RU2814394C1 - Способ разрушения асцитных клеток опухоли с помощью магнитных нанодисков и аптамеров в условиях переменного электромагнитного поля - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для разрушения асцитных клеток опухоли с помощью магнитных нанодисков и аптамеров в условиях переменного электромагнитного поля. Разрушение асцитных опухолевых клеток осуществляют с помощью дистанционно управляемых магнитных трехслойных нанодисков, имеющих квазидипольную магнитную структуру, состоящую из золотой оболочки и ядра из никеля. Нанодиски функционализированы специфическими для асцитных клеток опухоли ДНК-аптамерами, отраженными как SEQ ID NO 1. Разрушение асцитных опухолевых клеток осуществляют в условиях переменного электромагнитного поля с формой сигнала «синус» с напряженностью 200 Э, частотой 20 Гц или формой сигнала «меандр» с напряженностью 200 Э, частотой 10 Гц и скважностью 0,5. При этом нанодиски вводят непосредственно в опухоль или внутривенно. Способ обеспечивает повышение специфичности, снижение токсичности и увеличение эффективности магнитных нанодисков для разрушения опухолевых клеток за счет использования функционализированных специфических для асцитных клеток опухоли ДНК-аптамеров. 7 ил., 4 пр.

Description

Изобретение относится к области лечения асцитных опухолей.

Злокачественные новообразования до настоящего времени остаются одной из лидирующих причин смертности трудоспособного населения и важной проблемой общественного здравоохранения [Ferlay J./ Cancer incidence and mortality patterns in Europe: Estimates for 40 countries and 25 major cancers/ M. Colombet, I. Soerjomataram, T. Dyba, G. Randi, M. Bettio, A. Gavin, O. Visser, F. Bray – Eur. J. Cancer –V. 103. – P.356-387. – 2018]. Ведущими методами локальной терапии злокачественных новообразований остаются хирургия и лучевая терапия, основным недостатком которых является, прежде всего, их высокая инвазивность. Как хирургическое вмешательство, так и радиотерапия повреждают окружающие опухоль здоровые ткани. Другим недостатком этих методов является невозможность радикального удаления всех опухолевых клеток, поскольку микрометастазы, макроскопически незаметные для хирурга, впоследствии могут стать очагом формирования рецидивной опухоли.

Злокачественный асцит – это патологическое накопление жидкости в брюшной или плевральной полости, развивающееся вследствие опухолевого поражения легких, молочной железы, яичников, желудка, поджелудочной железы и толстой кишки [RU 2464974C1, 27.10.2012; RU2595864C1, 18.08.2015]. Он служит переносчиком опухолевых клеток из первичной локализации в стенку брюшины или на поверхность ее органов и содержит клеточные компоненты с опухолевыми и неопухолевыми клетками, и бесклеточными компонентами, которые создают уникальную микросреду, способную модифицировать поведение опухоли. Эти факторы микроокружения влияют на пролиферацию опухолевых клеток, прогрессирование, химиорезистентность и уклонение от иммунитета. Опухолевые клетки индуцируют комплексную иммуносупрессию, нейтрализующую противоопухолевый иммунитет, что приводит к прогрессированию заболевания и неэффективности лечения, провоцируя опухолестимулирующую среду [Almeida-Nunes D./ Immune Tumor Microenvironment in Ovarian Cancer Ascites/ Mendes-Frias A., Silvestre R., Dinis-Oliveira R., Ricardo S. – Int. J. Mol. Sci. – V. 23. – T.18. – P. 10692. – 2022].

После постановки диагноза лечение пациентов является паллиативным, а его выбор должен учитывать потенциальные риски, преимущества и ожидаемую продолжительность жизни пациента [Sangisetty S. / Malignant ascites: A review of prognostic factors, pathophysiology and therapeutic measures. / Miner T. – Journal List World J Gastrointest Surgv. – V. 4 – T. 4. – 2012]. На настоящее время в клинической практике наиболее распространенными методами лечения остаются парацентез, перитонеовенозное шунтирование, прием диуретиков, хирургическое уменьшение объема опухоли и внутрибрюшинная химиотерапия [Sangisetty S. / Malignant ascites: A review of prognostic factors, pathophysiology and therapeutic measures. / Miner T. – Journal List World J Gastrointest Surgv. – V. 4 – T. 4. – 2012].

В последние годы для разрушения злокачественных опухолей разрабатываются нестандартные наномедицинские инструменты и технологии их применения, включающие в себя физические методы разрушения опухолей [Naud C. / Cancer treatment by magneto-mechanical effect of particles, a review. / Thebault C., Carriere M., Hou Y., Morel R., Berger F., Dienyaand B., Joisten H. – Nanoscale Advances. – V. 26 – P.3632. – 2020; Zamay T. / Magnetic Nanoparticles in Theranostics. / Zamay S., Kolovskaya O., Kichkailo A. – In: Torchilin V, ed. Handbook of Materials for Nanomedicine: Metal-Based and Other Nanomaterials. – Jenny Stanford of Publishing Ptc. Ltd. – V. 201. – P. 2444-2446. – 2020]. Для этих целей используют наночастицы, обладающие уникальными свойствами магнитных материалов, позволяющими дистанционно управлять их движением, колебаниями, вращением, поглощением и энергетическим излучением в электромагнитных полях определенной частоты, напряжения и пространственной конфигурации. Сочетание нанотехнологий позволяет получить магнитные нанодиски, которые способны адресно удалять одиночные опухолевые клетки. Такой инструмент должен включать в себя, как минимум, два компонента. Первый компонент должен обладать способностью под влиянием внешних сил повреждать опухолевую клетку, индуцируя процессы ее гибели. Второй компонент должен выполнять функцию распознающего элемента и взаимодействовать с белковой мишенью, осуществляя, таким образом, контакт магнитных нанодисков с опухолевой клеткой.

Одним из наиболее перспективных компонентов микрохирургии являются суперпарамагнитные наночастицы [Naud C. / Cancer treatment by magneto-mechanical effect of particles, a review. / Thebault C., Carriere M., Hou Y., Morel R., Berger F., Dienyaand B., Joisten H. – Nanoscale Advances. – V. 26 – P.3632. – 2020], проявляющие магнитные свойства только при наложении магнитного поля. Без магнитного поля магнитный момент таких наночастиц равен нулю. Однако, несмотря на широкое использование суперпарамагнитных наночастиц, их эффективность в осуществлении деструкции опухолевых клеток достигла своего предела [Andrés Vergés M, Costo R, Roca AG, Marco JP, Goya GF, Serna CJ, Morales MP (2008) Uniform and water stable magnetite nanoparticles with diameters around the monodomain–multidomain limit. J Phys D Appl Phys 41:134003 [39] Lu H M, Zheng W T and Jiang Q 2007 J Phys. D: Appl. Phys. 40 320]. Это связано, прежде всего, с тем, что величина магнитного отклика суперпарамагнитных наночастиц, требуемая для биомедицинских применений, ограничена их размерами, так как выше суперпарамагнитного предела наночастицы агрегируют [B. D. Cullity, Introduction to Magnetic Materials (Addison-Wesley, Reading, 1972), p. 360]. Эффективность магнитных нанодисков возрастает с увеличением магнитного момента наночастицы, однако рост магнитного момента способствует их агрегации. Кроме того, химический синтез суперпарамагнитных частиц остается очень трудным для массового производства из-за относительно низкого выхода и плохой воспроизводимости качества наночастиц [E. An-Hui Lu, L. Salabas, and F. Sch€uth, Angew. Chem. Int. Ed. 46, 1222 (2007)]. 

Поиск новых концепций показал, что наиболее перспективными магнитными структурами для магнитомеханической деструкции опухолевых клеток являются магнитные нанодиски, представляющие собой новое поколение частиц. Магнитные нанодиски характеризуются высокой намагниченностью насыщения и отсутствием остаточной намагниченности, что облегчает дистанционное манипулирование ими с помощью магнитного поля, позволяет избежать проблемы агломерации нанодисков и делает их, таким образом, идеальными магнитомеханическими приводами для разрушения опухолевых клеток [Zugazagoitia, J., Guedes, C., Ponce, S., Ferrer, I., Molina-Pinelo, S., and Paz-Ares, L. (2016). Current challenges in cancer treatment. Clin. Ther. 38, 1551–1566. doi: 10.1016/j.clinthera.2016.03.026].

К настоящему времени уже известны способы разрушения опухоли с помощью магнитных наночастиц и нанодисков.

Так, например, известен способ разрушения опухоли с помощью наночастиц, к которым присоединены терапевтически активные вещества, высвобождение которых вызывается, инициируется или усиливается под воздействием переменного магнитного поля [RU 2490027, МПК A61K47/48, B82B1/00, опубл. 20.08.2013]. Высвобождение вызывается тем фактом, что термически лабильный линкер между терапевтически активным веществом и наночастицами расщепляется термически и/или тем, что используемый линкер лабилен по отношению к переменному магнитному полю. Терапевтически активное вещество связано с наночастицами посредством ковалентных, ионных или водородных связей, комплексообразования, внедрения или липофильных взаимодействий через линкер, который может расщепляться вследствие термической инициации или инициации электромагнитным или соответственно магнитным полем. В качестве линкеров могут выступать нуклеиновые кислоты или полипептиды.

Известные наночастицы не предполагают адресной доставки к патологическим очагам ткани, в результате чего может наблюдаться также их накопление в здоровых органах и тканях, что приведет к повышению токсического эффекта препарата.

Известен способ разрушения раковых клеток с помощью магнитных наночастиц, которые модифицируются нужными веществами, например, липосомами, полимерами, антителами, нуклеотидами и другими молекулами, способствующими специфическому связыванию с мишенями (US20070166232, 08.07.2016, A61K49/10). Для разрушения раковых клеток после введения магнитных наночастиц в опухоль производится нагрев частиц под воздействием высокочастотного внешнего магнитного поля, в результате чего клетки разрушаются.

Вследствие того, что повышение температуры при введении наночастиц не контролируемо, вместе с опухолевыми клетками могут подвергаться разрушению и здоровые клетки и ткани.

Известен способ разрушения опухолевых клеток с помощью наночастиц с ядром из оксида железа в оболочке из декстрана, функционализированных аптамерами к рецептору эпидермального фактора роста HER2 [Katarzuna Pala/Tumor-specific hyperthermia with aptamer-tagged superparamagnetic nanoparticles/ Anna Serwotka, Filip Jelen, Piotr Jakimowicz, Jacek Otlewski/ International Journal of Nanomedicine. -V.9. -P.67-76. -18.12.2013]. Разрушение опухолевых клеток, связавшихся с данными наночастицами с помощью аптамеров, происходит под воздействием на комплексы высокочастотного электромагнитного поля с частотой 280 Гц.

Недостатком способа является воздействие на опухолевые клетки, только при возбуждении высокочастотным электромагнитным полем, при котором происходит гипертермия, а именно нагрев опухолевых клеток и как следствие – их гибель. При этом, при повышении температуры, которое является неконтролируемым возможна гибель и здоровых клеток, и ткани.

В качестве наиболее близкого аналога к заявляемому изобретению выбран способ разрушения опухолевых клеток с помощью микродисков, модифицированных антителами, применяемыми для деструкции опухолевых клеток с помощью магнитного поля [Dong-Hyun Kim/ Biofunctionalized magnetic-vortex microdiscs for targeted cancer-cell destruction/ Elena A. Rozhkova, Ilya Ulasov, Samuel D. Bader,Tijana Rajh, Maciej S. Lesniak, Valentyn Novosad. – Nature materials.- V.9.- P.165-171.- 2010]. Данные магнитно-вихревые микродиски, получены методом магнетронного распыления и оптической литографии. Магнитно-вихревые микродиски имеют диаметр 1 микрометр, состоят из сплава железа и никеля в соотношении 20:80%, имеют толщину 60 нанометров и покрыты золотым слоем толщиной 5 нанометров. Применяют микродиски, модифицированные антителами к IL132R, белкам, экспрессирующимся клетками глиобластомы человека, для разрушения культуры клеток глиобластомы N10. Гибель опухолевых клеток происходит в результате процессов апоптоза, который запускается, в результате возбуждения вращающимся магнитным полем, величиной 90Э, дисков, связавшиеся с клетками культуры глиобластомы [Dong-Hyun Kim/ Biofunctionalized magnetic-vortex microdiscs for targeted cancer-cell destruction/ Elena A. Rozhkova, Ilya Ulasov, Samuel D. Bader,Tijana Rajh, Maciej S. Lesniak, Valentyn Novosad. – Nature materials.- V.9.- P.165-171.- 2010].

Описанные микродиски модифицированы антителами. Однако известно, что антитела являются иммуногенными и обладают низкой стабильностью. Поэтому при введении их в организм, они в короткие сроки могут быть уничтожены иммунной системой, и, таким образом, их воздействие на опухолевые клетки будет незначительным.

Техническим результатом настоящего изобретения является повышение специфичности, снижение токсичности и увеличения эффективности магнитных нанодисков для разрушения опухолевых клеток.

Технический результат достигается тем, что в способе разрушения асцитных клеток опухоли с помощью магнитных нанодисков и аптамеров в условиях переменного электромагнитного поля, новым является то, что разрушение асцитных опухолевых клеток осуществляют с помощью дистанционно управляемых магнитных трехслойных нанодисков, имеющих квазидипольную магнитную структуру, состоящую из золотой оболочки и ядра из никеля, функционализированных специфическими для асцитных клеток опухоли ДНК-аптамерами, отраженными как SEQ ID NO 1, в условиях переменного электромагнитного поля с формой сигнала «синус» с напряженностью 200 Э, частотой 20 Гц или формой сигнала «меандр» с напряженностью 200 Э, частотой 10 Гц и скважностью 0,5.

Поставленная задача решается тем, что в заявляемом способе предлагается разрушение асцитных опухолевых клеток с помощью направленных на опухоль дистанционно управляемых магнитных трехслойных нанодисков с квазидипольной структурой (Au/Ni/Au), функционализированных специфическими для опухолевых клеток ДНК-аптамерами. Магнитные нанодиски способны в биобезопасном переменном магнитном поле трансформировать магнитный момент в механический, находить и адресно удалять опухолевые клетки, не повреждая при этом здоровые клетки.

Нанодиски имеют радиус 500 нм, толщину 50 нм, золотую оболочку и ядро из никеля. Они обладают магнитной анизотропией и являются высокочувствительными к магнитным раздражителям, поскольку, обладая нулевой суммарной намагниченностью в отсутствие поля, в условиях слабых внешних магнитных полей приобретают высокую намагниченность.

Адресность магнитных нанодисков достигается путем их функционализации биораспознающими молекулами, в качестве которых используются ДНК-аптамеры, представляющие собой фрагменты однонитевой ДНК, образующие трехмерные структуры при взаимодействии комплементарных участков цепи, связывающиеся, благодаря уникальной конформации, со специфическими мишенями. В качестве таких биораспознающих молекул могут использоваться ДНК-аптамеры, специфичные к асцитным клеткам карциномы Эрлиха, представляющие собой нуклеотидную последовательность: сtcctctgac tgtaaccacg tcaatgggtg atatatgcag gttacgctgg ctagttgaaa gcataggtag tccagaagcc , отраженные как SEQ ID NO 1.

Стабилизацию нанодисков проводят с помощью тиолированного зонда: очищенного с помощью жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) олигонуклеотида 50-CGT GGT TAC AGT CAG AGG AGA A-/ThioMC6-D/-30, модифицированного на 3’ конце 6-гидроксигексилдисульфидной группой в бидистиллированной воде 24 часа при 4°C на шейкере (конечная концентрация 500 нМ). Этот тиолированный зонд дополняют 5’-концом аптамеров, отраженных как SEQ ID NO 1. Смесь разбавляют в 2 раза, смешивая ее с двукратным фосфатным буфером, содержащим Ca²⁺ и Mg²⁺ а затем с эквимолярным количеством аптамера. Перед использованием аптамер нагревают при 95°C 10 минут и охлаждают на льду 10 минут.

В способе разрушения опухолевых клеток нанодиски, связанные с аптамерами, специфичными к асцитным клеткам опухоли, находящиеся в стерильном растворе фосфатного буфера, содержащего Ca²⁺ и Mg²⁺, вводят непосредственно в опухоль или внутривенно, после чего по истечении определенного времени подвергают организм воздействию переменного электромагнитного поля.

Для разрушения опухолевых клеток может быть использовано переменное низкочастотное электромагнитное поле с формой сигнала «меандр» или переменное электромагнитное поле с формой сигнала «синус». Эффективность деструкции опухолевых клеток с помощью функционализированных ДНК-аптамерами магнитных дисков зависит от трансформации магнитного момента диска в механический момент. Именно этот процесс при связывании диска с опухолевой клеткой и осуществляет деструкцию клеточной мембраны или запуск внутриклеточного сигнального пути гибели клетки. Механический момент должен быть достаточен для запуска процесса.

Способ иллюстрируется следующими рисунками.

на фиг. 1 приведена фотография установки для магнитомеханической хирургии с помощью магнитных нанодисков, функционализированных аптамерами к опухолевым клеткам, на основе электромагнитной катушки.

на фиг. 2. приведены фотографии нанодисков, полученных с помощью сканирующей электронной микроскопии (а), и трансмиссионная электронная микроскопия поперечного сечения диска на кремниевой подложке (b, c).

на фиг. 3 приведены графики оценки эффективности магнитных нанодисков осуществлять деструкцию асцитной опухоли у мышей in vivo при использовании переменного магнитного поля синусовой формы с частотой 20 Гц; (а) – объем асцитной опухоли (мл); (b) – количество асцитных клеток в одном мл асцитной жидкости; (c) – общее количество асцитных клеток.

на фиг. 4 приведены графики оценки эффективности магнитных нанодисков осуществлять деструкцию асцитной опухоли у мышей in vivo при использовании переменного магнитного поля прямоугольной формы с частотой 10 Гц и скважностью 0,5; (а) – объем асцитной опухоли (мл); (b) – количество асцитных клеток в 1 мл асцитной жидкости; (c) – общее количество асцитных клеток.

на фиг. 5 приведены графики общего количества клеток в асцитной карциноме через 2 часа после магнитомеханического воздействия магнитными нанодисками в условиях переменного магнитного поля прямоугольной формы при частоте 10 Гц, скважности 0,5 и напряженности поля 200 Э in vivo.

на фиг. 6. приведены графики подбора параметров переменного магнитного поля для наиболее эффективной деструкции асцитных клеток карциномы Эрлиха в условиях in vitro с помощью функционализированных ДНК-аптамерами магнитных нанодисков; (а) – влияние частоты переменного магнитного поля синусовой формы на деструкцию асцитных клеток карциномы Эрлиха; (b) – влияние частоты магнитного поля прямоугольной формы при скважности 0,5 на деструкцию асцитных клеток карциномы Эрлиха; (c) – влияние скважности магнитного поля прямоугольной формы при частоте 10 Гц на деструкцию асцитных клеток карциномы Эрлиха.

на фиг. 7 приведена микроскопия клеток асцитной карциномы Эрлиха, взятых у мышей после лечения магнитными нанодисками в переменном низкочастотном электромагнитном поле с формой сигнала «меандр» при частоте 10 Гц, коэффициенте заполнения 0,5 и напряженности поля 200 Э in vivo через 2 часа и через 24 часа после воздействия магнитного поля (образцы получены от разных животных); (а) 2 часа после воздействия переменного электромагнитного поля, 7 дней после перевивки опухоли; (b) 24 часа после воздействия переменного электромагнитного поля, 8 дней после перевивки опухоли. Увеличение х20.

Способ разрушения опухолевых клеток с помощью магнитных микродисков и аптамеров в условиях переменного электромагнитного поля осуществляют следующим образом.

Для осуществления способа используют следующие расходные материалы, реактивы и приборы:

1. Фосфатный буфер, содержащий Ca²⁺ и Mg²⁺

2. Аптамеры, специфичные к асцитным клеткам

3. Магнитные нанодиски

4. Установка, генерирующая однородное переменное электромагнитное поле с напряженностью от 1 до 200 Э, формой импульсов синус или меандр, частотой от 0 до 100 Гц, скважность поля для импульсов прямоугольной формы (меандр) – от 0 до 1.

Для генерации переменного магнитного поля используют установку на основе электромагнитной катушки и блока управления, представленную на фиг. 1. Установка обеспечивает однородное переменное электромагнитное поле с напряженностью от 1 до 200 Э, с формой импульсов синус или меандр, частотой от 0 до 100 Гц, скважность поля для импульсов прямоугольной формы (меандр) – от 0 до 1. Внутренний рабочий диаметр катушки должен быть достаточного диаметра для того, чтобы вместить организм или часть тела, подвергающуюся воздействию поля. Трехслойные магнитные квазидипольные нанодиски, использующиеся для лечения представлены на фиг. 2.

Пациентам вводят внутривенно или непосредственно внутрь опухоли магнитные нанодиски, модифицированные аптамерами в фосфатном буфере, содержащем Ca²⁺ и Mg²⁺. Объем вводимого препарата и концентрацию нанодисков и аптамеров рассчитывают, исходя из размера опухоли и размера организма. Через 30 минут после инъекции организм подвергают воздействию переменного электромагнитного поля с напряженностью 200 Э, частотой 10 Гц и скважностью 0,5. Воздействие осуществляется в течение 10 минут. Или переменное электромагнитное поле с формой сигнала «синус» с напряженностью 200 Э, частотой 20 Гц. Воздействие осуществляется в течение 10 минут.

Оценку эффективности лечения проводят через 24 часа.

Способ разрушения опухолевых клеток с помощью магнитных нанодисков и аптамеров в условиях переменного электромагнитного поля иллюстрируется примерами.

Пример 1.

Для осуществления примера использовали модель асцитной опухоли in vivo. Для этого 6-недельным самцам мышей ICR весом 25 г было трансплантировано по 3 млн. асцитных клеток. Эффективность магнитомеханической терапии с помощью магнитных нанодисков оценивалась на 7-ые сутки после трансплантации опухоли.

Эффективность разрушения опухоли с помощью магнитных нанодисков исследовали in vivo на асцитной карциноме Эрлиха. Для разрушения отдельных опухолевых клеток использовали переменное электромагнитное поле синусовой и прямоугольной форм с наиболее оптимальными параметрами магнитного поля. Эффективность деструкции опухоли оценивали по общему объему асцитной опухоли, плотности и количеству асцитных клеток в опухоли через 24 часа после магнитомеханического воздействия на опухоль с помощью магнитных нанодисков. Для подтверждения специфичности магнитных нанодисков в качестве контрольной группы использовали животных, которым осуществляли магнитомеханическое воздействие магнитными дисками, функционализированными неспецифическим к асцитным клеткам аптамером. Результаты исследований показали, что при воздействии переменного электромагнитного поля синусовой формы объем асцитной карциномы Эрлиха у контрольных мышей без лечения и мышей, которых лечили дисками с неспецифическими аптамерами был практически одинаковым и составлял около 1,5 мл. При магнитомеханическом воздействии дисками с аптамерами, заявленными как SEQ ID NO1 объем опухоли имел тенденцию к снижению (фиг. 3). Плотность асцитных клеток в опухоли была почти в 1,5 раза ниже, в результате чего общее количество асцитных клеток в асцитной карциноме Эрлиха оказалось меньше после магнитомеханического воздействия магнитными нанодисками более чем в 1,5 раза.

Пример 2.

Для осуществления примера использовали модель асцитной опухоли in vivo. Для этого 6-недельным самцам мышей ICR весом 25 г было трансплантировано по 3 млн. асцитных клеток. Эффективность магнитомеханической терапии с помощью магнитных нанодисков оценивалась на 7-ые сутки после трансплантации опухоли.

Результаты исследования показали, что объем опухоли у животных через 24 часа после магнитомеханической терапии был достоверно ниже, чем в контрольных группах почти на порядок и составил около 0,3 мл (фиг. 4). При этом плотность клеток была примерно одинаковой в опухолях всех групп мышей. Таким образом, общее количество асцитных клеток в опухоли снижалось по сравнению с контролем в 3 раза. Практическая неизменность плотности асцитных клеток в асцитной карциноме Эрлиха при значительном снижении объема опухоли и количества опухолевых клеток, является косвенным свидетельством того, что эти параметры магнитного поля стимулируют апоптотический путь гибели клетки. Апоптоз в качестве механизма деструкции опухолевых клеток является более предпочтительным для организма, поскольку не вызывает воспалительного процесса, как это обычно происходит при некротической гибели опухолевых клеток

Пример 3.

Для осуществления примера использовали модель асцитной опухоли in vivo. Эффективность магнитомеханической терапии с помощью магнитных нанодисков оценивалась на 7-е сутки после трансплантации опухоли.

Для изучения изменений с клетками в асцитной опухоли, проходящих непосредственно после воздействия магнитомеханической терапии, была выполнена третья серия экспериментов, где определение общего количества клеток в опухоли и их морфология исследовались через 2 часа после терапии. Результаты исследования показали, что количество клеток в опухоли снизилось почти в 2 раза (фиг. 5) Тенденция к снижению наблюдалась и при магнитомеханическом воздействии дисками, функционализированными неспецифическими аптамерами.

Пример 4.

Для осуществления примера использовали клетки, полученные из мышей-опухоленосителей (6-недельных самцов мышей ICR весом 25 г, которым было трансплантировано по 3 млн. асцитных клеток) на седьмой день после трансплантации опухоли.

Для поиска наиболее оптимальных условий для деструкции опухолевых клеток определяли параметры электромагнитного поля, при которых наиболее эффективно осуществлялась гибель клеток с помощью магнитных дисков под действием магнитного поля. На первом этапе исследования осуществляли на клеточных культурах асцитной карциномы Эрлиха.

Вначале было исследовано переменное электромагнитное поле с синусовой формой. Переменной величиной стала частота, которую изменяли в пределах от 5 до 50 Гц (фиг. 6).

Оценка эффективности деструкции клеток в условиях изменения частоты магнитного поля показала, что при частоте 5, 10 и 50 Гц разрушение асцитных клеток происходит приблизительно одинаково. Доля мертвых клеток в клеточной культуре выросла в 4-5 раз после магнитомеханического воздействия. При частоте 20 Гц доля мертвых клеток была самой высокой – в 7 раз выше по сравнению с контролем.

Исследование влияния скважности прямоугольного магнитного поля на деструкцию асцитных клеток осуществляли в пределах изменения этого параметра от 0,1 до 0,5 (фиг. 6). На первом этапе, так же, как и в случае с синусовым полем, изучали влияние частоты магнитного поля на деструкцию асцитных клеток карциномы Эрлиха. Как видно из рисунка, из всех частот резко выделяется частота 10 Гц. Доля мертвых клеток в образце асцитных клеток после воздействия магнитного поля этой частоты возросла более чем в 11 раз, в то время как поле с частотой 5 Гц и 20 Гц увеличило долю мертвых клеток примерно в 6-8 раз. Наименее эффективным оказалось переменное электромагнитное поле с частотой 50 Гц.

При скважности прямоугольного магнитного поля равной 0,5 все асцитные клетки погибали, смертность опухолевых клеток достигала 100%.

Морфология клеток асцитной карциномы Эрлиха у животных, которым вводились магнитные нанодиски, функционализированные аптамером, отраженным как SEQ ID NO 1, значительно отличалась от морфологии клеток асцита у контрольных животных, которым не вводились магнитные нанодиски, и от морфологии клеток, которым вводились магнитные нанодиски, функционализированные неспецифическим аптамером (фиг. 7). В асцитической жидкости мышей, которым вводились магнитные нанодиски, функционализированные аптамером, отраженным как SEQ ID NO 1, присутствовало большое количество клеток в состоянии апоптоза и некроза. Кроме того, наблюдалось большое количество разрушенных клеток и отдельных ядер. Данный эффект наблюдался у мышей через 7 дней после перевивки опухоли и 2 часа после воздействия переменного электромагнитного поля и через 8 дней после перевивки опухоли и 24 часа после воздействия переменного электромагнитного поля.

Claims (1)

1. Способ разрушения асцитных клеток опухоли с помощью магнитных нанодисков и аптамеров в условиях переменного электромагнитного поля, отличающийся тем, что разрушение асцитных опухолевых клеток осуществляют с помощью дистанционно управляемых магнитных трехслойных нанодисков, имеющих квазидипольную магнитную структуру, состоящую из золотой оболочки и ядра из никеля, функционализированных специфическими для асцитных клеток опухоли ДНК-аптамерами, отраженными как SEQ ID NO 1, в условиях переменного электромагнитного поля с формой сигнала «синус» с напряженностью 200 Э, частотой 20 Гц или формой сигнала «меандр» с напряженностью 200 Э, частотой 10 Гц и скважностью 0,5, при этом нанодиски вводят непосредственно в опухоль или внутривенно.