ以上の抗ＶＥＧＦ抗体の可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ぶ）、１つ以上の抗ＶＥＧＦＲ抗体の可変ドメイン、またはＶＥＧＦＲ細胞外受容体機能領域によって提供され得る。

「制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）」という用語は、自己寛容の維持に重要なＴリンパ球の特定の亜集団を表す。サプレッサー機能を有するＴｒｅｇ細胞は、転写因子ＦＯＸＰ３、及びＣＤ１２７^低、ＣＴＬＡ－４＋、ＬＡＰ、ＣＤ３９＋、ＰＤ－１＋、ＧＡＲＰ等の他の細胞マーカーを細胞内で発現させることによって他のＴリンパ球と区別することができる。

「親和力」または「結合親和力」は、結合対のメンバー間の相互作用を反映する固有の結合親和力を指す。そのパートナーＹに対する分子Ｘの親和力は、一般に、解離定数（Ｋ_Ｄ）によって表すことができ、解離定数は、解離速度定数と会合速度定数の比（それぞれｋ_ｏｆｆおよびｋ_ｏｎ）である。親和力は、当該技術分野で既知の一般的な方法によって測定することができる。親和力を測定するための具体的な方法の１つは、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）である。

「抗体」という用語は、本明細書において最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を含むが、これらに限定されない。抗体は、任意のタイプおよびサブタイプ（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）の無傷の抗体（例えば、２つの完全長の軽鎖および２つの完全長の重鎖を有する）であり得る。

「全抗体」、「全長抗体」、「完全抗体」、及び「インタクト抗体」という用語は、本明細書で交換可能に１つの抗体を指すように使用され得、前記抗体は天然の抗体と実質的に類似の構造を有する。

「抗体重鎖」という用語は、天然に存在する立体配座で抗体分子中に存在するポリペプチド鎖の２つのタイプのうちの大きい方を指し、通常、抗体が属するクラスを決定する。

「抗体軽鎖」という用語は、その天然に存在する立体配座で抗体分子中に存在する２種類のポリペプチド鎖のうちの小さい方を指す。κ軽鎖およびλ軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖クラスを指す。

「二重特異性抗体」は、２つの異なる重鎖／軽鎖ペアを有し、２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマ融合またはＦａｂ’断片の連結を含む様々な方法によって調製することができる。

抗体の「抗原結合断片」という用語は、インタクト抗体、完全抗体または抗体鎖より少ないアミノ酸残基の抗体または抗体鎖の一部または断片であり、抗原に結合するか、またはインタクト抗体（すなわち、抗原結合断片が由来するインタクト抗体）と競合して抗原に結合することができる。抗原結合断片は、組換えＤＮＡ技術によって、または酵素もしくは化学的にインタクト抗体を切断することによって調製され得る。抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖを含むが、これらに限定されない。前記Ｆａｂ断片は、Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_Ｌ及びＣＨ１ドメインからなる一価の断片であり、例えば、完全抗体をパパインで消化することによって得ることができる。さらに、Ｆ（ａｂ’）_２は、ヒンジ領域のジスルフィド結合の下で完全抗体をペプシン消化することによって生成され、二価フラグメントであるＦａｂ’の二量体である。Ｆ（ａｂ’）_２は、中性条件下でヒンジ領域のジスルフィド結合を破壊することによって還元され得、したがってＦ（ａｂ’）_２二量体をＦａｂ’単量体に変換する。Ｆａｂ’単量体は本質的にヒンジ領域を有するＦａｂ断片である（他の断片のより詳細な記載は、基礎免疫学（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編集，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）を参照されたい）。前記Ｆｖ断片は、抗体の単一アームのＶ_Ｌ及びＶ_Ｈドメインからなる。また、Ｆｖ断片の両ドメインＶ_ＬとＶ_Ｈは、独立の遺伝子にコードされるが、それらを、組換え法を用いることにより両ドメインを単一のタンパク質鎖として生成する合成リンカーで連結することができ、前記単一のタンパク質鎖のうち、Ｖ_Ｌ領域とＶ_Ｈ領域がペアになって単鎖Ｆｖを形成する。前記抗体断片は、化学的方法、組換えＤＮＡ法、又はプロテアーゼ消化法によって得ることができる。

「免疫グロブリン」という用語は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合した２つの軽鎖及び２つの重鎖からなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各免疫グロブリン重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（Ｖ_Ｈ）を有し、続いて、重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ_１、ＣＨ_２およびＣＨ_３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各免疫グロブリン軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（Ｖ_Ｌ）を有し、続いて、軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（Ｃ_Ｌ）ドメインを有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）またはμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つのクラスのうちの１つに帰属することができ、ここで、あるクラスは、さらにサブクラス、例えば、γ_１（ＩｇＧ１）、γ_２（ＩｇＧ２）、γ_３（ＩｇＧ_３）、γ_４（ＩｇＧ_４）、α_１（ＩｇＡ_１）及びα_２（ＩｇＡ_２）に分類することができる。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κ及びλと呼ばれる２つのタイプのうちの１つに分類することができる。免疫グロブリンは、本質的に、免疫グロブリンヒンジ領域によって連結された２つのＦａｂ分子と１つのＦｃドメインとからなる。

「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために本明細書で使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域および変異体Ｆｃ領域を含む。天然の免疫グロブリン「Ｆｃドメイン」は、２つまたは３つの定常ドメイン、すなわちＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、および任意選択可能なＣＨ４ドメインを含む。例えば、天然抗体では、免疫グロブリンＦｃドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤクラスの抗体の２つの重鎖に由来する第２および第３の定常ドメイン（ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン）を含み、またはＩｇＭおよびＩｇＥクラスの抗体の２本の重鎖に由来する第２、第３および第４の定常ドメイン（ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびＣＨ４ドメイン）を含む。本明細書において特別な説明がない限り、Ｆｃ領域または重鎖定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓ，第５版，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載のＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従ってなされる。

「ヒト免疫グロブリン」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生される免疫グロブリンに対応するアミノ酸配列を有するか、またはヒト免疫グロブリンのレパートリーもしくはヒト免疫グロブリンをコードする他の配列を利用する非ヒト起源から誘導される免疫グロブリンである。

アミノ酸配列の「同一性パーセント（％）」とは、候補配列と本明細書に示す具体的なアミノ酸配列とを比較し、必要に応じて最大の配列同一性パーセントを達成するためにギャップを導入した後、配列同一性の一部として如何なる保存的置換を考慮しない場合、本明細書に示す具体的なアミノ酸配列のアミノ酸残基と同一の候補配列中のアミノ酸残基のパーセントを意味する。

「有効に連結される」という用語は、特定の各成分が、それらが意図された方法で機能することを可能にする関係にあることを意味する。

「Ｎ末端」という用語は、Ｎ末端の最後のアミノ酸を指し、用語「Ｃ末端」は、Ｃ末端の最後のアミノ酸を指す。

「融合」という用語は、２つ以上の成分が、ペプチド結合によって直接的に連結されるか、または１つ以上のペプチドリンカーを介して有効に連結されることを意味する。

「宿主細胞」という用語は、なかに外来性ポリヌクレオチドが導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫が含まれる。宿主細胞は、一次形質転換細胞およびそれから誘導される子孫を含む「形質転換体」および「形質転換細胞」を含む。宿主細胞は、本発明の多標的融合タンパク質を生成するために使用され得る任意のタイプの細胞系である。宿主細胞は、培養した細胞を含み、またトランスジェニック動物、トランスジェニック植物、または培養した植物組織もしくは動物組織内の細胞も含む。

「個体」または「被験者」という用語は、互換的に使用され得、哺乳動物を指す。哺乳動物は、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が含まれるが、これらに限定されない。特に、個体はヒトである。

「治療」という用語は、治療を受けている個体における疾患の自然経過を変化させることを目的とする臨床的介入を指す。所望の治療効果としては、疾患の発生又は再発の予防、症状の軽減、疾患の低減による如何なる直接的又は間接的病理学的結果、転移の予防、疾患進行速度の低下、疾患状態の寛解又は緩和、及び予後の寛解又は緩和が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の多標的融合タンパク質または医薬組成物は、疾患の進行を遅延させるか、または疾患の進行を遅らせるために使用される。

「抗腫瘍効果」という用語は、様々な手段によって示され得る生物学的効果を指し、例えば、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、腫瘍細胞増殖の減少、または腫瘍細胞生存の減少を含むが、これらに限定されない。「腫瘍」、「癌」および「癌性疾患」という用語は、本明細書において互換的に使用され得、固形腫瘍および液体腫瘍を包含する。

ＩＩ．多標的融合タンパク質
本発明は、血管内皮増殖阻害剤ドメイン（ｉ）、免疫グロブリンＦｃドメイン（ｉｉ）、およびＣＤ８０細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ｉｉｉ）を含む、新規な多標的融合タンパク質を提供する。

いくつかの実施形態では、前記（ｉ）、（ｉｉ）、および／または（ｉｉｉ）は、ペプチドリンカーによって有効に連結されていてもい。

いくつかの実施形態では、本発明の多標的融合タンパク質は、ジスルフィド結合により結合された２つの融合タンパク質第１サブユニットと２つの融合タンパク質第２サブユニットからなるヘテロ四量体糖タンパク質である。

いくつかの実施形態では、本発明の多標的融合タンパク質は、ジスルフィド結合により結合されたホモ二量体またはヘテロ二量体糖タンパク質である。

本発明の多標的融合タンパク質は、血管内皮細胞の増殖をブロックし、Ｔ細胞を活性化する。この多標的融合タンパク質は、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ通路をブロックすることによって血管内皮細胞の増殖をブロックすることができる一方、ＣＤ２８／Ｂ７共刺激経路を活性化し、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害性信号通路を阻害し、Ｂ７／ＣＴＬＡ－４信号伝達経路によって制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）機能を阻害することによってＴリンパ球を活性化し、それによって腫瘍微小環境を改善し、腫瘍免疫治療効果を向上することができる。

いくつかの実施形態では、本発明の多標的融合タンパク質は、１０^－８Ｍ以下、例えば、１０^－９Ｍ～１０^－１２Ｍの解離定数（Ｋ_Ｄ）でＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲと結合し、ＣＤ２８、ＰＤ－Ｌ１およびＣＴＬＡ－４に特異的に結合する。

以下、本発明の多標的融合タンパク質の各成分について説明する。

－血管内皮増殖阻害剤ドメイン
本発明の多標的融合タンパク質中の「血管内皮増殖阻害剤ドメイン」は、ＶＥＧＦ及び／又はＶＥＧＦＲに特異的に結合することができ、抗ＶＥＧＦ抗体及び／又は抗ＶＥＧＦＲ抗体から誘導される抗原結合断片及び／又はＶＥＧＦＲ細胞外受容体機能領域を含むが、これらに限定されない。

一実施形態では、本発明の多標的融合タンパク質に含まれる抗ＶＥＧＦ抗体及び／又は抗ＶＥＧＦＲ抗体から誘導される抗原結合断片は、本発明の多標的融合タンパク質が高い親和力、例えば１０^－８Ｍ以下、好ましくは１０^－９Ｍ～１０^－１２ＭのＫ_ＤでＶＥＧＦ及び／又はＶＥＧＦＲに特異的に結合することを可能にし、それにより、ＶＥＧＦのその受容体ＶＥＧＦＲへの結合によって媒介される信号伝達経路をブロックすることができる。

本発明の多標的融合タンパク質に含まれる抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦＲ抗体の抗原結合断片における、ペアとなる重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）の例を、以下の表１に提供する。いくつかの実施形態において、本発明の多標的融合タンパク質における抗原結合断片は、表１の抗ＶＥＧＦ抗体及び／又は抗ＶＥＧＦＲ抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）及び／又は軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列と実質的に同一な配列、例えば、表１に示すペアとなる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有する配列を含む。

一実施形態では、本発明の多標的融合タンパク質中の抗原結合断片は、配列番号１／２、３／４および５／６から選択される、ペアとなる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列に含まれる６つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）および軽鎖ＣＤＲの全てを含む。重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列中のＣＤＲを同定するための方法および技術は、当技術分野において公知であり、かつ、本明細書に開示される特定の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域のアミノ酸配列中のＣＤＲを同定するために使用することができる。ＣＤＲ境界を同定するために使用することができる例示的な周知の技術としては、例えば、Ｋａｂａｔ定義法、Ｃｈｏｔｈｉａ定義法、及びＡｂＭ定義法が挙げられる。例えば、Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ． （１９９１）；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉら，Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２７３：９２７－９４８ （１９９７）；及びＭａｒｔｉｎ ＡＣら，Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｌｏｏｐｓ：ａ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：９２６８－９２７２ （１９８９）を参照されたい。

本発明の多標的融合タンパク質中の抗原結合断片の供給源である抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦＲ抗体は、その軽鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいてκ型又はλ型に分類することができ、好ましくはκ型である。

抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦＲ抗体軽鎖定常領域のアミノ酸配列の例を、以下の表２に提供する。

本発明の多標的融合タンパク質中の抗原結合断片の供給源である抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦＲ抗体は、その重鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいて、好ましくはＩｇＧクラス抗体、特にＩｇＧ_１サブクラス、ＩｇＧ_２サブクラス、ＩｇＧ_４サブクラスの抗体であり、より特にＩｇＧ_４サブクラスの抗体である。好ましくは、前記ＩｇＧ_４サブクラスの抗体は、Ｆｃドメイン中のＳ２２８位にアーム交換（ａｒｍ－ｅｘｃｈａｎｇｅ）の発生を防止するアミノ酸による置換を含み、より好ましくはアミノ酸によるＳ２２８Ｐ置換である。

本明細書において、抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列の例を、以下の表３に提供する。

一実施形態では、本発明の多標的融合タンパク質に含まれるＶＥＧＦＲ細胞外受容体機能領域は、ＶＥＧＦＲの細胞外ドメインの一部またはその組み合わせである。ＶＥＧＦＲ受容体は、細胞表面に位置するチロシンキナーゼ型受容体であり、その細胞外領域は７個の免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインからなる。例えば、ヒトＶＥＧＦＲ１は、番号が１、２、３、４、５、６および７である７つのＩｇ様ドメインを含み、Ｉｇ様ドメイン１は細胞外ドメインのＮ末端に位置し、Ｉｇ様ドメイン７は細胞外ドメインのＣ末端に位置する。Ｉｇ様ドメインは、本明細書において特に指示がない限り、ＶＥＧＦＲタンパク質のＮ末端からＣ末端まで順番に番号付けされる。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲ細胞外受容体機能領域は、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３から選択される１種以上のＶＥＧＦＲの少なくとも一つのＩｇ様ドメインを含む。いくつかの形態では、ＶＥＧＦＲ細胞外受容体機能領域は、ＶＥＧＦＲのＩｇ様ドメインを少なくとも１、２、３、４、５、６個含むが、ただし７個を超えない。別の形態では、ＶＥＧＦＲ細胞外受容体機能領域は、ＶＥＧＦＲの１～７、１～６、１～５、１～４、１～３または１～２のＩｇ様ドメインを含む。

２つ以上のＶＥＧＦＲの少なくとも１つのＩｇ様ドメインを含むＶＥＧＦＲ細胞外受容体機能領域も、本明細書において考慮される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲ細胞外受容体機能領域は、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３から選択される２つ以上のＶＥＧＦＲからの少なくとも一つのＩｇ様ドメインを含む。各ＶＥＧＦＲの７つのＩｇ様ドメインの任意の組み合わせを含むＶＥＧＦＲ細胞外受容体機能領域が、本明細書において考慮される。例えば、ＶＥＧＦＲ細胞外受容体機能領域は、ＶＥＧＦＲ１（例えば、ヒトＶＥＧＦＲ１）のＩｇ様ドメイン２およびＶＥＧＦＲ２（例えば、ヒトＶＥＧＦＲ２）のＩｇ様ドメイン３を含み得る。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ細胞外受容体機能領域は、ＶＥＧＦＲ１（例えば、ヒトＶＥＧＦＲ１）のＩｇ様ドメイン１－３、ＶＥＧＦＲ１（例えば、ヒトＶＥＧＦＲ１）のＩｇ様ドメイン２－３、ＶＥＧＦＲ２（例えば、ヒトＶＥＧＦＲ２）のＩｇ様ドメイン１－３、ＶＥＧＦＲ１（例えば、ヒトＶＥＧＦＲ１）のＩｇ様ドメイン２およびＶＥＧＦＲ２（例えば、ヒトＶＥＧＦＲ２）のＩｇ様ドメイン３－４、またはＶＥＧＦＲ１（例えば、ヒトＶＥＧＦＲ１）のＩｇ様ドメイン２およびＶＥＧＦＲ３（例えば、ヒトＶＥＧＦＲ３）のＩｇ様ドメイン３を含み得る。これらのＩｇ様ドメインおよびＶＥＧＦＲ細胞外受容体機能領域の一部として使用され得る他のＩｇ様ドメインのより詳細な説明は、米国特許第７５３１１７３号、Ｙｕ ＤＣら，Ｓｏｌｕｂｌｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｄｅｃｏｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＦＰ３ ｅｘｅｒｔｓ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２０１２，２０（３）：９３８－９４７及びＨｏｌａｓｈ，Ｊ．ら，ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ：ａ ＶＥＧＦ ｂｌｏｃｋｅｒ ｗｉｔｈ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔｓ，ＰＮＡＳ，２００２，９９（１７）：１１３９３－１１３９８を参照されたく、全ての文献は、参考となるようにその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦＲ細胞外受容体機能性領域は、表４における配列番号７～９に示すアミノ酸配列から選択されるもの、又は配列番号７～９に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の同一性を有する任意のアミノ酸配列を有する。

本発明の多標的融合タンパク質におけるＶＥＧＦＲ細胞外受容体機能領域は、高い親和力で、例えば、１０^－８Ｍ以下、好ましくは１０^－９Ｍ～１０^－１２ＭのＫ_Ｄで、ＶＥＧＦファミリーに特異的に結合することができ、これにより、細胞表面ＶＥＧＦＲへのＶＥＧＦファミリーの結合と、それに続く信号伝達を阻害することができる。

－免疫グロブリンＦｃドメイン
本発明の多標的融合タンパク質における「免疫グロブリンＦｃドメイン」は、天然に存在する免疫グロブリンＦｃドメインの全てのアミノ酸残基を含むか、または天然に存在する免疫グロブリンＦｃドメインの一部のアミノ酸残基を含む。免疫グロブリンＦｃドメインは、本発明の多標的融合タンパク質に有利な薬物動態特性を提供し、長い血清半減期を含むが、これに限定されない。さらに、免疫グロブリンＦｃドメインはまた、例えば、タンパク質Ａによって本発明の多標的融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー、精製を可能にする。

免疫グロブリンＦｃドメインは、通常、二量体分子である。ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、及び選択可能なＣＨ４ドメインを含む免疫グロブリンＦｃドメインは、パパイン又はトリプシンによってインタクト（全長）免疫グロブリンを消化することによって調製することができるか、又は組換えによって調製することもできる。

一実施形態では、ＩｇＧ Ｆｃ領域は、ＩｇＧ ＣＨ２ドメイン及びＩｇＧ ＣＨ３ドメインを含む。好ましくは、免疫グロブリンＦｃドメインは、表５の配列番号１０～１２に示すアミノ酸配列を有するか、または配列番号１０～１２に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する。

配列番号１０～１２に定義された配列に加えて、ＩｇＧ Ｆｃ領域は、配列番号１０～１２に示す配列をさらに修飾したペプチド配列、例えば、配列番号１０～１２のアミノ酸残基に対して１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、または誘導体した後に得られたペプチド配列を含んでもよい。一実施形態では、ＩｇＧ Ｆｃ領域中のＳ２２８位に、アーム交換（ａｒｍ－ｅｘｃｈａｎｇｅ）の発生を防止するアミノ酸による置換が含まれ、特にアミノ酸によるＳ２２８Ｐ置換が含まれる。一実施形態では、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域は、アミノ酸によるＳ２２８Ｐ置換を含む。

－ＣＤ８０の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）
本発明の多標的融合タンパク質における「ＣＤ８０の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）」は、天然に存在するＣＤ８０ ＥＣＤの全てのアミノ酸残基を含むか、または天然に存在するＣＤ８０ ＥＣＤの一部のアミノ酸残基を含む。ある実施形態において、前記ＣＤ８０ ＥＣＤは、ＣＤ８０ ＩｇＶを含み、好ましくはヒトＣＤ８０ ＩｇＶを含み、より好ましくは、表６における配列番号１３または１４に示すアミノ酸配列を有する。

配列番号１３および１４に定義された配列に加えて、ＣＤ８０ ＥＣＤは、非修飾ペプチジルと実質的に同じ活性または機能を有すれば、配列番号１３および１４に示す配列をさらに修飾したペプチド配列、例えば、配列番号１３および１４のアミノ酸残基に対して１つまたは複数の保存的置換、欠失、または誘導体した後に得られたペプチド配列を含んでもよい。修飾されたペプチドは、未修飾ペプチドと関連する活性または機能を保持する。修飾されたペプチドは、典型的には、非修飾配列のアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列、例えば、配列番号１３または１４に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する。

－ペプチドリンカー
本発明の多標的融合タンパク質において、血管内皮増殖阻害剤ドメイン（ｉ）、免疫グロブリンＦｃドメイン（ｉｉ）、およびＣＤ８０ ＥＣＤ（ｉｉｉ）が、有効に連結されていてもよい「ペプチドリンカー」は、１個または複数のアミノ酸、典型的には約２～２０個のアミノ酸からなるペプチドである。ペプチドリンカーは、当該技術分野で公知であるか、または本明細書に記載されている。

いくつかの実施形態において、前記ペプチドリンカーは、少なくとも５個のアミノ酸を含み、好ましくはＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲ（配列番号２０）、ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ（配列番号２１）、ＡＫＴＴＰＫＬＧＧ（配列番号２２）、ＳＡＫＴＴＰＫＬＧＧ（配列番号２３）、ＳＡＫＴＴＰ（配列番号２４）、ＲＡＤＡＡＰ（配列番号２５）、ＲＡＤＡＡＰＴＶＳ（配列番号２６）、ＲＡＤＡＡＡＡＧＧＰＧＳ（配列番号２７）、ＲＡＤＡＡＡＡ（配列番号２８）、ＳＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ（配列番号２９）、ＡＤＡＡＰ（配列番号３０）、ＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰ（配列番号３１）、ＴＶＡＡＰ（配列番号３２）、ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号３３）、ＱＰＫＡＡＰ（配列番号３４）、ＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰ（配列番号３５）、ＡＫＴＴＰＰ（配列番号３６）、ＡＫＴＴＰＰＳＶＴＰＬＡＰ（配列番号３７）、ＡＫＴＴＡＰ（配列番号３８）、ＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰ（配列番号３９）、ＡＳＴＫＧＰ（配列番号４０）、ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号４１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＧＳ（配列番号４２）、ＧＥＮＫＶＥＹＡＰＡＬＭＡＬＳ（配列番号４３）、ＧＰＡＫＥＬＴＰＬＫＥＡＫＶＳ（配列番号４４）、ＧＨＥＡＡＡＶＭＱＶＱＹＰＡＳ（配列番号４５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡ（配列番号４６）から選ばれるペプチドリンカーを含む。

－多標的融合タンパク質
本明細書において、血管内皮増殖阻害剤ドメイン（ｉ）、免疫グロブリンＦｃドメイン（ｉｉ）、およびＣＤ８０ ＥＣＤ（ｉｉｉ）を任意の順で含む、多標的融合タンパク質を提供し、多標的融合タンパク質がＮ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の順、（ｉｉｉ）、（ｉ）および（ｉｉ）の順、または（ｉｉｉ）、（ｉｉ）および（ｉ）の順で有効に連結されることを含むが、これに限定されない。

一実施形態では、前記多標的融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、完全長抗ＶＥＧＦ抗体、完全長抗ＶＥＧＦＲ抗体、又は完全長抗ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦＲ二重特異性抗体、および前記抗体の２本の重鎖のそれぞれのＣ末端において有効に連結された１つのＣＤ８０ ＥＣＤを含む。

別の実施形態では、前記多標的融合タンパク質は、完全長抗ＶＥＧＦ抗体、完全長抗ＶＥＧＦＲ抗体、又は完全長抗ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦＲ二重特異性抗体、前記抗体の２本の重鎖のそれぞれのＮ末端において有効に連結された１つのＣＤ８０ ＥＣＤ、および前記抗体の２つの軽鎖のそれぞれのＮ末端において有効に連結された１つのＣＤ８０ ＥＣＤを含む。

さらに別の形態では、前記多標的融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、ＣＤ８０ ＥＣＤ、ＣＤ８０ ＥＣＤのＣ末端において有効に連結された二量体形態の免疫グロブリンＦｃドメイン、及び前記二量体形態の免疫グロブリンＦｃドメインのＣ末端において有効に連結された、抗ＶＥＧＦ抗体及び／又は抗ＶＥＧＦＲ抗体から誘導される抗原結合断片を含む。

さらに別の形態では、前記多標的融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、ＣＤ８０ ＥＣＤ、ＣＤ８０ ＥＣＤのＣ末端において有効に連結された二量体形態の免疫グロブリンＦｃドメイン、および前記二量体形態の免疫グロブリンＦｃドメインのＣ末端において有効に連結されたＶＥＧＦＲ細胞外受容体機能領域を含む。

ＩＩＩ．本発明の多標的融合タンパク質の製造および精製
本発明の多標的融合タンパク質は、例えば、固体ペプチド合成（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成）または組換え生産によって得ることができる。組換え生産のために、前記多標的融合タンパク質の各サブユニットをコードするポリヌクレオチドを分離し、宿主細胞内でさらにクローニングおよび／または発現させるために１つまたは複数のベクターに挿入する。前記ポリヌクレオチドは、従来の方法を用いて容易に分離および配列決定され得る。一実施形態では、本発明の１つ以上のポリヌクレオチドを含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。

発現ベクターは、当業者に周知の方法を用いて構築することができる。発現ベクターには、ウイルス、プラスミド、コスミド、ラムダファージ、または酵母人工染色体（ＹＡＣ）が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、二重発現カセットを有するグルタミンシンテターゼ高効率発現ベクターが使用される。

発現するための本発明の１つ以上のポリヌクレオチドを含む発現ベクターが調製されたら、発現ベクターは、適切な宿主細胞にトランスフェクトまたは導入され得る。この目的を達成するために、種々の技術、例えば、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、レトロウイルスの形質導入、ウイルストランスフェクション、遺伝子銃、リポソームに基づくトランスフェクション、または他の従来技術を使用することができる。

一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドを１種以上含む宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態において、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明の多標的融合タンパク質を産生するように操作され得る任意の種類の細胞系を指す。本発明の多標的融合タンパク質の複製および発現の支援に好適な宿主細胞は、当技術分野において周知である。そのような細胞は、必要に応じて、特定の発現ベクターでトランスフェクトまたは形質導入され得、大規模発酵槽への播種のために大量のベクター含有細胞を培養することによって、臨床用途のための十分な量の本発明の多標的融合タンパク質を得ることができる。適切な宿主細胞としては、大腸菌などの原核微生物、糸状菌または酵母などの真核微生物、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの様々な真核細胞、昆虫細胞などが挙げられる。懸濁培養に適した哺乳動物細胞株を使用することができる。有用な哺乳動物宿主細胞株の例としては、ＳＶ４０形質転換サル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７）、ヒト胎児腎臓系（ＨＥＫ２９３または２９３Ｆ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカーシア・グリーンサル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、骨髄腫細胞系、例えばＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３およびＳｐ２／０などを含むが、これらに限定されない。タンパク質を産生するのに適した哺乳動物宿主細胞株の概説は、例えば、Ｙａｚａｋｉ及びＷｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ編集，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），第２５５－２６８頁（２００３）を参照されたい。好ましい実施形態において、前記宿主細胞は、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３またはＮＳＯ細胞である。

これらの宿主細胞系における外来遺伝子の発現のための標準的な技術は、当技術分野において公知である。一実施形態では、本発明の多標的融合タンパク質を生成する方法が提供され、ここで、前記方法は、前記多標的融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む本明細書に提供される宿主細胞を、前記多標的融合タンパク質の発現に適した条件下で培養するとともに、および宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から前記多標的融合タンパク質を回収することを含む。

本明細書に記載されるように調製された多標的融合タンパク質は、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどの公知の技術によって精製することができる。特定のタンパク質を精製するための実際の条件は、正味の電荷、疎水性、親水性などの要因にも依存し、これらは当業者には明らかであろう。

本発明の多標的融合タンパク質の純度は、ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィーなどを含む、様々な周知の分析方法のいずれかによって決定することができる。本明細書に提供される多標的融合タンパク質の物理的／化学的特性および／または生物学的活性は、当該技術分野で公知の様々な測定方法によって同定、スクリーニング、または特徴付けることができる。

ＩＶ．併用療法
ＰＤ－１は、２つのリガンド、それぞれＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２を有する免疫抑制タンパク質である。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用は、例えば、腫瘍浸潤リンパ球の減少及び／又は癌細胞の免疫回避をもたらすことが知られている。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２との局所相互作用を阻害することにより免疫抑制を逆転させることができる。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ２との相互作用も阻止される場合、この効果は相加的である（ＩｗａｉＹ．ら、Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ＰＤ－Ｌ１ ｏｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｓｃａｐｅ ｆｒｏｍ ｈｏｓｔ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｂｙ ＰＤ－Ｌ１ ｂｌｏｃｋａｄｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００２、９９：１２２９３－７）。免疫応答調節における免疫チェックポイントＰＤ－１の信号伝達の重要性を考慮して、本発明は、本発明の多標的融合タンパク質と抗ＰＤ－１抗体とを含む、併用療法のための医薬組成物を開発している。

本明細書に記載の併用療法のための医薬組成物は、本発明の多標的融合タンパク質を用いた単独療法又は抗ＰＤ－１抗体を用いた単独療法と比較して、例えば、増強された抗癌効果、毒性の低下、及び／又は副作用の減少などの優れている有益効果を提供することができる。例えば、医薬組成物中の本発明の多標的融合タンパク質及び／または抗ＰＤ－１抗体は、単独療法投与と比較して、同じ治療効果を達成するのに必要とされる投与量よりも少ない投与量または短い投与時間で投与され得る。したがって、本発明はまた、併用療法のための医薬組成物を使用して癌を治療することを開示している。上記の医薬組成物の有効性は、当該技術分野において公知の細胞モデルおよび動物モデルにおいて試験することができる。

上記併用療法に含まれる抗ＰＤ－１抗体は、ＰＤ－１のリガンドへの結合を阻害又は低減することができる抗体であれば、いずれの抗ＰＤ－１抗体であってもよく、従来で知られている抗ＰＤ－１抗体及び将来開発される抗ＰＤ－１抗体を含む。抗ＰＤ－１抗体は、高い親和力で、例えば、１０^－８Ｍ以下、好ましくは１０^－９Ｍ～１０^－１２ＭのＫ_Ｄで、ＰＤ－１に特異的に結合することができ、それによって、リガンドＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２へのＰＤ－１の結合によって媒介される信号伝達経路をブロックすることができる。

本発明の併用療法に含まれる抗ＰＤ－１抗体のペアとなる重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）の例を、以下の表７に提供する。いくつかの実施形態では、本発明の併用療法における抗ＰＤ－１抗体は、表７に示すアミノ酸配列と実質的に同一の配列、例えば、表７に示すペアとなる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有する配列を含む。

一実施形態では、本発明の併用療法における抗ＰＤ－１抗体は、配列番号４７／４８、４９／５０、５１／５２、５３／５４、５５／５６、５７／５８、５９／６０、６１／６２、６３／６４、６５／６６、６７／６８、６９／７０、及び７１／７２からなる群から選択されるペアとなる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列に含まれる重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲの全てを含む。重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域のアミノ酸配列中のＣＤＲを同定するための方法および技術は、当技術分野において公知であり、かつ、本明細書に開示される特定の重鎖可変領域配列および／または軽鎖可変領域のアミノ酸配列中のＣＤＲを同定するために使用することができる。ＣＤＲ境界を同定するために使用することができる例示的な周知の技術としては、例えば、Ｋａｂａｔ定義法、Ｃｈｏｔｈｉａ定義法、及びＡｂＭ定義法が挙げられる。例えば、Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉら、Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８（１９９７）；およびＭａｒｔｉｎ ＡＣら，Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｌｏｏｐｓ：ａ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：９２６８－９２７２（１９８９）を参照されたい。

一実施形態では、本発明の併用療法における抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ、ピディリズマブ及びペンブロリズマブからなる群から選択される。

本発明の医薬組成物は、「治療有効量」又は「予防有効量」の本発明に記載の多標的融合タンパク質及び抗ＰＤ－１抗体を含み得る。「治療有効量」は、所望の用量でかつ所望の期間にわたって所望の治療結果を達成するのに有効な量を指す。治療有効量は、疾患状態、個体の年齢、性別、体重などの様々な要因に応じて変動させることができる。治療有効量は、任意の毒性または有害作用が治療上有益な効果に及ばさない量を指す。「治療有効量」は、治療を受けない被験者に対して、抑制測定可能なパラメータ（例えば、腫瘍増殖速度）は、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、なおより好ましくは少なくとも約８０％である。本発明の医薬組成物の抑制測定可能なパラメータ（例えば、腫瘍体積）の能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価することができる。

「予防有効量」は、所望の用量でかつ所望の期間にわたって所望の予防結果を効果的に達成する量を指す。一般に、予防有効量は、疾患の初期段階より前または疾患の初期段階で被験者に使用されるため、予防有効量は、治療有効量よりも少ない。

腫瘍免疫において、本発明の併用療法における多標的融合タンパク質及び抗ＰＤ－１抗体の治療方法は、実施例で実証したように、互いに相乗的であり得るため、本発明の医薬組成物は、腫瘍免疫のエスケープを防止するのに有利である。本発明の多標的融合タンパク質及び抗ＰＤ－１抗体を含む医薬組成物の共投与は、多標的融合タンパク質又は抗ＰＤ－１抗体を別々に投与することによって行うことができ、多標的融合タンパク質と抗ＰＤ－１抗体との併用製剤を単回投与することもできる。本発明の併用療法における、多標的融合タンパク質及び抗ＰＤ－１抗体の投与は、投与量及び投与期間の柔軟性を可能にする。

Ｖ．多標的融合タンパク質および医薬組成物の使用
本明細書に開示される多標的融合タンパク質および医薬組成物は、癌の治療的および予防的使用を有する。例えば、多標的融合タンパク質、及び抗ＰＤ－１抗体とのその組成物は、種々のがん性疾患を治療及び／又は予防するために、インビトロ若しくはエクスビボ培養細胞に、又は被験者、例えばヒト被験者に投与することができる。

一形態では、本発明は、多標的融合タンパク質又は本発明の医薬組成物を使用してインビボで被験者における血管内皮細胞の増殖をブロックし、Ｔ細胞を活性化する必要がある疾患を治療または予防し、それによって癌性腫瘍などの関連疾患の増殖もしくは発症、転移、または再発を阻害または低減することに関する。多標的融合タンパク質は、癌性腫瘍の増殖を阻害するか、またはその出現を予防するために単独で使用され得る。あるいは、多標的融合タンパク質は、他のがん治療剤／予防剤（例えば、抗ＰＤ－１抗体）と組み合わせて投与され得る。本発明の多標的融合タンパク質を抗ＰＤ－１抗体と投与する場合、この組合せは、任意の順序で又は同時に投与することができる。

したがって、一実施形態では、本発明は、被験者における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、治療有効量の本明細書に記載の多標的融合タンパク質または医薬組成物を被験者に投与することを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、被験者における腫瘍細胞の発生若しくは転移又は再発を予防する方法であって、予防有効量の本明細書に記載の多標的融合タンパク質又は医薬組成物を被験者に投与することを含む方法を提供する。

いくつかの実施形態では、多標的融合タンパク質または医薬組成物で治療及び／または予防される癌は、固形腫瘍、血液癌（例えば、白血病、リンパ腫、骨髄腫、例えば多発性骨髄腫）、及び転移性病巣が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、癌は固形腫瘍である。固形腫瘍の例としては、悪性腫瘍、例えば、肺、乳房、卵巣、リンパ系、消化管（例えば、結腸）、肛門、生殖器および尿生殖路（例えば、腎臓、膀胱上皮、膀胱細胞、前立腺）、咽頭、ＣＮＳ（例えば、脳、神経またはグリア細胞）、頭頸部、皮膚（例えば、黒色腫）、鼻咽頭（例えば、分化または未分化転移性または局所再発性鼻咽頭癌）および膵臓を侵入する癌などの多様な器官系の肉腫および癌、ならびに結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、小腸癌および食道癌などの悪性腫瘍を含む腺癌が挙げられる。癌は、初期、中期、もしくは後期、または転移性癌であり得る。

いくつかの実施形態では、癌は、黒色腫、乳癌、結腸癌、食道癌、消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）、腎臓癌（例えば腎細胞癌）、肝臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、頭頸部腫瘍、胃癌、造血器腫瘍（例えばリンパ腫）からなる群から選択される。

以下の実施例は、本発明の理解を助けるために記載される。実施例は、本発明の保護範囲を制限するものとして決して解釈されるべきではない。

実施例
実施例１、目的遺伝子を含むグルタミンシンテターゼ高効率発現ベクターの構築
（１）抗ＰＤ１抗体ＢＹ１８．１のコードヌクレオチドの合成及び発現ベクターの構築 Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｏｎｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ Ｎａｍｅ（ＩＮＮ）データベース中の９６２３番のニボルマブのアミノ酸配列データに従い、チャイニーズハムスター卵巣癌細胞（ＣＨＯ）での発現に適した下記のヌクレオチド配列に最適化し、このヌクレオチド配列の合成を上海捷瑞生物工程有限公司に委託した。前記ヌクレオチド配列の発現後に産生される抗ＰＤ１抗体は、本明細書では抗体ＢＹ１８．１として示される。

抗ＰＤ１抗体ＢＹ１８．１の軽鎖（ＢＹ１８．１Ｌ）ヌクレオチド配列（配列番号７３）：
ＣＴＣＧＡＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＣＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＣＣＴＧＴＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴＧＣＣＴＧＧＣＴＣＣＡＣＴＧＧＣＧＡＧＡＴＴＧＴＧＣＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＣＣＣＣＧＣＴＡＣＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＣＴＧＧＣＧＡＧＡＧＧＧＣＴＡＣＡＣＴＧＴＣＴＴＧＣＡＧＡＧＣＴＴＣＴＣＡＧＴＣＣＧＴＧＴＣＴＴＣＴＴＡＣＣＴＣＧＣＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＡＧＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＡＣＧＣＴＴＣＴＡＡＣＣＧＣＧＣＴＡＣＡＧＧＣＡＴＴＣＣＴＧＣＴＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＡＣＴＣＡＣＡＡＴＴＡＧＣＴＣＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＣＴＡＧＣＡＡＣＴＧＧＣＣＴＡＧＡＡＣＡＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＴＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＴＡＡＧＡＧＡＡＣＣＧＴＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＣＧＣＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＴＧＡＣＣＧＡＧＣＡＧＧＡＣＴＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＧＴＧＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＧＧＧＡＣＴＧＴＣＴＡＧＣＣＣＣＧＴＧＡＣＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＣＧＧＧＧＣＧＡＧＴＧＣＴＡＡＧＡＡＴＴＣ

抗ＰＤ１抗体ＢＹ１８．１の軽鎖（ＢＹ１８．１Ｌ）アミノ酸配列（配列番号７４）：
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＳＳＮＷＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

抗ＰＤ１抗体ＢＹ１８．１の重鎖（ＢＹ１８．１Ｈ）ヌクレオチド配列（配列番号７５）：
ＴＣＴＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＧＴＧＧＧＴＧＣＣＴＧＧＣＴＣＣＡＣＡＧＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＴＧＧＡＧＴＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＡＧＡＴＣＣＣＴＣＡＧＡＣＴＧＧＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＡＴＣＣＧＧＣＡＴＴＡＣＡＴＴＣＴＣＴＡＡＣＴＣＴＧＧＡＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＡＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＧＧＣＣＧＴＧＡＴＴＴＧＧＴＡＣＧＡＣＧＧＣＴＣＴＡＡＧＡＧＡＴＡＣＴＡＣＧＣＴＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＡＡＴＴＡＧＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＴＣＴＧＴＴＣＣＴＣＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＴＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＣＣＡＡＣＧＡＣＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＣＴＣＴＧＧＣＣＣＣＴＴＧＣＴＣＣＣＧＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＴＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＣＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＴＣＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＴＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＴＣＣＴＣＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＧＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＴＴＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＣＧＴＧＧＡＧＴＣＣＡＡＧＴＡＣＧＧＣＣＣＴＣＣＴＴＧＣＣＣＴＣＣＴＴＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＴＧＧＧＣＧＧＣＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＴＣＣＴＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＣＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＴＣＧＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＣＧＣＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＴＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＣＧＣＧＡＧＣＣＴＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＣＧＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＣＣＧＣＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＡＧＴＡＡ ＧＴＣＧＡＣ

抗ＰＤ１抗体ＢＹ１８．１の重鎖（ＢＹ１８．１Ｈ）アミノ酸配列（配列番号７６）：
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＤＣＫＡＳＧＩＴＦＳＮＳＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＫＲＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＦＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＮＤＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ

下線を付けた部分「ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ」は信号ペプチド配列である。

上海捷瑞生物工程有限公司は、前記ＢＹ１８．１Ｌコードヌクレオチド配列及びＢＹ１８．１Ｈコードヌクレオチド配列を合成した。それぞれ、ＢＹ１８．１ＬコードヌクレオチドをＸｈｏＩ－ＥｃｏＲＩで二重酵素で切断し、二重発現カセットを有するグルタミンシンテターゼ高効率発現ベクター（特許登録番号ＣＮ１０４１９５１７３Ｂ、北京比洋生物技術有限公司から入手）をＸｈｏＩ－ＥｃｏＲＩで二重酵素切断し、ＸｈｏＩ－ＥｃｏＲＩで二重酵素切断されたＢＹ１８．１Ｌコードヌクレオチドを、ＸｈｏＩ－ＥｃｏＲＩで二重酵素切断された二重発現カセットを有するグルタミンシンテターゼ高効率発現ベクターにリガーゼで連結してＢＹ１８．１Ｌコードヌクレオチドが導入された二重発現カセットを有するグルタミンシンテターゼ高効率発現ベクターを得た。次に、それぞれ、ＢＹ１８．１ＨコードヌクレオチドをＸｂａＩ－ＳａｌＩで二重酵素切断し、ＢＹ１８．１Ｌコードヌクレオチドが導入された二重発現カセットを有するグルタミンシンテターゼ高効率発現ベクターをＸｂａＩ－ＳａｌＩで二重酵素切断し、さらに、ＸｂａＩ－ＳａｌＩで二重酵素切断されたＢＹ１８．１Ｈコードヌクレオチドを、ＸｂａＩ－ＳａｌＩで二重酵素切断されたＢＹ１８．１Ｌコードヌクレオチドが導入された二重発現カセットを有するグルタミンシンテターゼ高効率発現ベクターにリガーゼで連結することにより、ＢＹ１８．１Ｌコードヌクレオチド及びＢＹ１８．１Ｈコードヌクレオチドが導入された二重発現カセットを有するグルタミンシンテターゼ高効率発現ベクターを得、配列決定により正確さを検証した後、発現させ、抗ＰＤ１抗体ＢＹ１８．１を得た。

あるいは、ＢＹ１８．１Ｈコードヌクレオチドが導入された二重発現カセットを有するグルタミンシンテターゼ高効率発現ベクターにＢＹ１８．１Ｌコードヌクレオチドを連結し、発現させて抗体ＢＹ１８．１を得ることもできる。

（２）ＣＤ８０細胞外ドメインと免疫グロブリンＦｃ領域とを含む融合タンパク質のコードヌクレオチドの合成および発現ベクターの構築
表１のＣＤ８０細胞外ドメインの配列および表６のＩｇＧ４ Ｆｃ配列に従って、チャイニーズハムスター卵巣癌細胞（ＣＨＯ）での発現に適したヌクレオチド配列に最適化し、以下の配列番号７７のポリヌクレオチド配列の合成を、上海捷瑞生物工程有限公司に委託した。前記ヌクレオチド配列の発現後に産生されるＣＤ８０－Ｆｃ融合タンパク質は、本明細書では融合タンパク質ＢＹ３１．１９としても表される。

融合タンパク質ＢＹ３１．１９（ＣＤ８０－Ｆｃ、ＩｇＧ４）のヌクレオチド配列（配列番号７７）
ＣＴＣＧＡＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＣＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＣＣＴＧＴＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴＧＣＣＴＧＧＣＴＣＣＡＣＴＧＧＣＧＴＣＡＴＣＣＡＴＧＴＧＡＣＣＡＡＡＧＡＧＧＴＣＡＡＡＧＡＡＧＴＣＧＣＡＡＣＴＣＴＧＴＣＴＴＧＣＧＧＡＣＡＣＡＡＣＧＴＣＴＣＣＧＴＣＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＣＣＣＡＧＡＣＴＡＧＡＡＴＡＴＡＴＴＧＧＣＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＡＴＧＴＣＣＧＧＣＧＡＴＡＴＧＡＡＣＡＴＴＴＧＧＣＣＴＧＡＧＴＡＣＡＡＧＡＡＣＣＧＧＡＣＡＡＴＣＴＴＣＧＡＴＡＴＴＡＣＴＡＡＴＡＡＣＣＴＧＡＧＴＡＴＣＧＴＧＡＴＴＣＴＣＧＣＴＣＴＧＣＧＣＣＣＴＡＧＣＧＡＣＧＡＧＧＧＣＡＣＡＴＡＣＧＡＧＴＧＴＧＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＴＡＣＧＡＧＡＡＧＧＡＴＧＣＡＴＴＣＡＡＧＣＧＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＣＣＧＡＣＴＴＣＣＣＡＡＣＣＣＣＡＴＣＴＧＡＣＡＡＧＣＧＣＧＴＧＧＡＧＴＣＣＡＡＧＴＡＣＧＧＣＣＣＴＣＣＴＴＧＣＣＣＴＣＣＴＴＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＴＧＧＧＣＧＧＣＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＴＣＣＴＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＣＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＴＣＧＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＣＧＣＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＴＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＣＧＣＧＡＧＣＣＴＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＣＧＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＣＣＧＣＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＧＣＴＡＡＧＡＡＴＴＣ

融合タンパク質ＢＹ３１．１９（ＣＤ８０－Ｆｃ、ＩｇＧ４）のアミノ酸配列（配列番号７８）
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＶＩＨＶＴＫＥＶＫＥＶＡＴＬＳＣＧＨＮＶＳＶＥＥＬＡＱＴＲＩＹＷＱＫＥＫＫＭＶＬＴＭＭＳＧＤＭＮＩＷＰＥＹＫＮＲＴＩＦＤＩＴＮＮＬＳＩＶＩＬＡＬＲＰＳＤＥＧＴＹＥＣＶＶＬＫＹＥＫＤＡＦＫＲＥＨＬＡＥＶＴＬＳＶＫＡＤＦＰＴＰＳＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
ここで、アミノ酸配列「ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ」は信号ペプチドである。

二重発現カセットを有するグルタミンシンテターゼ高効率発現ベクター（特許登録番号ＣＮ１０４１９５１７３Ｂ、北京比洋生物技術有限公司から入手）に、前記実施例１（１）と同様の方法を用いて、ＢＹ３１．１９コードヌクレオチドがＸｈｏＩ－ＥｃｏＲＩ二重酵素切断で連結された。配列決定により組換えベクターの正確さを検証した後、ＣＤ８０－Ｆｃ融合タンパク質発現に用いられる。発現されたＣＤ８０－Ｆｃ融合タンパク質は、融合タンパク質ＢＹ３１．１９と名付けられた。

（３）抗ＶＥＧＦ抗体とＣＤ８０細胞外ドメインとを含む融合タンパク質ＢＹ２４．４の、コードヌクレオチドの合成及び発現ベクターの構築
表１のＣＤ８０細胞外ドメインの配列、表２の抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列、表３の抗体の重鎖定常領域の配列、表４の抗体の軽鎖定常領域の配列、及び配列番号２０～４６のペプチドリンカー配列に従って、チャイニーズハムスター卵巣癌細胞（ＣＨＯ）での発現に適したヌクレオチド配列に最適化し、配列番号７９、８１に示すポリヌクレオチド配列の合成を、上海捷瑞生物工程有限公司に委託した。前記ヌクレオチド配列の発現後に産生される抗ＶＥＧＦ抗体－ＣＤ８０融合タンパク質は、本明細書では融合タンパク質ＢＹ２４．４として示される。

融合タンパク質ＢＹ２４．４（κ、ＩｇＧ４）の第１のサブユニット（ＢＹ２４．４Ｌ）ヌクレオチド配列（配列番号７９）：
ＣＴＣＧＡＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＴＡＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴＧＣＣＡＧＧＣＡＧＣＡＣＡＧＧＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＴＣＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＴＴＣＣＧＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＴＡＴＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＣＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＧＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＴＴＡＣＴＴＣＴＴＣＣＣＴＧＣＡＴＴＣＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＧＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＧＧＧＴＣＴＧＧＡＡＣＣＧＡＣＴＴＴＡＣＡＣＴＧＡＣＡＡＴＣＴＣＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡＡＧＡＣＴＴＴＧＣＣＡＣＣＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＡＣＴＣＣＡＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＧＣＡＡＧＧＡＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＧＡＧＧＡＣＣＧＴＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＣＣＧＣＣＡｇＣＧＴＧＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＣＧＣＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡｇＡＧＣＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＴＧＡＣＣＧＡＧＣＡＧＧＡＣＴＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＧＴＧＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＧＧＧＡＣＴＧＴＣＴＡＧＣＣＣＣＧＴＧＡＣＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＣＧＧＧＧＣＧＡＧＴＧＣＴＡＡＧＡＡＴＴＣ

融合タンパク質ＢＹ２４．４（κ、ＩｇＧ４）の第１のサブユニット（ＢＹ２４．４Ｌ）アミノ酸配列（配列番号８０）：
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＶＬＩＹＦＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＴＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴ ＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

融合タンパク質ＢＹ２４．４（κ、ＩｇＧ４）の第２のサブユニット（ＢＹ２４．４Ｈ）ヌクレオチド配列（配列番号８１）：
ＴＣＴＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＡＣＣＧＡＣＡＣＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴＧＣＣＡＧＧＣＴＣＴＡＣＡＧＧＣＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＧＡＡＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＣＴＧＧＴＧＣＡＡＣＣＡＧＧＧＧＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＣＴＧＴＣＣＴＧＣＧＣＣＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＡＡＴＴＡＣＧＧＣＡＴＧＡＡＴＴＧＧＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＡＣＡＣＣＴＡＣＡＣＣＧＧＣＧＡＧＣＣＣＡＣＣＴＡＣＧＣＣＧＣＴＧＡＣＴＴＴＡＡＧＡＧＧＡＧＧＴＴＣＡＣＣＴＴＣＴＣＴＣＴＧＧＡＣＡＣＣＴＣＣＡＡＧＴＣＣＡＣＣＧＣＴＴＡＣＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＴＣＴＣＴＧＡＧＧＧＣＴＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＡＧＴＡＣＣＣＣＣＡＴＴＡＣＴＡＣＧＧＧＴＣＣＴＣＣＣＡＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣＧＡＣＧＴＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＣＴＣＴＧＧＣＣＣＣＴＴＧＣＴＣＣＣＧＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＴＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＣＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＴＣＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＴＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＴＣＣＴＣＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＧＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＴＴＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＣＧＴＧＧＡＧＴＣＣＡＡＧＴＡＣＧＧＣＣＣＴＣＣＴＴＧＣＣＣＴＣＣＴＴＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＴＧＧＧＣＧＧＣＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＴＣＣＴＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＣＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＴＣＧＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＣＧＣＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＴＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＣＧＣＧＡＧＣＣＴＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＣＧＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＣＣＧＣＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＡＧＴＧＴＧＡＴＣＣＡＴＧＴＡＡＣＡＡＡＡＧＡＡＧＴＧＡＡＧＧＡＡＧＴＧＧＣＴＡＣＡＣＴＣＴＣＴＴＧＣＧＧＣＣＡＣＡＡＣＧＴＧＴＣＣＧＴＧＧＡＧＧＡＡＣＴＡＧＣＴＣＡＧＡＣＣＣＧＧＡＴＣＴＡＴＴＧＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＣＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＧＴＣＣＧＧＣＧＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＴＴＧＧＣＣＡＧＡＧＴＡＣＡＡＧＡＡＣＣＧＣＡＣＡＡＴＴＴＴＣＧＡＣＡＴＴＡＣＡＡＡＣＡＡＣＣＴＣＴＣＴＡＴＴＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＣＴＣＴＣＡＧＧＣＣＴＡＧＣＧＡＣＧＡＧＧＧＣＡＣＡＴＡＣＧＡＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＣＴＣＡＡＧＴＡＣＧＡＧＡＡＧＧＡＣＧＣＴＴＴＣＡＡＧＣＧＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＣＣＧＡＣＴＴＣＣＣＴＡＣＴＣＣＡＴＣＴＴＡＡＧＴＣＧＡＣ

融合タンパク質ＢＹ２４．４（κ、ＩｇＧ４）の第２のサブユニット（ＢＹ２４．４Ｈ）アミノ酸配列（配列番号８２）：
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲＲＦＴＦＳＬＤＴＳＫＳＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＹＰＨＹＹＧＳＳＨＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＩＨＶＴＫＥＶＫＥＶＡＴＬＳＣＧＨＮＶＳＶＥＥＬＡＱＴＲＩＹＷＱＫＥＫＫＭＶＬＴＭＭＳＧＤＭＮＩＷＰＥＹＫＮＲＴＩＦＤＩＴＮＮＬＳＩＶＩＬＡＬＲＰＳＤＥＧＴＹＥＣＶＶＬＫＹＥＫＤＡＦＫＲＥＨＬＡＥＶＴＬＳＶＫＡＤＦＰＴＰＳ

ここで、アミノ酸配列「ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ」は信号ペプチドである。

二重発現カセットを有するグルタミンシンテターゼ高効率発現ベクター（特許登録番号ＣＮ１０４１９５１７３Ｂ、北京比洋生物技術有限公司から入手）に、前記実施例１（１）と同様の方法を用いて、ＢＹ２４．４ＬコードヌクレオチドがＸｈｏＩ－ＥｃｏＲＩ二重酵素切断で連結され、さらに、ＢＹ２４．４Ｌコードヌクレオチドが連結された二重発現カセットを有するグルタミンシンテターゼ高効率発現ベクターに、ＢＹ２４．４ＨコードヌクレオチドがＸｂａＩ－ＳａｌＩ二重酵素切断によりクローニングされ、あるいは、その逆も同様である。配列決定により組換えベクターの正確さを検証した後、発現に用いられる。発現された抗ＶＥＧＦ抗体－ＣＤ８０融合タンパク質は、融合タンパク質ＢＹ２４．４と名付けられた。

（４）抗ＶＥＧＦＲ抗体とＣＤ８０細胞外ドメインとを含む融合タンパク質ＢＹ２４．５の、コードヌクレオチドの合成および発現ベクターの構築
表１のＣＤ８０細胞外ドメインの配列、表２の抗ＶＥＧＦＲ抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域配列、表３の抗体の重鎖定常領域配列、表４の抗体の軽鎖定常領域配列、及び配列番号２０～４６のペプチドリンカー配列に従って、チャイニーズハムスター卵巣癌細胞（ＣＨＯ）での発現に適したヌクレオチド配列として最適化し、配列番号８３、８５に示すポリヌクレオチド配列の合成を、上海捷瑞生物工程有限公司に委託した。前記ヌクレオチド配列の発現後に産生される抗ＶＥＧＦＲ抗体－ＣＤ８０融合タンパク質は、本明細書では融合タンパク質ＢＹ２４．５として示される。

融合タンパク質ＢＹ２４．５（κ、ＩｇＧ４）の第１のサブユニット（ＢＹ２４．５Ｌ）ヌクレオチド配列（配列番号８３）：
ＣＴＣＧＡＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＴＡＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴＧＣＣＡＧＧＣＡＧＣＡＣＡＧＧＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＴＡＧＣＴＣＣＧＴＧＡＧＣＧＣＣＴＣＴＡＴＣＧＧＣＧＡＣＡＧＡＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＡＧＣＴＴＣＴＣＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣＡＡＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＡＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＴＣＴＡＡＣＣＴＧＧＡＣＡＣＣＧＧＣＧＴＧＣＣＡＴＣＣＣＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＣＡＴＡＣＴＴＣＡＣＡＣＴＣＡＣＡＡＴＣＴＣＴＴＣＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＴＧＴＧＴＡＣＴＴＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＧＧＣＴＴＴＣＣＣＡＣＣＴＡＣＡＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＧＡＧＧＡＣＣＧＴＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＣＣＧＣＣＡｇＣＧＴＧＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＣＧＣＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡｇＡＧＣＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＴＧＡＣＣＧＡＧＣＡＧＧＡＣＴＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＧＴＧＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＧＧＧＡＣＴＧＴＣＴＡＧＣＣＣＣＧＴＧＡＣＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＣＧＧＧＧＣＧＡＧＴＧＣＴＡＡＧＡＡＴＴＣ

融合タンパク質ＢＹ２４．５（κ、ＩｇＧ４）の第１のサブユニット（ＢＹ２４．５Ｌ）アミノ酸配列（配列番号８４）：
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＩＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＤＮＷＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＤＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＹＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＦＡＶＹＦＣＱＱＡＫＡＦＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

融合タンパク質ＢＹ２４．５（κ、ＩｇＧ４）の第２のサブユニット（ＢＹ２４．５Ｈ）ヌクレオチド配列（配列番号８５）：
ＴＣＴＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＡＣＣＧＡＣＡＣＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴＧＣＣＡＧＧＣＴＣＴＡＣＡＧＧＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＴＣＧＴＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＧＧＣＴＣＣＣＴＣＡＧＡＣＴＧＴＣＴＴＧＣＧＣＴＧＣＴＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＣＡＴＴＣＴＣＴＴＣＣＴＡＣＴＣＴＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＡＣＡＧＧＣＴＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＴＣＣＡＧＣＡＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＧＣＴＣＴＴＡＣＡＴＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＧＡＴＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＣＧＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＴＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＴＡＧＡＧＴＧＡＣＣＧＡＣＧＣＴＴＴＣＧＡＣＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＴＣＴＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＣＴＣＴＧＧＣＣＣＣＴＴＧＣＴＣＣＣＧＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＴＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＣＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＴＣＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＴＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＴＣＣＴＣＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＧＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＴＴＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＣＧＴＧＧＡＧＴＣＣＡＡＧＴＡＣＧＧＣＣＣＴＣＣＴＴＧＣＣＣＴＣＣＴＴＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＴＧＧＧＣＧＧＣＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＴＣＣＴＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＣＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＴＣＧＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＣＧＣＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＴＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＣＧＣＧＡＧＣＣＴＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＣＧＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＣＣＧＣＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＡＧＴＧＴＧＡＴＣＣＡＴＧＴＡＡＣＡＡＡＡＧＡＡＧＴＧＡＡＧＧＡＡＧＴＧＧＣＴＡＣＡＣＴＣＴＣＴＴＧＣＧＧＣＣＡＣＡＡＣＧＴＧＴＣＣＧＴＧＧＡＧＧＡＡＣＴＡＧＣＴＣＡＧＡＣＣＣＧＧＡＴＣＴＡＴＴＧＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＣＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＧＴＣＣＧＧＣＧＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＴＴＧＧＣＣＡＧＡＧＴＡＣＡＡＧＡＡＣＣＧＣＡＣＡＡＴＴＴＴＣＧＡＣＡＴＴＡＣＡＡＡＣＡＡＣＣＴＣＴＣＴＡＴＴＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＣＴＣＴＣＡＧＧＣＣＴＡＧＣＧＡＣＧＡＧＧＧＣＡＣＡＴＡＣＧＡＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＣＴＣＡＡＧＴＡＣＧＡＧＡＡＧＧＡＣＧＣＴＴＴＣＡＡＧＣＧＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＣＣＧＡＣＴＴＣＣＣＴＡＣＴＣＣＡＴＣＴＴＡＡＧＴＣＧＡＣ

融合タンパク質ＢＹ２４．５（κ、ＩｇＧ４）の第２のサブユニット（ＢＹ２４．５Ｈ）アミノ酸配列（配列番号８６）：
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＳＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＴＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＩＨＶＴＫＥＶＫＥＶＡＴＬＳＣＧＨＮＶＳＶＥＥＬＡＱＴＲＩＹＷＱＫＥＫＫＭＶＬＴＭＭＳＧＤＭＮＩＷＰＥＹＫＮＲＴＩＦＤＩＴＮＮＬＳＩＶＩＬＡＬＲＰＳＤＥＧＴＹＥＣＶＶＬＫＹＥＫＤＡＦＫＲＥＨＬＡＥＶＴＬＳＶＫＡＤＦＰＴＰＳ

ここで、アミノ酸配列「ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ」は信号ペプチドである。

二重発現カセットを有するグルタミンシンテターゼ高効率発現ベクター（特許登録番号ＣＮ１０４１９５１７３Ｂ、北京比洋生物技術有限公司から入手）に、前記実施例１（１）と同様の方法を用いて、ＢＹ２４．５ＬコードヌクレオチドがＸｈｏＩ－ＥｃｏＲＩ二重酵素切断で連結され、さらに、ＢＹ２４．５Ｌコードヌクレオチドが連結された二重発現カセットを有するグルタミンシンテターゼ高効率発現ベクターに、ＢＹ２４．５ＨコードヌクレオチドがＸｂａＩ－ＳａｌＩ二重酵素切断によりクローニングされ、あるいは、その逆も同様である。配列決定により組換えベクターの正確さを検証した後、発現に用いられる。発現された抗ＶＥＧＦＲ抗体－ＣＤ８０融合タンパク質は、融合タンパク質ＢＹ２４．５と名付けられた。

（５）ＣＤ８０細胞外ドメイン、免疫グロブリンＦｃ領域、およびＶＥＧＦＲ細胞外受容体機能領域を含む融合タンパク質のコードヌクレオチドの合成および発現ベクターの構築
表１のＣＤ８０細胞外ドメインの配列、表６のＩｇＧ４ Ｆｃ配列、および表５のＶＥＧＦＲ機能性領域配列（ＶＥＧＦＲ１－Ｄ２／ＶＥＧＦＲ２－Ｄ３）に従って、チャイニーズハムスター卵巣癌細胞（ＣＨＯ）での発現に適したヌクレオチド配列に最適化し、配列番号８７に示すポリヌクレオチド配列の合成を、上海捷瑞生物工程有限公司に委託した。前記ヌクレオチド配列の発現後に産生されるＣＤ８０－Ｆｃ－ＶＥＧＦＲ融合タンパク質は、本明細書では融合タンパク質ＢＹ２４．１２として示される。

融合タンパク質ＢＹ２４．１２（ＣＤ８０－Ｆｃ－ＶＥＧＦＲ）のヌクレオチド配列（配列番号８７）
ＣＴＣＧＡＧＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＣＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＣＣＴＧＴＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴＧＣＣＴＧＧＣＴＣＣＡＣＴＧＧＣＧＴＣＡＴＣＣＡＴＧＴＧＡＣＣＡＡＡＧＡＧＧＴＣＡＡＡＧＡＡＧＴＣＧＣＡＡＣＴＣＴＧＴＣＴＴＧＣＧＧＡＣＡＣＡＡＣＧＴＣＴＣＣＧＴＣＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＣＣＣＡＧＡＣＴＡＧＡＡＴＡＴＡＴＴＧＧＣＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＡＴＧＴＣＣＧＧＣＧＡＴＡＴＧＡＡＣＡＴＴＴＧＧＣＣＴＧＡＧＴＡＣＡＡＧＡＡＣＣＧＧＡＣＡＡＴＣＴＴＣＧＡＴＡＴＴＡＣＴＡＡＴＡＡＣＣＴＧＡＧＴＡＴＣＧＴＧＡＴＴＣＴＣＧＣＴＣＴＧＣＧＣＣＣＴＡＧＣＧＡＣＧＡＧＧＧＣＡＣＡＴＡＣＧＡＧＴＧＴＧＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＴＡＣＧＡＧＡＡＧＧＡＴＧＣＡＴＴＣＡＡＧＣＧＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＣＣＧＡＣＴＴＣＣＣＡＡＣＣＣＣＡＴＣＴＧＡＣＡＡＧＣＧＣＧＴＧＧＡＧＴＣＣＡＡＧＴＡＣＧＧＣＣＣＴＣＣＴＴＧＣＣＣＴＣＣＴＴＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＴＧＧＧＣＧＧＣＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＴＣＣＴＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＣＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＴＣＧＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＣＧＣＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＴＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＣＧＣＧＡＧＣＣＴＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＣＧＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＣＣＧＣＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＡＧＴＧＣＴＴＣＣＧＡＣＡＣＣＧＧＣＣＧＣＣＣＴＴＴＣＧＴＧＧＡＧＡＴＧＴＡＣＴＣＣＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＧＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＴＧＡＣＣＧＡＧＧＧＣＣＧＣＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＴＣＣＣＴＴＧＣＣＧＣＧＴＧＡＣＣＴＣＣＣＣＴＡＡＣＡＴＣＡＣＣＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＡＡＧＴＴＣＣＣＴＣＴＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＣＣＣＴＧＡＣＧＧＣＡＡＧＣＧＣＡＴＣＡＴＣＴＧＧＧＡＣＴＣＣＣＧＣＡＡＧＧＧＣＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴＣＣＡＡＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＧＧＡＧＡＴＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＴＧＣＧＡＧＧＣＣＡＣＣＧＴＧＡＡＣＧＧＣＣＡＣＣＴＧＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＡＣＴＡＣＣＴＧＡＣＣＣＡＣＣＧＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＧＡＣＧＴＧＧＴＧＣＴＧＴＣＣＣＣＴＴＣＣＣＡＣＧＧＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＴＣＣＧＴＧＧＧＣＧＡＧＡＡＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＣＴＧＣＡＣＣＧＣＣＣＧＣＡＣＣＧＡＧＣＴＧＡＡＣＧＴＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣＴＴＣＡＡＣＴＧＧＧＡＧＴＡＣＣＣＴＴＣＣＴＣＣＡＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＡＡＧＡＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＣＣＧＣＧＡＣＣＴＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＧＴＴＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＧＡＣＧＧＣＧＴＧＡＣＣＣＧＣＴＣＣＧＡＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＣＣＴＧＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＣＴＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣＡＣＣＴＴＣＧＴＧＣＧＣＧＴＧＣＡＣＧＡＧＴＡＡＧＡＡＴＴＣ

融合タンパク質ＢＹ２４．１２（ＣＤ８０－Ｆｃ－ＶＥＧＦＲ）のアミノ酸配列（配列番号８８）
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＶＩＨＶＴＫＥＶＫＥＶＡＴＬＳＣＧＨＮＶＳＶＥＥＬＡＱＴＲＩＹＷＱＫＥＫＫＭＶＬＴＭＭＳＧＤＭＮＩＷＰＥＹＫＮＲＴＩＦＤＩＴＮＮＬＳＩＶＩＬＡＬＲＰＳＤＥＧＴＹＥＣＶＶＬＫＹＥＫＤＡＦＫＲＥＨＬＡＥＶＴＬＳＶＫＡＤＦＰＴＰＳＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＳＤＴＧＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲＥＬＶＩＰＣＲＶＴＳＰＮＩＴＶＴＬＫＫＦＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫＲＩＩＷＤＳＲＫＧＦＩＩＳＮＡＴＹＫＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫＴＮＹＬＴＨＲＱＴＮＴＩＩＤＶＶＬＳＰＳＨＧＩＥＬＳＶＧＥＫＬＶＬＮＣＴＡＲＴＥＬＮＶＧＩＤＦＮＷＥＹＰＳＳＫＨＱＨＫＫＬＶＮＲＤＬＫＴＱＳＧＳＥＭＫＫＦＬＳＴＬＴＩＤＧＶＴＲＳＤＱＧＬＹＴＣＡＡＳＳＧＬＭＴＫＫＮＳＴＦＶＲＶＨＥ

二重発現カセットを有するグルタミンシンテターゼ高効率発現ベクター（特許登録番号ＣＮ１０４１９５１７３Ｂ、北京比洋生物技術有限公司から入手）に、前記実施例１（１）と同様の方法を用いて、ＢＹ２４．１２コードヌクレオチドがＸｈｏＩ－ＥｃｏＲＩ二重酵素切断で連結された。配列決定により組換えベクターの正確さを検証した後、発現に用いられる。発現された融合タンパク質は、融合タンパク質ＢＹ２４．１２と名付けられた。

実施例２、目的タンパク質の発現および精製
（１）目的タンパク質の一過性発現
２９３Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能、カタログ番号１１６２５－０１９）細胞を、無血清ＣＤ ２９３培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能、カタログ番号１１９１３－０１９）中で懸濁培養した。トランスフェクション前の細胞培養物を遠心分離して細胞ペレットを得、細胞濃度が１×１０^６細胞／ｍｌとなるように新鮮な無血清ＣＤ２９３培養液に細胞を懸濁した。細胞懸濁液を振盪フラスコに入れた。実施例１で調製した目的遺伝子を含む組換え発現ベクタープラスミドの各ＤＮＡ２５０ｕｇとポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号４０８７２７）５００ｕｇをそれぞれ、細胞懸濁液１００ｍｌを例に、無血清ＣＤ２９３培養液１ｍｌに加えて混合し、室温で８分間静置した後、ＰＥＩ／ＤＮＡ懸濁液を、細胞懸濁液１００ｍｌを入れた振盪フラスコに滴下した。穏やかに混合し、５％のＣＯ_２、３７℃の振盪に置いて培養した（１２０回転／分）。５日後に培養上清を採取した。

（２）発現タンパク質の精製
上記の実施例２（１）で回収した培養上清中に存在する目的タンパク質を、ｐＨ７．４のＰＢＳ溶液で平衡化したＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ １ｍｌカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製品、カタログ番号：１１－００３４－９３）を用いて精製した。手短に述べると、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ １ｍｌカラムを、ｐＨ７．４のＰＢＳ溶液を用いて０．５ｍｌ／分の流速で、１０カラム床体積で平衡化した。上記実施例２（１）で回収した培養上清を、０．４５μｍろ過膜を用いてろ過した後、ｐＨ７．４のＰＢＳ溶液で平衡化したＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ １ｍｌカラムにローディングし、上清をロードした後、該カラムをまずｐＨ７．４のＰＢＳ溶液で流速０．５ｍｌ／分で５～１０個のカラム床の体積を洗浄し、その後に１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）で流速０．５ｍｌ／分で溶出する。溶出ピークを収集し、目的タンパク質ＢＹ１８．１、ＢＹ３１．１９、ＢＹ２４．４、ＢＹ２４．５、ＢＹ２４．１２がそれぞれ溶出ピークに存在する。

それぞれの目的タンパク質ＢＹ１８．１、ＢＹ３１．１９、ＢＹ２４．４、ＢＹ２４．５、ＢＹ２４．１２の純度および分子量を、還元剤（５ｍＭの１，４－ジチオトレイトール）の存在下でＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動およびクマシーブルーによる染色によって分析した。その結果を、分子量理論予測値と実測値とを合わせて、下記の表８に示す。真核生物発現系ではタンパク質に対するグリコシル化作用があるため、分子量実測値は理論予測値よりも若干高い値となる。

実施例３、ＥＬＩＳＡ法を用いた特異的結合効果の検出
組換えヒトＣＤ２８（北京義翹神州生物技術有限公司製、カタログ番号：５０１０３－Ｍ０８Ｈ）、組換えヒトＰＤ－Ｌ１（北京百普賽斯生物科技有限公司、カタログ番号：ＰＤ１－Ｈ５２２９）、組換えヒトＣＴＬＡ－４（北京義翹神州生物技術有限公司製、カタログ番号：１１１５９－Ｈ０８Ｈ）をそれぞれ０．５μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌに希釈し、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、品番：４２５９２）でコーティングした。上記実施例２（２）で精製した融合タンパク質ＢＹ２４．４、ＢＹ２４．５、ＢＹ２４．１２、ＢＹ３１．１９を２０００μｇ／ｍｌに希釈し、次に３倍のシリーズ希釈を行い、合計１６個の勾配を希釈し、各濃度勾配に対して複穴検出を行った。希釈試料５０μＬを、上記の組み換えヒトＣＤ２８、組み換えヒトＣＴＬＡ－４、または組み換えヒトＰＤ－Ｌ１でコーティングした９６ウェルプレートにそれぞれ加え、３７℃で２時間インキュベートした。３回洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒト二次抗体（北京中衫金橋公司製、品番ＺＤＲ－５３０１）を加え、３７℃で１時間インキュベートした。３回洗浄後、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質発色液（北京康偉世紀生物科技有限公司、製品番号：ＣＷ００５０）５０μｌ／ウェルを加えた。１０分後、２ＮのＨ_２ＳＯ_４を加えて発色を終了した。ＥＬＩＳＡリーダーを用いて、４５０ｎｍで各ウェルの吸光度ＯＤ値を決定した。

ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５ソフトウェアを用いて、吸光度ＯＤ値に対する融合タンパク質ＢＹ２４．４、ＢＹ２４．５、ＢＹ２４．１２、およびＢＹ３１．１９のタンパク質濃度をプロットし、データをフィッティングして、融合タンパク質によって媒介される特異的結合効果の半分最大有効濃度ＥＣ５０値を得た。結果を下記表９に示す。

ＥＬＩＳＡの結果は、本発明の多標的融合タンパク質ＢＹ２４．４、ＢＹ２４．５、ＢＹ２４．１２および陽性対照としてのＢＹ３１．１９のいずれもが、組み換えヒトＰＤ－Ｌ１、組み換えヒトＣＤ２８およびＣＴＬＡ－４に結合できることを示す。ＣＴＬＡ－４に対する結合能は、各融合タンパク質が最も強く、ＰＤ－Ｌがその次で、ＣＤ２８が最も弱い。

実施例４、ＢｉａｃｏｒｅＴ１００を用いて本発明の目的タンパク質のターゲットへの親和力の測定
表面プラズモン共鳴測定は、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、スウェーデン）で２５℃で行った。

まず、抗ＩｇＧ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号：ＢＲ－１００８－３９）をアミドカップリングによりＣＭ５チップ上に共有結合で固定化した。６０μｌのＮ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及び６０μｌのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）でＣＭ５チップを活性化し、次に、５μｌの抗ＩｇＧ抗体に９５μｌの希釈緩衝液ＨＢＳＴ（０．１ＭＨＥＰＥＳ、１．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４、０．００５％ｔｗｅｅｎ２０）を加えて０．２ｕｍのフィルターで濾過した後、アミドカップリングによって抗ＩｇＧ抗体をＣＭ５チップ上に共有固定化して、約９０００－１４０００共鳴単位（ＲＵ）の捕捉系を得た。ＣＭ５チップを１２０μｌのエタノールアミンでブロッキングした。

次に、実施例２で調製した本発明の各目的タンパク質をそれぞれ５μｇ／ｍｌに希釈し、この希釈液を流速１０μＬ／分で２分間注射し、実施例２で調製した本発明の各目的タンパク質をそれぞれのＦｃ領域を通じてＣＭ５チップ表面に非共有結合的に捕捉した。得られた複合体は、測定及び再生中のベースラインのドリフトを回避するためにＥＤＣ／ＮＨＳでの架橋によって安定化された。

結合抗原ＰＤ－１（北京義翹神州生物技術有限公司製、カタログ番号：１０３７７－Ｈ０８Ｈ）、ＶＥＧＦ１６５（北京義翹神州生物技術有限公司製、カタログ番号：１１０６６－ＨＮＡＨ）、マウスＶＥＧＦ１６４（北京義翹神州生物技術有限公司製、カタログ番号：５０１５９－ＭＮＡＢ）及びＶＥＧＦＲ２（北京義翹神州生物技術有限公司製、カタログ番号：１００１２－Ｈ０２Ｈ１）を、それぞれ、濃度勾配：７ｎＭ、２２ｎＭ、６６ｎＭ、２００ｎＭ、６００ｎＭとなるように調製した。１回当たり１８０秒間の流速３０μｌ／分で注入し、６００秒間の解離時間で、結合を測定した。３ＭのＭｇＣｌ_２溶液で３０秒間、流量１０μＬ／分で洗浄することにより、表面を再生した。ＢＩＡ評価ソフトウェア（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、スウェーデン）を用いてデータ分析を行い、下記表１０に示すアフィニティデータを得た。

融合タンパク質ＢＹ２４．４、ＢＹ２４．５、ＢＹ２４．１２は、各々のターゲットとのＫ_Ｄ（Ｍ）が１０^－９Ｍ未満であることから、各々のターゲットとの高い親和力を示し、特に融合タンパク質ＢＹ２４．１２は、マウスおよびヒトＶＥＧＦ－Ａの両方に高親和力で結合してもよく、それほど大きくは異ならないことが分かる。

実施例５、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）におけるＩＦＮ－γ分泌に対する本発明の目的タンパク質およびその組成物の影響
異なる健常ヒトに由来するＣＤ４^＋Ｔリンパ球及び樹状細胞（ＤＣ）は、北京時合生科学技術株式会社から購入した。ＣＤ４^＋Ｔリンパ球及び樹状細胞（ＤＣ）を、それぞれ、９６ウェル細胞培養プレートに１×１０^５細胞／ウェル及び１×１０^４細胞／ウェルで播種した。試験を、それぞれＢＹ１８．１群（１．０μｇ／ｍＬ）、ＢＹ２４．４群（１．１４μｇ／ｍＬ）、ＢＹ２４．４（１．１４μｇ／ｍＬ）＋ＢＹ１８．１（１．０μｇ／ｍＬ）、ＢＹ２４．５（１．１４μｇ／ｍＬ）＋ＢＹ１８．１（１．０μｇ／ｍＬ）、ＢＹ２４．１２（０．８４μｇ／ｍＬ）、およびＢＹ２４．１２（０．８４μｇ／ｍＬ）＋ＢＹ１８．１（１．０μｇ／ｍＬ）の７群に分けた。各群の３つのウェルに対して、要求に従って、抗体ＢＹ１８．１、融合タンパク質ＢＹ２４．４、ＢＹ２４．５、ＢＹ２４．１２、または抗体ＢＹ１８．１と各融合タンパク質ＢＹ２４．４、ＢＹ２４．５、ＢＹ２４．１２との組合せを、示される最終濃度まで添加する。最終的に１０％の牛胎児血清を含む１６４０培地を最終容量が２００μｌとなるように添加した。３７℃、５％のＣＯ_２で培養する。

培養５日後、これらの７つの試験群のいずれにおいても、ペレット化細胞が多く、シャトル細胞および接着細胞のかなりの部分が出現した。培養上清を採取し、各組のＩＦＮ－γの発現レベルを、依科賽生物科技有限公司製のＩＦＮ－γキット（品番：ＥＨ００８－９６ＥＬＩＳＡ）を用いて測定した。

検出結果は、抗体ＢＹ１８．１群（２２２１．８±３６４．５ｐｇ／ｍｌ）と比較して、単独した融合タンパク質群（９２４．１±２２１．９ｐｇ／ｍｌ）、融合タンパク質群（７６０．１±２８６．８ｐｇ／ｍｌ）及び融合タンパク質群（７９３．４±１３９．２ｐｇ／ｍｌ）のいずれもが抗体ＢＹ１８．１群（Ｐ＜０．０１）よりも顕著に低いＩＦＮ－γ分泌であったが、融合タンパク質ＢＹ２４．４、融合タンパク質ＢＹ２４．５及び融合タンパク質ＢＹ２４．１２にＢＹ１８．１がそれぞれ添加されると、各群のＩＦＮ－γ分泌はいずれも顕著に向上し、各群のＩＦＮ－γ分泌がそれぞれ、ＢＹ２４．４＋ＢＹ１８．１群（３４９４．２±３６４．５ｐｇ／ｍｌ）、ＢＹ２４．５＋ＢＹ１８．１群（３５２３．８±４６５．１ｐｇ／ｍｌ）及びＢＹ２４．１２＋ＢＹ１８．１群（３８０１．８±７０２．２ｐｇ／ｍｌ）であった。このことから、融合タンパク質ＢＹ２４．４、ＢＹ２４．５およびＢＹ２４．１２とＢＹ１８．１とのそれぞれの組合せは、ＩＦＮ－γ分泌の顕著な増加（Ｐ＜０．０１）をもたらすことができ、抗体ＢＹ１８．１（ＰＤ－１抗体）と本発明の多標的化融合タンパク質ＢＹ２４．４、ＢＹ２４．５およびＢＹ２４．１２との組合せが、ＩＦＮ－γ分泌に対する顕著な相乗効果を有することが示された。

実施例６、本発明の多標的融合タンパク質とＰＤ－１抗体との相乗効果
本実施例の主な目的は、本発明の多標的化融合タンパク質とＰＤ－１抗体とのインビボ抗腫瘍における相乗効果を検討することであり、従って、ＰＤ－１抗体及び各融合タンパク質の用量は、いずれも低用量であり、高用量では腫瘍抑制効果が良好でＰＤ－１抗体及び各融合タンパク質相互間の相乗効果は見られない可能性がある。

ＲＰＭＩ－１６４０培地中のマウス由来結腸癌細胞ＣＴ２６（ＡＴＣＣ）を、１×１０^６細胞／マウスの量で、約１８ｇの６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの右側前腹部皮下に１００μｌ／マウスで播種した。マウス由来結腸癌細胞を、０日目にＣＴ２６接種を行った。平均腫瘍体積が約９３ｍｍ^３に達したら、担癌マウスを、各６匹ずつ、合計５群にランダムにグループ化した。モル量は分子量の大きさから計算し、融合タンパク質ＢＹ３１．１９、ＢＹ２４．１２及び抗ｍＰＤ－１抗体は同等のモル量で投与した。具体的には、グループ分け及び投与量はそれぞれ、ビヒクル（ＰＢＳ）対照群、融合タンパク質ＢＹ３１．１９（１．６ｍｇ／ｋｇ）群、融合タンパク質ＢＹ２４．１２（２．５ｍｇ／ｋｇ）群、抗ｍＰＤ－１（３．０ｍｇ／ｋｇ、ＢｉｏＸｃｅｌｌから入手可能、クローン番号：ＲＭＰ１－１４、製品番号：ＢＥ０１４６）群、融合タンパク質ＢＹ２４．１２（２．５ｍｇ／ｋｇ）＋抗ｍＰＤ－１（３ｍｇ／ｋｇ）群。１週間に２回投与した。腫瘍体積の測定は週に３回行い、腫瘍体積の測定と同時にマウスの体重を秤量し、マウスの体重及び腫瘍体積の変化と投与時間との関係を記録した。試験の最後に、マウスを安楽死させ、血清及び腫瘍を採取し、血清を－８０℃まで凍結保存し、腫瘍を、秤量写真の後、ホルマリン固定及びパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）を経て組織サンプルとして調製した。各データを統計学的に分析し、各治療群とビヒクル対照群の相対腫瘍体積比（Ｔ／Ｃ）％（すなわち、（投与群腫瘍体積変化の平均値／ＰＢＳビヒクル対照群腫瘍体積変化の平均）ｘ１００％）及び腫瘍成長阻害率（Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ％）を（１－Ｔ／Ｃ）％として計算した。

試験終了時点で、ＢＹ３１．１９群、ＢＹ２４．１２群、ＰＤ－１群、ＢＹ２４．１２＋抗ｍＰＤ－１群の腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩ％）は腫瘍体積基準で、それぞれ、１５％、１７％、２４％、４７％と異なった抑制効果であった。免疫融合タンパク質ＢＹ２４．１２とＰＤ－１抗体との併用は、ＢＹ２４．１２とＰＤ－１を単独で使用する場合よりも腫瘍に対する阻害効果が著しく良好であり、したがって、両者間に相乗効果が存在する。

各群の動物は投与後体重増加が続き、全体の状態は良好で顕著な異常は見られず、顕著な薬物停止や動物の死亡は認められなかった。

Claims (14)

1. 血管内皮細胞の増殖をブロックし、Ｔ細胞を活性化する多標的融合タンパク質であって、血管内皮増殖阻害剤ドメイン（ｉ）、免疫グロブリンＦｃドメイン（ｉｉ）、およびＣＤ８０細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ｉｉｉ）を含む、多標的融合タンパク質。
2. 前記（ｉ）は、抗ＶＥＧＦ抗体及び／又は抗ＶＥＧＦＲ抗体から誘導される抗原結合断片及び／又はＶＥＧＦＲ細胞外受容体機能領域を含み、
   好ましくは、前記抗ＶＥＧＦ抗体及び／又は抗ＶＥＧＦＲ抗体の抗原結合断片は、抗ＶＥＧＦ抗体及び／又は抗ＶＥＧＦＲ抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖであり、より好ましくは、前記抗ＶＥＧＦ抗体及び／又は抗ＶＥＧＦＲ抗体の抗原結合断片は、配列番号１／２、３／４及び５／６から選択される、ペアとなる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列に含まれる重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲの６個全て、又は前記６個全ての重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲの１個以上と１、２、３、４、又は５個のアミノ酸変化（例えば、アミノ酸置換又は欠失）を有する配列を含み、さらに好ましくは、前記抗ＶＥＧＦ抗体及び／又は抗ＶＥＧＦＲ抗体の抗原結合断片は、配列番号１／２、３／４及び５／６から選択される、ペアとなる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列、又は前記ペアとなる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有する配列を含み、最も好ましくは、前記抗ＶＥＧＦ抗体及び／又は抗ＶＥＧＦＲ抗体の抗原結合断片は、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ、Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ、又はＲａｍｕｃｉｒｕｍａｂのＦａｂであり、
   好ましくは、ＶＥＧＦＲ細胞外受容体機能領域は、ＶＥＧＦＲ１の免疫グロブリン様ドメイン２およびＶＥＧＦＲ２の免疫グロブリン様ドメイン３を含み、または、前記ＶＥＧＦＲ細胞外受容体機能領域は、ＶＥＧＦＲ１の免疫グロブリン様ドメイン２、ＶＥＧＦＲ２の免疫グロブリン様ドメイン３およびＶＥＧＦＲ２の免疫グロブリン様ドメイン４を含み、または、前記ＶＥＧＦＲ細胞外受容体機能領域は、ＶＥＧＦＲ１の免疫グロブリン様ドメイン２を含み、より好ましくは、前記ＶＥＧＦＲ細胞外受容体機能領域は、配列番号７～９に示すアミノ酸配列から選択されるもの、または配列番号７～９に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を有する任意のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の多標的融合タンパク質。
3. 前記（ｉｉ）は、ヒト免疫グロブリンＦｃドメインであり、好ましくは、前記（ｉｉ）は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃドメインであり、より好ましくは、前記（ｉｉ）は、配列番号１０、１１または１２に示すアミノ酸配列のＦｃドメインを含み、または配列番号１０、１１または１２に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するＦｃドメインを含む、請求項１または２に記載の多標的融合タンパク質。
4. 前記（ｉｉｉ）は、ヒトＣＤ８０ ＥＣＤを含み、好ましくは、前記（ｉｉｉ）は、ヒトＣＤ８０ ＩｇＶまたはヒトＣＤ８０ ＩｇＶＩｇＣを含み、より好ましくは、前記（ｉｉｉ）は、配列番号１３または１４に示すアミノ酸配列、または配列番号１３または１４に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の多標的融合タンパク質。
5. 前記（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の間のペプチドリンカーをさらに含み、好ましくは、前記ペプチドリンカーは、１つ以上のアミノ酸を含み、より好ましくは、少なくとも５つのアミノ酸を含み、最も好ましくは、配列番号２０～４６から選択されるペプチドリンカーを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の多標的融合タンパク質。
6. 前記融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の順、（ｉｉｉ）、（ｉ）および（ｉｉ）の順、または（ｉｉｉ）、（ｉｉ）および（ｉ）の順で有効に連結される、請求項１～５のいずれか一項に記載の多標的融合タンパク質。
7. （ａ）完全長抗ＶＥＧＦ抗体、完全長抗ＶＥＧＦＲ抗体、又は完全長抗ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦＲ二重特異性抗体、および前記抗体の２本の重鎖のそれぞれのＣ末端において有効に連結されたＣＤ８０ ＥＣＤ、
   （ｂ）完全長抗ＶＥＧＦ抗体、完全長抗ＶＥＧＦＲ抗体、又は完全長抗ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦＲ二重特異性抗体、前記抗体の２本の重鎖のそれぞれのＮ末端において有効に連結された１つのＣＤ８０ ＥＣＤ、および前記抗体の２つの軽鎖のそれぞれのＮ末端において有効に連結された１つのＣＤ８０ ＥＣＤ、
   （ｃ）ＣＤ８０ ＥＣＤ、ＣＤ８０ ＥＣＤのＣ末端において有効に連結された二量体形態の免疫グロブリンＦｃドメイン、及び前記二量体形態の免疫グロブリンＦｃドメインのＣ末端において有効に連結された、抗ＶＥＧＦ抗体及び／又は抗ＶＥＧＦＲ抗体から誘導される抗原結合断片、
   又は
   （ｄ）ＣＤ８０ ＥＣＤ、ＣＤ８０ ＥＣＤのＣ末端において有効に連結された二量体形態の免疫グロブリンＦｃドメイン、および前記二量体形態の免疫グロブリンＦｃドメインのＣ末端において有効に連結されたＶＥＧＦＲ細胞外受容体機能領域を含み、
   好ましくは、前記抗体は、ＩｇＧクラスの抗体、特にＩｇＧ_１サブクラス、ＩｇＧ_２サブクラス、ＩｇＧ_４サブクラスの抗体であり、より特にＩｇＧ_４サブクラスの抗体であり、さらに好ましくは、前記ＩｇＧ_４サブクラスの抗体は、Ｆｃドメイン中のＳ２２８位にアミノ酸による置換を含み、より好ましくはアミノ酸によるＳ２２８Ｐ置換であり、さらに好ましくは、前記抗体の軽鎖型は、それぞれκ型またはλ型であり、好ましくはκ型であり、
   好ましくは、前記全長抗ＶＥＧＦ抗体は、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂであり、前記全長抗ＶＥＧＦＲ抗体は、Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂである請求項６に記載の多標的融合タンパク質。
8. 配列番号８０の融合タンパク質の第１のサブユニットおよび配列番号８２の融合タンパク質の第２のサブユニットを含む融合タンパク質（１）と、
   配列番号８４の融合タンパク質の第１のサブユニットおよび配列番号８６の融合タンパク質の第２のサブユニットを含む融合タンパク質（２）と、
   配列番号８８の融合タンパク質サブユニットを含む融合タンパク質（３）とからなる群から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の多標的融合タンパク質。
9. 請求項１～８のいずれか一項に記載の多標的融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
10. 請求項９に記載のポリヌクレオチドを含むベクターであって、好ましくは発現ベクターであり、最も好ましくは二重発現カセットを有するグルタミンシンテターゼ発現ベクターである、ベクター。
11. 請求項９に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１０に記載のベクターを含む宿主細胞であって、好ましくはＣＨＯ、ＨＥＫ２９３またはＮＳＯ細胞である、宿主細胞。
12. 請求項１～８のいずれか一項に記載の多標的融合タンパク質を生成するための方法であって、前記多標的融合タンパク質の発現に適した条件下で、請求項１１に記載の宿主細胞を培養するステップ（ｉ）と、前記融合タンパク質を回収するステップ（ｉｉ）とを含む、方法。
13. 請求項１～８のいずれか一項に記載の多標的融合タンパク質と、抗ＰＤ－１抗体とを含み、好ましくは前記抗ＰＤ－１抗体が、配列番号４７／４８、４９／５０、５１／５２、５３／５４、５５／５６、５７／５８、５９／６０、６１／６２、６３／６４、６５／６６、６７／６８、６９／７０および７１／７２からなる群より選択される、ペアとなる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列に含まれる重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲの６個全て、又は前記６個全ての重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲの１個以上と１、２、３、４、又は５個のアミノ酸変化（例えば、アミノ酸置換又は欠失）を有する配列を含み、さらに好ましくは前記抗ＰＤ－１抗体が、配列番号４７／４８、４９／５０、５１／５２、５３／５４、５５／５６、５７／５８、５９／６０、６１／６２、６３／６４、６５／６６、６７／６８、６９／７０および７１／７２からなる群より選択される、ペアとなる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列、又は前記ペアとなる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有する配列を含み、最も好ましくは前記抗ＰＤ－１抗体が、ニボルマブ、ピズマブ、およびツムマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｚｕｍａｂ）からなる群より選択される、医薬組成物。
14. 個体における癌性疾患（例えば、固形腫瘍および軟組織腫瘍）の治療または予防のための医薬の製造に使用され、好ましくは、癌性疾患が、黒色腫、乳癌、結腸癌、食道癌、消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）、腎臓癌（例えば、腎細胞癌）、肝臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、頭頸部腫瘍、胃癌、血液悪性疾患（例えば、リンパ腫）であり、特に、前記疾患は、結腸癌またはトリプルネガティブ乳癌であり、好ましくは、前記個体は哺乳動物であり、より好ましくはヒトである、請求項１～８のいずれか一項に記載の多標的融合タンパク質、請求項１３に記載の医薬組成物の使用。

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