RU2820059C2 - Индуцибельный промотор, вектор и клетка-хозяин на его основе - Google Patents
Индуцибельный промотор, вектор и клетка-хозяин на его основе Download PDFInfo
- Publication number
- RU2820059C2 RU2820059C2 RU2021126254A RU2021126254A RU2820059C2 RU 2820059 C2 RU2820059 C2 RU 2820059C2 RU 2021126254 A RU2021126254 A RU 2021126254A RU 2021126254 A RU2021126254 A RU 2021126254A RU 2820059 C2 RU2820059 C2 RU 2820059C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- stat5
- stat3
- host cell
- reporter
- Prior art date
Links
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims abstract description 67
- 239000013598 vector Substances 0.000 title abstract description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 49
- 108010017324 STAT3 Transcription Factor Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 102000004495 STAT3 Transcription Factor Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 102000001712 STAT5 Transcription Factor Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 108010029477 STAT5 Transcription Factor Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 108010018242 Transcription Factor AP-1 Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 102100023118 Transcription factor JunD Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 36
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 36
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 28
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 25
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims description 23
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 claims description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 18
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 12
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 11
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 141
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 44
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 44
- 102100031487 Growth arrest-specific protein 6 Human genes 0.000 description 33
- 101000923005 Homo sapiens Growth arrest-specific protein 6 Proteins 0.000 description 33
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 102100037236 Tyrosine-protein kinase receptor UFO Human genes 0.000 description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 17
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 13
- -1 IFN- γ Proteins 0.000 description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 12
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 12
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 12
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 12
- 230000004044 response Effects 0.000 description 11
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 10
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 10
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 10
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 9
- 102000014128 RANK Ligand Human genes 0.000 description 9
- 108010025832 RANK Ligand Proteins 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 9
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 8
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 101001083151 Homo sapiens Interleukin-10 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 7
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 7
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 7
- 102100025221 CD70 antigen Human genes 0.000 description 6
- 102100029391 Cardiotrophin-like cytokine factor 1 Human genes 0.000 description 6
- 101710107109 Cardiotrophin-like cytokine factor 1 Proteins 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 101000934356 Homo sapiens CD70 antigen Proteins 0.000 description 6
- 102100030703 Interleukin-22 Human genes 0.000 description 6
- 102100033502 Interleukin-37 Human genes 0.000 description 6
- 102100028123 Macrophage colony-stimulating factor 1 Human genes 0.000 description 6
- 102100034195 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 6
- 102100032100 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 8 Human genes 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 5
- 108010017550 Interleukin-10 Receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000004551 Interleukin-10 Receptors Human genes 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 102000015936 AP-1 transcription factor Human genes 0.000 description 4
- 108050004195 AP-1 transcription factor Proteins 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 4
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 4
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 4
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 4
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 4
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 4
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 3
- SXXLKZCNJHJYFL-UHFFFAOYSA-N 4,5,6,7-tetrahydro-[1,2]oxazolo[4,5-c]pyridin-5-ium-3-olate Chemical compound C1CNCC2=C1ONC2=O SXXLKZCNJHJYFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010082808 4-1BB Ligand Proteins 0.000 description 3
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 3
- 108091011896 CSF1 Proteins 0.000 description 3
- 102100028892 Cardiotrophin-1 Human genes 0.000 description 3
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 description 3
- 102100031614 Ciliary neurotrophic factor Human genes 0.000 description 3
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 3
- 108010092408 Eosinophil Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 3
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 3
- 101001002470 Homo sapiens Interferon lambda-1 Proteins 0.000 description 3
- 101000853000 Homo sapiens Interleukin-26 Proteins 0.000 description 3
- 101000998122 Homo sapiens Interleukin-37 Proteins 0.000 description 3
- 101100369992 Homo sapiens TNFSF10 gene Proteins 0.000 description 3
- 101100207070 Homo sapiens TNFSF8 gene Proteins 0.000 description 3
- 101000799461 Homo sapiens Thrombopoietin Proteins 0.000 description 3
- 101000845170 Homo sapiens Thymic stromal lymphopoietin Proteins 0.000 description 3
- 101000830596 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 15 Proteins 0.000 description 3
- 101000597779 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 18 Proteins 0.000 description 3
- 101000638255 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 8 Proteins 0.000 description 3
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 3
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 3
- 102100020990 Interferon lambda-1 Human genes 0.000 description 3
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 3
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 3
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 3
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 3
- 102100030236 Interleukin-10 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 3
- 108090000177 Interleukin-11 Proteins 0.000 description 3
- 102000003815 Interleukin-11 Human genes 0.000 description 3
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 3
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 description 3
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 3
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 3
- 108050003558 Interleukin-17 Proteins 0.000 description 3
- 102000013691 Interleukin-17 Human genes 0.000 description 3
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 description 3
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 description 3
- 102100039879 Interleukin-19 Human genes 0.000 description 3
- 108050009288 Interleukin-19 Proteins 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 3
- 108010065637 Interleukin-23 Proteins 0.000 description 3
- 102100036679 Interleukin-26 Human genes 0.000 description 3
- 108010066979 Interleukin-27 Proteins 0.000 description 3
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 3
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 3
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 3
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 3
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 3
- 102100039897 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 3
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 3
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 3
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 3
- 102100021592 Interleukin-7 Human genes 0.000 description 3
- 108010002335 Interleukin-9 Proteins 0.000 description 3
- 102000000585 Interleukin-9 Human genes 0.000 description 3
- 102000016267 Leptin Human genes 0.000 description 3
- 108010092277 Leptin Proteins 0.000 description 3
- 102100032352 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 3
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 3
- 102100026894 Lymphotoxin-beta Human genes 0.000 description 3
- 108090000362 Lymphotoxin-beta Proteins 0.000 description 3
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 102100039364 Metalloproteinase inhibitor 1 Human genes 0.000 description 3
- 101100207071 Mus musculus Tnfsf8 gene Proteins 0.000 description 3
- 102100031789 Myeloid-derived growth factor Human genes 0.000 description 3
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 3
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 3
- 108090000630 Oncostatin M Proteins 0.000 description 3
- 102100031942 Oncostatin-M Human genes 0.000 description 3
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 description 3
- 102100024819 Prolactin Human genes 0.000 description 3
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 3
- 108700012411 TNFSF10 Proteins 0.000 description 3
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 description 3
- 102100031294 Thymic stromal lymphopoietin Human genes 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 102100024598 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 10 Human genes 0.000 description 3
- 102100024587 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 15 Human genes 0.000 description 3
- 102100035283 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 18 Human genes 0.000 description 3
- 102100032101 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 9 Human genes 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 108010041776 cardiotrophin 1 Proteins 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 description 3
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 3
- 108090000681 interleukin 20 Proteins 0.000 description 3
- 102000004114 interleukin 20 Human genes 0.000 description 3
- 108010074108 interleukin-21 Proteins 0.000 description 3
- 108010074109 interleukin-22 Proteins 0.000 description 3
- 102000003898 interleukin-24 Human genes 0.000 description 3
- 108090000237 interleukin-24 Proteins 0.000 description 3
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 3
- 229940039781 leptin Drugs 0.000 description 3
- NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N leptin Chemical compound O=C([C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CCSC)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241000702371 Enterobacteria phage f1 Species 0.000 description 2
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150022345 GAS6 gene Proteins 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039619 Granulocyte colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 101001003149 Homo sapiens Interleukin-10 receptor subunit beta Proteins 0.000 description 2
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 2
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 241000254158 Lampyridae Species 0.000 description 2
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 208000036110 Neuroinflammatory disease Diseases 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 108700025832 Serum Response Element Proteins 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 229930189065 blasticidin Natural products 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 108010021843 fluorescent protein 583 Proteins 0.000 description 2
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000003959 neuroinflammation Effects 0.000 description 2
- 230000035409 positive regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 238000003571 reporter gene assay Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000867610 Chlorocebus pygerythrus Species 0.000 description 1
- 108091062157 Cis-regulatory element Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 101000983970 Conus catus Alpha-conotoxin CIB Proteins 0.000 description 1
- 101000932768 Conus catus Alpha-conotoxin CIC Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101001033233 Homo sapiens Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 101000848922 Homo sapiens Protein FAM72A Proteins 0.000 description 1
- 108010014726 Interferon Type I Proteins 0.000 description 1
- 102000002227 Interferon Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 244000207740 Lemna minor Species 0.000 description 1
- 235000006439 Lemna minor Nutrition 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000016979 Other receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000254064 Photinus pyralis Species 0.000 description 1
- 241000593806 Phyllis Species 0.000 description 1
- 235000001855 Portulaca oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 102100034514 Protein FAM72A Human genes 0.000 description 1
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 1
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 1
- 239000012996 alamarblue reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000002484 cyclic voltammetry Methods 0.000 description 1
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 102000052620 human IL10 Human genes 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035407 negative regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
Abstract
Группа изобретений относится к области биотехнологии и молекулярной биологии. Предложены универсальный индуцибельный промотор, вектор и клетка-хозяин на его основе, а также способ получения данной клетки-хозяина. Индуцибельный промотор включает сайты связывания транскрипционных факторов STAT3, STAT5 и AP-1 и минимальный промотор, при этом сайты связывания транскрипционных факторов располагаются от 5' конца к 3' концу один за другим в последовательности STAT3-STAT5-AP-1. Предложенные изобретения позволяют анализировать активность различных целевых белков. 4 н. и 11 з.п. ф-лы, 17 ил., 1 табл., 13 пр.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии, а именно к универсальному индуцибельному промотору, вектору и клетке-хозяину на его основе, а также способу получения данной клетки-хозяина. Предложенные изобретения позволяют анализировать активность целевого белка, например, лиганда рецептора, например, цитокина.
Предшествующий уровень техники
Различные терапевтически активные полипептиды (например, моноклональные антитела, слитые белки, различные цитокины, лиганды рецепторов и так далее) доказали свою ценность в качестве эффективных лекарств для лечения ряда нарушений и заболеваний.
При разработке того или иного нового терапевтически активного полипептида необходимо проводить функциональные тесты для определения биологической активности данного терапевтически активного полипептида.
Тесты для определения биологической активности терапевтически активного полипептида представляют собой совокупность методик, применяемых для оценки кандидатов лекарственных препаратов, основой которых является исследование биологической активности молекулы in vitro с использованием как первичных клеточных культур, так и специализированных клеточных линий, либо in vivo с применением лабораторных животных. Данные, полученные при помощи функциональных тестов, позволяют получить информацию об активности того или иного кандидата терапевтически активного полипептида.
Функциональные тесты можно разделить на следующие группы:
1) анализ на специфическую активность (стимуляция и ингибирование клеточной пролиферации, цитотоксичность/апоптоз, противовирусная активность, дифференциация, миграция, и тп.);
2) анализ экспрессии репортерных генов.
Тесты на регуляцию пролиферации/цитотоксичности являются наиболее универсальными для большинства терапевтически активных полипептидов. В таких анализах уровень и активность терапевтически активных полипептидов измеряется через их способность повышать или снижать пролиферацию клеток. В основе метода лежит отслеживание роста либо гибели клеток в ответ на воздействие анализируемого образца (Banks RE. Measurement of cytokines in clinical samples using immunoassays: problems and pitfalls. Crit Rev Clin Lab Sci. 2000 Apr;37(2):131-82. doi: 10.1080/10408360091174187. PMID: 10811142).
Такие тесты нашли применение для анализа антипролиферативной активности, например, исследователи оценивали способность IFN-β-1a снижать рост клеток линии WISH (Renato Mastrangeli ET AL., In vitro biological characterization of IFN-β-1a major glycoforms, Glycobiology, Volume 25, Issue 1, January 2015, Pages 21–29, https://doi.org/10.1093/glycob/cwu082).
Другим ярким примером является анализ пролиферации лимфоцитов, который широко используется для оценки клеточного иммунитета (Nikbakht, M. ET ALL, Evaluation of a new lymphocyte proliferation assay based on cyclic voltammetry; an alternative method. Sci Rep 9, 4503 (2019). https://doi.org/10.1038/s41598-019-41171-8). На данный момент коммерчески доступны клеточные пролиферативные тесты для множества цитокинов: IFN-γ, IL-1α, IL-1β, IL-2,3,4,5,6,7,8,10,13,15,19,21,33.
Репортерные гены обычно используются в клеточных тестах для отслеживания изменений экспрессии, опосредованных рецепторами, на уровне транскрипции и/или трансляции. Эти оптимизированные гены экспрессируются под контролем чувствительного элемента в составе промотора, с которыми связываются транскрипционные факторы.
Phyllis A. Rees, R. Joel Lowy описывают использование репортерной клеточной линии для измерения интерферонов 1 типа, что служит альтернативой длительным и трудоёмким пролиферативным тестам (Phyllis A. ET ALL, Measuring type I interferon using reporter gene assays based on readily available cell lines, Journal of Immunological Methods, Volume 461, 2018, Pages 63-72, ISSN 0022-1759, https://doi.org/10.1016/j.jim.2018.06.007).
Jacqueline Mock и др разработали репортерную линию с геном люциферазы под контролем NF-kB зависимого промотора. Был получен аналог таким классическими тестами, как анализ пролиферативной активности CTLL-2, ИФА на выявление INF-γ индуцированного IL-12, определение цитотоксической активности TNF (Mock J. ET ALL, A universal reporter cell line for bioactivity evaluation of engineered cytokine products. Sci Rep. 2020;10(1):3234. Published 2020 Feb 24. doi:10.1038/s41598-020-60182-4).
Zeuner MT и др. показали применение линии репортерных клеток с NF-κB чувствительным промотором и геном люциферазы для исследования нейровоспаления. Данный анализ позволяет оценивать эффективность провоспалительных молекул и пептидов, а также противовоспалительных фармацевтических препаратов в нервных клетках (Marie-Theres Zeuner ET ALL., Development and Characterisation of a Novel NF- κ B Reporter Cell Line for Investigation of Neuroinflammation, Mediators Inflamm, 2017, doi: 10.1155/2017/6209865).
Wang et al. разработали аналог пролиферативного теста на основе клеточной линии, экспрессирующей люциферазу под контролем SIE (serum response element) (Wang L. et al., Development of reporter gene assays to determine the bioactivity of biopharmaceuticals, Biotechnology Advances (2018), https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2019.107466).
К преимуществам репортерных клеток по сравнению с классическими анализами на специфическую активность можно отнести следующее:
1) хорошая воспроизводимость результатов, возможность автоматизации и масштабирования;
2) специфичность к целевому препарату;
3) высокая чувствительность, низкий уровень фоновой активации;
4) удобство использования, простота детекции репортерного сигнала.
К недостаткам репортерных клеток по сравнению с классическими анализами на специфическую активность можно отнести длительный процесс разработки индивидуальных репортерных клеток для целевого препарата, так как он может длиться до нескольких месяцев.
Таким образом, существует потребность в репортерных клетках, которые могли бы быть использованы для определения биологической активности множества различных терапевтически активных полипептидов, а не только одного индивидуального терапевтически активного полипептида.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторами изобретения был разработан универсальный индуцибельный промотор, включающий сайты связывания транскрипционных факторов STAT3, STAT5 и AP-1 и минимальный промотор, а также вектор и клетка-хозяин на его основе, которые позволяют определять биологическую активность множества различных терапевтически активных полипептидов, а не только одного индивидуального терапевтически активного полипептида.
Краткое описание изобретения
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к индуцибельному промотору, включающему сайты связывания транскрипционных факторов STAT3, STAT5 и AP-1 и минимальный промотор.
В некоторых вариантах осуществления изобретения индуцибельный промотор включает сайт связывания транскрипционного фактора STAT3, который представляет собой нуклеотидную последовательность, которую выбирают из группы нуклеотидных последовательностей, которая включает SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3.
В некоторых вариантах осуществления изобретения индуцибельный промотор включает сайт связывания транскрипционного фактора STAT5, который представляет собой нуклеотидную последовательность, которую выбирают из группы нуклеотидных последовательностей, которая включает SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6.
В некоторых вариантах осуществления изобретения индуцибельный промотор включает сайт связывания транскрипционного фактора семейства AP-1, который представляет собой нуклеотидную последовательность, которую выбирают из группы нуклеотидных последовательностей, которая включает SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9.
В некоторых вариантах осуществления изобретения индуцибельный промотор включает сайты связывания транскрипционных факторов STAT3, STAT5 и AP-1, которые располагаются от 5´ конца к 3´ концу один за другим в следующей последовательности STAT3-STAT5-AP-1.
В некоторых вариантах осуществления изобретения индуцибельный промотор включает сайты связывания транскрипционных факторов STAT3, STAT5 и AP-1, которые располагаются от 5´ конца к 3´ концу один за другим в следующей последовательности STAT3-STAT5-AP-1 и включают нуклеотидную последовательность, которую выбирают из группы нуклеотидных последовательностей, которая включает SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12.
В некоторых вариантах осуществления изобретения индуцибельный промотор включает сайты связывания транскрипционных факторов STAT3, STAT5 и AP-1, которые включают нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 13.
В некоторых вариантах осуществления изобретения индуцибельный промотор включает минимальный промотор, который включает ТАТА-последовательность.
В некоторых вариантах осуществления изобретения индуцибельный промотор включает минимальный промотор, который включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 14.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к индуцибельному экспрессионному вектору, включающему в направлении от 5'-конца к 3'-концу любой из вышеуказанных индуцибельных промоторов и репортерный ген.
В некоторых вариантах осуществления изобретения индуцибельный экспрессионный вектор включает репортерный ген, который представляет собой ген белка люциферазы светляка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения индуцибельный экспрессионный вектор включает ген белка люциферазы светляка, который включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 15.
В некоторых вариантах осуществления изобретения индуцибельный экспрессионный вектор включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 16.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения клетки-хозяина для анализа активности целевого белка, который включает трансформирование клетки любым из вышеуказанных индуцибельных экспрессионных векторов.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к клетке-хозяину для анализа активности целевого белка, которая содержит любой из вышеуказанных индуцибельных промоторов и репортерный ген.
В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка-хозяин включает репортерный ген, который представляет собой ген белка люциферазы светляка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка-хозяин включает ген белка люциферазы светляка, который включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 15.
В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка-хозяин включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 16.
В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка-хозяин используется для анализа активности целевого белка, где целевой белок представляет собой лиганд рецептора.
В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка-хозяин используется для анализа активности целевого белка, где целевой белок представляет собой цитокин.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 представляет собой схему генетической репортерной конструкции. Данная конструкция содержит нуклеотидную последовательность гена репортерного белка люциферазы светляка под контролем STAT3, STAT5, AP-1 зависимого промотора. Некодирующий регион включает минимальный промотор, состоящий из последовательности TATA-box (TATA-последовательность), на 5` конце которого размещён цис-регуляторный элемент, состоящий из чередующихся друг за другом сайтов связывания транскрипционных факторов STAT3, STAT5, AP-1 в трёх повторах как указано на схеме. Фланкирующие последовательности комплементарны участкам, окружающим экспрессионную кассету в составе целевого вектора, и содержат сайты узнавания для эндонуклеаз рестрикции Acc65I и BglII.
Фиг. 2 представляет собой карту репортерного плазмидного вектора E6.90_STAT3_STAT5_AP-1_FLuc, кодирующего ген люциферазы светляка под контролем STAT3, STAT5, AP-1 зависимого промотора.
AmpR – ген беталактамазы, обуславливает устойчивость к ампициллину, позволяет вести селекцию в клетках E.coli;
Поли-А – сигнал полиаденилирования, терминатор транскрипции;
STAT3-STAT5-AP-1 – регуляторный элемент, контролирующий экспрессию гена FLuc;
MinP – минимальный промотор, содержащий TATA-box;
FLuc – ген люциферазы светляка Photinus pyralis (firefly);
HygR – ген, обуславливающий устойчивость к гигромицину. Позволяет вести селекцию культуры клеток эукариот;
Промотор/энхансер SV40 – эукариотический промотор/энхансер вируса SV40.
Фиг. 3 представляет собой карту экспрессионного плазмидного вектора E4.244_IL10RA_PR, кодирующего ген IL10RA человека.
HS4 – инсулятор HS4;
pCMVe/EF1alpha – конститутивный гибридный промотор CMV/EF1alpha;
Kozak – последовательность Козак;
IL10RA – ген IL10RA человека;
Поли-А – сигнал полиаденилирования, терминатор транскрипции;
Энхансер SV40 – энхансер вируса SV40;
b-globin MAR – MAR-элемент (М5) гена b-globin человека;
Rep origin 1 – сайт начала репликации;
AmpR – ген бета-лактамазы, обуславливающий устойчивость к ампициллину. Позволяет вести селекцию культуры клеток E.coli;
F1 origin – ориджин репликаци бактериофага f1;
Промотор SV40 –эукариотический промотор вируса SV40;
Puro R – эукариотическая устойчивость к пуромицину. Ген, обуславливающий усточивость к пуромицину. Позволяет вести селекцию культуры клеток эукариот.
Фиг. 4 представляет собой карту экспрессионного плазмидного вектора E4.245_IL10RB_BR, кодирующего ген IL10RB человека.
HS4 – инсулятор HS4;
pCMVe/EF1alpha –конститутивный гибридный промотор CMV/EF1alpha;
Kozak – последовательность Козак;
IL10RA – ген IL10RA человека;
Поли-А – сигнал полиаденилирования, терминатор транскрипции;
Энхансер SV40 – энхансер вируса SV40;
b-globin MAR – MAR-элемент (М5) гена b-globin человека;
Rep origin 1 – сайт начала репликации;
AmpR – ген бета-лактамазы, обуславливающий устойчивость к ампициллину. Позволяет вести селекцию культуры клеток E.coli;
F1 origin – ориджин репликаци бактериофага f1;
Промотор SV40 – эукариотический промотор вируса SV40;
Blasti R – эукариотическая устойчивость к Бластицидину. Ген, обуславливающий усточивость к бластицидину. Позволяет вести селекцию культуры клеток эукариот.
Фиг. 5 представляет собой гистограмму, на которой показана кратность активации репортерных клеток HEK293 Nf-kB в ответ на разные дозы PMA.
Фиг. 6 представляет собой гистограмму, на которой показана кратность активации клональных линий репортера HEK293_STAT3-STAT5-AP1_FLuc в ответ на PMA в концентрации 33нМ.
A2, A4, A5, B1, B3, B5, B6, C4, C6, D1, D4, C4#2, B0>, B1>, B2>, B3> – названия различных клональных репортерных линий;
исходные – нетрансфецированные родительские клетки;
пул – популяция клеток после трансфекции.
В качестве контролей – пул и нетрансфецированные клетки.
Фиг. 7 представляет собой гистограмму, на которой показана кратность активации клональных линий репортера HEK293_STAT3-STAT5-AP1_FLuc, экспрессирующих IL10R, в ответ на IL10 100 нг/мл.
A1.2, A1.4, A1.5, A1.7, C1.1, C1.2, C1.6, C1.15, C1.11, C1.14, C1.16, A4_1, A4_3, A4_9, A4_10, C4_3, C4_12, C4_13, A5, A8, A9, A12, A15, A23, A31, C44, C4.4, C12, C16, C20, C27, C28, C29, C31, C33, C40, C41 – названия различных клональных линий репортера к IL10.
Фиг. 8 представляет собой график, иллюстрирующий дозозависимый ответ клеток HEK293-STAT3-STAT5-AP1_FLuc_IL10R на активацию IL10.
Фиг. 9 представляет собой график GAS6-зависимой активации пулов HEK293_STAT3-STAT5-AP1_FLuc_AXL, полученных на основе трех разных клонов (Cl. D1, cl. B3, cl. C4#2) репортерной клеточной линии HEK293_STAT3-STAT5-AP1_FLuc. GAS6 – активатор AXL-зависимого сигналинга в клетке.
Cl. D1, cl. B3, cl. C4#2 – клоны репортерной клеточной линии HEK293_STAT3-STAT5-AP1_FLuc.
Фиг. 10 представляет собой график зависимости активации репортерной клеточной линии HEK293_STAT3-STAT5-AP1_FLuc_AXL от концентрации различных препаратов GAS6.
Препарат GAS6#1, #2, #3 – три разных препарата Gas6.
Фиг. 11 представляет собой график зависимости активации репортерной клеточной линии HEK293_AXL_STAT3-STAT5-AP1 от времени инкубации клеток в присутствии GAS6.
Фиг. 12 представляет собой график зависимости пролиферации клеток DU145 от концентрации GAS6.
Фиг. 13–15 представляет собой графики GAS6-зависимой активации различных клонов (клон C2 на фигуре 13, клон Н4 на фигуре 14, клон Е8 на фигуре 15) DU145_STAT3-STAT5-AP1_FLuc.
Клоны С2, H4 и E8 – это клоны клеточной линии DU145_STAT3-STAT5-AP1, которая получена на основе клеточной линии DU145, природного экспрессора AXL с помощью конструкции, кодирующей люциферазу светляка под контролем STAT3-STAT5-AP1-промотора. Данные клоны показали наибольший ответ на обработку GAS6.
Фигура 16 представляет собой график GAS6-зависимой активации пула и отдельных клонов HEK293_AXL_STAT3-STAT5-AP1_FLuc.
Cl. 1, cl. 8, cl. 10, cl. 14 – клоны клеточной линии HEK293_AXL_STAT3-STAT5-AP1_FLuc, которые получены из пула HEK293_AXL_STAT3-STAT5-AP1_FLuc.
Пул – клеточная линия HEK293_AXL_STAT3-STAT5-AP1_FLuc, полученная на основе клеточной линии HEK293_AXL – оверэкспрессора AXL, в которую был встроен ген, кодирующий люциферазу светляка, под контролем STAT3-STAT5-AP1- зависимого промотора.
Фиг. 17 представляет собой график зависимости активации репортерной клеточной линии HEK293_AXL_STAT3-STAT5-AP1 от числа клеток.
Определения и общие методы
Если иное не определено в настоящем документе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, будут иметь значения, которые обычно понятны специалистам в данной области.
Кроме того, если по контексту не требуется иное, термины в единственном числе включают в себя термины во множественном числе, и термины во множественном числе включают в себя термины в единственном числе. Как правило, используемая классификация и методы культивирования клеток, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики, аналитической химии, химии органического синтеза, медицинской и фармацевтической химии, а также гибридизации и химии белка и нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Ферментативные реакции и способы очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителя, как это обычно осуществляется в данной области, или как описано в настоящем документе.
Термины «нуклеиновая кислота», «нуклеиновая последовательность» или «нуклеиновокислотная последовательность», «полинуклеотид», «олигонуклеотид», «полинуклеотидная последовательность» и «нуклеотидная последовательность», которые используются равнозначно в данном описании, обозначают четкую последовательность нуклеотидов, модифицированных или не модифицированных, определяющую фрагмент или участок нуклеиновой кислоты, содержащую или не содержащую неприродные нуклеотиды и являющуюся либо двухцепочечной ДНК или РНК, либо одноцепочечной ДНК или РНК, либо продуктами транскрипции указанных ДНК.
Как применяют в настоящем описании, полинуклеотиды включают, в качестве неограничивающих примеров, все последовательности нуклеиновой кислоты, получаемые любыми способами, доступными в этой области, включая, в качестве неограничивающих примеров, рекомбинантные способы, т. е. клонирование последовательностей нуклеиновой кислоты из рекомбинантной библиотеки или генома клетки, использование обычной технологии клонирования и ПЦР и т. п., и способами синтеза.
Здесь также следует упомянуть, что данное изобретение не относится к нуклеотидным последовательностям в их природной хромосомной среде, т. е. в природном состоянии. Последовательности данного изобретения были выделены и/или очищены, т. е. были взяты прямо или косвенно, например, путем копирования, при этом их среда была по меньшей мере частично модифицирована. Таким образом, также здесь следует подразумевать изолированные нуклеиновые кислоты, полученные путем генетической рекомбинации, например, с помощью принимающих клеток (клеток-хозяев), или полученные путем химического синтеза.
Термин нуклеотидная последовательность охватывает его комплемент, если не указано иное. Таким образом, нуклеиновую кислоту, имеющую определенную последовательность следует понимать как охватывающие ее комплементарную цепь с ее комплементарной последовательностью.
Термин «вектор» при использовании в настоящем документе означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она соединена.
Как применяют в настоящем описании, термин «экспрессия» определяют как транскрипцию и/или трансляцию конкретной нуклеотидной последовательности, запускаемую ее промотором.
Подробное описание изобретения
Индуцибельный промотор
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к индуцибельному промотору, включающему сайты связывания транскрипционных факторов STAT3, STAT5 и AP-1 и минимальный промотор.
Индуцибельный промотор по изобретению является универсальным для использования в репортерных клеточных системах для определения активновности лигандов рецепторов, например, цитокинов.
Под индуцибельным промотором понимается промотор, который обеспечивает экспрессию генов в ответ на специфический сигнал.
Авторы изобретения неожиданно установили, что наличие в индуцибельном промоторе сайтов связывания транскрипционных факторов STAT3, STAT5 и AP-1 позволяет определять уровень экспрессии репортерного гена в ответ на специфический сигнал, который получается от взаимодействия лиганда с его рецептором, при этом лиганд рецептора может быть выбран из множества цитокинов и других лигандов рецептора, которое включает: IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-13, IL-15, IL-21, GM-CSF, IL-3, IL-5, IL-6, IL-11, IL-12, IL-27, LIF, OSM, CNTF, CT-1, CLC, NP, лептин, NNT-1/BSF-3, IFN-α, IFN- β, IFN-γ , IL-23, IL-10 , IL-20 , IL-22, IL-28, IL-29, IL-19, IL-24, IL-26, IL37, IL18, M-CSF, CSF1, G-CSF, CSF 3, IL-31, IL-35, гормон роста, пролактин, THPO, MGDF, EPO, TSLP, TNFSF18, IL-1, IL-17, TNF, TNF-α, RANKL (OPGL/TRANCE), TRAIL, VEGI, CD153 (CD30L), CD154 (CD40L), CD70 (CD27L), TNF-C, CD70, 4-1BB лиганд или GAS6, что делает данный индуцибельный промотор универсальным для использования в репортерных клеточных системах для определения активновности лигандов к рецептору, например, цитокинов.
Сайт связывания транскрипционного фактора STAT3 включает коровую часть, которая представляет собой TTCnnnGAA.
В некоторых вариантах осуществления изобретения индуцибельный промотор включает сайт связывания транскрипционного фактора STAT3, который представляет собой нуклеотидную последовательность, которую выбирают из группы нуклеотидных последовательностей, которая включает SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3.
Сайт связывания транскрипционного фактора STAT5 включает коровую часть, которая представляет собой TTCnnnGAA.
В некоторых вариантах осуществления изобретения индуцибельный промотор включает сайт связывания транскрипционного фактора STAT5, который представляет собой нуклеотидную последовательность, которую выбирают из группы нуклеотидных последовательностей, которая включает SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6.
Сайт связывания транскрипционного фактора AP-1 включает коровую часть, которая представляет собой T[G/T]A[C/G]TCA.
В некоторых вариантах осуществления изобретения индуцибельный промотор включает сайт связывания транскрипционного фактора семейства AP-1, который представляет собой нуклеотидную последовательность, которую выбирают из группы нуклеотидных последовательностей, которая включает SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9.
В некоторых вариантах осуществления изобретения индуцибельный промотор включает сайты связывания транскрипционных факторов STAT3, STAT5 и AP-1, которые располагаются от 5´ конца к 3´ концу один за другим в следующей последовательности STAT3-STAT5-AP-1.
В некоторых вариантах осуществления изобретения индуцибельный промотор включает сайты связывания транскрипционных факторов STAT3, STAT5 и AP-1, которые располагаются от 5´ конца к 3´ концу один за другим в следующей последовательности STAT3-STAT5-AP-1, где STAT3-STAT5-AP-1 представлен в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 или более повторах. Максимальное количество повторов STAT3-STAT5-AP-1 ограничивается емкостью экспрессионного вектора. Количество повторов STAT3-STAT5-AP-1 не влияет на работоспособность индуцибельного промотора по изобретению.
В некоторых вариантах осуществления изобретения индуцибельный промотор включает сайты связывания транскрипционных факторов STAT3, STAT5 и AP-1, которые располагаются от 5´ конца к 3´ концу один за другим в следующей последовательности STAT3-STAT5-AP-1 и включают нуклеотидную последовательность, которую выбирают из группы нуклеотидных последовательностей, которая включает SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12.
В некоторых вариантах осуществления изобретения индуцибельный промотор включает сайты связывания транскрипционных факторов STAT3, STAT5 и AP-1, которые включают нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 13.
В некоторых вариантах осуществления изобретения индуцибельный промотор включает минимальный промотор, который включает ТАТА-последовательность (TATA-box).
Под минимальным промотором подразумевается наименьший по составу регуляторных элементов промотор, содержащий ТАТА-последовательность (TATA-box, Хогнесса бокс, ТАТА-бокс) и место начала транскрипции, который не функционирует без добавления перед ним специальных регуляторных элементов.
В некоторых вариантах осуществления изобретения индуцибельный промотор включает минимальный промотор, который включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 14.
Индуцибельный экспрессионный вектор
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к индуцибельному экспрессионному вектору, включающему в направлении от 5'-конца к 3'-концу любой из вышеуказанных индуцибельных промоторов и репортерный ген.
Индуцибельный экспрессионный вектор по изобретению является универсальным для получения репортерных клеточных систем для определения активновности лиганда к его рецептору, например, цитокина.
Индуцибельный экспрессионный вектор представляет собой рекомбинантный вектор.
В некоторых вариантах осуществления изобретения индуцибельный экспрессионный вектор включает репортерный ген, который представляет собой ген белка люциферазы.
В некоторых вариантах осуществления изобретения индуцибельный экспрессионный вектор включает репортерный ген, который представляет собой ген белка люциферазы светляка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения индуцибельный экспрессионный вектор включает ген белка люциферазы светляка, который включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 15.
В некоторых вариантах осуществления изобретения индуцибельный экспрессионный вектор включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 16.
В некоторых вариантах осуществления изобретения индуцибельный экспрессионный вектор включает репортерный ген, который представляет собой ген, кодирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP), или ген красного флуоресцентного белка (DsRed) или ген LacZ, кодирующий фермент бета-галактозидазу, или любой другой ген, кодирующий флуоресцентные или люминесцентные белки, которые могут быть использованы в качестве репортерного гена.
В некоторых вариантах осуществления изобретения индуцибельный экспрессионный вектор включает гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую регуляторные последовательности, которые обеспечивают экспрессию гена репортерного полипептида.
Под «регуляторными последовательностями, которые обеспечивают экспрессию продукта, кодируемого гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, в целевых клетках» подразумевается в рамках данного изобретения полинуклеотидные последовательности, которые необходимы для воздействия на экспрессию и процессинг кодирующих последовательностей, к которым они клонированы. Регулирующие экспрессию последовательности включают соответствующие последовательности инициации транскрипции, терминации, индуцибельного промотора и энхансера; эффективные сигналы процессинга РНК, такие как сплайсинг и сигналы полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые повышают эффективность трансляции (т.е. консенсусная последовательность Козака); последовательности, которые повышают стабильность белка; и, при желании, последовательности, которые усиливают секрецию белка. Характер таких регулирующих последовательностей различается в зависимости от организма-хозяина; в прокариотах такие контролирующие последовательности, как правило, включают промотор, сайт связывания рибосомы, а также последовательности терминации транскрипции; в эукариотах, как правило, такие контролирующие последовательности включают промоторы и последовательности терминации транскрипции. Термин «регуляторные последовательности» включает, как минимум, все компоненты, наличие которых имеет важное значение для экспрессии и процессинга.
Термины «энхансеры» или «энхансер», используемые в изобретении, могут относиться к последовательности ДНК, которая расположена как смежная с последовательностью ДНК, кодирующей рекомбинантный продукт. Энхансерные элементы обычно расположены в 5'-направлении от промоторного элемента или могут быть расположены ниже или в пределах кодирующей последовательности ДНК (например, последовательности ДНК, транскрибированной или транслированной в рекомбинантный продукт или продукты). Таким образом, энхансерный элемент может быть расположен на расстоянии 100 пар оснований, 200 пар оснований или 300 или больше пар оснований перед последовательностью ДНК, которая кодирует рекомбинантный продукт, или после этой последовательности. Энхансерные элементы могут увеличивать количество экспрессируемого рекомбинантного продукта от последовательности ДНК, превышая экспрессию, обусловленную одиночным промоторным элементом. Специалистам в данной области техники доступно множество энхансерных элементов.
В некоторых вариантах осуществления изобретения универсальный индуцибельный экспрессионный вектор может быть использован для создания клетки-хозяина, которая используется как универсальная репортерная клеточная линия для анализа активности множества различных лигандов рецептора, которые, например, представляют собой IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-13, IL-15, IL-21, GM-CSF, IL-3, IL-5, IL-6, IL-11, IL-12, IL-27, LIF, OSM, CNTF, CT-1, CLC, NP, лептин, NNT-1/BSF-3, IFN-α, IFN- β, IFN-γ , IL-23, IL-10 , IL-20 , IL-22, IL-28, IL-29, IL-19, IL-24, IL-26, IL37, IL18, M-CSF, CSF1, G-CSF, CSF 3, IL-31, IL-35, гормон роста, пролактин, THPO, MGDF, EPO, TSLP, TNFSF18, IL-1, IL-17, TNF, TNF-α, RANKL (OPGL/TRANCE), TRAIL, VEGI, CD153 (CD30L), CD154 (CD40L), CD70 (CD27L), TNF-C, CD70, 4-1BB лиганд или GAS6.
Клетка-хозяин и способ ее получения
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения клетки-хозяина для анализа активности целевого белка, который включает трансформирование клетки любым из вышеуказанных индуцибельных экспрессионных векторов.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к клетке-хозяину для анализа активности целевого белка, которая содержит любой из вышеуказанных индуцибельных промоторов и репортерный ген.
Из-за особенностей вышеуказанных индуцибельных промоторов по изобретению клетка-хозяин по изобретению может быть использована для анализа активности множества различных лигандов рецептора, которые, например, представляют собой IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-13, IL-15, IL-21, GM-CSF, IL-3, IL-5, IL-6, IL-11, IL-12, IL-27, LIF, OSM, CNTF, CT-1, CLC, NP, лептина, NNT-1/BSF-3, IFN-α, IFN- β, IFN-γ , IL-23, IL-10 , IL-20 , IL-22, IL-28, IL-29, IL-19, IL-24, IL-26, IL37, IL18, M-CSF, CSF1, G-CSF, CSF 3, IL-31, IL-35, гормон роста, пролактин, THPO, MGDF, EPO, TSLP, TNFSF18, IL-1, IL-17, TNF, TNF-α, RANKL (OPGL/TRANCE), TRAIL, VEGI, CD153 (CD30L), CD154 (CD40L), CD70 (CD27L), TNF-C, CD70, 4-1BB лиганд или GAS6.
Клетка-хозяин по изобретению является рекомбинантной клеткой-хозяином.
В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка-хозяин включает репортерный ген, который представляет собой ген белка люциферазы.
В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка-хозяин включает репортерный ген, который представляет собой ген белка люциферазы светляка.
В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка-хозяин включает ген белка люциферазы светляка, который включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 15.
В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка-хозяин включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 16.
В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка-хозяин включает репортерный ген, который представляет собой ген, кодирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP), или ген красного флуоресцентного белка (DsRed) или ген LacZ, кодирующий фермент бета-галактозидазу, или любой другой ген, кодирующий флуоресцентные или люминесцентные белки, которые могут быть использованы в качестве репортерного гена.
В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка-хозяин используется для анализа активности целевого белка, где целевой белок представляет собой лиганд рецептора.
В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка-хозяин используется для анализа активности целевого белка, где целевой белок представляет собой цитокин.
В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку.
В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего.
Клеточные линии млекопитающих, используемые в качестве хозяев для трансформации, хорошо известны в данной области и включают множество иммортализованных доступных клеточных линий. К ним относятся, например, клетки яичников китайского хомячка (CHO), NS0 клетки, клетки SP2, HEK-293T клетки, 293 Фристайл клетки (Invitrogen), NIH-3T3 клетки, клетки HeLa, клетки почек хомячка (BHK), клетки почек африканских зеленых мартышек (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Hep G2), A549 клетки и ряд других клеточных линий. Клеточные линии выбираются путем определения, какие клеточные линии имеют высокие уровни экспрессии и обеспечивают необходимые характеристики продуцируемого белка. Другими клеточными линиями, которые могут быть использованы, являются клеточные линии насекомых, такие как Sf9 или Sf21 клетки. Клетки-хозяева растений, например, включают Nicotiana, Arabidopsis, ряску, кукурузу, пшеницу, картофель и т. д. Клетки бактерий хозяина включают виды Escherichia и Streptomyces. Дрожжевые клетки-хозяева включают Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris.
Вышеуказанная клетка-хозяин по изобретению не относится к клетке-хозяину, полученной с использованием человеческих эмбрионов.
Вышеуказанная клетка-хозяин по изобретению не относится к клетке-хозяину, полученной с модификации генетической целостности клеток зародышевой линии человека.
Примеры
Для наилучшего понимания изобретения приводятся следующие примеры. Эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не должны толковаться как ограничивающие сферу применения изобретения в любой форме.
Все публикации, патенты и патентные заявки, указанные в этой спецификации включены в данный документ путем отсылки. Хотя вышеупомянутое изобретение было подробно описано путем иллюстрации и примера в целях исключения двусмысленного толкования, специалистам в данной области на основе идей, раскрытых в данном изобретении, будет вполне понятно, что могут быть внесены определенные изменения и модификации без отклонения от сущности и объема прилагаемых вариантов осуществления изобретения.
Материалы и общие методы
Методы рекомбинантной ДНК
Для манипуляций с ДНК использовали стандартные методы, описанные у Sambrook J. и др., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Реагенты для молекулярной биологии использовали согласно инструкциям производителей.
Синтез генов
Требуемые сегменты генов получали из олигонуклеотидов, созданных путем химического синтеза. Генные сегменты длиной от 300 до 1400 п.н., которые фланкированы уникальными сайтами рестрикции, собирали путем отжига и лигирования олигонуклеотидов, включая ПЦР-амплификацию и последующее клонирование через сайты рестрикции. Последовательности ДНК субклонированных генных фрагментов подтверждали путем секвенирования ДНК.
Определение последовательностей ДНК
Последовательности ДНК определяли путем секвенирования по Сенгеру.
Анализ последовательностей ДНК и обработка данных о последовательностях
Применяли пакет программ фирмы Unipro UGENE версия 1.29 и SnapGene Viewer для создания, картирования, анализа, аннотирования и иллюстрации последовательностей.
Экспрессионные векторы
Векторы содержащие репортерный ген, описанные в материалах заявки помимо репортерной конструкции содержали: сайт инициации репликации, обеспечивающий репликацию указанной плазмиды в Е.coli, ген, придающий устойчивость Е.coli к селективному антибиотику (ампициллину).
Сборку генетических конструкций вектора, как указано ниже, осуществляли с помощью ПЦР и/или синтеза и сборки генов с использованием известных методов и процедур рекомбинации путем соединения соответствующих сегментов нуклеиновых кислот, например, с использованием уникальных сайтов рестрикции в соответствующих векторах. Субклонированные нуклеотидные последовательности подтверждали секвенированием ДНК. Для кратковременных трансфекций создавали большие количества плазмид посредством получения плазмид из трансформированных культур E.coli.
Пример 1. Получение репортерного плазмидного вектора, кодирующего ген люциферазы светляка под контролем STAT3-STAT5-AP-1 чувствительного промотора.
Для создания универсальной репортерной конструкции были выбраны транскрипционные факторы STAT3, STAT5, AP-1, опосредующие действие большого числа разнообразных сигнальных молекул.
Был создан регуляторный элемент, включающий минимальный промотор, состоящий из последовательности TATA-box, на 5` которого разместили сайты связывания для транскрипционных факторов STAT3, STAT5, AP-1 (doi:10.1128/JVI.01713-10; doi:10.1074/jbc.M001748200) в трёх повторах (Фиг. 1). Такая комбинация сайтов связывания факторов транскрипции позволяет получить индуцибельный промотор широкого спектра применения.
Для сборки массива были синтезированы шесть частично комплементарных олигонуклеотидов длиной 60 п.о., с перекрытием в 20 п.о. Сборку проводили методом синтеза из олигонуклеотидов, в результате получили фрагмент длиной 249 п.о., фланкированный участками, комплементарными плазмидному вектору. Полученная последовательность клонирована в составе вектора E6.90 методом безлигазного клонирования (Фиг. 2). Клонированные нуклеотидные последовательности подтверждали секвенированием ДНК.
Пример 2. Получение плазмидных векторов, кодирующих субъединицы рецептора IL-10 для создания стабильной клеточной линии-экспрессора.
Для оценки репортерной линии в специфичном клеточном тесте мы экспрессировали на поверхности репортерных клеток рецептор IL-10.
Для наработки нативных последовательностей гена человеческого IL-10Ra (https://www.uniprot.org/uniprot/Q13651) и человеческого IL-10Rb (https://www.uniprot.org/uniprot/Q08334) из мононуклеарных клеток периферической крови донора была выделена тотальная РНК, на основе которой синтезирована кДНК. Полученная библиотека кДНК была использована в качестве матрицы для амплификации методом ПЦР целевых последовательностей, фланкированных сайтами рестрикции. Клонирование целевых генов в составе экспрессионных векторов осуществлено методом рестрикции-лигирования (Фиг. 3, Фиг. 4). Клонированные нуклеотидные последовательности подтверждали секвенированием ДНК.
Пример 3. Активация HEK293 Nf-kB.
Для скрининга клональных репортерных линий мы использовали активатор PMA. Данный агент напрямую воздействует на протеинкиназу С, таким образом запуская сигнальные каскады, активирующие экспрессию репортерного гена (https://doi.org/10.1007/s11373-005-1210-5; doi: 10.1093/carcin/bgm261). Для определения оптимальной дозы PMA мы провели эксперименты с активацией репортерной линии HEK293 Nf-kB. Клетки засевали в белом культуральном 96-луночном планшете для работы с адгезионными культурами в количестве 3*105 клеток на лунку и добавляли активатор PMA в концентрациях, указанных на графике до объёма 150 мкл в лунке. Все растворы готовили в ростовой среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина и 10 мкг/мл гентамицина. Планшет инкубировали в течение 24 ч при 37°С во влажной атмосфере в присутствии 5% CO2. По окончании инкубации лунки осушали и добавляли 100 мкл субстрата люциферина с лизирующим компонентом, оставляли планшет в темноте на 10 минут, после чего детектировали уровень люминесценции на планшетном ридере с использованием программного пакета SparkControl V2.1 (Tecan, Австрия).
Таким образом была подобрана оптимальная концентрация активатора PMA 33нМ (Фиг. 5).
Пример 4. Получение стабильной клеточной линии репортера.
Важными показателями для репортерной клеточной линии является кратность активации в ответ на исследуемую молекулу, а также уровень фоновой активации.
Для получения стабильной клеточной линии репортера использовали клеточную линию HEK293 (ATCC CRL-1573, США), которую трансфецировали плазмидным вектором, содержащим репортерную конструкцию из примера 1. Полученный стабильный пул клонировали методом лимитирующих разведений. Для скрининга клональных линий HEK293_STAT3-STAT5-AP1_FLuc проводили тест на активацию экспрессии люциферазы. Клетки засевали в 96-луночные планшеты в количестве 1*105 клеток на лунку и добавляли активатор PMA 33 нМ до конечного объёма 150 мкл в лунке. Все растворы готовили в ростовой среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина и 10 мкг/мл гентамицина. Планшет инкубировали в течение 24 ч при 37°С во влажной атмосфере в присутствии 5% CO2. По окончании инкубации лунки осушали и добавляли 100 мкл субстрата люциферина с лизирующим компонентом, оставляли планшет в темноте на 10 минут, после чего детектировали уровень люминесценции на планшетном ридере с использованием программного пакета SparkControl V2.1 (Tecan, Австрия).
Таким образом была получена репортерная клеточная линия, показывающая высокую кратность активации и низкий уровень фоновой активации (Фиг. 6).
Пример 5. Получение репортерной линии, специфичной к IL10.
Для оценки репортерной линии в специфичном клеточном тесте мы экспрессировали на поверхности репортерных клеток рецептор IL-10. Для этого клеточную линию репортера HEK293_STAT3-STAT5-AP1_FLuc, полученную в примере 4 трансфецировали плазмидными векторами, кодирующими субъединицы рецептора IL-10, полученными в примере 2. Для скрининга клональных линий репортера, экспрессирующих рецептор IL10 проводили тест на активацию экспрессии люциферазы, описанный в примере 3. В качестве активатора использовали IL10 рекомбинантный человеческий в концентрации 100 нг/мл.
В результате скрининга и отбора клонов по кратности активации была получена репортерная линия на основе универсальной линии, специфичная к IL10 (Фиг. 7).
Пример 6. Тест на определение активности IL10
Репортерные линии применяют для оценки активности кандидатов лекарственного препарата. Мы провели тест на активацию экспрессии люциферазы в ответ на различные концентрации активатора IL10, указанные на графике. Постановка теста описана в примере 3.
В итоге мы наблюдали дозозависимый ответ репортерной клеточной линии на специфичный активатор (Фиг. 8).
Пример 7. Создание репортерной клеточной линии HEK293_STAT3-STAT5-AP1_FLuc_AXL для оценки AXL-опосредованной активации препаратом Gas6 STAT3-STAT5-AP1 внутриклеточного сигналинга на основе универсальной репортерной клеточной линии HEK293_STAT3-STAT5-AP1_FLuc.
Для создания репортерной клеточной линии HEK293_STAT3-STAT5-AP1_FLuc_AXL использовали три клона универсальной репортерной клеточной линии HEK293_STAT3-STAT5-AP1_FLuc: cl. D1, cl. B3 и cl. С4#2, на основе которых получили, соответственно, 3 пула клеток с внедренным конституционно-экспрессируемым геном рецептора AXL. AXL-опосредованную активацию этих пулов проверили в тесте. Тест проводили в культуральном 96-луночном планшете для работы с люминесценцией. Суспензия в каждой лунке содержала 30000 клеток HEK293_STAT3-STAT5-AP1_FLuc_AXL и AXL-лиганд GAS6 в концентрациях, указанных на Фиг. 9. Конечный объем клеточной суспензии в лунке составлял 100 мкл, все компоненты суспензии готовили в среде DMEM, не содержащей эмбриональную бычью сыворотку. После добавления всех компонентов планшет инкубировали в течение 16 ч при 37°С, 5% CO2 и далее, с помощью набора для оценки люминесценции, определяли интенсивность люминесценции в лунках. Измерение проводили при помощи планшетного ридера. Величину активации рассчитывали, как отношение величины люминесценции для данного пула в присутствии GAS6 к величине люминесценции в отсутствии GAS6.
Пример 8. Тестирование различных препаратов GAS6 на AXL-опосредованную активации STAT3-STAT5-AP1 на репортерной клеточной линии HEK293_STAT3-STAT5-AP1_FLuc_AXL.
Тест ставили аналогично процедуре, описанной в Примере 7 (в присутствии GAS6 в концентрации 2 мкг/мл), для активации использовали HEK293_STAT3-STAT5-AP1_FLuc_AXL (пул, полученный на основе клеточной линии HEK293_STAT3-STAT5-AP1_FLuc : cl. D1, см. Пример 7) и различные препараты GAS6 в указанной на графике концентрации (Фиг.10).
Пример 9. Анализ AXL-опосредованной активации клонов HEK293_STAT3-STAT5-AP1_FLuc_AXL.
Из пулов, полученных на основе клеточных линий HEK293_STAT3-STAT5-AP1_FLuc: cl. D1, cl. B3 и cl. С4#2 (см. Пример 7) отобрали отдельные клоны, показавшие GAS6-зависимую активацию в тесте (проводился аналогично тесту в Примерe 7 в присутствии GAS6 в концентрации 2 мкг/мл). Клоны, показавшие наибольшую активацию, были отобраны из клеточного пула, полученного на основе cl. D1. Величины активации в одном из 96-луночных планшетов c различными клонами данного пула и самим исходным пулом представлен в таблице 1, активации указаны относительно не активированных клеток, лунка H11- соответствует пулу. Серым цветом отмечена лунка, соответствующая клону HEK293_STAT3-STAT5-AP1_FLuc_AXL (cl.13), который был использован для дальнейшей работы.
Пример 10. Исследование зависимости активации репортерной клеточной линии HEK293_STAT3-STAT5-AP1_FLuc_AXL от времени инкубации в присутствии препарата GAS6.
Тест ставили аналогично процедуре, описанной в Пример 7, для активации использовали клетки репортерной линии HEK293_STAT3-STAT5-AP1_FLuc_AXL (cl.13) и GAS6 в концентрации 2 мкг/мл (Фиг. 11); после добавления всех компонентов планшет инкубировали в течение указанного на графике времени, далее определяли интенсивность люминесценции в лунках. Величину активации рассчитывали, как отношение величины люминесценции в присутствии указанной концентрации GAS6 к величине люминесценции в отсутствии GAS6 варианта с таким же временем инкубации. Наибольшая активация наблюдалась при 24 часовой инкубации.
Пример 11. Создание репортерной клеточной линии на основе природной клеточной линии Du145 для оценки AXL-опосредованной активации STAT3-STAT5-AP1 внутриклеточного сигналинга.
Для теста на проверку активации пролиферации клеток линию Du145 лигандом AXL GAS6 (Фиг. 12) использовали клеточную линию Du145, являющуюся природным экспрессором AXL. Тест проводили в культуральном 96-луночном планшете для работы с адгезионными культурами. Суспензия в каждой лунке содержала 5 000 клеток Du145 и AXL-лиганд GAS6 в указанной на графике концентрации. Конечный объем клеточной суспензии в лунке составлял 100 мкл, все компоненты суспензии готовили в среде DMEM, содержащей 0,3% эмбриональной бычьей сыворотки. После добавления всех компонентов планшет инкубировали в течение 72 ч при 37°С, 5% CO2 и далее в каждую лунку вносили по 10 мкл реактива аламар синий, после чего планшет встряхивали на орбитальном шейкере и далее инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 6 ч. Величину флуоресценции оценивали при длине волны возбуждения 544 нм, длине волны испускания – 590 нм, используя планшетный ридер.
Для создания на основе клеточной линии - природного экспрессора AXL, репортерной клеточной линии, чувствительной к GAS6-зависимомой активации AXL сигналинга, получили стабильные клоны клеток линии Du145, содержащие ген STAT3-STAT5-AP1_FLuc, кодирующий люциферазу светляка под контролем STAT3-STAT5-AP1-промотора.
Отобрали клоны, показавшие активацию в тесте (Фиг. 13-15). Тест проводили в 96-луночном планшете для ИФА. За сутки до эксперимента иммобилизовали AXL-лиганд GAS6 на пластик: готовили раствор GAS6 в концентрации 5 мкг/мл в DPBS и вносили в лунки планшета по 100 мкл. Планшет инкубировали в течение 16 ч при 37°С, 5% CO2. Далее вносили суспензию, которая содержала 50 000 клеток Du145_STAT3-STAT5-AP1_FLuc. Конечный объем клеточной суспензии в лунке составлял 100 мкл. После добавления клеточной суспензии планшет инкубировали в течение 16 ч при 37°С, 5% CO2 и далее, с помощью набора для оценки люминесценции, определяли интенсивность люминесценции в лунках. Измерение проводили при помощи планшетного ридера.
Пример 12. Создание репортерной клеточной линии HEK293_AXL_STAT3-STAT5-AP1_FLuc на основе оверэксперссирующей AXL клеточной линии HEK-293-AXL для оценки AXL-опосредованной активации STAT3-STAT5-AP1 внутриклеточного сигналинга.
Для создания репортерной клеточной линии HEK293_AXL_STAT3-STAT5-AP1_FLuc использовали клеточную линию HEK293_AXL – оверэкспрессор AXL, на основе которой получили пул клеток, содержащих ген, кодирующий люциферазу светляка под контролем STAT3-STAT5-AP1-промотора. Далее из этого пула отобрали отдельные клоны, показавшие активацию в тесте (Фиг. 16). Тест проводили аналогично процедуре, описанной в Пример 7 при концентрации GAS6 2 мкг/мл. Величину активации рассчитывали, как отношение величины люминесценции для данного клона в присутствии GAS6 к величине люминесценции в отсутствии GAS6.
Пример 13. Исследование зависимости активации репортерной клеточной линии HEK293_AXL_STAT3-STAT5-AP1 от числа клеток.
Тест ставили аналогично процедуре, описанной в Пример 7 при концентрации GAS6 2 мкг/мл, для активации использовали клетки репортерной линии HEK293_AXL_STAT3-STAT5-AP1 в указанном на графике (Фиг. 17) числе клеток на лунку 96-луночного планшета. Наибольшая активация наблюдалась, когда в лунке содержалось 25–50 тысяч клеток репортерной линии.
--->
Перечень последовательностей
<110> ЗАО "БИОКАД"
<120> Индуцибельный промотор, вектор и клетка-хозяин на его основе
<160> 16
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> Природная последовательность
<220>
<223> сайт связывания транскрипционного фактора STAT3
<400> 1
agggttcctg gaaggga 17
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> Природная последовательность
<220>
<223> сайт связывания транскрипционного фактора STAT3
<400> 2
cagattccgg gaatccc 17
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> Природная последовательность
<220>
<223> сайт связывания транскрипционного фактора STAT3
<400> 3
atccttctgg gaattct 17
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> Природная последовательность
<220>
<223> сайт связывания транскрипционного фактора STAT5
<400> 4
attattctga gaaaagg 17
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> Природная последовательность
<220>
<223> сайт связывания транскрипционного фактора STAT5
<400> 5
tactttctta gaaaatt 17
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> Природная последовательность
<220>
<223> сайт связывания транскрипционного фактора STAT5
<400> 6
ggtgttccta gaagagg 17
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> Природная последовательность
<220>
<223> сайт связывания транскрипционного фактора AP-1
<400> 7
agcttagcta tgactcatcc ggaagct 27
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Природная последовательность
<220>
<223> сайт связывания транскрипционного фактора AP-1
<400> 8
gtattagtca tcgctattac catg 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Природная последовательность
<220>
<223> сайт связывания транскрипционного фактора AP-1
<400> 9
gatagcggtt tgactcacgg ggat 24
<210> 10
<211> 61
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Комбинация сайтов связывания транскрипционных факторов STAT3,
STAT5 и AP-1
<400> 10
agggttcctg gaagggaatt attctgagaa aaggagctta gctatgactc atccggaagc 60
t 61
<210> 11
<211> 58
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Комбинация сайтов связывания транскрипционных факторов STAT3,
STAT5 и AP-1
<400> 11
cagattccgg gaatccctac tttcttagaa aattgtatta gtcatcgcta ttaccatg 58
<210> 12
<211> 58
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Комбинация сайтов связывания транскрипционных факторов STAT3,
STAT5 и AP-1
<400> 12
atccttctgg gaattctggt gttcctagaa gagggatagc ggtttgactc acggggat 58
<210> 13
<211> 177
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Комбинация сайтов связывания транскрипционных факторов STAT3,
STAT5 и AP-1
<400> 13
agggttcctg gaagggaatt attctgagaa aaggagctta gctatgactc atccggaagc 60
tcagattccg ggaatcccta ctttcttaga aaattgtatt agtcatcgct attaccatga 120
tccttctggg aattctggtg ttcctagaag agggatagcg gtttgactca cggggat 177
<210> 14
<211> 31
<212> DNA
<213> Природная последовательность
<220>
<223> минимальный промотор
<400> 14
agagggtata taatggaagc tcgacttcca g 31
<210> 15
<211> 1656
<212> DNA
<213> Природная последовательность
<220>
<223> ген белка люциферазы светляка
<400> 15
atggaagatg ccaaaaacat taagaaaggc ccagcgccat tctacccact cgaagacggg 60
accgctggcg agcagctgca taaagccatg aagcgctacg ccctggtgcc cggcaccatc 120
gcctttaccg acgcacatat cgaggtggac attacctacg ccgagtactt cgagatgagc 180
gttcggctgg cagaagctat gaagcgctat gggctgaata caaaccatcg gatcgtggtg 240
tgtagcgaga atagcttgca gttcttcatg cccgtgttgg gtgccctgtt catcggtgtg 300
gctgtggccc cagctaacga catctacaac gagcgcgagc tgctgaacag catgggcatc 360
agccagccca ccgtcgtatt cgtgagcaag aaagggctgc aaaagatcct caacgtgcaa 420
aagaagctac cgatcataca aaagatcatc atcatggata gcaagaccga ctaccagggc 480
ttccaaagca tgtacacctt cgtgacttcc catttgccac ccggcttcaa cgagtacgac 540
ttcgtgcccg agagcttcga ccgggacaaa accatcgccc tgatcatgaa cagtagtggc 600
agtaccggat tgcccaaggg cgtagcccta ccgcaccgca ccgcttgtgt ccgattcagt 660
catgcccgcg accccatctt cggcaaccag atcatccccg acaccgctat cctgagcgtg 720
gtgccatttc accacggctt cggcatgttc accacgctgg gctacttgat ctgcggcttt 780
cgggtcgtgc tcatgtaccg cttcgaggaa gagctattct tgcgcagctt gcaagactat 840
aagattcaat ctgccctgct ggtgcccaca ctatttagct tcttcgctaa gagcactctc 900
atcgacaagt acgacctaag caacttgcac gagatcgcca gcggcggggc gccgctcagc 960
aaggaggtag gtgaggccgt ggccaaacgc ttccacctac caggcatccg ccagggctac 1020
ggcctgacag aaacaaccag cgccattctg atcacccccg aaggggacga caagcctggc 1080
gcagtaggca aggtggtgcc cttcttcgag gctaaggtgg tggacttgga caccggtaag 1140
acactgggtg tgaaccagcg cggcgagctg tgcgtccgtg gccccatgat catgagcggc 1200
tacgttaaca accccgaggc tacaaacgct ctcatcgaca aggacggctg gctgcatagc 1260
ggcgacatcg cctactggga cgaggacgag cacttcttca tcgtggaccg gctgaagagc 1320
ctgatcaaat acaagggcta ccaggtagcc ccagccgaac tggagagcat cctgctgcaa 1380
caccccaaca tcttcgacgc cggggtcgcc ggcctgcccg acgacgatgc cggcgagctg 1440
cccgccgcag tcgtcgtgct ggaacacggt aaaaccatga ccgagaagga gatcgtggac 1500
tatgtggcca gccaggttac aaccgccaag aagctgcgcg gtggtgttgt gttcgtggac 1560
gaggtgccta aaggactgac cggcaagttg gacgcccgca agatccgcga gattctcatt 1620
aaggccaaga agggcggcaa gatcgccgtc tgataa 1656
<210> 16
<211> 1951
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Генетическая конструкция, включающая ген белка люциферазы
светляка под контролем индуцибельного промотора, включающего
сайты связывания транскрипционных факторов STAT3, STAT5 и AP-1 и
минимальный промотор
<400> 16
agggttcctg gaagggaatt attctgagaa aaggagctta gctatgactc atccggaagc 60
tcagattccg ggaatcccta ctttcttaga aaattgtatt agtcatcgct attaccatga 120
tccttctggg aattctggtg ttcctagaag agggatagcg gtttgactca cggggatgat 180
atcaagatct agactctaga gggtatataa tggaagctcg acttccagct tggcattccg 240
gtactgttgg taaaaagctt ggcaatccgg tactgttggt aaactcgagg ccaccatgga 300
agatgccaaa aacattaaga aaggcccagc gccattctac ccactcgaag acgggaccgc 360
tggcgagcag ctgcataaag ccatgaagcg ctacgccctg gtgcccggca ccatcgcctt 420
taccgacgca catatcgagg tggacattac ctacgccgag tacttcgaga tgagcgttcg 480
gctggcagaa gctatgaagc gctatgggct gaatacaaac catcggatcg tggtgtgtag 540
cgagaatagc ttgcagttct tcatgcccgt gttgggtgcc ctgttcatcg gtgtggctgt 600
ggccccagct aacgacatct acaacgagcg cgagctgctg aacagcatgg gcatcagcca 660
gcccaccgtc gtattcgtga gcaagaaagg gctgcaaaag atcctcaacg tgcaaaagaa 720
gctaccgatc atacaaaaga tcatcatcat ggatagcaag accgactacc agggcttcca 780
aagcatgtac accttcgtga cttcccattt gccacccggc ttcaacgagt acgacttcgt 840
gcccgagagc ttcgaccggg acaaaaccat cgccctgatc atgaacagta gtggcagtac 900
cggattgccc aagggcgtag ccctaccgca ccgcaccgct tgtgtccgat tcagtcatgc 960
ccgcgacccc atcttcggca accagatcat ccccgacacc gctatcctga gcgtggtgcc 1020
atttcaccac ggcttcggca tgttcaccac gctgggctac ttgatctgcg gctttcgggt 1080
cgtgctcatg taccgcttcg aggaagagct attcttgcgc agcttgcaag actataagat 1140
tcaatctgcc ctgctggtgc ccacactatt tagcttcttc gctaagagca ctctcatcga 1200
caagtacgac ctaagcaact tgcacgagat cgccagcggc ggggcgccgc tcagcaagga 1260
ggtaggtgag gccgtggcca aacgcttcca cctaccaggc atccgccagg gctacggcct 1320
gacagaaaca accagcgcca ttctgatcac ccccgaaggg gacgacaagc ctggcgcagt 1380
aggcaaggtg gtgcccttct tcgaggctaa ggtggtggac ttggacaccg gtaagacact 1440
gggtgtgaac cagcgcggcg agctgtgcgt ccgtggcccc atgatcatga gcggctacgt 1500
taacaacccc gaggctacaa acgctctcat cgacaaggac ggctggctgc atagcggcga 1560
catcgcctac tgggacgagg acgagcactt cttcatcgtg gaccggctga agagcctgat 1620
caaatacaag ggctaccagg tagccccagc cgaactggag agcatcctgc tgcaacaccc 1680
caacatcttc gacgccgggg tcgccggcct gcccgacgac gatgccggcg agctgcccgc 1740
cgcagtcgtc gtgctggaac acggtaaaac catgaccgag aaggagatcg tggactatgt 1800
ggccagccag gttacaaccg ccaagaagct gcgcggtggt gttgtgttcg tggacgaggt 1860
gcctaaagga ctgaccggca agttggacgc ccgcaagatc cgcgagattc tcattaaggc 1920
caagaagggc ggcaagatcg ccgtctgata a 1951
<---
Claims (20)
1. Индуцибельный промотор, включающий сайты связывания транскрипционных факторов STAT3, STAT5 и AP-1 и минимальный промотор, где:
сайт связывания транскрипционного фактора STAT3 представляет собой нуклеотидную последовательность, которую выбирают из группы нуклеотидных последовательностей, которая включает SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3;
сайт связывания транскрипционного фактора STAT5 представляет собой нуклеотидную последовательность, которую выбирают из группы нуклеотидных последовательностей, которая включает SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6;
сайт связывания транскрипционного фактора семейства AP-1 представляет собой нуклеотидную последовательность, которую выбирают из группы нуклеотидных последовательностей, которая включает SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9;
сайты связывания транскрипционных факторов STAT3, STAT5 и AP-1 располагаются от 5' конца к 3' концу один за другим в следующей последовательности STAT3-STAT5-AP-1;
минимальный промотор включает ТАТА-последовательность.
2. Индуцибельный промотор по п.1, где сайты связывания транскрипционных факторов STAT3, STAT5 и AP-1 располагаются от 5' конца к 3' концу один за другим в следующей последовательности STAT3-STAT5-AP-1 и включают нуклеотидную последовательность, которую выбирают из группы нуклеотидных последовательностей, которая включает SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12.
3. Индуцибельный промотор по п.1, где сайты связывания транскрипционных факторов STAT3, STAT5 и AP-1 включают нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 13.
4. Индуцибельный промотор по п.1, где минимальный промотор включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 14.
5. Индуцибельный экспрессионный вектор, включающий в направлении от 5'-конца к 3'-концу индуцибельный промотор по любому из пп.1-4 и репортерный ген.
6. Индуцибельный экспрессионный вектор по п.5, где репортерный ген представляет собой ген белка люциферазы светляка.
7. Индуцибельный экспрессионный вектор по п.6, где ген белка люциферазы светляка включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 15.
8. Индуцибельный экспрессионный вектор по п.5, который включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 16.
9. Способ получения клетки-хозяина для анализа активности целевого белка, включающий трансформирование клетки индуцибельным экспрессионным вектором по любому из пп.5-8.
10. Клетка-хозяин для анализа активности целевого белка, содержащая индуцибельный промотор по любому из пп.1-4 и репортерный ген.
11. Клетка-хозяин по п.10, где репортерный ген представляет собой ген белка люциферазы светляка.
12. Клетка-хозяин по п.11, где ген белка люциферазы светляка включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 15.
13. Клетка-хозяин по п.10, которая включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 16.
14. Клетка-хозяин по п.10, где целевой белок представляет собой лиганд рецептора.
15. Клетка-хозяин по п.14, где лиганд рецептора представляет собой цитокин.
Priority Applications (8)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
TW111133549A TW202328452A (zh) | 2021-09-07 | 2022-09-05 | 誘導型啟動子、基於其的載體和宿主細胞 |
IL311289A IL311289A (en) | 2021-09-07 | 2022-09-06 | An activatable promoter, a vector and a storage cell based thereon |
CA3231157A CA3231157A1 (en) | 2021-09-07 | 2022-09-06 | Inducible promoter, vector and host cell based thereon |
KR1020247011535A KR20240055082A (ko) | 2021-09-07 | 2022-09-06 | 유도성 프로모터, 벡터 및 이에 기반한 숙주 세포 |
PCT/RU2022/050279 WO2023038547A1 (ru) | 2021-09-07 | 2022-09-06 | Индуцибельный промотор, вектор и клетка-хозяин на его основе |
AU2022341881A AU2022341881A1 (en) | 2021-09-07 | 2022-09-06 | Inducible promoter, vector and host cell based thereon |
ARP220102426A AR127003A1 (es) | 2021-09-07 | 2022-09-07 | Promotor inducible, vector y célula huésped basados en el mismo |
CONC2024/0002825A CO2024002825A2 (es) | 2021-09-07 | 2024-03-07 | Promotor inducible, vector y célula huésped basados en él |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2021126254A RU2021126254A (ru) | 2023-03-07 |
RU2820059C2 true RU2820059C2 (ru) | 2024-05-28 |
Family
ID=
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2007101290A (ru) * | 2004-07-16 | 2008-07-20 | Аксам С.Р.Л. (It) | Способы и анализы определения активности гуанилатциклазы |
WO2019199689A1 (en) * | 2018-04-09 | 2019-10-17 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods and compositions comprising a viral vector for expression of a transgene and an effector |
US20200308591A1 (en) * | 2019-03-28 | 2020-10-01 | Eurofins Discoverx Corporation | Promoter region analysis methods and cells for practicing same |
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2007101290A (ru) * | 2004-07-16 | 2008-07-20 | Аксам С.Р.Л. (It) | Способы и анализы определения активности гуанилатциклазы |
WO2019199689A1 (en) * | 2018-04-09 | 2019-10-17 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods and compositions comprising a viral vector for expression of a transgene and an effector |
US20200308591A1 (en) * | 2019-03-28 | 2020-10-01 | Eurofins Discoverx Corporation | Promoter region analysis methods and cells for practicing same |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
LERNER L. et al. STAT3-dependent enhanceosome assembly and disassembly: synergy with GR for full transcriptional increase of the α2-macroglobulin gene. GENES & DEVELOPMENT, v.17, p.2564-2577. BEDNORZ N. L. et al. Tracking the Activation of Stat5 through the Expression of an Inducible Reporter Gene in a Transgenic Mouse Line. Endocrinology, 2011, v.152, no.5, p.1935-1947. * |
RINCON, M., & FLAVELL, R. A. AP-1 transcriptional activity requires both T-cell receptor-mediated and co-stimulatory signals in primary T lymphocytes. The EMBO Jour-nal, 1994, v.13, no.18, p.4370-4381. doi:10.1002/j.1460-2075.1994.tb06757.x. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Kotanides et al. | Interleukin-4-induced STAT6 recognizes and activates a target site in the promoter of the interleukin-4 receptor gene | |
Schuermann et al. | The leucine repeat motif in Fos protein mediates complex formation with Jun/AP-1 and is required for transformation | |
Patterson et al. | Codon optimization of bacterial luciferase (lux) for expression in mammalian cells | |
WO2018171747A1 (zh) | 一种体外DNA-to-Protein(D2P)的合成体系、制剂、试剂盒及制备方法 | |
Mesner et al. | Isolating apparently pure libraries of replication origins from complex genomes | |
You et al. | Efficient mAb production in CHO cells with optimized signal peptide, codon, and UTR | |
Zhao et al. | Gene Codon Composition Determines Differentiation-Dependent Expression of a Viral Capsid Gene in Keratinocytes In Vitro and InVivo | |
CN106255700A (zh) | 具有高分泌效率的蛋白质分泌因子和包含其的表达载体 | |
WO2009155950A1 (en) | Cloning-free method of generating transcriptionally and post-transcriptionally controllable expression active linear reporter constructs | |
Iizasa et al. | Highly efficient yeast-based in vivo DNA cloning of multiple DNA fragments and the simultaneous construction of yeast/Escherichia coli shuttle vectors | |
RU2820059C2 (ru) | Индуцибельный промотор, вектор и клетка-хозяин на его основе | |
WO2023038547A1 (ru) | Индуцибельный промотор, вектор и клетка-хозяин на его основе | |
Chai et al. | Human rhinovirus internal ribosome entry site element enhances transgene expression in transfected CHO-S cells | |
MacFerrin et al. | [7] Overproduction of proteins using expression-cassette polymerase chain reaction | |
JP2023116620A (ja) | 環状rnaを使用したタンパク質翻訳およびその応用 | |
CN118302529A (en) | Inducible promoters, vectors and host cells based thereon | |
CN109072251A (zh) | 启动子 | |
Andersson et al. | Sequence selectivity of c-Myb in vivo: resolution of a DNA target specificity paradox | |
WO2005090562A1 (ja) | 軽度の低温により遺伝子の発現を促進させる配列 | |
EP0755453A1 (en) | Dna regulatory elements responsive to cytokines | |
Wang et al. | Maximal induction of p69 2′, 5′-oligoadenylate synthetase in Daudi cells requires cooperation between an ISRE and two IRF-1-like elements | |
RU2396343C2 (ru) | Генетически модифицированная линия фибробластов мыши nih/3т3-174 | |
CN110093361A (zh) | 一种增强基因表达的增强子多肽及其应用 | |
Britton et al. | Tag-on-Demand: exploiting amber codon suppression technology for the enrichment of high-expressing membrane protein cell lines | |
WO2024051855A1 (zh) | 一种核酸构建物以及在ivtt体系中的应用 |