RU2817924C1 - Устройство для криоконсервирования эритроцитов и способ его применения - Google Patents

Abstract

Группа изобретений относится к медицинской технике, в частности к трансфузиологии, и применяется для криоконсервирования и подготовки эритроцитов к трансфузии. Представлено устройство для криоконсервирования эритроцитов, содержащее контейнер для эритроцитов, соединенный трубками с полимерными иглами для присоединения к контейнерам с растворами. При этом контейнер для криоконсервирования эритроцитов соединен трубкой с зажимом с первым патрубком первого четверника. Вторые патрубки первого и второго четверника соединены трубкой с зажимом. Их третьи патрубки соединены трубкой с зажимом и обратным клапаном, между которыми установлен бактериальный фильтр. Четвертый патрубок первого четверника соединен трубкой линии криопротектора с тройником, к которому присоединены две трубки, каждая из которых оканчивается полимерной иглой и имеет зажим. На одной из трубок между зажимом и тройником установлен бактериальный фильтр. Четвертый патрубок второго четверника соединен трубкой с зажимом с коннектором Луер-лок, а первый его патрубок соединен трубкой с зажимом с полимерной иглой. Также описан способ использования указанного устройства. Достигается сохранение качества подготовленных к трансфузии эритроцитов и снижение вероятности их микробной контаминации. 2 н. и 17 з.п. ф-лы, 2 табл., 6 ил.

Description

Изобретение относится к медицинской технике, в частности к трансфузиологии, и применяется для криоконсерваирования и подготовки эритроцитов к трансфузии.

Эритроциты востребованы для лечения больных с политравмой, массивной кровопотерей, анемией, после химио- и лучевой терапии. Однако до сих пор сохраняется риск передачи с эритроцитами опасных инфекций от донора к реципиенту. Вызвано это коротким, до 49 суток, сроком хранения эритроцитов и наличием серонегативного «окна» - периода, когда не могут быть выявлены маркеры опасных инфекций. Задача решается карантинизацией, т. е. повторным анализом крови донора через 120 суток после её заготовки. Карантинизировать эритроциты, сохраняя их полезные свойства, можно при условии замораживания, продолжительного хранения до 10 лет, и размораживания эритроцитов для повторного анализа на маркеры опасных инфекций (HIV, HBV, HCV). В связи с этим востребованы криоконсервированные эритроциты, способы криоконсервирования и устройства для криконсервирования эритроцитов.

Известны устройства для криконсервирования клеток человека и животных, выпускаемые отечественными Виробан (Контейнер «Криопак» (руководство по эксплуатации). https://biomedgroup.ru/product/43950.html) и зарубежными фирмами: Макофарма (Контейнер Maco Biotech однокамерный для клеток (руководство по эксплуатации). https://www.asta.ru/kontejnery-maco-biotech-dlya-kletok). Такие устройства содержат отдельные контейнеры, соединенные трубками с зажимами, и предназначены для замораживания, хранения при низких температурах и размораживания клеток, но не позволяют в закрытой системе проводить все технологические операции, необходимые для криоконсервирования и отмывания эритроцитов.

Известен аппарат Haemonetics ACP 215, США (руководство по эксплуатации, https://www.manualslib.com/products/Haemonetics-Acp-215-11414777.html) для глицеролизации, деглицеролизации эритроцитов и одноразовые расходные материалы к нему, выполненные в виде систем, содержащих соединенные в определенной последовательности трубки, зажимы насосные сегменты, фильтры, разветвители и другие элементы, характерные для трансфузионных систем. Для каждого этапа способа криконсервирования эритроцитов используют отдельные системы: для глицеролизации и для деглицеролизации. Единая закрытая система для всех этапов технологии, включая отмывание эритроцитов, отсутствует. Кроме того, различные этапы технологии требуют использования дополнительного оборудования и расходных материалов для многократного стерильного и не всегда надежного термосоединения трубок.

Известен также наиболее близкий аналог «Комплект изделий для криоконсервирования эритроцитов однократного применения, стерильный», производства ОАО «Синтез» (инструкция по эксплуатации) https://docs.nevacert.ru/files/med_reestr_v2/52096_instruction.pdf), состоящий из нескольких контейнеров, соединенных трубками с зажимами, в одном из которых содержится гемоконсервант «Глюгицир». Заготовленную в этой системе цельную донорскую кровь центрифугируют, переводят плазму в отдельный контейнер, а контейнер с эритроцитной массой соединяют с контейнером, содержащим раствор криопротектора «Криосин». Соединение контейнеров, проводят с нарушением герметичности и трансфузиологического принципа «замкнутости» системы путем введения перфоратора, находящегося на трубке контейнера с раствором «Криосин», в порт контейнера с эритроцитной массой. Причем эту манипуляцию повторяют многократно. Тем самым возрастает риск микробной контаминации эритроцитов из-за условно стерильного соединения контейнеров.

Способ криоконсервирования эритроцитов с использованием устройства-прототипа возможен только в асептических условиях при наличии «чистых» помещений, локальных стерильных зон и ламинарных шкафов, сохраняющих стерильность целевого продукта – отмытого и ресуспендированного эритроцитного концентрата.

Необходимо единое, целостное и замкнутое устройство, которое без наличия асептических условий окружающей среды, не нарушая стерильность на всех этапах технологического процесса криконсервирования и подготовки эритроцитов к трансфузии, может обеспечить реализацию следующих технологических этапов:

- перевод в устройство эритроцитов, полученных от донора,

- перевод в устройство раствора криопротектора (глицеролизация),

- центрифугирование и удаление супернатанта,

- замораживание, хранение, размораживание устройства с эритроцитами в вакуумированном воздухонепроницаемом полимерном пакете,

- перевод в устройство гипертонического и отмывающего растворов (деглицеролизация),

- повторное центрифугирование и удаление супернатанта,

- многократный перевод в устройство отмывающего раствора, центрифугирование и удаление супернатанта (отмывание),

- перевод в устройство консервирующего раствора и ресуспендирование отмытых эритроцитов.

В связи с этим задачей изобретения является реализация многоэтапной технологии криоконсервирования, хранения и подготовки эритроцитов к трансфузии с помощью единого закрытого устройства взамен различных устройств для каждого этапа технологии, которые должны поэтапно соединяться друг с другом путем сваривания различных трубок.

Технический результат состоит в сохранении качества подготовленных к трансфузии эритроцитов и снижении вероятности их микробной контаминации.

Дополнительный технический результат заключается в том, что не требуются асептические внешние условия для стерильного осуществления технологических манипуляций. Необходимо только стандартное штатное трансфузиологическое оборудование. Упрощается работа персонала. Отсутствует потребность в использовании сложных автоматических клеточных процессоров, аппаратов для стерильного сваривания трубок и расходных материалов к ним.

Поставленная задача решена и технический результат достигнут тем, что устройство для криоконсервирования эритроцитов содержит контейнер для эритроцитов, соединенный трубками с полимерными иглами для присоединения к контейнерам с растворами. При этом контейнер для криконсервирования эритроцитов соединен трубкой с зажимом с первым патрубком первого четверника, вторые патрубки первого и второго четверника соединены трубкой с зажимом. Их третьи патрубки соединены трубкой с зажимом и обратным клапаном, между которыми установлен бактериальный фильтр. Кроме того, четвертый патрубок первого четверника соединен трубкой линии криопротектора с тройником, к которому присоединены две трубки, каждая из которых оканчивается полимерной иглой и имеет зажим. Причем на одной из трубок между зажимом и тройником установлен бактериальный фильтр. Четвертый патрубок второго четверника соединен трубкой с зажимом с коннектором Луер-лок, а первый его патрубок соединен трубкой, содержащей зажим, с полимерной иглой.

Другие конкретизирующие и развивающие признаки и особенности устройства указаны в зависимых пунктах формулы изобретения.

В частности, дополнительный технический результат получают за счет того, что в устройстве используют разноцветные плоские съемные или несъемные щелевых зажимы или зажимы-защелки, а также бактериальные фильтры, содержащие стерилизующую мембрану с порами не более 0,2 мкм.

Целесообразно чтобы контейнер для криконсервирования эритроцитов имел номинальную вместимость не менее 1000 мл, прямоугольную, предпочтительно квадратную форму с закругленными углами; был выполнен из совместимого с эритроцитами прозрачного и эластичного материала, сохраняющего герметичность контейнера при температуре от минус 85 до плюс 40 градусов Цельсия.

Удобно, чтобы контейнер для криоконсервирования эритроцитов на боковых швах имел прямую и обратную шкалу объема заполнения растворами, а коннектор Луер-лок и полимерные иглы устройства были закрыты съемными герметизирующими колпачками.

Кроме того, конструкция устройства рассчитана на сопряжение с контейнерами для растворов и контейнером для эритроцитов номинальной вместимостью 500 мл и адаптирована для криоконсервирования одной донорской дозы эритроцитов 300 мл +/- 10 %.

Номинальный объем контейнера для криоконсервирования эритроцитов – 1000 мл выбран для того, чтобы в нем могли свободно разместиться 300 мл эритроцитной взвеси и 500 мл отмывающего раствора. А сам контейнер, выполненный из гибкого материала и заполненный эритроцитной взвесью в растворе, совместно с трубками, зажимами и другими элементами устройства мог свободно разместиться в стакане центрифуги ограниченного объема. По тому же соображению компактности целесообразно, чтобы устройство имело малогабаритные плоские съемные или несъемные зажимы, или зажимы-защелки. Разный цвет зажимов позволяет быстро идентифицировать трубки различного функционального назначения.

Предпочтительная квадратная форма контейнера имеет по периметру минимальную площадь швов при заданной площади и объеме контейнера, что позволяет экономить материал, из которого изготовлен контейнер. Контейнер квадратной формы, в отличие от прямоугольной, не выступает за габариты стакана центрифуги. Скругленные углы контейнера не повреждают пакет, в котором стерилизуют устройство, содержащее такой контейнер. Совместимость материала, из которого выполнен контейнер, с эритроцитами сохраняет функциональную активность и не повреждает эритроциты. Прозрачность материала, прямая и обратная шкала объема заполнения контейнера раствором, нанесенная на боковые швы, позволяет визуально следить и контролировать уровень заполнения контейнера отмывочным раствором и объемом супернатанта.

Способность контейнера К1 выдерживать температуру замораживания минут 85 градусов Цельсия и сохранять герметичность проверили в эксперименте. Заморозили/разморозили 10 контейнеров предварительно заполнив их отмывочным раствором. Последовательно присоединили к трубке каждого контейнера манометр Little doctor electronic M6 и создали давление 40 кПа. Давление было неизменным в течение 15 минут у всех 10-и контейнеров, что соответствовало нормативным требованиям, предъявляемым к прочности и герметичности контейнеров для гемокомпонентов.

Конструкция устройства для криконсервирования эритроцитов рассчитана на точное объемное сопряжение со стандартными, промышленно выпускаемыми контейнерами, содержащими строго определенные объемы растворов глицерола, гипертонического и изотонического растворов для глицеролизации, деглицеролизации и отмывания в закрытом устройстве одной дозы эритроцитов, чтобы не измерять необходимые объемы растворов на каждом этапе способа применения устройства.

Использование в устройстве бактериальных фильтров с мембраной, имеющей поры размером не более 0,2 мкм, позволяет осуществлять «холодную» стерилизацию растворов, вводимых через них в устройство, и сохранять стерильность целевого продукта – эритроцитов, при всех технологических манипуляциях с растворами. Сохранение стерильности обусловлено четкой корреляцией, установленной фирмой «Миллипор», между способностью мембраны задерживать микроорганизмы и размером пор мембраны менее 0,2 мкм.

Технический результат достигается также благодаря тому, что предложен способ использования устройства для криоконсервирования эритроцитов.

Способ включает: соединение контейнера для криоконсервирования эритроцитов с контейнером, содержащим донорские эритроциты, и соединение с контейнером, содержащим раствор криопротектора.

Способ также предусматривает перевод в контейнер для криоконсервирования эритроцитов вначале эритроцитов при помешивании, после чего перевод в контейнер раствора криопротектора через бактериальный фильтр; центрифугирование, отделение и перевод супернатанта, минуя бактериальный фильтр, в пустой контейнер из-под эритроцитов, запаивание и отделение трубки линии криопротектора совместно с прилежащей частью устройства для криоконсервирования эритроцитов.

Кроме того, способ обеспечивает помещение в полимерный пакет оставшейся части устройства для криоконсервирования эритроцитов и контейнера для криоконсервированных эритроцитов, заполненного концентрированными эритроцитами в криопротекторе; вакуумирование, герметизацию, замораживание и хранение пакета.

Способ также обеспечивает размораживание криоконсервированных эритроцитов, удаление пакета; присоединение вначале шприца с гипертоническим раствором к коннектору Луер-лок устройства для криоконсервирования эритроцитов, добавление гипертонического раствора к размороженным эритроцитам, отсоединение шприца и герметизацию коннектора Луер-лок съемным колпачком.

После выполнения перечисленных выше операций способ последовательно обеспечивает: присоединение полимерной иглы устройства для криоконсервирования эритроцитов к контейнеру с отмывочным изотоническим раствором и перевод его через бактериальный фильтр в контейнер с эритроцитами, суспендированных в гипертоническом растворе при помешивании; центрифугирование, отделение супернатанта и перевод его, минуя бактериальный фильтр, в пустой контейнер из-под отмывочного раствора;

Способ также предусматривает после каждого этапа отмывания эритроцитов замену на новый контейнер со свежим отмывочным изотоническим раствором предыдущего контейнера, в который переместили супернатант, «загрязненный» остатками криопротектора, гипертонического раствора и детритом поврежденных эритроцитов. Способ включает повторение не менее трех раз описанного выше порядка отмывания эритроцитов; присоединение к коннектору Луер-лок контейнера с консервирующим (взвешивающим) раствором и перевод консервирующего раствора через бактериальный фильтр в контейнер с отмытыми эритроцитами при помешивании.

На завершающем этапе способ включает отделение от устройства контейнера для криоконсервирования эритроцитов с отмытыми и ресуспендированными эритроцитами. После чего контейнер передают для переливания эритроцитов реципиенту.

Конкретизирующие и развивающие признаки способа применения устройства для криоконсервирования эритроцитов указаны в зависимых пунктах, относящихся к независимому пункту формулы изобретения, касающегося способа.

В частности, дополнительный технический результат достигают за счет того, что в способе в качестве криопротектора используют раствор глицерола 57% объемом 600 +/- 10%; в качестве гипертонического раствора – 12% раствор натрия хлорида объемом 60 мл +/- 10%; в качестве отмывающего изотонического раствора – 0,9% раствор натрия хлорида в объеме не менее 1,5 – 2,0 литра, расфасованного в контейнеры с номинальной вместимостью 500 мл; в качестве консервирующего раствора – SAG-M объемом 350 мл.

Кроме того, согласно способу, в процессе криоконсервирования и отмывания эритроцитов последовательно отделяют и удаляют супернатанты, содержащие раствор криопротектора, гипертонический и изотонический растворы, используя центрифугирование при центробежном ускорении 1250 g в течение 10 мин и плазмоэкстрактор, который перемещает супернатанты из контейнера для криоконсервирования эритроцитов в освободившиеся из-под растворов пустые контейнеры. При этом названные растворы, из контейнеров их содержащих, первоначально переводят в контейнер для криконсервирования эритроцитов путем перфорации полимерными иглами устройства для криоконсервирования эритроцитов мембран штуцеров контейнеров, закрытых отделяемым защитным элементом.

Способ также обеспечивает безаппаратным методом перевод из контейнеров раствора криопротектора, отмывающих растворов и консервирующего раствора в контейнер для криоконсервирования эритроцитов, используя силу тяжести гидростатического столба растворов в трубках и контейнерах, расположенных по высоте на расстоянии не более 100 см от контейнера для криоконсервирования эритроцитов.

Для осуществления способа используют пакет для размещения в нем устройства для криоконсервирования эритроцитов, контейнер которого заполнен концентрированными в растворе криопротектора эритроцитами, вакуумирования, замораживания/размораживания и хранения пакета. Причем пакет выполнен из прозрачного, гибкого, воздухонепроницаемого полимерного материала, обеспечивающего герметизацию посредством термосформированного шва и удержание вакуума в пакете при температуре от минус 85 до плюс 40 градусов Цельсия.

Экспериментально подтверждено (пример осуществления устройства и способа его применения представлен ниже), что приведенные в пунктах 12 – 14 формулы изобретения объемы растворов, указанные отклонения которых от номинального объема совпадают с предусмотренными в технических условиях производителей, необходимы и достаточны для достижения заявленного технического результата.

Параметры центрифугирования находящихся в контейнере К1 устройства эритроцитов, суспендированных в растворах, определены из экспериментов. Задача состояла в образовании максимального объема супернатанта за приемлемое время, сильно не удлиняющего этап центрифугирования, и нахождении максимально допустимой перегрузки, не нарушающей целостность устройства для криоконсервирования эритроцитов. Исследовали три центробежных ускорения 1500, 1400 и 1250g при центрифугировании 10-и устройств. Только при 1250g все устройства сохраняли целостность. Продолжительность центрифугирования свыше 10 минут не приводила к увеличению объема супернатанта в контейнере К1 и лучшему отмыванию эритроцитов.

Разность уровней расположения по высоте контейнеров с эритроцитами и растворами на расстоянии 100 см друг от друга обусловлена двумя причинами и проверена в экспериментах. Выше 100 см растворы с большой скоростью суспендируют эритроциты, которые не успевают адаптироваться к резкому изменению осмолярности окружающей среды; часть из них гемолизируется. Меньше 100 см - нежелательно удлиняется процесс отмывания эритроцитов в силу снижения скорости поступления растворов в контейнер К1 с эритроцитами. При 100 см среднее время ресуспендирования эритроцитов составляло 20 минут.

Пакет для вакуумирования позволяет удобно перемещать и компактно хранить в нем эритроциты, находящиеся в контейнере К1, и части устройства для криоконсервирования эритроцитов, необходимой для последующей деглицеролизации и отмывания эритроцитов. Прозрачность материала пакета обеспечивает возможность наблюдения за целостностью его содержимого; гибкость материала – возможность вакуумирования и уменьшения объема пакета; воздухонепроницаемость материала предотвращает контакт воздуха с ПВХ материалом, из которого выполнен контейнер К1. Сквозь ПВХ материал небольшая часть кислорода воздуха проникает в контейнер К1 и ухудшает условиях хранения эритроцитов.

Способность пакета удерживать вакуум при температуре от минус 85 до плюс 40 градусов Цельсия проверили в эксперименте, аналогичном вышеописанному для проверки целостности контейнера К1 при том же диапазоне температур. С тем отличием, что пакет, содержащий эритроциты в контейнере К1 устройства для криоконсервирования эритроцитов, запаяли термошвом и создали вакуум с помощью вакууматора Fidget Go. Целостность пакета и наличие вакуума проверили путем сжатия пакета под водой в течение 15 минут. Пузырьки воздуха не обнаруживались, что свидетельствовало о целостности пакета и сохранении вакуума.

Предпочтительные признаки изобретения описаны в зависимых пунктах формулы изобретения, а также следуют из приведенного ниже конкретного, но не ограничивающего примера выполнения устройства и осуществления способа его применения со ссылками на прилагаемые схемы, показанные на фиг. 1 – 6.

Фиг.1. Схема устройства для криоконсервирования эритроцитов. Устройство на фиг. 1 состоит из, четверников (разветвителей трубок) 1 и 2, полимерных игл со съемными герметизирующими колпачками 3 – 5, зажимов 6 – 12, обратного клапана 13, бактериальных стерилизующих фильтров с мембраной (0,2 мкм) 14 и 15, тройника (разветвителя трубок) 16, коннектора Луер-Лок со съемным герметизирующим колпачком 17, контейнера К1 для криоконсервирования эритроцитов 18. Элементы 1 - 18 устройства соединены трубками с применение сварных и клеевых технологий, где a – место термосоединения технологической трубки контейнера с эритроцитами с трубкой устройства для криоконсервирования эритроцитов, a1 – a4 - места запаивания и отделения трубок вместе с прилежащими частями устройства. A, B, С, D - соответственно линии донорских эритроцитов, раствора криопротектора, отмывающего изотонического раствора, гипертонического раствора. A + B - часть устройства для глицеролизации эритроцитов. C + D – часть устройства для деглицеролизации и отмывания эритроцитов.

Фиг. 2. Схема присоединения к устройству для криконсервирования эритроцитов контейнера К2 с донорскими эритроцитами и контейнера К3 с раствором криопротектора (глицеролизация).

Фиг. 3. Схема присоединения к устройству для криконсервирования эритроцитов шприца 19 с гипертоническим раствором, набранным из контейнера К4, и контейнера К5 с отмывочным изотоническим раствором (деглицеролизация). В контейнере К1 – размороженные эритроциты, концентрированные в растворе криопротектора.

Фиг. 4. Схема последовательного присоединения к устройству для криконсервирования эритроцитов нескольких контейнеров К5/1 – К5/4 с отмывочным изотоническим раствором (отмывание).

Фиг. 5. Схема присоединения к устройству для криконсервирования эритроцитов контейнера К6 с консервирующим (взвешивающим) раствором. В отделенном от устройства контейнере К1 содержатся отмытые и ресуспендированные эритроциты, готовые к трансфузии.

Стрелки на фиг. 2 - 5 показывают направления потоков. Цифровые обозначения и наименования элементов устройства на фиг. 2 - 5 такие же, как и на фиг.1.

Фиг. 6. Последовательность этапов способа использования устройства для криоконсервирования эритроцитов.

Параметры изготовленных в соответствии с предложенным техническим решением устройств для криконсервирования эритроцитов и способа их использования, а также показатели качества глицеролизированных, деглицеролизированных и отмытых эритроцитов приведены ниже на примерах криоконсервирования лейкоредуцированных эритроцитов доноров.

Эритроциты (эритроцитная взвесь лейкоредуцированная, с остаточным содержанием лейкоцитов менее 10⁶ в единице (единица/доза – количество эритроцитного компонента в одном контейнере)) получены от 6 штатных доноров в объеме 600 мл +/- 10%, содержащихся в среднем по 300 мл +/-10% от каждого донора в полимерных контейнерах вместимостью 500 мл из ПВХ-материала. Всего – 12 контейнеров.

Изготовили 12 устройств для криоконсервирования эритроцитов с параметрами, соответствующим описанным в формуле изобретения.

Все элементы устройств выполнены из нетоксичных эритроцитосовместимых, гипоаллергенных, апирогенных полимерных материалов, устойчивых к низким отрицательным температурам (минус 85 град Цельсия) и центрифугированию с перегрузкой 1250 g. Устройства стерилизовали радиационным методом дозой 20 +/-5 кГр.

Экспериментальное оборудование:

1. Аппарат для автоматического спаивания трубок TSCD-П.

2. Аппарат для запаивания трубок Гекон-С.

3. Весы-помешиватели «Б.Микс».

4. Рефрижераторная центрифуга Sorvall RC 3C plus.

5. Плазмоэкстрактор Jouan.

6. Морозильная камера Haier.

7. Размораживатель Barkey Plasmatherm.

8. Стойка трансфузионная ММ-101.

7. Вакууматор для вакуумирования и запаивания пакетов Fidget Go.

С цель проверки стерильности и качества конечного продукта - отмытых эритроцитов, провели два вида экспериментов с разным типом присоединения к устройству для криконсервирования эритроцитов 12-и контейнеров с эритроцитами.

Закрыли все зажимы 6 – 12 (фиг. 1) на устройстве для криконсервирования эритроцитов.

Первый эксперимент: шесть контейнеров К1 с эритроцитами в объеме 300 мл +/- 10% соединили путем термосваривания технологической трубки контейнера с трубкой линии A устройства для криконсервирования эритроцитов в месте «a», обозначенном на фиг.1. Использовали аппарат для сваривания трубок с внутренним/внешним диаметром 3,0/4,1 мм. Второй эксперимент: другие 6 контейнеров К1 с эритроцитами в объеме 300 мл +/- 10% присоединили к устройству для криоконсервирования эритроцитов путем перфорации полимерной иглой 3 линии А устройства мембраны штуцеров каждого из 6-и контейнеров с эритроцитами, предварительно сняв колпачок с полимерной иглы и удалив со штуцера отделяемый защитный элемент. В каждом эксперименте реализовали все этапы способа применения устройства (фиг. 6).

Этап глицеролизации. К контейнеру К3 с раствором криопротектора - глицерол концентрацией 57% объемом 600 мл, присоединили полимерную иглу 4 линии В устройства для криоконсервирования эритроцитов, предварительно сняв колпачок с полимерной иглы и удалив со штуцера контейнера К3 отделяемый защитный элемент.

Контейнер К1 для криконсервирования эритроцитов поместили на весы-помешиватели, расположенные на лабораторном столе (фиг. 2). На трансфузионной стойке подвесили на высоте 100 см от уровня стола контейнеры К2 и К3. Включили весы-помешиватели, открыли зажимы 12 и 6. Перевели самотеком под действием силы тяжести эритроциты из контейнера К2 в контейнер К1. После чего открыли зажим 7 и перевели в контейнер К1 через бактериальный фильтр 14 раствор криопротектора. Закрыли зажимы 12, 6, 7. Среднее время для заполнения контейнера К1 эритроцитами и раствором криопротектора составило 20 +/- 5 мин.

Отпаяли часть устройства в месте а1 линии В и удалили вместе с пустым контейнером К3. Разместили без линии В все 6 устройств для криконсервирования эритроцитов с контейнером К1, заполненным эритроцитами и раствором криопротектора, в 6-и центрифужных стаканах, разделенных перегородкой. В одну часть стакана поместили контейнер К1, в другую – остальные элементы устройства. Провели центрифугирование в течение 10 минут при центробежном ускорении 1250 g. Среднее время с учетом размещения/извлечения устройства из центрифуги и центрифугирования составило 15 +/- 2 мин.

После центрифугирования разместили контейнер К1 в плазмоэкстракторе. Открыли зажимы 6 и 12. Перевели супернатант в контейнер К2. Отпаяли часть устройства с контейнером К2 в месте а2, используя запаиватель трубок. Оставшуюся часть устройства поместили в полимерный пакет, размером 20 х 30 см, который вакуумировали и запаяли, используя вакууматор. Среднее время составило 10+/-1 мин. Всего на этап глицеролизации эритроцитов затратили 45 – 50 минут.

Пакеты с устройством для криоконсервирования эритроцитов, содержащим в контейнере К1 концентрированные в растворе криопротектора эритроциты, поместили в стандартные алюминиевые коробки и заморозили в морозильной камере до температуры минус 85 град Цельсия со скоростью 1-3 град/мин. Выдержали 6 месяцев и разморозили в размораживателе со скоростью 1-3 град/мин до температуры 37 град. Цельсия. Пакет удалили.

Этап деглицеролизации. Отобрали в шприц 19 из контейнера К4 60 мл 12% гипертонического раствора натрия хлорида (фиг. 3). Закрыли зажимы 8 и 11, открыли зажимы 9, 10, 12. Поместили контейнер К1 на весы-помешиватель. Присоединили шприц 19 к коннектору Луер-лок 17 линии D устройства и медленно перевели гипертонический раствор в контейнер К1 при помешивании. Закрыли зажим 9, отсоединили шприц 19 и закрыли коннектор 17 герметизирующим винтовым колпачком. Полимерную иглу 5 линии С устройства ввели в порт контейнера К5/1, содержащего 500 мл отмывочного изотонического 0,9% раствора натрия хлорида. Открыли зажим 8 и перевели раствор в контейнер К1 при помешивании.

Закрыли зажимы 8 – 12. Разместили в каждом из 6 стаканов центрифуги линию С устройства с контейнером К1, заполненным гипертоническим и отмывочным изотоническим раствором. Центрифугировали в течении 10 минут при центробежном ускорении 1250 g. Открыли зажимы 8, 11, 12. Используя плазмоэкстрактор, переместили обратным током через обводную трубку супернатант в пустой контейнер К5/1. Удалили контейнер К5/1 с «загрязненным» отмывочным раствором и заменили его на новый контейнер. Трехкратно повторили описанные этапы способа, каждый раз с новым контейнером К5/2 – К5/4.

Отпаяли в месте а3 линии С последний из контейнеров - К5/4. Сняв колпачок, соединили коннектор Луер-лок 17 линии D с контейнером К6, содержащим 350 мл консервирующего раствора SAG-M. Закрыли зажим 11, открыли зажимы 10, 12. Перевели раствор в контейнер К1 при помешивании. Среднее время, затраченное на деглицеролизацию, отмывание и консервирование одной донорской дозы эритроцитов, составило 100 +/- 10 минут, которое можно уменьшить на 20% при одновременном центрифугировании 6-и контейнеров К1.

Отпаяли в месте а4 от линии С контейнер К1 с отмытыми и ресуспендированными в консервирующем растворе эритроцитами. Провели анализ конечного продукта по параметрам качества и стерильности.

Предложенное устройство и способ его применения, минуя стадию глицеролизации, также можно использовать для деглицеролизации и отмывания (фиг. 6 пункты 10 – 18) замороженной эритроцитной взвеси, хранящейся при низких температурах на станциях заготовки и переливания крови.

Анализы, проведенные в соответствии с ГОСТом EN 556-1-2011, не выявили нарушения стерильности всех 12 доз глицеролизованных, деглицеролизованных и отмытых эритроцитов, подготовленных к трансфузии с использованием предложенного устройства и способа его применения, что свидетельствовало о достижении технического результата - низкой вероятности контаминации целевого продукта. При этом все дозы эритроцитов, подготовленных к трансфузии, были стерильны независимо от способа первоначального присоединения контейнера с донорскими эритроцитами к устройству: путем термосваривания технологических трубок или прокалывания полимерной иглой мембраны штуцера контейнера с донорскими эритроцитами.

Параметры качества отмытых и ресуспендированных эритроцитов (целевой продукт) с использованием предложенного устройства и способа его применения определили с помощью оборудования и аналитических методов, представленных в таблице 1. Средние значения (по 12-и донорским единицам/дозам) параметров качества полученного целевого продукта в сравнении с нормативными требованиями ПП РФ от 22.06.2019 № 797 «Об утверждении Правил заготовки, хранения, транспортировки и клинического использования донорской крови и ее компонентов ….», Приложение 1, пункт 10,  представлены в таблице 2.

Оборудование и аналитические методы определения параметров целевого продукта*

Таблица 1

№	Параметр	Оборудование	Метод определения
1	Объем	Весы – помешиватель «Б.Микс»	Взвешивание
2	Гематокрит	Гематокритная центрифуга CM-70 Skyline	Центрифужный, в капиллярах
3	Гемоглобин в надосад. жидкости	Гемоглобинометр «МиниГем 540»	Гемоглобинцианидный
4	Гемоглобин	Гемоглобинометр «МиниГем 540»	Гемоглобинцианидный
5	Осмолярность	Осмометр Osmomat 030	Мембранный

* - эритроцитная взвесь размороженная, отмытая, содержащаяся в контейнере К1 (в ед./дозе)

Параметры качества целевого продукта в ед./дозе

Таблица 2

№	Параметр	Объем, мл	Гематокрит	Гемоглобин в надосад. жидкости, г	Гемоглобин, г	Осмолярность, мОсм/л**
1	Результат использования устройства и способа	240	0,55	0,1	48	12
2	Регламент по ПП РФ 22.06.2019 № 797, Приложение 1, п. 10	≥ 185	0,37-0,7	≤ 0,2	≥ 36	≤ 20

** - превышение осмолярности над осмолярностью взвешивающего (консервирующего) раствора SAG-M.

Дисперсия значений каждого параметра, представленного в таблице 2, по результатам анализа 12 проб, не превышала +/- 10 %.

Результаты анализов свидетельствуют о соответствии нормативным требованиям и о достижении заявленного технического результата – сохранении качества подготовленных к трансфузии эритроцитов.

Вся многостадийная технология криоконсервирования и подготовки эритроцитов к трансфузии путем глицеролизации, деглицеролизации и отмывания осуществлена в едином закрытом устройстве, не требовала по сравнению с устройствами-аналогами нескольких различных устройств для каждой стадии технологии, наличия асептических условий и «чистых» производственных помещений, сложных автоматических клеточных процессоров, многократного аппаратного спаивания трубок и расходных материалов к ним. Для воспроизведения предложенного способа криоконсервирования эритроцитов достаточно стандартного трансфузиологического оборудования, включенного в табель оснащения организаций Службы крови.

Claims (19)

1. Устройство для криоконсервирования эритроцитов, содержащее контейнер для эритроцитов, соединенный трубками с полимерными иглами для присоединения к контейнерам с растворами, отличающееся тем, что контейнер для криоконсервирования эритроцитов соединен трубкой с зажимом с первым патрубком первого четверника, вторые патрубки первого и второго четверника соединены трубкой с зажимом, их третьи патрубки соединены трубкой с зажимом и обратным клапаном, между которыми установлен бактериальный фильтр, четвертый патрубок первого четверника соединен трубкой линии криопротектора с тройником, к которому присоединены две трубки, каждая из которых оканчивается полимерной иглой и имеет зажим, причем на одной из трубок между зажимом и тройником установлен бактериальный фильтр; четвертый патрубок второго четверника соединен трубкой с зажимом с коннектором Луер-лок, а первый его патрубок соединен трубкой с зажимом с полимерной иглой.

2. Устройство по п.1, отличающееся тем, что зажимы выполнены в виде плоских съемных или несъемных щелевых зажимов или зажимов-защелок.

3. Устройство по п.2, отличающееся тем, что зажимы выполнены разноцветными.

4. Устройство п.1, отличающееся тем, что бактериальные фильтры содержат стерилизующую мембрану с порами размером не более 0,2 мкм.

5. Устройство п.1, отличающееся тем, что полимерные иглы и коннектор Луер-лок закрыты герметизирующими съемными колпачками.

6. Устройство по п.1, отличающееся тем, что контейнер для криоконсервирования эритроцитов имеет номинальную вместимость не менее 1000 мл, прямоугольную, предпочтительно квадратную форму с закругленными углами и выполнен из прозрачного совместимого с эритроцитами материала.

7. Устройство по п.6, отличающееся тем, что боковые швы контейнера для криоконсервирования эритроцитов имеют прямую и обратную шкалу объема заполнения раствором.

8. Устройство по п.6, отличающееся тем, что контейнер для криоконсервирования эритроцитов выполнен из эластичного материала, сохраняющего герметичность при температуре от минус 85 до плюс 40 градусов Цельсия.

9. Устройство по п.1, отличающееся тем, что конструкция устройства рассчитана на присоединение контейнеров для растворов и контейнера для эритроцитов номинальной вместимостью 500 мл, содержащего одну донорскую дозу эритроцитов 300 мл +/- 10%.

10. Способ использования устройства для криоконсервирования эритроцитов по п.1, включающий: соединение контейнера для криоконсервирования эритроцитов с контейнером, содержащим донорские эритроциты, и соединение с контейнером, содержащим раствор криопротектора, перевод в контейнер для криоконсервирования эритроцитов вначале эритроцитов при помешивании, после чего - раствора криопротектора через бактериальный фильтр; центрифугирование, отделение и перевод супернатанта, минуя бактериальный фильтр, в пустой контейнер из-под эритроцитов, запаивание и отделение трубки линии криопротектора устройства по п.1; помещение в полимерный пакет оставшейся части устройства по п.1 и контейнера для криоконсервированных эритроцитов, заполненного концентрированными в криопротекторе эритроцитами; вакуумирование, герметизацию, замораживание и хранение пакета; размораживание криоконсервированных эритроцитов, удаление пакета; присоединение вначале шприца с гипертоническим раствором к коннектору Луер-лок устройства по п.1, добавление гипертонического раствора к размороженным эритроцитам при помешивании, отсоединение шприца и герметизацию коннектора Луер-лок съемным колпачком; после чего присоединение полимерной иглы устройства по п.1 к контейнеру с отмывочным раствором и перевод его через бактериальный фильтр в контейнер с эритроцитами, суспендированными в гипертоническом растворе; центрифугирование, отделение и перевод супернатанта, минуя бактериальный фильтр, в пустой контейнер из-под отмывочного раствора; замену этого контейнера на новый контейнер с отмывочным раствором, повторение не менее трех раз описанного выше порядка отмывания эритроцитов с использованием каждый раз нового контейнера с отмывочным раствором; присоединение к коннектору Луер-лок контейнера с консервирующим раствором, перевод консервирующего раствора через бактериальный фильтр в контейнер с отмытыми эритроцитами при помешивании; отделение от устройства по п.1 и передачу контейнера для криоконсервирования эритроцитов с отмытыми и ресуспендированными эритроцитами для переливания реципиенту.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что соединение контейнера с эритроцитами и контейнеров, содержащих растворы, с устройством по п.1 проводят путем спаивания технологической трубки контейнера с эритроцитами с трубкой устройства по п.1, оканчивающейся полимерной иглой, или путем перфорации полимерными иглами мембран штуцеров присоединяемых контейнеров, закрытых отделяемым защитным элементом.

12. Способ по п.10, отличающийся тем, что в качестве криопротектора используют раствор глицерола концентрацией 57% объемом 600 мл +/- 10%.

13. Способ по п.10, отличающийся тем, что в качестве гипертонического раствора используют 12% раствор натрия хлорида объемом 60 мл +/- 10%.

14. Способ по п.10, отличающийся тем, что в качестве отмывочного раствора используют 0,9% изотонический раствор натрия хлорида в объеме не менее 1,5–2,0 литра, расфасованного в контейнеры с номинальным объемом 500 мл.

15. Способ по п.10, отличающийся тем, что в качестве консервирующего раствора используют раствор SAG-M объемом 350 мл.

16. Способ по п.10, отличающийся тем, что центрифугирование проводят в течение 10 минут при центробежном ускорении 1250g.

17. Способ по п.10, отличающийся тем, что перевод эритроцитов и растворов из контейнеров, их содержащих, в контейнер для криоконсервирования эритроцитов осуществляют под действием силы тяжести, причем контейнеры расположены по высоте на расстоянии не более 100 см друг от друга.

18. Способ по п.10, отличающийся тем, что после центрифугирования супернатант отделяют от концентрированных эритроцитов и переводят в пустой контейнер из-под растворов с помощью плазмоэкстрактора.

19. Способ по п.10, отличающийся тем, что пакет для размещения, вакуумирования, замораживания и хранения части устройства по п.1, содержащего контейнер с концентрированными в растворе криопротектора эритроцитами, выполнен из прозрачного гибкого, воздухонепроницаемого полимерного материала, обеспечивающего герметизацию посредством термосформированного шва и удержание вакуума в пакете при температуре от минус 85 до плюс 40 градусов Цельсия.