RU2817217C1

RU2817217C1 - Антитело к цитомегаловирусу человека и его применение

Info

Publication number: RU2817217C1
Application number: RU2022118040A
Authority: RU
Inventors: Хуасинь ЛЯО; Юэмин ВАН; Чанвэнь У; Вэйхун ЧЖЭН
Original assignee: Чжухай Триномаб Фармасьютикал Ко., Лтд.
Priority date: 2019-12-04
Filing date: 2020-12-04
Publication date: 2024-04-11

Abstract

Группа изобретений относится к иммунологии и к лечению цитомегаловирусной инфекции. Предложены моноклональное антитело, которое является специфическим в отношении цитомегаловируса человека (HCMV), или его антигенсвязывающий фрагмент, а также нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вектор экспрессии, клетка-хозяин и способ получения антитела. Также предложено применение антитела в диагностике, предупреждении и лечении инфицированного индивидуума. Антитело обладает высокой нейтрализующей активностью в отношении различных штаммов вируса HCMV в различных участках ткани у индивидуума. 15 н. и 11 з.п. ф-лы, 4 ил., 8 пр.

Description

Настоящее изобретение относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые являются специфическими к цитомегаловирусу человека и связываются с ним с высокой аффинностью, и к способу их получения. Антитела по настоящему изобретению также характеризуются высокой эффективностью нейтрализации инфекции. Настоящее изобретение также относится к эпитопам, с которыми связываются антитела, и к применению антител в диагностике, предупреждении и лечении инфицированных индивидуумов.

Уровень техники

Цитомегаловирус человека (HCMV) является широко распространенным патогеном с уровнем инфицирования, составляющим 40% - 100% населения, который вызывает серьезные осложнения и даже смерть у людей с нарушенной иммунной функцией, таких как реципиенты трансплантатов органов, реципиенты трансплантатов костного мозга, пациенты с HIV, беременные женщины и эмбрионы, а также вовлечен в развитие злокачественных опухолей и хронических заболеваний. В Соединенных Штатах Америки и Европе частота живорождений с инфицированием HCMV оценивается в 0,2% - 1,2%; уровень инфицирования женщин детородного возраста в Китае достигает 95,3%, а уровень внутриутробной инфекции, вызванной первичной инфекцией у беременных женщин, составляет приблизительно 30,0% - 40,0%. Серопозитивность по HCMV более распространена в развивающихся странах или регионах с низким уровнем дохода.

После первичного инфицирования HCMV может находиться в латентном состоянии, проходить продуктивную вирусную репликацию, что позволяет вирусу распространяться в организме хозяина и уклоняться от иммунной системы хозяина, и полностью устранить HCMV сложно. В целом, у большинства людей, инфицированных HCMV, симптомы не проявляются. У людей с заболеваниями и нарушенной иммунной функцией (например, реципиенты трансплантатов, пациенты с HIV и т.д.) первичная инфекция или реактивация HCMV может привести к поражениям мочевыделительной системы, центральной нервной системы, печени, легкого, системы кровообращения и т.д.; HCMV также оказывает вторичное иммуносупрессивное действие и увеличивает вероятность инфекции, что приводит к заболеваемости и смертности. Кроме того, HCMV является основной причиной в случае инфекций, вызывающих врожденные дефекты, включая дефекты органов, задержку развития, умственную отсталость и потерю зрения и слуха, обусловленных вертикальной передачей через беременных женщин. В настоящее время не существует терапии для предупреждения или лечения инфекции плода. Превимис (MSD) для предупреждения HCMV-инфекции и сопутствующих заболеваний является первым новым лекарственным средством против HCMV-инфекции, одобренным FDA в Соединенных Штатах Америки за последние 15 лет, и применим только для взрослых пациентов. Цитогам и цитотект представляют собой два имеющихся на рынке препарата иммуноглобулина к цитомегаловирусу, но они демонстрируют клинически значимые побочные эффекты и сомнительную терапевтическую эффективность.

Ввиду чрезвычайно важной роли антител в иммунной защите, особенно того факта, что антитела незаменимы для борьбы с инфекцией, несмотря на многочисленные неудачи с моноклональными антителами к цитомегаловирусу человека, были основания выбрать их для дальнейших исследований. В свете современных достижений в технологии антител, более вероятно, что моноклональные антитела с высокой нейтрализующей способностью, полученные из В-клеток человека, являются более эффективными.

Антитела, раскрытые в настоящем изобретении, получены из В-клеток человека, что устраняет недостатки предшествующего уровня техники, и целью настоящего изобретения является получение полностью человеческого моноклонального антитела с сильной специфичностью и высоким нейтрализующим титром, что подходит для медикаментозного лечения, предупреждения и/или диагностики HCMV-инфекции, а также может быть использовано для лечения различных нарушений, ассоциированных с HCMV-инфекцией.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение, таким образом, предусматривает новое антитело, которое связывается с цитомегаловирусом человека, и его антигенсвязывающие фрагменты, а также новые эпитопы, с которыми связывается антитело.

В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает высокоспецифическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые нейтрализуют цитомегаловирусную инфекцию человека при высоких титрах. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению связываются с гликопротеином gB оболочки цитомегаловируса человека.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с доменом слияния гликопротеина gB цитомегаловируса человека.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с эпитопом в домене слияния гликопротеина gB, содержащем один или более аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из N208, L213 и Y226 домена слияния гликопротеина gB. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению связываются с эпитопом в домене слияния гликопротеина gB, содержащем аминокислотные остатки L213 и Y226 домена слияния гликопротеина gB. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению связываются с эпитопом в домене слияния гликопротеина gB, содержащем аминокислотный остаток N208 домена слияния гликопротеина gB.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает высокоспецифическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые нейтрализуют HCMV-инфекцию при высоких титрах. В некоторых вариантах осуществления антитело к цитомегаловирусу человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержат по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три из трех определяющих комплементарность областей (CDR), содержащихся в вариабельной области тяжелой цепи (VH).

В некоторых вариантах осуществления антитело к цитомегаловирусу человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержат по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три из трех определяющих комплементарность областей (CDR), содержащихся в вариабельной области легкой цепи (VL).

В некоторых вариантах осуществления антитело к цитомегаловирусу человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), где VH содержит одну, две или три определяющие комплементарность области (CDR), представленные под SEQ ID NO: 13, 14, 15 или 16.

В некоторых вариантах осуществления антитело к цитомегаловирусу человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержат вариабельную область легкой цепи (VL), где VL содержит одну, две или три определяющие комплементарность области (CDR), представленные под SEQ ID NO: 33, 34, 35 или 36.

В некоторых вариантах осуществления антитело к цитомегаловирусу человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где

(a) VH содержит три определяющие комплементарность области (CDR), представленные под SEQ ID NO: 13, 14, 15 или 16; и/или

(b) VL содержит три определяющие комплементарность области (CDR), представленные под SEQ ID NO: 33, 34, 35 или 36.

В предпочтительном варианте осуществления VH содержит аминокислотную последовательность или состоит из аминокислотной последовательности, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO 13, 14, 15 или 16.

В предпочтительном варианте осуществления VL содержит аминокислотную последовательность или состоит из аминокислотной последовательности, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO 33, 34, 35 или 36.

В предпочтительном варианте осуществления антитело к цитомегаловирусу человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержат

три определяющие комплементарность области тяжелой цепи (HCDR) из вариабельной области тяжелой цепи, представленной под SEQ ID NO: 13, 14, 15 или 16, и три определяющие комплементарность области легкой цепи (LCDR) из вариабельной области легкой цепи, представленной под SEQ ID NO: 33, 34, 35 или 36.

В некоторых вариантах осуществления антитело к цитомегаловирусу человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержат 1, 2, 3, 4, 5 или 6 из иллюстративных комбинаций HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 антител или их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению, показанных в таблице A.

В некоторых вариантах осуществления антитело к цитомегаловирусу человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержат HCDR3, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9, 10, 11 или 12 или состоящую из нее.

В некоторых вариантах осуществления антитело к цитомегаловирусу человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и/или вариабельную область легкой цепи (VL), где

(i) VH содержит определяющие комплементарность области HCDR1, HCDR2 и HCDR3, где HCDR1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1, 2, 3 или 4 или состоит из нее; HCDR2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5, 6, 7 или 8 или состоит из нее; HCDR3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9, 10, 11 или 12 или состоит из нее;

и/или

(ii) где VL содержит определяющие комплементарность области LCDR1, LCDR2 и LCDR3, где LCDR1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21, 22, 23 или 24 или состоит из нее; LCDR2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 25, 26, 27 или 28 или состоит из нее; LCDR3 содержит аминокислотную последовательность или состоит из аминокислотной последовательности, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29, 30, 31 или 32.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает антитело к цитомегаловирусу человека или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где

(a) VH содержит:

(i) HCDR1, HCDR2 и HCDR3, содержащие последовательности под SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 9 или состоящие из них; или

(ii) HCDR1, HCDR2 и HCDR3, содержащие последовательности под SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10 или состоящие из них; или

(iii) HCDR1, HCDR2 и HCDR3, содержащие последовательности под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 11 или состоящие из них; или

(iv) HCDR1, HCDR2 и HCDR3, содержащие последовательности под SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 12 или состоящие из них;

и/или

(b) VL содержит:

(i) LCDR1, LCDR2 и LCDR3, содержащие последовательности под SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 29 или состоящие из них; или

(ii) LCDR1, LCDR2 и LCDR3, содержащие последовательности под SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 30 или состоящие из них; или

(iii) LCDR1, LCDR2 и LCDR3, содержащие последовательности под SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 31 или состоящие из них; или

(iv) LCDR1, LCDR2 и LCDR3, содержащие последовательности под SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 32 или состоящие из них.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает антитело к цитомегаловирусу человека или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где VH содержит определяющие комплементарность области HCDR1, HCDR2 и HCDR3; и VL содержит определяющие комплементарность области LCDR1, LCDR2 и LCDR3, при этом комбинация HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3, содержащихся в антителе или его антигенсвязывающем фрагменте, показана в следующей таблице (таблица A).

В некоторых вариантах осуществления антитело к цитомегаловирусу человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержат вариабельную область тяжелой цепи VH и/или вариабельную область легкой цепи VL, где

(a) вариабельная область тяжелой цепи VH

(i) содержит аминокислотную последовательность или состоит из аминокислотной последовательности, которая на по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13, 14, 15 или 16; или

(ii) содержит аминокислотную последовательность или состоит из аминокислотной последовательности, которая выбрана из SEQ ID NO: 13, 14, 15 или 16; или

(iii) содержит аминокислотную последовательность, содержащую 1 или больше (предпочтительно не более 10, более предпочтительно не более 5, 4, 3, 2, 1) аминокислотных изменений (предпочтительно аминокислотных замен, более предпочтительно консервативных аминокислотных замен) по сравнению с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 13, 14, 15 или 16, при этом предпочтительно аминокислотные изменения не находятся в CDR-областях;

и/или

(b) вариабельная область легкой цепи VL

(i) содержит аминокислотную последовательность или состоит из аминокислотной последовательности, которая на по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 33, 34, 35 или 36; или

(ii) содержит аминокислотную последовательность или состоит из аминокислотной последовательности, которая выбрана из SEQ ID NO: 33, 34, 35 или 36; или

(iii) содержит аминокислотную последовательность, содержащую 1 или больше (предпочтительно не более 10, более предпочтительно не более 5, 4, 3, 2, 1) аминокислотных изменений (предпочтительно аминокислотных замен, более предпочтительно консервативных аминокислотных замен) по сравнению с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 33, 34, 35 или 36, при этом предпочтительно аминокислотные изменения не находятся в CDR-областях.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает антитело к цитомегаловирусу человека или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат комбинацию вариабельной области тяжелой цепи VH и вариабельной области легкой цепи VL, как показано в следующей таблице (таблице B).

В некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению имеют форму IgG, IgM, IgA, IgD или IgE. В некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению содержат константную область тяжелой цепи, выбранную из, например, константных областей тяжелой цепи IgG, IgM, IgA, IgD или IgE; в частности, константную область тяжелой цепи, выбранную из константной области тяжелой цепи IgG, более конкретно из константной области тяжелой цепи IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, например из константной области тяжелой цепи IgG1, IgG2, IgG3 или IgG 4 человека. В одном варианте осуществления константная область тяжелой цепи представляет собой константную область тяжелой цепи IgG1 человека или IgG3 человека. В одном варианте осуществления константная область тяжелой цепи представляет собой константную область тяжелой цепи IgG2 человека или IgG4 человека. В одном варианте осуществления константная область тяжелой цепи представляет собой константную область тяжелой цепи IgG1 человека. В другом варианте осуществления молекула антитела по настоящему изобретению имеет константную область легкой цепи, например, выбранную из константной области легкой цепи κ или λ, предпочтительно из константной области легкой цепи κ (например, κ человека).

В еще одном варианте осуществления молекула антитела по настоящему изобретению содержит константную область тяжелой цепи IgG1 (например, IgG1 человека). В еще одном варианте осуществления молекула антитела по настоящему изобретению содержит константную область тяжелой цепи IgG3 (например, IgG3 человека). В одном варианте осуществления константная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность или состоит из аминокислотной последовательности, которая представлена под SEQ ID NO: 45, или которая характеризуется по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или большей идентичностью с ней.

В еще одном варианте осуществления молекула антитела по настоящему изобретению содержит константную область легкой цепи κ, например константную область легкой цепи κ человека. В одном варианте осуществления константная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность или состоит из аминокислотной последовательности, которая представлена под SEQ ID NO: 18, или которая характеризуется по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или большей идентичностью с ней.

В еще одном варианте осуществления молекула антитела по настоящему изобретению содержит константную область легкой цепи λ, например константную область легкой цепи λ человека. В одном варианте осуществления константная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность или состоит из аминокислотной последовательности, которая представлена под SEQ ID NO: 17, или которая характеризуется по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или большей идентичностью с ней.

В некоторых вариантах осуществления антитело к цитомегаловирусу человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержат тяжелую цепь и/или легкую цепь, где

(a) тяжелая цепь

(i) содержит аминокислотную последовательность или состоит из аминокислотной последовательности, которая на по меньшей мере 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 37, 39, 41 или 43; или

(ii) содержит аминокислотную последовательность или состоит из аминокислотной последовательности, которая выбрана из SEQ ID NO: 37, 39, 41 или 43; или

(iii) содержит аминокислотную последовательность, содержащую 1 или больше (предпочтительно не более 20 или 10, более предпочтительно не более 5, 4, 3, 2, 1) аминокислотных изменений (предпочтительно аминокислотных замен, более предпочтительно консервативных аминокислотных замен) по сравнению с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 37, 39, 41 или 43, при этом предпочтительно аминокислотные изменения не находятся в CDR-областях тяжелой цепи, более предпочтительно аминокислотные изменения не находятся в вариабельной области тяжелой цепи;

и/или

(b) легкая цепь

(i) содержит аминокислотную последовательность или состоит из аминокислотной последовательности, которая на по меньшей мере 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 38, 40, 42 или 44; или

(ii) содержит аминокислотную последовательность или состоит из аминокислотной последовательности, которая выбрана из SEQ ID NO: 38, 40, 42 или 44; или

(iii) содержит аминокислотную последовательность, содержащую 1 или больше (предпочтительно не более 20 или 10, более предпочтительно не более 5, 4, 3, 2, 1) аминокислотных изменений (предпочтительно аминокислотных замен, более предпочтительно консервативных аминокислотных замен) по сравнению с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 38, 40, 42 или 44, при этом предпочтительно аминокислотные изменения не находятся в CDR-областях легкой цепи, более предпочтительно аминокислотные изменения не находятся в вариабельной области легкой цепи.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает антитело к цитомегаловирусу человека или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь и легкую цепь, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат комбинацию тяжелой и легкой цепей, показанную в следующей таблице (таблице C).

В одном варианте осуществления по настоящему изобретению аминокислотные изменения, описанные в данном документе, включают замены, вставки или делеции аминокислот. Предпочтительно аминокислотные изменения, описанные в данном документе, представляют собой аминокислотные замены, предпочтительно консервативные замены.

В предпочтительных вариантах осуществления аминокислотные изменения, описанные в данном документе, находятся в областях вне CDR (например, в FR). Более предпочтительно, аминокислотные изменения, описанные в данном документе, находятся в областях вне вариабельной области тяжелой цепи и/или вне вариабельной области легкой цепи.

В некоторых вариантах осуществления замены являются консервативными заменами. Консервативная замена относится к замене одной аминокислоты на другую в пределах одного класса, например, замена одной кислотной аминокислоты на другую кислотную аминокислоту, замена одной основной аминокислоты на другую основную аминокислоту или замена одной нейтральной аминокислоты на другую нейтральную аминокислоту. Иллюстративные замены показаны в приведенной ниже таблице D.

В определенных вариантах осуществления замена находится в CDR-области антитела. Как правило, полученный вариант будет характеризоваться наличием модификаций (например, улучшений) определенных биологических свойств (например, повышенной аффинностью) по сравнению с исходным антителом и/или будет иметь определенные биологические свойства, которые в значительной степени сохраняются у исходного антитела. Иллюстративным вариантом с замещением является антитело с созревшей аффинностью.

В определенных вариантах осуществления антитела, представленные в данном документе, могут быть дополнительно модифицированы таким образом, чтобы они содержали другие небелковые фрагменты, известные и легко доступные в данной области техники. Подходящие фрагменты для дериватизации антител включают без ограничения водорастворимые полимеры. Неограничивающие примеры водорастворимых полимеров включают без ограничения полиэтиленгликоль (PEG), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксан, поли-1,3,6-триоксан, сополимеры этилена и малеинового ангидрида, полиаминокислоты (гомополимеры или случайные сополимеры) и декстран или поли(n-винилпирролидон-полиэтилен)гликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры полипропиленоксида и этиленоксида, полиоксиэтилированные многоатомные спирты (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси. Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению могут быть химически модифицированы путем ковалентного присоединения к полимеру, например, для увеличения периода полужизни в кровообращении.

В определенных вариантах осуществления антитела, предусмотренные в данном документе, изменяют для увеличения или уменьшения степени гликозилирования антитела. Добавление или делеция сайта гликозилирования антитела могут быть удобно осуществлены путем изменения аминокислотной последовательности для создания или удаления одного или более сайтов гликозилирования. Если антитело содержит Fc-область, углевод, присоединенный к ней, может быть изменен. Модификации, обеспечивающие удаление нежелательных сайтов гликозилирования, могут быть полезны в некоторых применениях, таких как удаление модуля фукозы для усиления функции антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) (см. Shield et.al, (2002) JBC277:26733). В других применениях могут быть выполнены модификации, обеспечивающие галактозилирование, для модификации комплементзависимой цитотоксичности (CDC).

В определенных вариантах осуществления может быть желательным получение сконструированных с цистеином антител, таких как «тиоMAb», в которых один или более остатков антитела заменены на остаток цистеина. Сконструированные с цистеином антитела могут быть созданы, как описано, например, в патенте США №7521541.

В некоторых вариантах осуществления антитела к цитомегаловирусу человека или их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению демонстрируют такую же или подобную аффинность связывания и/или специфичность к HCMV, как и антитело по настоящему изобретению; и/или ингибируют (например, конкурентно ингибируют) и/или связываются с теми же или перекрывающимися эпитопами, что и антитела по настоящему изобретению; и/или конкурируют с антителом по настоящему изобретению за связывание с HCMV; и/или обладают одним или более биологическими свойствами антител по настоящему изобретению.

В некоторых вариантах осуществления антитела или их фрагменты по настоящему изобретению способны эффективно нейтрализовать HCMV. В некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению нейтрализуют HCMV уже при EC50, составляющей 0,15 мкг/мл или меньше. В некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению нейтрализуют HCMV при EC50, составляющей 0,15, 0,14, 0,13, 0,12, 0,11, 0,10, 0,09, 0,08, 0,07, 0,06, 0,05, 0,04, 0,03 и 0,02 мкг/мл или меньше. В некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению нейтрализуют HCMV при очень низкой EC50 в эндотелиальных клетках или фибробластах.

В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению способны непосредственно блокировать инвазию вируса в клетки хозяина.

В некоторых вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению способно эффективно связываться с гликопротеином gB, например связываться с гликопротеином gB с равновесной константой диссоциации (K_D), равной приблизительно 50 нм или меньше, предпочтительно равной приблизительно 40 нм или меньше, более предпочтительно равной приблизительно 30 нм или меньше, еще более предпочтительно равной приблизительно 20 нм или меньше и наиболее предпочтительно равной приблизительно 5 нм, 4 нм, 3 нм, 2 нм, 1,5 нм, 1 нм, 0,9 нм, 0,8 нм или 0,7 нм или меньше. В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания антитела определяют с использованием анализа методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR).

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере часть каркасных последовательностей антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению представляет собой консенсусные каркасные последовательности человека.

В некоторых вариантах осуществления антитело к цитомегаловирусу человека по настоящему изобретению представляет собой антитело в форме IgG, например антитело в форме IgG1, или антитело в форме IgG2, или антитело в форме IgG3, или антитело в форме IgG4.

В некоторых вариантах осуществления антитело к цитомегаловирусу человека представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело к цитомегаловирусу человека является гуманизированным. В некоторых вариантах осуществления антитело к цитомегаловирусу человека представляет собой антитело человека. В одном варианте осуществления антитело к цитомегаловирусу человека по настоящему изобретению также охватывает фрагменты этого антитела, предпочтительно фрагменты антитела, выбранные из группы, состоящей из Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, одноцепочечного антитела (например, scFv) или (Fab')₂, однодоменного антитела, диател (dAb) или линейного антитела.

В определенных вариантах осуществления молекула антитела к цитомегаловирусу человека имеет форму молекулы биспецифического или полиспецифического антитела.

В некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению не вызывают аутоиммунный ответ.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение также охватывает антитела, конъюгированные с меткой («иммуноконъюгаты»).

В некоторых вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению может быть конъюгировано с выявляемой меткой для обеспечения визуализации сайта, содержащего представляющие интерес клетки (например, клетку, инфицированную HCMV). Антитела, меченные с использованием широкого ряда меток, могут быть использованы в широком ряду анализов. Выявление комплекса антитело-антиген, образованного между антителом по настоящему изобретению и представляющим интерес эпитопом (эпитопом HCMV) облегчено присоединением к антителу выявляемого вещества. Подходящие способы выявления включают применение меток, таких как радионуклиды, ферменты, коэнзимы, флуоресцентные вещества, хемилюминесцентные вещества, хромогены, субстраты ферментов или кофакторы, ингибиторы ферментов, комплексы простетических групп, свободные радикалы, частицы, красители и т.п.Меченые антитела могут использоваться в ряду хорошо известных анализов, таких как радиоиммуноанализы, ферментные иммуноанализы (например, ELISA) и флуоресцентные иммуноанализы. Подходящие метки и соответствующие способы описаны, например, в [15] US 3766162, US 3791932, US 3817837 или US 4233402 и т.д.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает нуклеиновые кислоты, кодирующие любые из антител или их фрагментов, описанных в данном документе, или любую их цепь. В одном варианте осуществления предусмотрен вектор, содержащий нуклеиновую кислоту. В одном варианте осуществления вектор представляет собой вектор экспрессии, такой как эукариотический вектор. В одном варианте осуществления предусмотрена клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту или вектор.

Например, нуклеиновая кислота по настоящему изобретению включает:

нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13-16 и 33-44, или нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13-16 и 33-44.

Настоящее изобретение также охватывает нуклеиновые кислоты, которые гибридизируются при жестких условиях с описанными ниже нуклеиновыми кислотами или характеризуются наличием одной или более замен (например, консервативных замен), делеций или вставок по сравнению с таковыми: нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность, выбранную из любой из последовательностей под SEQ ID NO: 13-16 и 33-44; или нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из любой из последовательностей под SEQ ID NO: 13-16 и 33-44.

В одном варианте осуществления предусмотрен один или более векторов, содержащих нуклеиновую кислоту. В одном варианте осуществления вектор представляет собой вектор экспрессии, такой как эукариотический вектор экспрессии. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит промотор EF и/или энхансер CMV. Например, вектор включает без ограничения вирусы, плазмиды, космиды, фаг λ или дрожжевую искусственную хромосому (YAC). В одном варианте осуществления например, предусмотрен вектор pCDNA 3.1. После получения вектора экспрессии или последовательности ДНК для экспрессии вектор экспрессии может быть трансфицирован или введен в подходящую клетку-хозяина. Для этой цели могут использоваться различные методики, например слияние протопластов, осаждение фосфатом кальция, электропорация, ретровирусная трансдукция, вирусная трансфекция, генная пушка, трансфекция на основе липидов или другие общепринятые методики. В случае слияния протопластов клетки инкубируют в культуре и подвергают скринингу в отношении соответствующей активности. Способы и условия культивирования полученных трансфицированных клеток и извлечения полученных молекул антител известны специалистам в данной области техники и могут быть изменены или оптимизированы на основании описания и способов, известных из уровня техники, в зависимости от используемых конкретных векторов экспрессии и клеток-хозяев млекопитающих. В качестве альтернативы, клетки, в хромосомы которых стабильно встроена ДНК, могут быть отобраны путем введения одного или более маркеров, позволяющих отбирать трансфицированные клетки-хозяева. Маркер может, например, обеспечивать прототрофию, устойчивость к биоцидам (например, антибиотикам) или устойчивость к тяжелым металлам (например, меди) и т.д. для ауксотрофного хозяина. Селектируемый маркерный ген может быть связан непосредственно с последовательностью ДНК, подлежащей экспрессии или введению в ту же клетку путем совместной трансформации. Для оптимального синтеза мРНК также могут потребоваться дополнительные элементы. Эти элементы могут включать сигналы сплайсинга, а также транскрипционные промоторы, энхансеры и сигналы терминации.

В одном варианте осуществления предусмотрена клетка-хозяин, содержащая один или более полинуклеотидов по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления представлена клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин предпочтительно представляет собой клетку, обычно используемую для экспрессии генов белков и т.п., особенно подходящую для экспрессии генов антител. Подходящие клетки-хозяева для настоящего изобретения включают прокариотические микроорганизмы, такие как E.coli. Клетка-хозяин также может представлять собой эукариотический микроорганизм, такой как нитчатый гриб или дрожжи, или различные эукариотические клетки, например клетки насекомых, клетки растений и т.д. Клетки позвоночных также могут использоваться в качестве хозяев. Например, можно использовать линии клеток млекопитающих, сконструированные подходящими для роста в суспензии. Примеры применимых линий клеток-хозяев млекопитающих включают трансформированную SV40 линию CV1 почки обезьяны (COS-7); линию почки эмбриона человека (клетки HEK293 или 293F), клетки 293, клетки почки новорожденного хомяка (BHK), клетки почки обезьяны (CV1), клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76), клетки рака шейки матки человека (HELA), клетки почки собаки (MDCK), клетки печени крыса линии Buffalo (BRL 3A), клетки легкого человека (W138), клетки печени человека (Hep G2), клетки яичника китайского хомячка (клетки CHO), клетки CHOK1SV, клетки CHOK1SV GS-KO, клетки CHOS, клетки NSO, линии клеток миеломы, такие как YO, NSO, P3X63 и Sp2/0 и т.д. Обзор линий клеток-хозяев млекопитающих, пригодных для получения белков, см., например, в Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (под ред. B. K. C. Lo, Humana Press, Тотова, Нью-Джерси), стр.255-268 (2003). В предпочтительном варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку CHO, такую как клетка CHOS, клетка CHOK1SV или CHOK1SV GS-KO, или клетка-хозяин представляет собой клетку 293, такую как клетка HEK293.

В одном варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку. В другом варианте осуществления клетка-хозяин выбрана из клетки дрожжей, клетки млекопитающего (например, клетки CHO или клетки 293, такой как клетка HEK293), или других клеток, подходящих для получения соответствующего антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. В одном варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой прокариотическую клетку.

В некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева представляют собой, например, клети E.coli, клетки актиномицетов, клетки дрожжей, клетки насекомых (SF9 и т.д.), клетки млекопитающего (293, HEK293, COS-1, CHO, клетки миеломы и т.д.).

Обычно линию рекомбинантных клеток животного, такую как линия клеток CHO, которая стабильно продуцирует антитело на высоком уровне, используют для промышленного получения рекомбинантных антител. Получение, клонирование и амплификация гена для обеспечения высокого уровня экспрессии и скрининга таких линий рекомбинантных клеток могут быть выполнены известными способами (например, см. Omasa T: J. Biosci. Bioeng. 94, 600-605, 2002 и т.д.).

В одном варианте осуществления предусмотрен способ получения молекулы антитела по настоящему изобретению, где способ включает культивирование клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело (например, любую из полипептидных цепей и/или множество полипептидных цепей), или вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту при условиях, подходящих для экспрессии антитела, и необязательно извлечение антитела из клетки-хозяина (или культуральной среды клетки-хозяина, или надосадочной жидкости). Для рекомбинантного получения молекулы антитела по настоящему изобретению нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело (например, антитело, описанное выше, например, любую из полипептидных цепей и/или множество полипептидных цепей), выделяют и вставляют в один или более векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Такие нуклеиновые кислоты легко выделяют и секвенируют с использованием общепринятых протоколов (например, с помощью олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи антител).

В предпочтительном варианте осуществления по настоящему изобретению антитело по настоящему изобретению представляет собой полностью гуманизированное антитело. Рекомбинантное антитело человека может быть получено с использованием известного способа (ссылка на Nature, 312: 643, 1984, Nature, 321: 522, 1986 и т.д.). Например, антитело по настоящему изобретению может быть получено путем культивирования клетки-хозяина, в которую введен вектор по настоящему изобретению, и очистки полученного антитела от культуральной надосадочной жидкости и т.д. Более конкретно, антитело может быть получено следующим способом: вектор экспрессии антитела человека конструируют путем вставки кДНК, кодирующей VH и VL, в вектор экспрессии для клеток животных, содержащий гены, кодирующие CH антитела человека и/или CL антитела человека, которые продуцируются одной и той же клеткой или разными клетками человека, соответственно, и вводят в клетки животных для экспрессии. В некоторых вариантах осуществления векторы экспрессии, рекомбинированные с нуклеиновыми кислотами, кодирующими VH или VL, обычно получают отдельно и используют для совместной трансфекции клеток-хозяев, но также они могут быть введены путем рекомбинации в один и тот же вектор экспрессии.

В некоторых вариантах осуществления поликлональное антитело или моноклональное антитело может быть получено от экспериментальных животных, таких как мыши, кролики, козы и т.д.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело к цитомегаловирусу человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, которые можно получить из клеток, продуцирующих антитела, полученных из крови человека, представляют собой полностью человеческие антитела. Полностью гуманизированное антитело не является иммуногенным и не демонстрирует иммунного ответа даже при введении в организм человека в качестве лекарственного средства на основе антитела. Например, моноклональные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению могут быть получены следующими способами: клон клетки, продуцирующий антитело, выделяют из крови здорового человека с помощью различных стадий, антитело получают из культуральной надосадочной жидкости клона клетки и полученное антитело подвергают аффинной очистке (см., например, WO2010/114106).

Молекулы антител, полученные, как описано в данном документе, могут быть очищены с помощью известных в уровне техники методик, таких как высокоэффективная жидкостная хроматография, ионообменная хроматография, гель-электрофорез, аффинная хроматография, эксклюзионная хроматография и т.д. Фактические условия, используемые для очистки конкретного белка, также будут зависеть от таких факторов, как суммарный заряд, гидрофобность и гидрофильность, и будут очевидными для специалистов в данной области техники. Чистота молекул антител по настоящему изобретению может быть определена любым из ряда хорошо известных аналитических способов, включая эксклюзионную хроматографию, гель-электрофорез, высокоэффективную жидкостную хроматографию и т.д.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение также предусматривает способы идентификации, скрининга или характеристики физических/химических свойств и/или биологической активности молекул антител по настоящему изобретению.

В одном аспекте антигенсвязывающую активность антител по настоящему изобретению тестируют, например, известными способами, такими как ELISA, вестерн-блоттинг и т.д. Связывание с HCMV может быть определено с использованием способов, известных из уровня техники, а иллюстративные способы раскрыты в данном документе. В некоторых вариантах осуществления используют анализы методом поверхностного плазмонного резонанса (например, измерения аффинности) или ELISA-анализы.

Следует учитывать, что любой из приведенных выше анализов может быть выполнен с использованием иммуноконъюгатов по настоящему изобретению вместо антител к цитомегаловирусу человека или в дополнение к ним.

Следует учитывать, что любой из приведенных выше анализов может быть выполнен с использованием комбинации антител к цитомегаловирусу человека и других активных средств.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую антитела по настоящему изобретению.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает композицию, предпочтительно фармацевтическую композицию, содержащую любые из молекул антител, описанных в данном документе, или их фрагментов (предпочтительно их антигенсвязывающих фрагментов), или иммуноконъюгатов на их основе. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит фармацевтические адъюванты.

Настоящее изобретение также предусматривает композицию (в том числе фармацевтическую композиции или фармацевтический состав), содержащую антитело или его иммуноконъюгат по настоящему изобретению, и/или композицию (в том числе фармацевтическую композицию или фармацевтический состав), содержащую полинуклеотид, кодирующий антитело по настоящему изобретению. В определенных вариантах осуществления композиция содержит одно или более антител или их фрагментов по настоящему изобретению или один или более полинуклеотидов, кодирующих одно или более антител или их фрагментов по настоящему изобретению.

Такие композиции также могут содержать подходящие фармацевтически приемлемые адъюванты, такие как фармацевтически приемлемые носители, фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, включая буферы или разбавители, известные из уровня техники.

Как используется в настоящем документе, «фармацевтически приемлемый носитель» включает любые возможные физиологически совместимые растворители, дисперсионные среды, изотонические и задерживающие абсорбцию средства и т.д. Фармацевтические носители, подходящие для настоящего изобретения, могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масла, в том числе полученные из нефти, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.д. Вода является предпочтительным носителем при внутривенном введении фармацевтической композиции. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также могут использоваться в качестве жидких носителей, особенно для инъекционных растворов.

Подходящие вспомогательные вещества включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и т.п.В отношении использования вспомогательных веществ и их вариантов применения см. также «Handbook of Pharmaceutical Excipients» (пятое издание, R. C. Rowe, P. J. Seskey and S. C. Owen, pharmaceutical Press, Лондон, Чикаго).

Композиции, при необходимости, могут также содержать незначительные количества увлажнителей, или эмульгаторов, или рН-буферов.

Композиции по настоящему изобретению могут быть в различных формах. Такие формы включают, например, жидкие, полутвердые и твердые лекарственные формы, такие как жидкие растворы (например, инъекционные и инфузионные растворы), дисперсии или суспензии, липосомы и суппозитории. Предпочтительная форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения. Обычно предпочтительные композиции находятся в форме инъекционных или инфузионных растворов. Предпочтительными способами введения являются парентеральная (например, внутривенная, подкожная, внутрибрюшинная (i. p.), внутримышечная) инъекция. В предпочтительном варианте осуществления молекулу антитела вводят путем внутривенной инфузии или инъекции. В предпочтительном варианте осуществления молекулу антитела вводят путем внутримышечной, внутрибрюшинной или подкожной инъекции.

Антитела по настоящему изобретению, связывающиеся с цитомегаловирусом человека, могут быть лиофилизированы для хранения и восстановлены в подходящей среде-носителе перед применением. Показали, что эта методика, эффективна для общепринятого получения белка, и могут быть использованы хорошо известные методики лиофилизации и восстановления.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение также предусматривает наборы, содержащие антитело, фармацевтическую композицию или иммуноконъюгат по настоящему изобретению и необязательно листок-вкладыш в упаковке с руководством по введению.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение также обеспечивает фармацевтический продукт, содержащий антитело, фармацевтическую композицию, иммуноконъюгат по настоящему изобретению, необязательно дополнительно содержащий листок-вкладыш в упаковке с руководством по введению.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение также предусматривает способы предупреждения или лечения цитомегаловирусной инфекции человека или заболевания, связанного с цитомегаловирусом человека (связанного с HCMV заболевания), включающие введение эффективного количество антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, или его иммуноконъюгата, или фармацевтической композиции по настоящему изобретению.

«Ассоциированное с HCMV заболевание» относится к любому заболеванию, ассоциированному с HCMV-инфекцией, включая заболевания, при которых, как было показано или как можно считать, HCMV является патофизиологической причиной заболевания, или одной из причин, усугубляющих заболевание. Например, заболевания, обусловленные HCMV, также охватываются объемом понятия «связанные с HCMV заболевания». В некоторых вариантах осуществления ассоциированные с HCMV заболевания включают без ограничения различные заболевания, такие как (a) интерстициальная пневмония, ретинит, гастроэнтерит, энцефалит и т.д., возникающие в результате реактивации HCMV при иммунодефицитных состояниях, таких как AIDS, рак, после трансплантации органов, трансплантации костного мозга, гемодиализа и т.д.; (b) врожденная HCMV-инфекция, обусловленная распространением HCMV-инфекции от беременной женщины к плоду; (с) аборт, мертворождение и неонатальная смерть, обусловленные вышеупомянутой врожденной HCMV-инфекцией; (d) низкий вес при рождении, гепатоспленомегалия, желтуха, тромбоцитопеническая пурпура, микроцефалия, нарушение умственного развития, умственная отсталость, хориоретинит или нарушение слуха вследствие вышеупомянутой врожденной HCMV-инфекции без смертельного исхода; (e) профилактическое или терапевтическое средство для лечения дисфункции печени, интерстициальной пневмонии или мононуклеоза, обусловленных HCMV-инфекцией у новорожденного или младенца. Иллюстративные заболевания также описаны в работе Taya Keiko, Discussion of Infection: Cytomegalovirus infection, Infectious Diseases Weekly Report Japan.2003; Week 15, p10-14; Griffiths, P.D., The treatment of Cytomegalovirus infection. J. Anti. Chemo., 2002: 49: p243-253; Demmler, G.J., Congential cytomegalovirus infection and disease. Seminars in Pediatric Infection Diseases. Seminors in Pediatric Infectious Diseases, 1999; 10: p195-200.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу повышения, усиления или стимуляции устойчивости у субъекта-человека, инфицированного цитомегаловирусом человека, включающему введение эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или иммуноконъюгата на его основе или фармацевтической композиции по настоящему изобретению.

В некоторых вариантах осуществления индивидуумами, подходящими для способов по настоящему изобретению, являются индивидуумы, инфицированные HCMV.

В некоторых вариантах осуществления индивидуумами, подходящими для способов по настоящему изобретению, являются пациенты, перенесшие трансплантацию, беременные женщины, новорожденные, пациенты, инфицированные HIV, пациенты с раком или пациенты с аутоиммунными заболеваниями.

Следует учитывать, что любой из приведенных выше способов лечения может быть выполнен с использованием иммуноконъюгатов, или композиций, или наборов по настоящему изобретению вместо или в дополнение к антителам по настоящему изобретению.

Способ введения антител по настоящему изобретению (а также фармацевтических композиций или иммуноконъюгатов, содержащих их) может представлять собой любой подходящий путь, такой как парентеральное введение, например внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное или подкожное, чресслизистое (буккальное, интраназальное, интравагинальное, ректальное) или другие способы, как будет понятно специалистам в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления антитела к цитомегаловирусу человека по настоящему изобретению могут быть введены пациенту любым подходящим путем, например парентерально посредством внутривенной (i. v.) инфузии или болюсной инъекции, внутримышечно, или подкожно, или внутрибрюшинно.

Данный документ охватывает различные схемы введения дозы, включающие без ограничения однократное введение дозы или многократное введение дозы в несколько моментов времени, болюсное введение дозы и импульсную инфузию.

Для предупреждения или лечения заболевания подходящая дозировка антитела по настоящему изобретению будет зависеть от типа заболевания, подлежащего лечению, типа антитела, тяжести и течения заболевания, вводится ли антитело в профилактических или терапевтических целях, предшествующей терапии, истории болезни пациента и ответа на антитело, а также от решения лечащего врача. Антитело может быть введено пациенту за одну лечебную процедуру или за ряд лечебных процедур. Как правило, врач вводит композицию до тех пор, пока не будет достигнута доза, обеспечивающая необходимый эффект.Таким образом, антитела по настоящему изобретению могут быть введены в одной дозе или в двух или более дозах (которые могут содержать одинаковые или разные количества необходимой молекулы) в течение периода времени или путем непрерывной инфузии через имплантированное устройство или катетер. Подходящие дозы могут быть определены с использованием соответствующих данных об ответе на дозу. В определенных вариантах осуществления антитела можно вводить пациенту в течение длительного периода времени.

В определенных вариантах осуществления антитела к цитомегаловирусу человека или их антигенсвязывающие фрагменты, предусмотренные в данном документе, могут использоваться для выявления присутствия HCMV в биологическом образце или для диагностики HCMV-инфекции. Используемый в данном документе термин «выявление» включает количественное или качественное выявление, иллюстративные способы выявления могут предусматривать иммуногистохимию, иммуноцитохимию, проточную цитометрию (например, FACS), магнитные гранулы, связанные с антителами, ELISA-анализы, PCR-технологию (например, RT-PCR). В определенных вариантах осуществления биологический образец представляет собой образец крови, сыворотки крови или другой жидкости биологического происхождения. В определенных вариантах осуществления биологический образец может представлять собой образец ткани, взятый, например, из слюнной железы, легкого, печени, поджелудочной железы, почки, уха, глаза, плаценты, пищеварительного тракта, сердца, яичника, гипофиза, надпочечника, щитовидной железы, головного мозга или кожи.

Способы диагностики могут включать приведение антитела или фрагмента антитела в контакт с образцом. Способы диагностики могут также включать выявление комплексов антиген/антитело.

В некоторых вариантах осуществления способ включает приведение биологического образца в контакт с антителом к цитомегаловирусу человека или его антигенсвязывающим фрагментом, как описано в данном документе, в условиях, при которых обеспечивается связывание антитела к цитомегаловирусу человека с HCMV, и выявление того, образуется ли комплекс между антителом к цитомегаловирусу человека и HCMV. Образование комплекса указывает на присутствие HCMV. Способ может представлять собой способ in vitro или in vivo. В одном варианте осуществления антитела к цитомегаловирусу человека используют для отбора субъектов, подходящих для лечения антителами к цитомегаловирусу человека, например, где HCMV является биомаркером, используемым для отбора субъекта.

В одном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению может использоваться для диагностики описанных в данном документе заболеваний, например для оценки (например, мониторинга) лечения или прогрессирования, диагностики и/или определения стадии заболеваний, описанных в данном документе, у индивидуума. В определенных вариантах осуществления предусмотрено антитело к цитомегаловирусу человека, конъюгированное с меткой.

В некоторых вариантах осуществления любого из изобретений, предусмотренных в данном документе, образец получают до лечения антителом к цитомегаловирусу человека. В некоторых вариантах осуществления образец получают до лечения фармацевтической композицией, описанной в данном документе. В некоторых вариантах осуществления образец фиксируют в формалине или заливают парафином (FFPE). В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой биоптат (например, трепан-биоптат), операционный материал (например, образец, полученный в результате хирургической резекции) или тонкоигольный аспират.

В некоторых вариантах осуществления HCMV является выявленным до лечения, например до начала лечения или до определенного лечения после интервала лечения.

В некоторых вариантах осуществления предусмотрены наборы для выявления, содержащие антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, для диагностики заболеваний, описанных в данном документе, например связанного с HCMV заболевания или HCMV-инфекции.

В некоторых вариантах осуществления предусмотрен способ лечения заболеваний, описанных в данном документе, включающий проведение теста на присутствие HCMV у субъекта (например, в образце) (например, образце субъекта) с определением тем самым значения HCMV, сравнение значения HCMV с контрольным значением и введение терапевтически эффективного количества антитела к цитомегаловирусу человека (например, антитела к цитомегаловирусу человека, описанного в данном документе) или его антигенсвязывающего фрагмента субъекту, если значение HCMV больше контрольного значения, с обеспечением таким образом лечения заболеваний, описанных в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению могут быть использованы для пассивной иммунизации.

В некоторых вариантах осуществления антитела или их фрагменты по настоящему изобретению также могут использоваться в наборах для мониторинга при получении вакцин с необходимой иммуногенностью.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к способу нейтрализации цитомегаловируса человека у индивидуума или в образце, включающему приведение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению в контакт с индивидуумом или образцом и тестирование способности антитела или его антигенсвязывающего фрагмента связываться с обеспечением нейтрализации цитомегаловируса человека.

Поэтому настоящее изобретение также относится к применению антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению для описанного выше способа, а также к применению антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению для получения лекарственного препарата, или композиции, или набора для описанного выше способа и/или к применению антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению в получении набора для диагностики заболевания, описанного в данном документе.

Способы и варианты применения, применимые к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам по настоящему изобретению в равной степени применимы к иммуноконъюгатам, композициям или наборам, содержащим антитела или их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению.

Далее настоящее изобретение описано более подробно со ссылкой на прилагаемые графические материалы. Однако эти графические материалы и конкретные варианты осуществления настоящего изобретения не следует рассматривать как ограничивающие объем настоящего изобретения, и модификации, легко осуществимые специалистами в данной области техники, будут включены в сущность настоящего изобретения и объем прилагаемой формулы изобретения.

Краткое описание графических материалов

На фиг.1 показаны результаты нейтрализации стандартных штаммов HCMV Towne и TB40E в клетках HFF с помощью TRN1017, TRN1018, TRN1019 и TRN1020.

На фиг.1А показаны результаты нейтрализации стандартного штамма HCMV Towne в клетках HFF с помощью четырех антител TRN1017, TRN1018, TRN1019 и TRN1020. На фиг.1 В показаны результаты нейтрализации штамма HCMV TB40E в инфицированных клетках HFF с помощью четырех антител TRN1017, TRN1018, TRN10l9 и TRN1020.

На фиг.2 показана аффинность связывания антител TRN1017, TRN1018, TRN1019 и TRN1020 соответственно с антигеном, представляющим собой гликопротеин gB.

На фиг.3 показаны эффекты одноточечных мутаций в 12 сайтах гликозилирования (N208, N281, N284, N302, N341, N383, N405, N409, N417, N447, N452 и N456) гликопротеина gB в отношении активности связывания антител по настоящему изобретению.

На фиг.4 показана линейная структура внеклеточного сегмента гликопротеина gB и его домена слияния (включая три положения мутации).

Определения

Следует учитывать, что термины, используемые в данном документе, предназначены исключительно для описания конкретных вариантов осуществления и не подразумевают ограничения объема настоящего изобретения, который будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения. Если не указано иное, все используемые в данном документе технические и научные термины имеют те же значения, что обычно понимаются специалистом в области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение.

Для целей интерпретации данного описания будут использоваться следующие определения, и, где это уместно, термины, используемые в единственном числе, могут также предусматривать множественное число и наоборот.Следует учитывать, что термины, используемые в данном документе, предназначены исключительно для описания конкретных вариантов осуществления и не подразумеваются как ограничивающие.

Термин «приблизительно» при использовании в сочетании с числовым значением предназначен для охвата числовых значений в диапазоне, имеющем нижний предел, который на 5% меньше, чем указанное числовое значение, и верхний предел, который на 5% больше, чем указанное числовое значение.

Используемый в данном документе термин «и/или» означает любой из альтернативных вариантов или два или больше из альтернативных вариантов.

Используемые в данном документе термины «содержащий» или «включающий» означают включение указанных элементов, целых чисел или стадий, но не исключение любых других элементов, целых чисел или стадий. Используемые в данном документе термины «содержащий» или «включающий» при использовании в данном документе, если не указано иное, охватывают указанные элементы, целые числа или стадии. Например, ссылка на вариабельную область антитела, «содержащую» определенную последовательность, также подразумевает охват вариабельных областей антитела, состоящих из этой конкретной последовательности.

«Цитомегаловирус человека» (HCMV) представляет собой вирус с двуспиральной ДНК рода Cytomegalovirus подсемейства Herpesviruses, также известный как герпесвирус человека типа 5 (HHV-5). Все используемые в данном документе термины «цитомегаловирус человека», «HCMV», «герпесвирус человека типа 5», «HHV-5» являются родовыми названиями.

«Гликопротеин gB цитомегаловируса человека (HCMV)» (или «гликопротеин gB HCMV» или «гликопротеин gB HCMB») является одним из основных гликопротеинов, составляющих внешнюю оболочку HCMV, который, как известно, принимает участие в инвазии вирусных частиц в клетки, слиянии клеток и межклеточном распространении вирусной инфекции. Аминокислотную последовательность гликопротеина gB HCMV можно получить из общедоступной базы данных последовательностей NCBI GENE.

«Домен слияния гликопротеина gB цитомегаловируса человека (HCMV)» или «домен слияния гликопротеина gB HCMV» относится к области, состоящей из смежных аминокислотных остатков в положениях 150-250, в аминокислотной последовательности гликопротеина gB HCMV (Heidi G. Burke et al. Crystal Structure of the Human Cytomegalovirus Glycoprotein B. 2015).

«Определяющая комплементарность область», или «область CDR», или «CDR» представляет собой область вариабельного домена антитела, которая является высоковариабельной по последовательности и образует структурно определенную петлю («гипервариабельную петлю») и/или включает контактирующий с антигеном остаток («контактирующую с антигеном точку»). CDR в основном отвечают за связывание с антигенными эпитопами. CDR тяжелой и легкой цепей обычно называют CDR1, CDR2 и CDR3, нумеруя их последовательно от N-конца. CDR, расположенные в вариабельном домене тяжелой цепи антитела, обозначаются как HCDR1, HCDR2 и HCDR3, а CDR, расположенные в вариабельном домене легкой цепи антитела, обозначаются как LCDR1, LCDR2 и LCDR3. В пределах данной аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи или вариабельной области тяжелой цепи точная граница аминокислотной последовательности для каждой CDR может быть определена с использованием любой из ряда хорошо известных систем присвоения для CDR антител или комбинации таковых, включая, например, систему по Chothia, основанную на трехмерной структуре антител и топологии петель CDR (Chothia et al. (1989) Nature 342: 877-883, Al-Lazikani et al. "Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 273, 927-948 (1997)), систему по Kabat, основанную на изменчивости последовательности антител (Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4-е изд. U.S. Department of Hea1th and Human Services, National Institutes of Health (1987)), систему AbM (University of Bath), «контактную» систему (University College London), систему базы данных International ImMunoGeneTics (IMGT) (на сайте imgt.cines.fr/ в Интернете) и систему определения CDR по North на основании кластеризации аффинного распространения с использованием большого количества кристаллических структур.

Например, согласно различным схемам определения CDR остатки каждой CDR определяют следующим образом.

CDR также могут быть определены на основании тех же положений нумерации по Kabat, что и эталонные последовательности CDR (любые из иллюстративных CDR в настоящем изобретении).

Если не указано иное, в настоящем изобретении термин «CDR» или «последовательность CDR» охватывает последовательности CDR, определенные любым из описанных выше путей.

Если не указано иное, в настоящем изобретении ссылка на положения остатков в вариабельной области антитела, включая остатки вариабельной области тяжелой цепи и остатки вариабельной области легкой цепи, относится к нумерации положений в соответствии с системой нумерации по Kabat (Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд. Public Health Service, National Institutes of Health, Бетесда, Мэриленд (1991)).

В одном варианте осуществления границу CDR антитела по настоящему изобретению определяют по правилам IMGT, например с использованием базы данных IMGT.

Следует отметить, что границы CDR вариабельных областей одного и того же антитела, полученные на основе различных систем присвоения, могут отличаться. То есть, последовательности CDR вариабельных областей одного и того же антитела, определенные по различным системам присвоения, являются различными. Таким образом, при определении антитела с конкретной последовательностью CDR, определенной в данном документе, объем антитела также охватывает антитела, последовательности вариабельных областей которых включают конкретную последовательность CDR, но заявленные границы CDR которых отличаются от конкретных границ CDR, определенных в данном документе, вследствие применения различных схем (например, различных правил или комбинаций систем присвоения).

Используемый в данном документе термин «нейтрализация» относится к способности нейтрализации свойства патогена инициировать и/или поддерживать инфекцию у хозяина.

Используемый в данном документе термин «эпитоп» относится к части антигена (например, гликопротеина gB HCMV), которая специфически взаимодействует с молекулой антитела. Эпитопы в белковом антигене могут быть образованы из смежных аминокислот (обычно линейные эпитопы) или дискретных аминокислот (обычно конформационные эпитопы), соединенных в результате сворачивания третичной структуры белка. Эпитопы, образованные из смежных аминокислот, обычно (но не всегда) остаются подверженными воздействию денатурирующих растворителей, в то время как эпитопы, образованные в результате сворачивания третичной структуры, как правило, недоступны воздействию при обработке денатурирующими растворителями.

«Антитело, которое связывается с тем же или перекрывающимся эпитопом», что и эталонное антитело, относится к антителу, которое блокирует связывание эталонного антитела с его антигеном в конкурентном анализе на 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% или больше, и наоборот, эталонное антитело блокирует связывание антитела с его антигеном в конкурентном анализе на 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% или больше.

Антитело, конкурирующее с эталонным антителом за связывание с его антигеном, относится к антителу, которое блокирует связывание эталонного антитела с его антигеном в конкурентном анализе на 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% или больше. Наоборот, эталонное антитело блокирует 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, или 95%, или больше связывания антитела с его антигеном в конкурентном анализе. Для определения того, конкурирует ли одно антитело с другим, могут использоваться многочисленные типы конкурентных анализов, такие как ELISA, SPR, твердофазный прямой или непрямой радиоиммуноанализ (RIA), твердофазный прямой или непрямой иммуноферментный анализ (EIA) (см., например, Stahli et al. 1983, Methods in Enzymology 9:242-253)).

Антитело, которое ингибирует (например, конкурентно ингибирует) связывание эталонного антитела с его антигеном, относится к антителу, которое ингибирует связывание эталонного антитела с его антигеном на 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% или больше. Наоборот, эталонное антитело ингибирует связывание антитела с его антигеном на 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% или больше. Связывание антитела с его антигеном может быть измерено с помощью аффинности (например, константы равновесной диссоциации). Способы определения аффинности известны из уровня техники.

Антитело, проявляющее такую же или подобную аффинность связывания и/или специфичность, как и эталонное антитело, относится к антителу, которое может характеризоваться аффинностью и/или специфичностью связывания, составляющими по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% или больше таковой эталонного антитела. Это может быть определено любым известным из уровня техники способом определения аффинности и/или специфичности связывания.

«Антитело в форме IgG» относится к форме IgG, к которой принадлежит константная область тяжелой цепи антитела. Константные области тяжелой цепи одинаковы для всех антител одного типа и различаются у антител разных типов. Например, антитело в форме IgG1 относится к структуре IgG3, в которой домен константной области тяжелой цепи Ig представляет собой IgG1.

«Человеческое» антитело (HuMAb) относится к антителу, содержащему вариабельную область, в которой и каркасная область, и CDR-области получены из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Кроме того, если антитело содержит константные области, то константные области также получены из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека.

«Гуманизированное» антитело относится к антителу, в котором некоторые, большинство или все из аминокислот вне домена CDR антитела, отличного от человеческого (например, мышиного антитела), были заменены на соответствующие аминокислоты человеческого иммуноглобулина. В одном варианте осуществления гуманизированной формы антитела некоторые, большинство или все аминокислоты вне домена CDR были заменены аминокислотами иммуноглобулина человека, а некоторые, большинство или все из аминокислот внутри одной или более областей CDR не были изменены. Небольшие добавления, делеции, вставки, замены или модификации аминокислот допустимы при условии, что они не приводят к утрате способности антитела связывать конкретный антиген. «Гуманизированное» антитело сохраняет такую же антигенную специфичность, как и исходное антитело.

Используемое в данном документе «химерное антитело» относится к антителу, в котором вариабельная область получена от одного вида, а константная область получена от другого вида, например, антитело, в котором вариабельная область получена из антитела мыши, а константная область получена из антитела человека.

Используемый в данном документе «фрагмент антитела» относится к молекуле, отличающейся от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела и связывается с антигеном, с которым связывается интактное антитело. Используемый в данном документе термин «антигенсвязывающий фрагмент» относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, гликопротеином gB HCMV человека). Примеры фрагментов антител включают без ограничения Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, диатела, линейные антитела, одноцепочечные антитела (например, scFv), однодоменные антитела, двухвалентные антитела, или биспецифические антитела, или их фрагменты, антитела верблюдовых и биспецифические или полиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

Используемый в данном документе «полиспецифический» относится к антителу, которое специфически связывается с по меньшей мере двумя разными антигенами или двумя разными эпитопами в антигене, например с тремя, четырьмя или пятью разными антигенами или эпитопами.

Используемый в данном документе термин «биспецифическое» относится к антителу, которое специфически связывается с двумя разными антигенами или двумя разными эпитопами в одном антигене. Биспецифические антитела могут быть перекрестно реактивными в отношении других родственных антигенов или могут связываться с эпитопами, общими для двух или более разных антигенов.

«Иммуноконъюгат» представляет собой антитело, конъюгированное с одним или более другими веществами, включая без ограничения метки.

Используемый в данном документе термин «метка» относится к соединению или композиции, которая непосредственно или опосредовано конъюгирована или слита со средством, таким как полинуклеотидный зонд или антитело, и обеспечивает выявление средства, с которым она конъюгирована или слита. Метка может быть выявляемой сама по себе (например, радиоизотопная метка или флуоресцентная метка) или, в случае ферментативной метки, может катализировать химическое изменение в выявляемом соединении или композиции, представляющих собой субстрат.Данный термин подразумевает прямое мечение зонда или антитела путем присоединения (т.е. физического связывания) выявляемого вещества к зонду или антителу, а также непрямое мечение зонда или антитела путем реакции с другим реагентом, который подвергается прямому мечению. Примеры непрямого мечения включают выявление первичного антитела с использованием флуоресцентно меченного вторичного антитела и концевого мечения ДНК-зонда биотином, чтобы его можно было выявить с помощью флуоресцентно меченного стрептавидина.

«Вектор» относится к полинуклеотиду, который способен реплицироваться в биологической системе или перемещаться между такими системами. Полинуклеотиды векторов обычно содержат такие элементы, как начало репликации, сигнал полиаденилирования или селектируемый маркер, функция которых заключается в обеспечении репликации или поддержании полинуклеотида в биологической системе. Примеры таких биологических систем могут включать клетки, вирусы, животных, растения и биологические системы, восстановленные с помощью биологических компонентов, способных обеспечивать репликацию векторов. Полинуклеотид, содержащий вектор, может представлять собой молекулу ДНК или РНК или гибридную молекулу этих молекул. «Вектор экспрессии» относится к вектору, который может быть использован в биологической системе или восстановленной биологической системе для непосредственной трансляции полипептида, кодируемого полинуклеотидной последовательностью, присутствующей в векторе экспрессии.

«Выделенное» антитело представляет собой антитело, которое было отделено от компонентов его естественной среды. В некоторых вариантах осуществления антитело очищено до степени чистоты более 95% или 99%, как определено, например, с помощью электрофореза (например, SDS-PAGE, IEF, капиллярного электрофореза) или хроматографии (например, ионообменной или обращенно-фазовой HPLC). Обзор способов оценки чистоты антител см., например, в Flatman et al. J. Chromatogr. B848: 79-87 (2007)).

«Выделенная» нуклеиновая кислота относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая была отделена от компонентов ее естественной среды. Выделенная нуклеиновая кислота предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетке, которая обычно содержит молекулу нуклеиновой кислоты, но которая находится вне хромосомы или в хромосомном положении, отличном от ее естественного хромосомного положения.

Расчет идентичности последовательностей проводился следующим образом.

Для определения процентной идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновых кислот последовательности выравнивают для обеспечения оптимального сравнения (например, в одну или обе из первой и второй аминокислотных последовательностей или последовательностей нуклеиновых кислот могут быть введены гэпы для обеспечения оптимального выравнивания, или негомологичные последовательности могут быть отброшены для целей сравнения). В предпочтительном варианте осуществления для целей сравнения длина выравниваемой эталонной последовательности составляет по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 50%, 60% и еще более предпочтительно по меньшей мере 70%, 80%, 90%, 100% длины эталонной последовательности. Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих аминокислотных положениях или нуклеотидных положениях. Если положение в первой последовательности занято тем же аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и соответствующее положение во второй последовательности, то молекулы идентичны в этом положении.

Сравнение двух последовательностей и вычисление процентной идентичности может быть выполнено с использованием математических алгоритмов. В предпочтительном варианте осуществления процент идентичности двух аминокислотных последовательностей определяли с использованием алгоритмов по Needleman и Wunsch ((1970) J. Mol. Biol48:444-453) (доступного на http://www.gcg.com), которые были интегрированы в программу GAP программного пакета GCG, с использованием либо матрицы Blossum 62, либо матрицы PAM250 и штрафов за гэпы 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4, а также штрафов за удлинение 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В еще одном предпочтительном варианте осуществления процент идентичности двух аминокислотных последовательностей определяли с помощью программы GAP в программном пакете GCG (доступом на http://www.gcg.com), используя матрицу NWSgapdna.CMP и штрафа за гэп 40, 50, 60, 70 или 80 и штрафа за удлинение 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Особенно предпочтительным набором параметров (и одним набором параметров, который следует использовать, если не указано иное) является матрица оценки Blossum 62 со штрафом за гэп 12, штрафом за удлинение гэпа 4 и штрафом за сдвиг рамки гэпа 5.

Процент идентичности двух аминокислотных или нуклеотидных последовательностей также может быть определен с использованием алгоритма по E. Meyers и W. Miller ((1989) CABIOS, 4:11-17), который был встроен в программу ALIGN (версия 2.0), с использованием таблицы оцениваемых остатков PAM120, штрафа за удлинение гэпа 12 и штрафа за гэп 4.

В качестве дополнения или альтернативы, последовательности нуклеиновых кислот и последовательности белков, описанные в данном документе, могут дополнительно использоваться в качестве «запрашиваемых последовательностей» для проведения поисков в общедоступных базах данных, например, для идентификации других последовательностей представителей семейства или родственных последовательностей.

Используемый в данном документе термин «гибридизация в условиях низкой, средней, высокой или очень высокой жесткости» описывает условия гибридизации и промывки. Руководство по проведению реакций гибридизации можно найти в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6, включенном посредством ссылки. В ссылках описаны как способы с использованием воды, так и способы с использованием средства, отличного от воды, и можно использовать любой из способов. Конкретные условия гибридизации, о которых идет речь в данном документе, являются следующими: 1) условия гибридизации низкой жесткости, предусматривающие промывку дважды в 6X хлориде натрия/ цитрате натрия (SSC) при приблизительно 45°C, затем в 0,2X SSC, 0,1% SDS при по меньшей мере 50°C (при условиях низкой жесткости температура для промывки может быть повышена до 55°C); 2) условия гибридизации средней жесткости, предусматривающие промывку один или более раз в 6X SSC при приблизительно 45°C, затем в 0,2X SSC, 0,1% SDS при 60°C; 3) условия гибридизации высокой жесткости, предусматривающие промывку один или более раз в 6X SSC при приблизительно 45°C, затем в 0,2X SSC, 0,1% SDS при 65°C; и предпочтительно 4) условия гибридизации очень высокой жесткости, включающие промывку один или более раз в 0,5 М фосфате натрия, 7% SDS при 65°C, затем в 0,2X SSC, 0,1% SDS при 65°C. Условия очень высокой жесткости (4) являются предпочтительными условиями и должны использоваться, если не указано иное. Термины «клетка-хозяин», «линия клеток-хозяев» и «культура клеток-хозяев» используются взаимозаменяемо и относятся к клетке, в которую вводится экзогенная нуклеиновая кислота, в том числе к потомству такой клетки. К клеткам-хозяевам относятся «трансформанты» и «трансформированные клетки», к которым относятся в первую очередь трансформированные клетки и полученное от них потомство, независимо от количества пассажей. Потомство может не быть точно таким же по содержанию нуклеиновых кислот, как и исходная клетка, а может содержать мутации. В данный документ включено мутантное потомство, характеризующееся такой же функциональной или биологической активностью, что и клетки, отобранные посредством скрининга или выбранные из потомства первоначально трансформированной клетки.

Термин «фармацевтический вспомогательный материал» относится к разбавителю, адъюванту (например, адъюванту Фрейнда (полному и неполному)), вспомогательному веществу, носителю или стабилизатору и т.д., с которыми вводят активное вещество.

Термин «фармацевтическая композиция» относится к композиции, которая представлена в форме, обеспечивающей эффективную биологическую активность содержащихся в ней активных ингредиентов, и которая не содержит дополнительных ингредиентов, характеризующихся неприемлемой токсичностью для субъекта, которому вводится композиция.

Термин «эффективное количество» относится к количеству или дозе антитела, или фрагмента, или конъюгата, или композиции по настоящему изобретению, которое при введении пациенту в однократной или многократной дозе обеспечивает необходимый эффект у пациента, нуждающегося в лечении или предупреждении. Эффективное количество легко может быть определено лечащим врачом, как специалистом в данной области техники, с учетом следующих факторов, таких как вид млекопитающего; размер, возраст и общее состояние здоровья; конкретные вовлеченные заболевания; степень или тяжесть заболевания; ответ у отдельного пациента; конкретное вводимое антитело; способы введения; характеристики биодоступности вводимого состава; выбранный режим введения дозы и применение любой сопутствующей терапии.

«Терапевтически эффективное количество» относится к количеству, эффективному при дозировках и в течение периодов времени, требующихся для достижения необходимого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела, или фрагмента антитела, или конъюгата, или их композиции может варьировать в зависимости от таких факторов, как состояние заболевания, возраст, пол и вес субъекта, а также способность антитела или части антитела вызывать необходимый ответ у субъекта. Терапевтически эффективное количество также является таким, что любой токсический или неблагоприятный эффект антитела или фрагмента антитела, или конъюгата, или их композиции меньше, чем терапевтически полезный эффект.«Терапевтически эффективное количество» предпочтительно обеспечивает ингибирование измеряемого параметра на по меньшей мере приблизительно 20%, более предпочтительно на по меньшей мере приблизительно 40%, еще более предпочтительно на по меньшей мере приблизительно 50%, 60% или 70% и еще более предпочтительно на по меньшей мере приблизительно 80% или 90% по сравнению с не получавшим лечение индивидуумом. Способность соединения ингибировать измеряемый параметр может быть оценена в системе модели на животном, предсказывающей эффективность при аутоиммунном заболевании или воспалении у человека.

«Профилактически эффективное количество» относится к количеству, которое при необходимых дозировках и в течение необходимых периодов времени, является эффективным для достижения профилактического результата. Как правило, профилактически эффективное количество будет меньше терапевтически эффективного количества, поскольку профилактическая доза используется у человека до заболевания или на более ранней стадии заболевания.

Используемые в данном документе «индивидуум» или «субъект» используют взаимозаменяемо и они предусматривают млекопитающих, таких как человек.

Используемое в данном документе «лечение» относится к замедлению, прерыванию, остановке, облегчению, прекращению, уменьшению или обращению прогрессирования или тяжести существующего симптома, нарушения, состояния или заболевания.

Используемое в данном документе «предупреждение» предусматривает ингибирование возникновения или развития заболевания или нарушения или симптомов конкретного заболевания или нарушения. В некоторых вариантах осуществления субъект или беременная женщина с семейным анамнезом заболевания иммунной системы (аутоиммунного заболевания или нарушения иммунитета) является кандидатом для профилактического режима. В целом, в контексте заболевания иммунной системы (аутоиммунного заболевания или нарушения иммунитета) термин «предупреждения» относится к введению лекарственного средства до появления признака или симптома заболевания иммунной системы (аутоиммунного заболевания или нарушенного иммунитета), в частности, у субъекта, подверженного риску заболевания иммунной системы (аутоиммунного заболевания или нарушения иммунитета).

«Образец субъекта/пациента» относится к сбору клеток или жидкостей, полученных от пациента или субъекта. Источником образца ткани или клеток может быть плотная ткань, например свежие, замороженные и/или консервированные органы, или образцы тканей, или биоптаты, или пунктаты; кровь или любой компонент крови; жидкости организма, такие как спинномозговая жидкость, амниотическая жидкость, перитонеальная жидкость (асцитическая жидкость) или интерстициальная жидкость; клетки от субъекта в любой период беременности или развития. Образцы тканей могут содержать соединения, которые в природных условиях не находятся вместе с тканями, такие как консерванты, антикоагулянты, буферы, фиксаторы, питательные вещества, антибиотики и т.д.

Эти и другие аспекты и варианты осуществления настоящего изобретения описаны в прилагаемых вариантах осуществления и в следующем подробном описании настоящего изобретения и проиллюстрированы в следующих примерах. Любые или все признаки, обсуждаемые выше и по всей настоящей заявке, могут быть объединены в различных вариантах осуществления настоящего изобретения. Следующие примеры дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение, однако следует понимать, что примеры описаны в качестве иллюстрации, а не ограничения, и что различные модификации могут быт внесены специалистами в данной области техники.

Примеры

Пример 1. Конструирование последовательностей конкретного антигена, представляющего собой гликопротеин gB HCMV

Информация о последовательностях гликопротеина gB 56 штаммов цитомегаловируса человека (включая экспериментальные и клинические штаммы) была получена из базы данных NCBI GENG, и гомология гликопротеина gB составляла более 70% при выравнивании аминокислотных последовательностей. В качестве одного специфического антигена был выбран гликопротеин gB стандартного штамма Towne (штамма gB_Towne), последовательность которого показана под SEQ ID NO: 19, при этом гомологичная последовательность гликопротеина gB из 56 штаммов вируса была выбрана в качестве другого специфического антигена (штамм gB_Con.), последовательность которого показана под SEQ ID NO: 20, для скрининга моноклонального антитела широкого спектра действия к цитомегаловирусу человека.

SEQ ID NO: 19

MESRIWCLVVCVNLCIVCLGAAVSSSSTRGTSATHSHHSSHTTSAAHSRSGSVSQRVTSSQTVSHGVNETIYNTTLKYGDVVGVNTTKYPYRVCSMAQGTDLIRFERNIVCTSMKPINEDLDEGIMVVYKRNIVAHTFKVRVYQKVLTFRRSYAYIHTTYLLGSNTEYVAPPMWEIHHINSHSQCYSSYSRVIAGTVFVAYHRDSYENKTMQLMPDDYSNTHSTRYVTVKDQWHSRGSTWLYRETCNLNCMVTITTARSKYPYHFFATSTGDVVDISPFYNGTNRNASYFGENADKFFIFPNYTIVSDFGRPNSALETHRLVAFLERADSVISWDIQDEKNVTCQLTFWEASERTIRSEAEDSYHFSSAKMTATFLSKKQEVNMSDSALDCVRDEAINKLQQIFNTSYNQTYEKYGNVSVFETTGGLVVFWQGIKQKSLVELERLANRSSLNLTHNETKESTDGNNATHLSNMESVHNLVYAQLQFTYDTLRGYINRALAQIAEAWCVDQRRTLEVFKELSKINPSAILSAIYNKPIAARFMGDVLGLASCVTINQTSVKVLRDMNVKESPGRCYSRPVVIFNFANSSYVQYGQLGEDNEILLGNHRTEECQLPSLKIFIAGNSAYEYVDYLFKRMIDLSSISTVDSMIALDIDPLENTDFRVLELYSQKELRSINVFDLEEIMREFNSYKQRVKYVEDKGLNDIFEAQKIEWHELEVLFQGPGHHHHHHH

SEQ ID NO: 20

MESRIWCLVVCVNLCIVCLGAAVSSSSTSHATSSTHNGSHTSRTTSAQTRSVSQHVTSSEAVSHRANETIYNTTLKYGDVVGVNTTKYPYRVCSMAQGTDLIRFERNIVCTPMKPINEDLDEGIMVVYKRNIVAHTFKVRVYQKVLTFRRSYAYIHTTYLLGSNTEYVAPPMWEIHHINSHSQCYSSYSRVIAGTVFVAYHRDSYENKTMQLMPDDYSNTHSTRYVTVKDQWHSRGSTWLYRETCNLNCMVTITTARSKYPYHFFATSTGDVVDISPFYNGTNRNASYFGENADKFFIFPNYTIVSDFGRPNSAPETHRLVAFLERADSVISWDIQDEKNVTCQLTFWEASERTIRSEAEDSYHFSSAKMTATFLSKKQEVNMSDSALDCVRDEAINKLQQIFNTSYNQTYEKYGNVSVFETTGGLVVFWQGIKQKSLVELERLANRSSLNLTHETKESTDGNNTTHLSNMESVHNLVYAQLQFTYDTLRGYINRALAQIAEAWCVDQRRTLEVFKELSKINPSAILSAIYNKPIAARFMGDVLGLASCVTINQTSVKVLRDMNVKESPGRCYSRPVVIFNFANSSYVQYGQLGEDNEILLGNHRTEECQLPSLKIFIAGNSAYEYVDYLFKRMIDLSSISTVDSMIALDIDPLENTDFRVLELYSQKELRSSNVFDLEEIMREFNSYKQRVKYVEDKGLNDIFEAQKIEWHELEVLFQGPGHHHHHHH.

Пример 2. Скрининг в отношении сывороточного антитела к гликопротеину gB HCMV

1. Процесс скрининга

Добровольцы с ослабленным иммунитетом были набраны в различных больницах и было получено 272 образца цельной крови от соответствующих критериям участия пациентов; мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) человека и плазму крови выделяли с помощью среды для разделения лимфоцитов Ficoll (GE). Два разработанных гликопротеина gB HCMV были экспрессированы и очищены общепринятыми способами при концентрации 2 мкг/мл для последующего применения. Для 272 образцов крови (отделенная плазма крови) проводили тест на титр антител (титр антител в сыворотке крови, измеренный по EC50) с помощью ELISA-анализа, и осуществляли классификацию рака.

2. Результаты

272 клинических образца крови принадлежали к 17 различным типам раковых заболеваний, и результат показал, что 268 образцов были серопозитивными, при этом уровень получения положительного результата составлял вплоть до 98,53%, что согласуется с заключением, представленным в исследовании о распространенности HCMV-инфекции в человеческой популяции. Эти образцы относили к образцам от пациентов с глиобластомой, раком легкого, раком прямой кишки, раком печени, раком желудка, раком пищевода, раком толстой кишки, раком почки, раком яичника, раком молочной железы, раком поджелудочной железы, раком предстательной железы, раком мочевого пузыря, раком желчного пузыря, раком шейки матки и красной волчанкой и т.д. соответственно, что указывает на широкое распространение HCMV в популяциях с ослабленным иммунитетом, таких как пациенты с раком и пациенты с аутоиммунными заболеваниями. У этих пациентов имеются антитела к цитомегаловирусу человека, поэтому моноклональные скрининг антител к цитомегаловирусу человека может быть выполнен по их В-клеткам.

Пример 3. Выделение гена моноклонального антитела к цитомегаловирусу человека

1. Сортинг В-клеток, специфических в отношении антигенного белка штамма gB_Towne и штамма gB_Con

Чтобы улучшить выход сортинга В-клеток памяти, отбирали образец под номером Es0018 в примере 3 для специфического сортинга с двумя гликопротеинами gB HCMV (штамма gB_Towne и штамма gB_Con) в одно и то же время. Стадии скрининга являются следующими.

Одиночные В-лимфоциты памяти можно было получать из специфических в отношении антигена gB В-лимфоцитов памяти в периферической крови человека в режиме сортинга по отдельной клетке с использованием проточной цитометрии (BD FACSAria) в соответствии с инструкциями производителя, применяя логические гейты, установленные в соответствии с CD3-/CD14-/CD16-/CD235a-/CD19+/SIgD-/-мечеными gB_Towne и gB_Con+. Для повышения специфичности сортинга меченые gB_Towne и gB_Con метили флуоресцентными веществами двух цветов (PE-Cy7 и Bv421) с получением в результате дважды позитивных клеток по диагонали и однократно позитивных клеток в логическом гейте.

2. Амплификация гена вариабельной области антитела отдельной клетки

Стадии являются следующими. Были успешно разработаны и созданы полный набор праймеров для RT-PCR/PCR и экспериментальные условия для амплификации всех известных семи семейств тяжелых цепей антител человеческого происхождения и тринадцати семейств легких цепей, включая гены вариабельной области антитела из IgG, IgA, IgM, IgD и IgE (см. CN107760690B).

3. Результаты

Из образца выделяли множество В-клеток памяти и получали последовательности генов антител после амплификации генов вариабельной области антител в отдельной клетке с использованием разработанных праймеров, при этом частота соматических мутаций фрагмента гена тяжелой цепи VH антитела составляла от 10% до 18,5%. После амплификации генов вариабельной области антитела отдельной клетки получили 103 последовательности генов вариабельной области тяжелой цепи антитела и 109 последовательностей генов вариабельной области легкой цепи антитела соответственно, после их попарного объединения уровень получения положительного результата для выявленных антител составил 32,4%, частота соматических мутаций тяжелой цепи положительного антитела составила от 7% до 16,5%, а легкой цепи - от 2% до 15%.

Пример 4. Экспрессия моноклонального антитела к цитомегаловирусу человека

1. Конструирование векторов экспрессии

Конструировали линейные векторы экспрессии для последовательности гена вариабельной области тяжелой цепи и последовательности гена вариабельной области легкой цепи вышеупомянутого антитела, полученного в результате успешно попарного объединения, соответственно, и выделенные гены вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи соответственно объединяли с соответствующими им последовательностями константной области с использованием способа ПЦР с перекрывающимися праймерами (Crystal Structure of the Human Cytomegalovirus Glycoprotein B, Heidi G. Burke and Ekaterina E. Heldwein, PLoS Pathog. 2015 Oct; 11(10): e1005227) в полноразмерные гены тяжелой и легкой цепей и экспрессировали рекомбинантные антитела для скрининга и идентификации антител.

2. Скрининг положительных антител

Упомянутым выше вектором экспрессии (PCDNA 3.1), содержащим гены тяжелой и легкой цепей, трансфицировали клетки HEK293 с использованием реагента трансфекции (Quigen) и культивировали в 12-луночном планшете со средой DMEM, содержащей FBS, в течение 48 часов. Через 48 часов надосадочную жидкость культуры клеток собирали и тестировали в отношении экспрессии антител и их связывания с антигеном, представляющим собой гликопротеин gB HCMV (штамм gB_Towne и штамм gB_Con), с помощью ELISA. Стандартом являлся TRN006 (CN 103910796 B), начальная концентрация составляла 0,5 мкг/мл; надосадочная жидкость культуры клеток с начальной концентрацией представляла собой исходный раствор, который подвергали серии из 4 10-кратных разведений; Fab мыши к IgG человека-HRP (Abcam) разбавляли коммерчески доступным SuperBlock в соотношении 1:10000. После завершения реакции показания при двух длинах волн 450 нм (образец) и 630 нм (лунка микропланшета) снимали с помощью многоцелевого устройства для считывания микропланшетов, и окончательными рассчитываемыми значениями были OD450-OD630. Выбирали точки с хорошей линейной зависимостью (R2>0,99) между значением OD450-OD630 для TRN006 и его соответствующей концентрацией для получения уравнения линейной регрессии и рассчитывали концентрацию антитела, при этом значение образца попадало в линейный интервал.

3. Результаты идентификации

Наконец, конструировали линейные векторы экспрессии для тяжелой и легкой цепей 134 антител соответственно, которые успешно попарно объединяли и которыми осуществляли совместную трансфекцию клеток HEK293; 42 антитела с положительным связыванием подвергали скринингу, при этом уровень получения положительного результата составлял 32,3%, при этом для 36 антител была показана сильная положительная реакция в отношении штамма gB_Towne, и для 24 антител была показан сильная положительная реакция в отношении штамма gB_Con и штамма gB_Towne.

В четырех подвергнутых скринингу антителах по настоящему изобретению тяжелая цепь может содержать CDR1 под SEQ ID NO: 1-4, и/или CDR2 под SEQ ID NO: 5-8, и/или CDR3 под SEQ ID NO: 9-12. В конкретных примерах легкая цепь содержит CDR1 под SEQ ID NO: 21-24, и/или CDR2 под SEQ ID NO: 25-28, и/или CDR3 под SEQ ID NO: 29-32.

TRN1017

24 антитела, для которых была показана сильная положительная реакция как в отношении штамма gB_Con, так и в отношении штамма gB_Towne, были идентифицированы путем секвенирования ДНК (Invitrogen) соответствующих препаратов ДНК. Одно из антител было идентифицировано как TRN1017, и оно содержало

аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленную под SEQ ID NO: 13, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленную под SEQ ID NO: 33;

аминокислотную последовательность тяжелой цепи, представленную под SEQ ID NO: 37, и аминокислотную последовательность легкой цепи, представленную под SEQ ID NO: 38.

TRN1018

24 антитела, для которых была показана сильная положительная реакция как в отношении штамма gB_Con, так и в отношении штамма gB_Towne, были идентифицированы путем секвенирования ДНК соответствующих препаратов ДНК. Одно из антител было идентифицировано как TRN1018, и оно содержало

аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленную под SEQ ID NO: 14, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленную под SEQ ID NO: 34;

аминокислотную последовательность тяжелой цепи, представленную под SEQ ID NO: 39, и аминокислотную последовательность легкой цепи, представленную под SEQ ID NO: 40.

TRN1019

24 антитела, для которых была показана сильная положительная реакция как в отношении штамма gB_Con, так и в отношении штамма gB_Towne, были идентифицированы путем секвенирования ДНК соответствующих препаратов ДНК. Одно из антител было идентифицировано как TRN1019, и оно содержало

аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленную под SEQ ID NO: 15, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленную под SEQ ID NO: 35;

аминокислотную последовательность тяжелой цепи, представленную под SEQ ID NO: 41, и аминокислотную последовательность легкой цепи, представленную под SEQ ID NO: 42.

TRN1020

24 антитела, для которых была показана сильная положительная реакция как в отношении штамма gB_Con, так и в отношении штамма gB_Towne, были идентифицированы путем секвенирования ДНК соответствующих препаратов ДНК. Одно из антител было идентифицировано как TRN1020, и оно содержало

аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленную под SEQ ID NO: 16, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленную под SEQ ID NO: 36;

аминокислотную последовательность тяжелой цепи, представленную под SEQ ID NO: 43, и аминокислотную последовательность легкой цепи, представленную под SEQ ID NO: 44.

Анализировали аминокислотные последовательности упомянутых выше вариабельных областей и определяли последовательности CDR этих четырех антител следующим образом с использованием правила нумерации IMGT:

Пример 5. Оценивание противовирусной нейтрализующей способности моноклональных антител к цитомегаловирусу человека

1. Оценивание противовирусной нейтрализующей способности антител в клетках HFF

Для оценивания нейтрализующей способности антител выбирали клеточную модель HFF, а также стандартные штаммы HCMV - Towne и TB40E (оба приобретены в ATCC), в качестве контроля использовали уже описанные антитела SM5_1 и SM10, соответственно (Crystal Structure of the Human Cytomegalovirus Glycoprotein B, Heidi G. Burke and Ekaterina E. Heldwein, PLoS Pathog. 2015 Oct:11(10): e1005227). Перед инфицирование высевали 5,00E+03 клеток HFF на лунку в 96-луночный планшет, при этом плотность клеток составляла приблизительно 90%. Антитело с начальной концентрацией 100 мкг/мл подвергали серии из 8 3-кратных разведений с помощью PBS, в каждую лунку добавляли по 10 мкл разведения, а в обработанную вирусом контрольную группу добавляли 10 мкл среды DMEM. Клетки инфицировали дозой вируса, соответствующей MOI=0,96, т.е. добавляли 40 мкл/лунка исходного раствора вируса, смесь инкубировали в инкубаторе при 37°C в течение l часа в качестве раствора для инфицирования вирусом. Надосадочную жидкость клеток сливали из 96-луночного планшета, затем дважды промывали с помощью 100 мкл PBS. 50 мкл растворов для инфицирования вирусом с различными разведениями антител добавляли в 96-луночный планшет и инфицирование смеси осуществляли в течение 4 часов в инкубаторе при 37°C. Раствор для инфицирования вирусом аспирировали и однократно осуществляли промывку с помощью 100 мкл PBS. В каждую лунку добавляли по 100 мкл среды DMEM и культивировали в инкубаторе, содержащем 5% CO₂, при 37°C в течение 96 часов, во время чего ежедневно наблюдали и регистрировали состояние клеток. Надосадочную жидкость культуры клеток сливали и осуществляли двукратную промывку с помощью PBS. В каждую лунку добавляли по 50 мкл 4% параформальдегида; планшет оставляли при комнатной температуре на 30 минут для фиксации клеток и осуществляли двукратную промывку с помощью PBS. Ядра клеток окрашивали в течение 15 минут с помощью 100 мкл 10 мкг/мл красителя Hoechst и осуществляли 3-кратную промывку с помощью 200 мкл PBS (96-луночный планшет осторожно встряхивали), окрашивание ядер наблюдали при синем свете, а вирусную инфекцию наблюдали при зеленом свете. Интенсивность флуоресценции измеряли при длине волны излучения 535 нм и длине волны возбуждения 485 нм и относительную интенсивность флуоресценции использовали для описания степени вирусной инфекции клеток и эффекта антител в отношении вирусной инфекции. Результаты расчетов (формула: эффект в отношении вирусной инфекции=100 - интенсивность флуоресценции обработанной комплексом антитело-вирус группы / интенсивность флуоресценции обработанной вирусом группы × 100).

2. Оценивание противовирусной нейтрализующей способности антител в первичных клетках HUVEC

Антитела оценивали по их способности противостоять инфекции, обусловленной Towne, в линиях первичных клеток HUVEC. Перед инфицирование высевали 4,00E+04 клеток HUVEC на лунку в 96-луночный планшет, при этом плотность клеток составляла приблизительно 80%. Антитело с начальной концентрацией 100 мкг/мл подвергали серии из 8 3-кратных разведений, в каждую лунку добавляли по 10 мкл разведения, а в обработанную вирусом контрольную группу добавляли 10 мкл среды. Клетки инфицировали дозой вируса, соответствующей MOI=5, т.е. добавляли 40 мкл/лунка исходного раствора вируса, смесь инкубировали в инкубаторе при 37°C в течение l часа в качестве раствора для инфицирования вирусом. Надосадочную жидкость клеток сливали из 96-луночного планшета, затем дважды промывали с помощью 100 мкл PBS. 50 мкл растворов для инфицирования вирусом с различными разведениями антител добавляли в 96-луночный планшет и инфицирование смеси осуществляли в течение 4 часов в инкубаторе при 37°C. Раствор для инфицирования вирусом аспирировали и дополняли с помощью 100 мкл среды DMEM на лунку, смесь культивировали в инкубаторе, содержащем 5% CO₂, при 37°C в течение 7 дней, во время чего ежедневно наблюдали и регистрировали состояние клеток. Надосадочную жидкость культуры клеток сливали и осуществляли двукратную промывку с помощью PBS. В каждую лунку добавляли по 50 мкл 4% параформальдегида; планшет оставляли при комнатной температуре на 30 минут для фиксации клеток и осуществляли двукратную промывку с помощью PBS. Ядра клеток окрашивали в течение 15 минут с помощью 100 мкл 10 мкг/мл красителя Hoechst и осуществляли 3-кратную промывку с помощью 200 мкл PBS (96-луночный планшет осторожно встряхивали), окрашивание ядер наблюдали при синем свете, а вирусную инфекцию наблюдали при зеленом свете. Интенсивность флуоресценции измеряли при длине волны излучения 535 нм и длине волны возбуждения 485 нм и относительную интенсивность флуоресценции использовали для описания степени вирусной инфекции клеток и эффекта антител в отношении вирусной инфекции. Результаты расчетов (формула: эффект в отношении вирусной инфекции=100 - интенсивность флуоресценции обработанной комплексом антитело-вирус группы / интенсивность флуоресценции обработанной вирусом группы × 100).

3. Результаты

На графике результатов SM5_1 и SM10 представляют собой антитела к цитомегаловирусу, уже представленные в качестве положительных контролей; TRNO79 представляет собой антитело к вирусу бешенства (CN201611069303.4), HCV0082 представляет собой антитело к HCV, а два неродственных антитела используют в качестве отрицательных контролей. Как показано на фиг.1A, EC50 четырех линий антител, TRN1017, TRN1018, TRN1019 и TRN1020, на стандартном штамме HCMV, Towne, составляла 0,017-0,074 мкг/мл. EC50 означает половину эффективной концентрации и относится к концентрации, при которой у 50% тестовых животных индуцируется специфический ответ, или при которой индекс ответа ингибируется наполовину. Меньшая EC50 указывает на более сильную нейтрализующую способность антитела. Как показано на фиг.1 В, EC50 четырех линий антител, TRN1017, TRN1018, TRN1019 и TRN1020, на клиническом штамме HCMV, TB40E, составила 0,015-0,091 мкг/мл. Приведенные выше результаты показывают, что антитела по настоящему изобретению обладают очень высокой нейтрализующей активностью как в отношении стандартного штамма HCMV, Towne, так и в отношении штамма TB40E.

Между тем, два из данных антител, TRN1017 и TRN1020, также оценивали на линиях первичных клеток HUVEC в отношении их способности противостоять инфекции, обусловленной вирусом Towne, и антитела также обладали чрезвычайно высокой нейтрализующей активностью, при этом EC50 составляла 0,089 мкг/мл и 0,041 мкг/мл соответственно.

HUVEC представляет собой эндотелиальную клетку пупочной вены человека, а HFF представляет собой фибробластную клетку крайней плоти человека (HFF). Приведенные выше результаты демонстрируют, что антитела по настоящему изобретению обладают более высокой нейтрализующей вирус способностью в отношении различных штаммов вируса HCMV; дополнительно, антитела по настоящему изобретению обладают способностью нейтрализовать HCMV, инфицирующий различные типы клеток, и, таким образом, антитела по настоящему изобретению обладают потенциалом нейтрализовать HCMV в различных участках ткани у индивидуума.

Пример 6. Определение аффинности антител

Способность антитела связываться с гликопротеином gB (штамм gB_Towne) определяли in vitro с использованием Biacore (принцип SPR). Антитело к IgG человека (Fc) присоединяли в двух каналах чипа CM5 посредством присоединения через аминогруппу, в итоге в канале 1 было присоединено 5485.4RU, а в канале 2 было присоединено 5622.4RU. Концентрация захватывающего антитела составляла l мкг/мл, а время связывания составляло 45 с.Концентрация связанного антигенного белка gB0049 составляла 1,25 мкг/мл, 2,5 мкг/мл, 5 мкг/мл, 10 мкг/мл и 20 мкг/мл, время связывания составляло 90 с, время диссоциации составляло 600 с.Регенерационный раствор представлял собой 3 M MgCl₂, а время регенерации составляло 30 с.

Результаты показаны на фиг.2, все значения K_D антитела, связывающегося с гликопротеином gB, находились в наномолярном диапазоне, при этом значение K_D TRN1020 составляло 0,60 нМ, значение K_D TRN1018 составляло 27,9 нМ, а значение K_D TRN1017 составляло 1,13 нМ, что указывает на то, что антитело по настоящему изобретению обладает более высокой способностью связывания с антигеном гликопротеина gB.

Пример 7. Исследования антигенсвязывающих эпитопов антител

1. Эффект дегликозилирования антигена в отношении связывающей способности антитела

В настоящем изобретении исследовали эффект гликозилирования гликопротеина gB в отношении антитела. Сначала 12 сайтов гликозилирования (N208, N281, N284, N302, N341, N383, N405, N409, N417, N447, N452 и N456) белка gB_Towne были мутированы до глутамина посредством осуществления одноточечной мутации с использованием набора (физические и химические свойства аспарагина и глутамина аналогичны, и эффект мутации в отношении пространственной структуры является минимальным), затем, активность связывания мутантного варианта гликопротеина gB с антителами SM10, TRN1017 и TRN1019 определяли с помощью непрямого ELISA соответственно.

Как показано в результатах на фиг.3, после мутирования сайтов гликозилирования гликопротеинов gB N208, N281, N284, N302, N341, N383, N405, N409, N417, N447, N452 и N456 до глутамина способность связывания антител TRN1017 и TRN1019 по настоящему изобретению с мутантным вариантом гликопротеина gB с N208Q была значительно снижена, а изменение связывания с другими мутантными вариантами гликопротеина gB было незначительным. Между тем, с учетом того, что эпитоп связывания контрольного антитела SM10 пространственно примыкает к сайту N208, изменение связывания SM10 с мутантным вариантом гликопротеина gB с N208Q не является значительным, что указывает на то, что мутация N208 не приводит к чрезмерному изменению прилегающей пространственной структуры, тем самым демонстрируя, что сайт N208 в гликопротеине gB является ключевым эпитопом связывания антигена для антител по настоящему изобретению.

3. Сайт-направленная мутация аминокислотного сайта гликопротеина gB

Для получения дополнительных данных по эпитопам этих антител авторы настоящего изобретения выполнили аланиновое сканирование (186aa-228aa) по аминокислотам, расположенным выше и ниже N208 и, наконец, осуществили скрининг в отношении сайтов L213 и Y226. Константы аффинности антител TRN1017, TRN1018, TRN1019 и TRN1020 в отношении мутантов в этих двух сайтах определяли с использованием принципа SPR, и результаты показали, что способность связывания антител с этими двумя мутантными вариантами была значительно снижена (без значительного изменения связывания контрольного антитела 1G2), что указывает на то, что L213 и Y226 являются критическими эпитопами для антител по настоящему изобретению.

Таким образом, получили данные по трем аминокислотам в эпитопах этих антител (N208, L213 и Y226), которые структурно расположены в домене слияния гликопротеина gB (аминокислоты R150-C250, являющиеся структурной основой для функции слияния мембран, обеспечиваемой гликопротеином gB), и антитела, нацеленные на этот домен, могут непосредственно блокировать проникновение вируса в клетки хозяина (фиг.4).

В заключение следует отметить, что в отличие от антител к доменам AD-1, AD-2, AD-4 и AD-5, о которых сообщалось (Structure of HCMV glycoprotein B in the postfusion conformation bound to a neutralizing human antibody, Sumana Chandramouli et al. Nature Communications volume 6, Article number: 8176 (2015)); Germline V-genes sculpt the binding site of a family of antibodies neutralizing human cytomegalovirus, Christy A Thomson et al. The EMBO Journal (2008) 27, 2592-2602), эпитопы антител по настоящему изобретению направлены в отношении домена слияния гликопротеина gB. Для всех этих антител была показана высокая нейтрализующая вирус активность и высокий лекарственный потенциал. В то же время полученные данные по эпитопам антител обеспечивает теоретическую основу для разработки структурной вакцины на основе гликопротеина HCMV_gB.

Пример 8. Анализ антинуклеарной устойчивости антитела

Клетка Hep-2 представляет собой эпителиальную клетку рака гортани человека, которую во всем мире обычно выбирают в качестве субстрата для способа непрямой иммунофлуоресценции в качестве стандартного способа выявления антинуклеарного антитела ввиду характерного для нее богатого антигенного спектра, сильной антигенной специфичности и высокого содержания антигена в Hep-2. Этот способ использовали в настоящем изобретении для выявления антинуклеарной устойчивости 4 антител TRN1017, TRN1018, TRN1019 и TRN1020 и выявление проводили в соответствии с инструкциями набора для выявления антинуклеарных антител (ANA).

Результаты показывают, что антитела TRN1017, TRN1018, TRN1019 и TRN1020 не вызывают реакции иммунофлуоресценции с клетками Hep-2 при концентрации 100 мкг/мл, что указывает на отсутствие аутоиммунной реакции антител с клетками Hep-2.

Описание приведенных выше примеров используется исключительно для объяснения способа и основной идеи настоящего изобретения. Следует отметить, что некоторые улучшения и модификации могут быть осуществлены специалистами в данной области техники без отступления от принципа настоящего изобретения, и эти улучшения и модификации также должны рассматриваться в рамках объема защиты настоящего изобретения.

Список последовательностей

Список информации о последовательностях CDR тяжелой цепи

Список информации о последовательностях CDR легкой цепи

Список информации об аминокислотных последовательностях вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL) антитела

Аминокислотные последовательности тяжелой цепи (HC) и легкой цепи (LC) антитела

Константная область легкой цепи λ:

GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO:17)

Константная область легкой цепи κ:

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:18)

Константная область тяжелой цепи:

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:45)

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110>Чжухай Триномаб Биотекнолоджи Ко., Лтд.

<120>Антитело к цитомегаловирусу человека и его применение

<130>MTPIRU220125

<140>PCT/CN2020/133816

<141>2020-12-04

<150>CN201911226892.6

<151>2019-12-04

<160>45

<170>PatentIn версия 3.3

<210>1

<211>8

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>1

Gly Phe Thr Phe Arg His Tyr Trp

1 5

<210>2

<211>8

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>2

Gly Phe Thr Phe Ser Asn His Gly

1 5

<210>3

<211>8

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>3

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp

1 5

<210>4

<211>8

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>4

Gly Phe Ser Phe Ser Thr Tyr Ala

1 5

<210>5

<211>8

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>5

Ile His Gly Ser Gly Thr Thr Thr

1 5

<210>6

<211>8

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>6

Ile Ser Ser Asp Gly Thr Asp Thr

1 5

<210>7

<211>8

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>7

Ile Phe Pro Arg Asp Ser Tyr Ser

1 5

<210>8

<211>8

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>8

Val Ser Gly Arg Gly Thr Ser Thr

1 5

<210>9

<211>10

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>9

Val Arg Asp Asp Tyr Thr Ser Gly Tyr Asn

1 5 10

<210>10

<211>18

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>10

Ala Arg Asp Gly Arg Cys Gly Asp Glu Arg Cys Tyr Ser Gly Leu Pro

1 5 10 15

Asp Val

<210>11

<211>11

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>11

Ala Ile Tyr Asn Asp Leu Arg Ser Gly Asn Ser

1 5 10

<210>12

<211>21

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>12

Ala Lys Asp Ser Tyr Val Gly Gly Ser Phe Asp Trp Leu Pro Arg Pro

1 5 10 15

Asp Tyr Phe Asp His

20

<210>13

<211>117

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>13

Gln Val Leu Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ala Cys Glu Thr Ser Gly Phe Thr Phe Arg His Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Leu

35 40 45

Ser Ser Ile His Gly Ser Gly Thr Thr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ile Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Ser Pro Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Asp Asp Tyr Thr Ser Gly Tyr Asn Trp Gly Gln Gly Ala Phe

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210>14

<211>125

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>14

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn His

20 25 30

Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Ser Asp Gly Thr Asp Thr Arg Asp Ala Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Asp Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Arg Cys Gly Asp Glu Arg Cys Tyr Ser Gly Leu Pro

100 105 110

Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Arg Val Ser Val Ser Ser

115 120 125

<210>15

<211>118

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>15

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Ala Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Ala Ile Ile Phe Pro Arg Asp Ser Tyr Ser Ala Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu His Trp Ser Ser Leu Glu Ala Ser Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ile Tyr Asn Asp Leu Arg Ser Gly Asn Ser Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Pro Leu Ile Val Ser Ser

115

<210>16

<211>128

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>16

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ala Val Ser Gly Arg Gly Thr Ser Thr Phe Tyr Leu Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Thr Val Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Val Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Ser Tyr Val Gly Gly Ser Phe Asp Trp Leu Pro Arg Pro

100 105 110

Asp Tyr Phe Asp His Trp Gly Arg Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210>17

<211>106

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>17

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro

35 40 45

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210>18

<211>107

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>18

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210>19

<211>731

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Штамм gB_Towne

<400>19

Met Glu Ser Arg Ile Trp Cys Leu Val Val Cys Val Asn Leu Cys Ile

1 5 10 15

Val Cys Leu Gly Ala Ala Val Ser Ser Ser Ser Thr Arg Gly Thr Ser

20 25 30

Ala Thr His Ser His His Ser Ser His Thr Thr Ser Ala Ala His Ser

35 40 45

Arg Ser Gly Ser Val Ser Gln Arg Val Thr Ser Ser Gln Thr Val Ser

50 55 60

His Gly Val Asn Glu Thr Ile Tyr Asn Thr Thr Leu Lys Tyr Gly Asp

65 70 75 80

Val Val Gly Val Asn Thr Thr Lys Tyr Pro Tyr Arg Val Cys Ser Met

85 90 95

Ala Gln Gly Thr Asp Leu Ile Arg Phe Glu Arg Asn Ile Val Cys Thr

100 105 110

Ser Met Lys Pro Ile Asn Glu Asp Leu Asp Glu Gly Ile Met Val Val

115 120 125

Tyr Lys Arg Asn Ile Val Ala His Thr Phe Lys Val Arg Val Tyr Gln

130 135 140

Lys Val Leu Thr Phe Arg Arg Ser Tyr Ala Tyr Ile His Thr Thr Tyr

145 150 155 160

Leu Leu Gly Ser Asn Thr Glu Tyr Val Ala Pro Pro Met Trp Glu Ile

165 170 175

His His Ile Asn Ser His Ser Gln Cys Tyr Ser Ser Tyr Ser Arg Val

180 185 190

Ile Ala Gly Thr Val Phe Val Ala Tyr His Arg Asp Ser Tyr Glu Asn

195 200 205

Lys Thr Met Gln Leu Met Pro Asp Asp Tyr Ser Asn Thr His Ser Thr

210 215 220

Arg Tyr Val Thr Val Lys Asp Gln Trp His Ser Arg Gly Ser Thr Trp

225 230 235 240

Leu Tyr Arg Glu Thr Cys Asn Leu Asn Cys Met Val Thr Ile Thr Thr

245 250 255

Ala Arg Ser Lys Tyr Pro Tyr His Phe Phe Ala Thr Ser Thr Gly Asp

260 265 270

Val Val Asp Ile Ser Pro Phe Tyr Asn Gly Thr Asn Arg Asn Ala Ser

275 280 285

Tyr Phe Gly Glu Asn Ala Asp Lys Phe Phe Ile Phe Pro Asn Tyr Thr

290 295 300

Ile Val Ser Asp Phe Gly Arg Pro Asn Ser Ala Leu Glu Thr His Arg

305 310 315 320

Leu Val Ala Phe Leu Glu Arg Ala Asp Ser Val Ile Ser Trp Asp Ile

325 330 335

Gln Asp Glu Lys Asn Val Thr Cys Gln Leu Thr Phe Trp Glu Ala Ser

340 345 350

Glu Arg Thr Ile Arg Ser Glu Ala Glu Asp Ser Tyr His Phe Ser Ser

355 360 365

Ala Lys Met Thr Ala Thr Phe Leu Ser Lys Lys Gln Glu Val Asn Met

370 375 380

Ser Asp Ser Ala Leu Asp Cys Val Arg Asp Glu Ala Ile Asn Lys Leu

385 390 395 400

Gln Gln Ile Phe Asn Thr Ser Tyr Asn Gln Thr Tyr Glu Lys Tyr Gly

405 410 415

Asn Val Ser Val Phe Glu Thr Thr Gly Gly Leu Val Val Phe Trp Gln

420 425 430

Gly Ile Lys Gln Lys Ser Leu Val Glu Leu Glu Arg Leu Ala Asn Arg

435 440 445

Ser Ser Leu Asn Leu Thr His Asn Glu Thr Lys Glu Ser Thr Asp Gly

450 455 460

Asn Asn Ala Thr His Leu Ser Asn Met Glu Ser Val His Asn Leu Val

465 470 475 480

Tyr Ala Gln Leu Gln Phe Thr Tyr Asp Thr Leu Arg Gly Tyr Ile Asn

485 490 495

Arg Ala Leu Ala Gln Ile Ala Glu Ala Trp Cys Val Asp Gln Arg Arg

500 505 510

Thr Leu Glu Val Phe Lys Glu Leu Ser Lys Ile Asn Pro Ser Ala Ile

515 520 525

Leu Ser Ala Ile Tyr Asn Lys Pro Ile Ala Ala Arg Phe Met Gly Asp

530 535 540

Val Leu Gly Leu Ala Ser Cys Val Thr Ile Asn Gln Thr Ser Val Lys

545 550 555 560

Val Leu Arg Asp Met Asn Val Lys Glu Ser Pro Gly Arg Cys Tyr Ser

565 570 575

Arg Pro Val Val Ile Phe Asn Phe Ala Asn Ser Ser Tyr Val Gln Tyr

580 585 590

Gly Gln Leu Gly Glu Asp Asn Glu Ile Leu Leu Gly Asn His Arg Thr

595 600 605

Glu Glu Cys Gln Leu Pro Ser Leu Lys Ile Phe Ile Ala Gly Asn Ser

610 615 620

Ala Tyr Glu Tyr Val Asp Tyr Leu Phe Lys Arg Met Ile Asp Leu Ser

625 630 635 640

Ser Ile Ser Thr Val Asp Ser Met Ile Ala Leu Asp Ile Asp Pro Leu

645 650 655

Glu Asn Thr Asp Phe Arg Val Leu Glu Leu Tyr Ser Gln Lys Glu Leu

660 665 670

Arg Ser Ile Asn Val Phe Asp Leu Glu Glu Ile Met Arg Glu Phe Asn

675 680 685

Ser Tyr Lys Gln Arg Val Lys Tyr Val Glu Asp Lys Gly Leu Asn Asp

690 695 700

Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Leu Glu Val Leu Phe

705 710 715 720

Gln Gly Pro Gly His His His His His His His

725 730

<210>20

<211>729

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Штамм gB_Con

<400>20

Met Glu Ser Arg Ile Trp Cys Leu Val Val Cys Val Asn Leu Cys Ile

1 5 10 15

Val Cys Leu Gly Ala Ala Val Ser Ser Ser Ser Thr Ser His Ala Thr

20 25 30

Ser Ser Thr His Asn Gly Ser His Thr Ser Arg Thr Thr Ser Ala Gln

35 40 45

Thr Arg Ser Val Ser Gln His Val Thr Ser Ser Glu Ala Val Ser His

50 55 60

Arg Ala Asn Glu Thr Ile Tyr Asn Thr Thr Leu Lys Tyr Gly Asp Val

65 70 75 80

Val Gly Val Asn Thr Thr Lys Tyr Pro Tyr Arg Val Cys Ser Met Ala

85 90 95

Gln Gly Thr Asp Leu Ile Arg Phe Glu Arg Asn Ile Val Cys Thr Pro

100 105 110

Met Lys Pro Ile Asn Glu Asp Leu Asp Glu Gly Ile Met Val Val Tyr

115 120 125

Lys Arg Asn Ile Val Ala His Thr Phe Lys Val Arg Val Tyr Gln Lys

130 135 140

Val Leu Thr Phe Arg Arg Ser Tyr Ala Tyr Ile His Thr Thr Tyr Leu

145 150 155 160

Leu Gly Ser Asn Thr Glu Tyr Val Ala Pro Pro Met Trp Glu Ile His

165 170 175

His Ile Asn Ser His Ser Gln Cys Tyr Ser Ser Tyr Ser Arg Val Ile

180 185 190

Ala Gly Thr Val Phe Val Ala Tyr His Arg Asp Ser Tyr Glu Asn Lys

195 200 205

Thr Met Gln Leu Met Pro Asp Asp Tyr Ser Asn Thr His Ser Thr Arg

210 215 220

Tyr Val Thr Val Lys Asp Gln Trp His Ser Arg Gly Ser Thr Trp Leu

225 230 235 240

Tyr Arg Glu Thr Cys Asn Leu Asn Cys Met Val Thr Ile Thr Thr Ala

245 250 255

Arg Ser Lys Tyr Pro Tyr His Phe Phe Ala Thr Ser Thr Gly Asp Val

260 265 270

Val Asp Ile Ser Pro Phe Tyr Asn Gly Thr Asn Arg Asn Ala Ser Tyr

275 280 285

Phe Gly Glu Asn Ala Asp Lys Phe Phe Ile Phe Pro Asn Tyr Thr Ile

290 295 300

Val Ser Asp Phe Gly Arg Pro Asn Ser Ala Pro Glu Thr His Arg Leu

305 310 315 320

Val Ala Phe Leu Glu Arg Ala Asp Ser Val Ile Ser Trp Asp Ile Gln

325 330 335

Asp Glu Lys Asn Val Thr Cys Gln Leu Thr Phe Trp Glu Ala Ser Glu

340 345 350

Arg Thr Ile Arg Ser Glu Ala Glu Asp Ser Tyr His Phe Ser Ser Ala

355 360 365

Lys Met Thr Ala Thr Phe Leu Ser Lys Lys Gln Glu Val Asn Met Ser

370 375 380

Asp Ser Ala Leu Asp Cys Val Arg Asp Glu Ala Ile Asn Lys Leu Gln

385 390 395 400

Gln Ile Phe Asn Thr Ser Tyr Asn Gln Thr Tyr Glu Lys Tyr Gly Asn

405 410 415

Val Ser Val Phe Glu Thr Thr Gly Gly Leu Val Val Phe Trp Gln Gly

420 425 430

Ile Lys Gln Lys Ser Leu Val Glu Leu Glu Arg Leu Ala Asn Arg Ser

435 440 445

Ser Leu Asn Leu Thr His Glu Thr Lys Glu Ser Thr Asp Gly Asn Asn

450 455 460

Thr Thr His Leu Ser Asn Met Glu Ser Val His Asn Leu Val Tyr Ala

465 470 475 480

Gln Leu Gln Phe Thr Tyr Asp Thr Leu Arg Gly Tyr Ile Asn Arg Ala

485 490 495

Leu Ala Gln Ile Ala Glu Ala Trp Cys Val Asp Gln Arg Arg Thr Leu

500 505 510

Glu Val Phe Lys Glu Leu Ser Lys Ile Asn Pro Ser Ala Ile Leu Ser

515 520 525

Ala Ile Tyr Asn Lys Pro Ile Ala Ala Arg Phe Met Gly Asp Val Leu

530 535 540

Gly Leu Ala Ser Cys Val Thr Ile Asn Gln Thr Ser Val Lys Val Leu

545 550 555 560

Arg Asp Met Asn Val Lys Glu Ser Pro Gly Arg Cys Tyr Ser Arg Pro

565 570 575

Val Val Ile Phe Asn Phe Ala Asn Ser Ser Tyr Val Gln Tyr Gly Gln

580 585 590

Leu Gly Glu Asp Asn Glu Ile Leu Leu Gly Asn His Arg Thr Glu Glu

595 600 605

Cys Gln Leu Pro Ser Leu Lys Ile Phe Ile Ala Gly Asn Ser Ala Tyr

610 615 620

Glu Tyr Val Asp Tyr Leu Phe Lys Arg Met Ile Asp Leu Ser Ser Ile

625 630 635 640

Ser Thr Val Asp Ser Met Ile Ala Leu Asp Ile Asp Pro Leu Glu Asn

645 650 655

Thr Asp Phe Arg Val Leu Glu Leu Tyr Ser Gln Lys Glu Leu Arg Ser

660 665 670

Ser Asn Val Phe Asp Leu Glu Glu Ile Met Arg Glu Phe Asn Ser Tyr

675 680 685

Lys Gln Arg Val Lys Tyr Val Glu Asp Lys Gly Leu Asn Asp Ile Phe

690 695 700

Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly

705 710 715 720

Pro Gly His His His His His His His

725

<210>21

<211>9

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>21

Arg Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr

1 5

<210>22

<211>6

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>22

Gln Ser Val Gly Gly Tyr

1 5

<210>23

<211>6

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>23

Gln Ser Ile Thr Lys Tyr

1 5

<210>24

<211>8

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>24

Asn Ser Asn Ile Gly Lys Asn Tyr

1 5

<210>25

<211>3

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>25

Asp Val Ser

1

<210>26

<211>3

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>26

Asp Ala Ser

1

<210>27

<211>3

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>27

Thr Thr Ser

1

<210>28

<211>3

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>28

Asn Asn Asn

1

<210>29

<211>11

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>29

Ser Ser Tyr Thr Thr Lys Ser Thr Leu Tyr Val

1 5 10

<210>30

<211>10

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>30

Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Leu Thr

1 5 10

<210>31

<211>9

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>31

Gln Gln Ser Phe Ser Thr Leu Trp Thr

1 5

<210>32

<211>11

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>32

Ala Thr Trp Asp Lys Thr Leu Asn Phe Trp Val

1 5 10

<210>33

<211>111

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>33

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Arg Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Pro Cys Thr Gly Ser Arg Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Ile Leu Tyr Asp Val Ser His Arg Pro Ser Gly Ile Ser Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Leu Gly Asp Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Arg Asp Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Lys

85 90 95

Ser Thr Leu Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Thr Val Ser Val Leu

100 105 110

<210>34

<211>108

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>34

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Val Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210>35

<211>108

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<220>

<221>Другой признак

<222>(108)..(108)

<223>Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе

аминокислоту

<400>35

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

His Thr Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Leu

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Ser Thr Leu Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys Xaa

100 105

<210>36

<211>109

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>36

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Leu Ser Ala Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ile Gly Lys Asn

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Leu Tyr Asn Asn Asn Leu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ala Gly Asp Glu Ala Thr Tyr Ser Cys Ala Thr Trp Asp Lys Thr Leu

85 90 95

Asn Phe Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val

100 105

<210>37

<211>447

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>37

Gln Val Leu Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ala Cys Glu Thr Ser Gly Phe Thr Phe Arg His Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Leu

35 40 45

Ser Ser Ile His Gly Ser Gly Thr Thr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ile Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Ser Pro Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Asp Asp Tyr Thr Ser Gly Tyr Asn Trp Gly Gln Gly Ala Phe

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210>38

<211>217

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>38

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Arg Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Pro Cys Thr Gly Ser Arg Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Ile Leu Tyr Asp Val Ser His Arg Pro Ser Gly Ile Ser Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Leu Gly Asp Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Arg Asp Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Lys

85 90 95

Ser Thr Leu Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Thr Val Ser Val Leu Gly

100 105 110

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

115 120 125

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

130 135 140

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

145 150 155 160

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

165 170 175

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

180 185 190

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

195 200 205

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210>39

<211>455

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>39

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn His

20 25 30

Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Ser Asp Gly Thr Asp Thr Arg Asp Ala Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Asp Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Arg Cys Gly Asp Glu Arg Cys Tyr Ser Gly Leu Pro

100 105 110

Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Arg Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Thr

115 120 125

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

130 135 140

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

145 150 155 160

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

165 170 175

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

195 200 205

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu

210 215 220

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

225 230 235 240

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

245 250 255

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

260 265 270

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

275 280 285

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

305 310 315 320

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

325 330 335

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

340 345 350

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys

355 360 365

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

370 375 380

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

385 390 395 400

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

405 410 415

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

420 425 430

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

435 440 445

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455

<210>40

<211>215

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>40

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Val Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210>41

<211>448

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>41

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Ala Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Ala Ile Ile Phe Pro Arg Asp Ser Tyr Ser Ala Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu His Trp Ser Ser Leu Glu Ala Ser Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ile Tyr Asn Asp Leu Arg Ser Gly Asn Ser Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Pro Leu Ile Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210>42

<211>214

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>42

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

His Thr Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Leu

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Ser Thr Leu Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210>43

<211>458

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>43

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ala Val Ser Gly Arg Gly Thr Ser Thr Phe Tyr Leu Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Thr Val Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Val Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Ser Tyr Val Gly Gly Ser Phe Asp Trp Leu Pro Arg Pro

100 105 110

Asp Tyr Phe Asp His Trp Gly Arg Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

130 135 140

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

145 150 155 160

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

165 170 175

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

180 185 190

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

195 200 205

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

210 215 220

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

225 230 235 240

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

245 250 255

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

260 265 270

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

275 280 285

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

290 295 300

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

305 310 315 320

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

325 330 335

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

340 345 350

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

355 360 365

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

370 375 380

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

385 390 395 400

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

405 410 415

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

420 425 430

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

435 440 445

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455

<210>44

<211>216

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>44

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Leu Ser Ala Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ile Gly Lys Asn

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Leu Tyr Asn Asn Asn Leu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ala Gly Asp Glu Ala Thr Tyr Ser Cys Ala Thr Trp Asp Lys Thr Leu

85 90 95

Asn Phe Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210>45

<211>330

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетическая

<400>45

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<---

Claims

1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающиеся с гликопротеином gB цитомегаловируса человека, содержащие вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит три определяющие комплементарность области HCDR1, HCDR2 и HCDR3 и вариабельная область легкой цепи содержит три определяющие комплементарность области LCDR1, LCDR2 и LCDR3, где:

(i) вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, представленную под SEQ ID NO: 1, HCDR2, представленную под SEQ ID NO: 5, и HCDR3, представленную под SEQ ID NO: 9; и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, представленную под SEQ ID NO: 21, LCDR2, представленную под SEQ ID NO: 25, и LCDR3, представленную под SEQ ID NO: 29; или

(ii) вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, представленную под SEQ ID NO: 2, HCDR2, представленную под SEQ ID NO: 6, и HCDR3, представленную под SEQ ID NO: 10; и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, представленную под SEQ ID NO: 22, LCDR2, представленную под SEQ ID NO: 26, и LCDR3, представленную под SEQ ID NO: 30; или

(iii) вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, представленную под SEQ ID NO: 3, HCDR2, представленную под SEQ ID NO: 7, и HCDR3, представленную под SEQ ID NO: 11; и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, представленную под SEQ ID NO: 23, LCDR2, представленную под SEQ ID NO: 27, и LCDR3, представленную под SEQ ID NO: 31; или

(iv) вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, представленную под SEQ ID NO: 4, HCDR2, представленную под SEQ ID NO: 8, и HCDR3, представленную под SEQ ID NO: 12; и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, представленную под SEQ ID NO: 24, LCDR2, представленную под SEQ ID NO: 28, и LCDR3, представленную под SEQ ID NO: 32.

2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат:

(1) три HCDR вариабельной области тяжелой цепи, представленной под SEQ ID NO: 13, при этом указанные три HCDR включают HCDR1, представленную под SEQ ID NO: 1, HCDR2, представленную под SEQ ID NO: 5, и HCDR3, представленную под SEQ ID NO: 9, и три LCDR вариабельной области легкой цепи, представленной под SEQ ID NO: 33, при этом указанные три LCDR включают LCDR1, представленную под SEQ ID NO: 21, LCDR2, представленную под SEQ ID NO: 25, и LCDR3, представленную под SEQ ID NO: 29; или

(2) три HCDR вариабельной области тяжелой цепи, представленной под SEQ ID NO: 14, при этом указанные три HCDR включают HCDR1, представленную под SEQ ID NO: 2, HCDR2, представленную под SEQ ID NO: 6, и HCDR3, представленную под SEQ ID NO: 10, и три LCDR вариабельной области легкой цепи, представленной под SEQ ID NO: 34, при этом указанные три LCDR включают LCDR1, представленную под SEQ ID NO: 22, LCDR2, представленную под SEQ ID NO: 26, и LCDR3, представленную под SEQ ID NO: 30; или

(3) три HCDR вариабельной области тяжелой цепи, представленной под SEQ ID NO: 15, при этом указанные три HCDR включают HCDR1, представленную под SEQ ID NO: 3, HCDR2, представленную под SEQ ID NO: 7, и HCDR3, представленную под SEQ ID NO: 11, и три LCDR вариабельной области легкой цепи, представленной под SEQ ID NO: 35, при этом указанные три LCDR включают LCDR1, представленную под SEQ ID NO: 23, LCDR2, представленную под SEQ ID NO: 27, и LCDR3, представленную под SEQ ID NO: 31; или

(4) три HCDR вариабельной области тяжелой цепи, представленной под SEQ ID NO: 16, при этом указанные три HCDR включают HCDR1, представленную под SEQ ID NO: 4, HCDR2, представленную под SEQ ID NO: 8, и HCDR3, представленную под SEQ ID NO: 12, и три LCDR вариабельной области легкой цепи, представленной под SEQ ID NO: 36, при этом указанные три LCDR включают LCDR1, представленную под SEQ ID NO: 24, LCDR2, представленную под SEQ ID NO: 28, и LCDR3, представленную под SEQ ID NO: 32.

3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающиеся с гликопротеином gB цитомегаловируса человека, содержащие тяжелую цепь и легкую цепь, где:

(i) тяжелая цепь состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 37 и легкая цепь состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 38;

(ii) тяжелая цепь состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 39 и легкая цепь состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 40;

(iii) тяжелая цепь состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 41 и легкая цепь состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 42;

(iv) тяжелая цепь состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 43 и легкая цепь состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 44.

4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-3, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с эпитопом в домене слияния гликопротеина gB, содержащем один или более аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из N208, L213 и Y226 домена слияния гликопротеина gB.

5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-4, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат:

(i) вариабельную область тяжелой цепи, представленную под SEQ ID NO: 13, и вариабельную область легкой цепи, представленную под SEQ ID NO: 33;

(ii) вариабельную область тяжелой цепи, представленную под SEQ ID NO: 14, и вариабельную область легкой цепи, представленную под SEQ ID NO: 34;

(iii) вариабельную область тяжелой цепи, представленную под SEQ ID NO: 15, и вариабельную область легкой цепи, представленную под SEQ ID NO: 35;

(iv) вариабельную область тяжелой цепи, представленную под SEQ ID NO: 16, и вариабельную область легкой цепи, представленную под SEQ ID NO: 36.

6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-5, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с гликопротеином gB цитомегаловируса человека с K_D, составляющей приблизительно 50 нM или меньше.

7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-6, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способны связываться с доменом слияния гликопротеина gB цитомегаловируса человека.

8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-7, где по меньшей мере часть каркасных последовательностей представляет собой консенсусные каркасные последовательности человека.

9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-8, где антитело представляет собой моноклональное антитело человека.

10. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-9, где антигенсвязывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, одноцепочечного антитела или F(ab')₂, однодоменного антитела, диатела или линейного антитела.

11. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-10, где антитело представляет собой IgG-подобное антитело, при этом антитело представлено в форме IgG1, или антитело представлено в форме IgG2, или антитело представлено в форме IgG3, или антитело представлено в форме IgG4.

12. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-11.

13. Вектор экспрессии, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту по п. 12.

14. Клетка-хозяин для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-11, содержащая вектор по п. 13, где клетка-хозяин представляет собой эукариотическую или прокариотическую клетку.

15. Клетка-хозяин по п. 14, где клетка-хозяин выбрана из клетки E. coli, дрожжевой клетки, клетки млекопитающего или клетки растения.

16. Клетка-хозяин по п. 14, где клетка-хозяин представляет собой клетку CHO или клетку 293.

17. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-11, при этом способ включает:

культивирование клетки-хозяина, содержащей выделенную нуклеиновую кислоту по п. 12 или вектор экспрессии по п. 13; и

извлечение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из клетки-хозяина или культуральной среды.

18. Иммуноконъюгат для предупреждения или лечения HCMV-инфекции или связанного с HCMV заболевания у субъекта-человека, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-11 и метку.

19. Фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения HCMV-инфекции или связанного с HCMV заболевания у субъекта-человека, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-11 или иммуноконъюгат по п. 18 и один или более фармацевтически приемлемых вспомогательных материалов.

20. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-11 или иммуноконъюгата по п. 18 в получении фармацевтической композиции для выявления HCMV-инфекции или связанного с HCMV заболевания.

21. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-11 или иммуноконъюгата по п. 18 в получении фармацевтической композиции для лечения или предотвращения HCMV-инфекции или связанного с HCMV заболевания.

22. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-11 или иммуноконъюгата по п. 18 в получении набора для выявления HCMV-инфекции или связанного с HCMV заболевания.

23. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-11 или иммуноконъюгата по п. 18 в получении набора для лечения или предотвращения HCMV-инфекции или связанного с HCMV заболевания.

24. Способ предупреждения или лечения HCMV-инфекции или связанного с HCMV заболевания у субъекта-человека, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-11, или иммуноконъюгата по п. 18, или фармацевтической композиции по п. 19.

25. Способ нейтрализации HCMV у индивидуума, включающий приведение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-11 в контакт с индивидуумом и тестирование способности антитела или его антигенсвязывающего фрагмента связываться с HCMV с обеспечением его нейтрализации.

26. Способ нейтрализации HCMV в образце, включающий приведение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-11 в контакт с образцом и тестирование способности антитела или его антигенсвязывающего фрагмента связываться с HCMV с обеспечением его нейтрализации.