RU2811690C1 - Test system for quantitative diagnostics of human mrna of mxa, oas1, eif2ak2 genes based on pcr - Google Patents
Test system for quantitative diagnostics of human mrna of mxa, oas1, eif2ak2 genes based on pcr Download PDFInfo
- Publication number
- RU2811690C1 RU2811690C1 RU2022135032A RU2022135032A RU2811690C1 RU 2811690 C1 RU2811690 C1 RU 2811690C1 RU 2022135032 A RU2022135032 A RU 2022135032A RU 2022135032 A RU2022135032 A RU 2022135032A RU 2811690 C1 RU2811690 C1 RU 2811690C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gene
- insdseq
- insdqualifier
- mxa
- eif2ak2
- Prior art date
Links
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 title claims description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 33
- 101000926535 Homo sapiens Interferon-induced, double-stranded RNA-activated protein kinase Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims abstract description 39
- 101001128393 Homo sapiens Interferon-induced GTP-binding protein Mx1 Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 101001008907 Homo sapiens 2'-5'-oligoadenylate synthase 1 Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 102100027769 2'-5'-oligoadenylate synthase 1 Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 12
- 101150113359 OAS1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims abstract description 3
- 102100031802 Interferon-induced GTP-binding protein Mx1 Human genes 0.000 claims description 26
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 14
- 101150009493 mxa gene Proteins 0.000 claims description 10
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 claims description 9
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 5
- 102100034170 Interferon-induced, double-stranded RNA-activated protein kinase Human genes 0.000 abstract description 22
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 abstract description 6
- 102000048122 human MX1 Human genes 0.000 abstract description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 abstract description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 102000047077 human OAS1 Human genes 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 241000582786 Monoplex Species 0.000 description 13
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 8
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 6
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 5
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 5
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 5
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 5
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 4
- 102100023727 Mitochondrial antiviral-signaling protein Human genes 0.000 description 4
- 101710142315 Mitochondrial antiviral-signaling protein Proteins 0.000 description 4
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 4
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 4
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 3
- 101710089751 Interferon-induced, double-stranded RNA-activated protein kinase Proteins 0.000 description 3
- 108010065637 Interleukin-23 Proteins 0.000 description 3
- 102000013264 Interleukin-23 Human genes 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 3
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 3
- 229940124829 interleukin-23 Drugs 0.000 description 3
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 3
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 3
- 102100037435 Antiviral innate immune response receptor RIG-I Human genes 0.000 description 2
- 101710127675 Antiviral innate immune response receptor RIG-I Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 2
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 2
- 102000013446 GTP Phosphohydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108091006109 GTPases Proteins 0.000 description 2
- 101710085061 Orsellinic acid synthase Proteins 0.000 description 2
- 101710110277 Orsellinic acid synthase armB Proteins 0.000 description 2
- 206010062106 Respiratory tract infection viral Diseases 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- SIIZPVYVXNXXQG-KGXOGWRBSA-N [(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-[[(3s,4r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-3-hydroxyoxolan-2-yl]methyl [(2r,4r,5r)-2-(6-aminopurin-9-yl)-4-hydroxy-5-(phosphonooxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OC2[C@@H](O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@H]2O)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)[C@@H](O)[C@H]1OP(O)(=O)OCC([C@@H](O)[C@H]1O)OC1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 SIIZPVYVXNXXQG-KGXOGWRBSA-N 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000005860 defense response to virus Effects 0.000 description 2
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 102000007863 pattern recognition receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010089193 pattern recognition receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 102100027962 2-5A-dependent ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010000834 2-5A-dependent ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 108700021236 Antiviral Restriction Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000054566 Antiviral Restriction Factors Human genes 0.000 description 1
- 101100026251 Caenorhabditis elegans atf-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 101100072149 Drosophila melanogaster eIF2alpha gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101710196290 Eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical group C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001011382 Homo sapiens Interferon regulatory factor 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000999373 Homo sapiens Interferon-related developmental regulator 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001050288 Homo sapiens Transcription factor Jun Proteins 0.000 description 1
- 101001057508 Homo sapiens Ubiquitin-like protein ISG15 Proteins 0.000 description 1
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 1
- 101710090028 Inositol-3-phosphate synthase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010014726 Interferon Type I Proteins 0.000 description 1
- 102000002227 Interferon Type I Human genes 0.000 description 1
- 102100036480 Interferon-related developmental regulator 2 Human genes 0.000 description 1
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004163 JAK-STAT signaling pathway Effects 0.000 description 1
- 238000012313 Kruskal-Wallis test Methods 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000006404 Mitochondrial Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010058682 Mitochondrial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 201000002481 Myositis Diseases 0.000 description 1
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 1
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000711902 Pneumovirus Species 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100023132 Transcription factor Jun Human genes 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 102100027266 Ubiquitin-like protein ISG15 Human genes 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002155 anti-virotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000010468 interferon response Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014599 transmission of virus Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 238000007039 two-step reaction Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000006490 viral transcription Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к средствам молекулярной диагностики и может быть использовано в клинической иммунологии и медицине для оценки иммунного статуса пациента методом ПЦР в реальном времени. Настоящее изобретение представляет собой диагностическую тест-систему для количественной оценки уровней мРНК генов MxA, OAS1, EIF2AK2 человека в биологическом образце. Тест-система включает в себя две пробы (I и II), в которых одновременно проходят несколько реакций: в пробе I - определение уровней экспрессии генов MxA, OAS1, EIF2AK2 человека, в пробе II - определение уровня экспрессии гена GAPDH (ген нормировки).The invention relates to molecular diagnostic tools and can be used in clinical immunology and medicine to assess the patient’s immune status using real-time PCR. The present invention is a diagnostic test system for quantitative assessment of mRNA levels of the human MxA, OAS1, EIF2AK2 genes in a biological sample. The test system includes two samples (I and II), in which several reactions take place simultaneously: in sample I - determination of the expression levels of the human genes MxA, OAS1, EIF2AK2, in sample II - determination of the expression level of the GAPDH gene (normalization gene).
С момента открытия интерферонов (ИФН) был достигнут значительный прогресс в описании природы самих цитокинов - сигнальных компонентов, которые управляют клеточным ответом, и их противовирусной активности. Выявлено четыре основных эффекторных пути ИФН-опосредованного противовирусного ответа: путь Mx GTPase, путь 2′-5′-олигоаденилатсинтетазы (OAS1), управляемый рибонуклеазой L, путь протеинкиназы R (эукариотический фактор инициации трансляции 2-альфа-киназа 2, который у человека кодируется геном EIF2AK2) и путь, подобный убиквитину ISG15. Данные эффекторные пути индивидуально блокируют вирусную транскрипцию, разрушают вирусную РНК, ингибируют трансляцию и модифицируют функцию белка, чтобы контролировать все этапы репликации вируса [1].Since the discovery of interferons (IFNs), significant progress has been made in describing the nature of the cytokines themselves - the signaling components that control the cellular response - and their antiviral activity. Four major effector pathways of the IFN-mediated antiviral response have been identified: the Mx GTPase pathway, the 2′-5′-oligoadenylate synthetase (OAS1) pathway driven by ribonuclease L, the protein kinase R pathway (eukaryotic translation initiation factor 2-
В ответ на инфицирование гриппом клетка вырабатывает врожденный иммунный ответ, ограничивающий размножение вируса. Основным драйвером этого ответа является группа цитокинов под общим названием ИФН I типа. Экспрессия ИФН требует выявления вирус-специфических паттернов (патоген-ассоциированных молекулярных паттернов [PAMPs]), которые распознаются клеточными сенсорами (рецепторами распознавания паттернов [PRRs]) как чужеродные, из которых RIG-I актуален во время инфицирования эпителиальных клеток вирусом гриппа. RIG-I активируется при распознавании двухцепочечной РНК (дцРНК), содержащей 5′-трифосфат, и передает сигнал ниже по пути через взаимодействие с митохондриальным белком IPS-1 / MAVS / VISA / Cardif. Следствием этой нижестоящей передачи сигналов является активация факторов транскрипции IRF3, NF-κB и ATF-2 / c-Jun, которые активируют транскрипцию ИФН. Секретируемые ИФН действуют аутокринным и паракринным образом, активируя рецептор ИФН. Сигнал передается по пути Jak / STAT в ядро, где он активирует транскрипцию сотен ИФН-зависимых генов (ISG), многие из которых обладают противовирусной активностью, включая EIF2AK2, MxA, OAS1, необходимой клетке для преодоления вирусной инфекции и ограничения распространения вируса на соседние неинфицированные клетки [2].In response to influenza infection, the cell produces an innate immune response that limits the replication of the virus. The main driver of this response is a group of cytokines collectively called type I IFN. IFN expression requires the identification of virus-specific patterns (pathogen-associated molecular patterns [PAMPs]) that are recognized as foreign by cellular sensors (pattern recognition receptors [PRRs]), of which RIG-I is relevant during influenza virus infection of epithelial cells. RIG-I is activated upon recognition of double-stranded RNA (dsRNA) containing 5′-triphosphate and transmits a signal downstream through interaction with the mitochondrial protein IPS-1/MAVS/VISA/Cardif. The consequence of this downstream signaling is the activation of the transcription factors IRF3, NF-κB and ATF-2/c-Jun, which activate IFN transcription. Secreted IFNs act in an autocrine and paracrine manner, activating the IFN receptor. The signal is transmitted through the Jak/STAT pathway into the nucleus, where it activates the transcription of hundreds of IFN-dependent genes (ISGs), many of which have antiviral activity, including EIF2AK2, MxA, OAS1, necessary for the cell to overcome viral infection and limit the spread of the virus to neighboring uninfected cells [2].
Индуцируемый интерфероном I типа MxA-белок обладает избирательной активностью против нескольких вирусов. Однако точный механизм противовирусного действия не выяснен. Связываясь с дцРНК, OAS-1 катализирует образование 20-50-связанного олигоаденилата и активирует РНКазу, которая расщепляет вирусную и клеточную РНК. EIF2AK2 также активируется дцРНК; это приводит к фосфорилированию его субстрата, eIF2a, который ингибирует фактор обмена гуанозиновых нуклеотидов, eIF2b, и останавливает репликацию вируса. EIF2AK2 может действовать путем отключения белка после инфицирования клетки и ограничивают передачу вируса неинфицированным клеткам [3].The type I interferon-induced MxA protein has selective activity against several viruses. However, the exact mechanism of antiviral action is not clear. By binding to dsRNA, OAS-1 catalyzes the formation of a 20-50-linked oligoadenylate and activates RNase, which cleaves viral and cellular RNA. EIF2AK2 is also activated by dsRNA; this results in phosphorylation of its substrate, eIF2a, which inhibits the guanosine nucleotide exchange factor, eIF2b, and stops viral replication. EIF2AK2 may act by shutting down the protein once a cell has been infected and limit viral transmission to uninfected cells [3].
Совместное определение уровня экспрессии генов MxA, OAS1, EIF2AK2 позволяет определить уровень активации врожденного иммунного ответа организма и дать оценку активации ИФН-опосредованного противовирусного ответа. Особенную актуальность данная оценка приобретает при анализе патогенеза острых респираторных вирусных инфекций, вызванных вирусами гриппа, пневмовирусами, аденовирусами, коронавирусами. Наиболее чувствительным и специфичным методом определения уровня экспрессии генов является ПЦР в реальном времени. В данной методике предполагается наличие двух праймеров и флуоресцентно меченого олигонуклеотидного зонда, специфических к интересующей мРНК.Joint determination of the level of expression of the MxA, OAS1, EIF2AK2 genes allows us to determine the level of activation of the body's innate immune response and assess the activation of the IFN-mediated antiviral response. This assessment becomes especially relevant when analyzing the pathogenesis of acute respiratory viral infections caused by influenza viruses, pneumoviruses, adenoviruses, and coronaviruses. The most sensitive and specific method for determining the level of gene expression is real-time PCR. This technique assumes the presence of two primers and a fluorescently labeled oligonucleotide probe specific to the mRNA of interest.
В настоящее время не зарегистрировано тест-систем, которые можно использовать для одновременного определения экспрессии генов MxA, OAS1, EIF2AK2 методом ПЦР в реальном времени. Известен способ определения экспрессии большого числа генов (включая MxA, OAS1, EIF2AK2) методом микроэррей [4], который является более дорогостоящим методом по сравнению с методом ПЦР. Также известны методы определения экспрессии MxA с использованием мультиплексной тест-системы для количественного анализа экспрессии генов интерферона лямбда (IFNλ), противовирусного белка МхА и интерлейкина 23 (IL23) [5], а также двух генов MxA, OAS1 с использованием набора для диагностики или прогнозирования лихорадки денге, включающего средства для обнаружения изменения уровня экспрессии одного или нескольких белков, родственных интерферону [6].Currently, there are no registered test systems that can be used to simultaneously determine the expression of the MxA, OAS1, EIF2AK2 genes using real-time PCR. There is a known method for determining the expression of a large number of genes (including MxA, OAS1, EIF2AK2) using the microarray method [4], which is a more expensive method compared to the PCR method. There are also known methods for determining the expression of MxA using a multiplex test system for quantitative analysis of the expression of the genes interferon lambda (IFNλ), antiviral protein MxA and interleukin 23 (IL23) [5], as well as two genes MxA, OAS1 using a diagnostic or prognostic kit dengue fever, including means to detect changes in the expression level of one or more interferon-related proteins [6].
Таким образом, актуальность предлагаемого изобретения обусловлена необходимостью определения уровня экспрессии ИФН-индуцируемых генов для более глубокого понимания патогенеза острых респираторных вирусных инфекций и определения дальнейших стратегий их лечения, а также определения уровня активации интерферонового ответа. Отсутствие аналогичных коммерческих тест-систем делает данное изобретение уникальным продуктом интеллектуального творчества.Thus, the relevance of the present invention is due to the need to determine the level of expression of IFN-induced genes for a deeper understanding of the pathogenesis of acute respiratory viral infections and to determine further strategies for their treatment, as well as to determine the level of activation of the interferon response. The absence of similar commercial test systems makes this invention a unique product of intellectual creativity.
Технический результат заключается в подобранных последовательностях праймеров и олигонуклеотидных TaqMan зондов, а также условиях проведения ПЦР в реальном времени (концентрации вносимых реагентов и температурном профиле проводимых реакций). Данный результат достигается тем, что тест-система для количественной диагностики мРНК генов MxA, OAS1, EIF2AK2 человека на основе ПЦР включает набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов со следующей структурой:The technical result consists in the selected sequences of primers and oligonucleotide TaqMan probes, as well as the conditions for real-time PCR (concentration of the introduced reagents and the temperature profile of the reactions performed). This result is achieved by the fact that the test system for quantitative diagnosis of human mRNA of the MxA, OAS1, EIF2AK2 genes based on PCR includes a set of oligonucleotide primers and fluorescent probes with the following structure:
прямой праймер на ген MxA - GAGACAATCGTGAAACAGCAAATCA (SEQ NO. 1)direct primer for the MxA gene - GAGACAATCGTGAAACAGCAAATCA (SEQ NO. 1)
обратный праймер на ген MxA - TATCGAAACATCTGTGAAAGCAAGC (SEQ NO. 2)reverse primer for the MxA gene - TATCGAAACATCTGTGAAAGCAAGC (SEQ NO. 2)
флуоресцентный зонд на ген MxA Fam- CACTGGAAGAGCCGGCTGTGGATATG-BHQ2fluorescent probe for the MxA gene Fam-CACTGGAAGAGCCGGCTGTGGATATG-BHQ2
(SEQ NO. 3)(SEQ NO. 3)
прямой праймер на ген OAS1 - CCAAGGTGGTAAAGGGTGGCT (SEQ NO. 4)forward primer for the OAS1 gene - CCAAGGTGGTAAAGGGTGGCT (SEQ NO. 4)
обратный праймер на ген OAS1 - CTGGACCTCAAACTTCACGGAAA (SEQ NO. 5)reverse primer for the OAS1 gene - CTGGACCTCAAACTTCACGGAAA (SEQ NO. 5)
флуоресцентный зонд на ген OAS1 - Rox-AGGCCGATCTGACGCTGACCTGGTTGT- BHQ3fluorescent probe for the OAS1 gene - Rox-AGGCCGATCTGACGCTGACCTGGTTGT-BHQ3
(SEQ NO. 6)(SEQ NO. 6)
прямой праймер на ген EIF2AK2 - GAAAGCGAACAAGGAGTAAGGGA (SEQ NO. 7)direct primer for the EIF2AK2 gene - GAAAGCGAACAAGGAGTAAGGGA (SEQ NO. 7)
обратный праймер на ген EIF2AK2 - CCATCCCGTAGGTCTGTGAAA (SEQ NO. 8)reverse primer for the EIF2AK2 gene - CCATCCCGTAGGTCTGTGAAA (SEQ NO. 8)
флуоресцентный зонд на ген EIF2AK2 - Cy5-AGCCCCAAAGCGTAGAGGTCCACTTCC-BHQ1fluorescent probe for the EIF2AK2 gene - Cy5-AGCCCCAAAGCGTAGAGGTCCACTTCC-BHQ1
(SEQ NO. 9).(SEQ NO. 9).
С помощью указанной тест-системы осуществляют количественное определение уровня мРНК генов MxA, OAS1, EIF2AK2 человека, в ходе которого проводят предварительную реакцию обратной транскрипции, а далее полимеразную цепную реакцию в реальном времени по следующему температурному профилю: первичная денатурация в течение 5 мин при температуре 95°С, далее 40 циклов двухступенчатой реакции, состоящей из этапа денатурации в течение 10 с при температуре 95°С и этапа отжига праймеров и элонгации цепи в течение 30 с при температуре 61°С.Using the specified test system, a quantitative determination of the level of mRNA of the human genes MxA, OAS1, EIF2AK2 is carried out, during which a preliminary reverse transcription reaction is carried out, and then a polymerase chain reaction in real time according to the following temperature profile: primary denaturation for 5 minutes at a temperature of 95 °C, then 40 cycles of a two-step reaction, consisting of a denaturation step for 10 s at a temperature of 95°C and a primer annealing and chain elongation step for 30 s at a temperature of 61°C.
Описание фигурDescription of the figures
На фиг. 1 представлен расчёт эффективности ПЦР для количественной оценки мРНК гена MxA, проведённой в моноплексном режиме: A - кривые роста флуоресценции, полученные для линейки разведений образцов (от -9 до -3) при анализе флуоресценции на канале FAM в режиме реального времени; Б - построенная по полученным значениям Cq кривая, используемая для расчёта эффективности реакции.In fig. Figure 1 shows the calculation of PCR efficiency for quantitative assessment of MxA gene mRNA, carried out in monoplex mode: A - fluorescence growth curves obtained for a range of sample dilutions (from -9 to -3) when analyzing fluorescence on the FAM channel in real time; B - curve constructed from the obtained Cq values, used to calculate the reaction efficiency.
На фиг. 2 представлен расчёт эффективности реакции ПЦР для количественной оценки мРНК гена OAS1, проведённой в моноплексном режиме: A - кривые роста флуоресценции, полученные для линейки разведений образцов (от -9 до -2) при анализе флуоресценции на канале ROX в режиме реального времени; Б - построенная по полученным значениям Cq кривая, используемая для расчёта эффективности реакции.In fig. Figure 2 shows the calculation of the efficiency of the PCR reaction for quantitative assessment of the OAS1 gene mRNA, carried out in monoplex mode: A - fluorescence growth curves obtained for a range of sample dilutions (from -9 to -2) when analyzing fluorescence on the ROX channel in real time; B - curve constructed from the obtained Cq values, used to calculate the reaction efficiency.
На фиг. 3 представлен расчёт эффективности реакции ПЦР для количественной оценки мРНК гена EIF2AK2, проведённой в моноплексном режиме: A - кривые роста флуоресценции, полученные для линейки разведений образцов (от -9 до -2) при анализе флуоресценции на канале Cy5 в режиме реального времени; Б - построенная по полученным значениям Cq кривая, используемая для расчёта эффективности реакции.In fig. Figure 3 shows the calculation of the efficiency of the PCR reaction for quantitative assessment of the EIF2AK2 gene mRNA, carried out in monoplex mode: A - fluorescence growth curves obtained for a range of sample dilutions (from -9 to -2) when analyzing fluorescence on the Cy5 channel in real time; B - curve constructed from the obtained Cq values, used to calculate the reaction efficiency.
На фиг. 4 представлено сравнение эффективностей реакций ПЦР в моноплексном и мультиплексном форматах: А - представлены стандартные калибровочные кривые, используемые для расчёта эффективностей амплификации MxA, OAS1 и EIF2AK2 в мультиплексном формате (одновременная детекция в одной пробирке); Б - стандартная калибровочная кривая, полученная в мультиплексном формате ПЦР в сравнении c калибровочной кривой при моноплексной постановке для гена MxA; В - стандартная калибровочная кривая, полученная в мультиплексном формате ПЦР в сравнении с калибровочной кривой при моноплексной постановке для гена OAS1; Г - стандартная калибровочная кривая, полученная в мультиплексном формате ПЦР, в сравнении c калибровочной кривой при моноплексной постановке для гена EIF2AK2.In fig. Figure 4 shows a comparison of the efficiencies of PCR reactions in monoplex and multiplex formats: A - standard calibration curves used to calculate the amplification efficiencies of MxA, OAS1 and EIF2AK2 in a multiplex format (simultaneous detection in one tube); B - standard calibration curve obtained in the multiplex PCR format in comparison with the calibration curve with a monoplex formulation for the MxA gene; B - standard calibration curve obtained in the multiplex PCR format in comparison with the calibration curve with a monoplex formulation for the OAS1 gene; D - standard calibration curve obtained in the multiplex PCR format, in comparison with the calibration curve for the monoplex formulation for the EIF2AK2 gene.
На фиг. 5 представлен результат электрофоретического разделения в агарозном геле продуктов, полученных в ходе проведения мультиплексной и моноплексных ПЦР, для оценки возможности образования в ходе реакции нежелательных неспецифических продуктов.In fig. Figure 5 shows the result of electrophoretic separation in an agarose gel of the products obtained during multiplex and monoplex PCR to assess the possibility of the formation of undesirable nonspecific products during the reaction.
На фиг. 6 представлено определение уровня экспрессии генов MxA, OAS1 и EIF2AK2 в периферических мононуклеарных клетках крови пациентов с гриппозной инфекцией, новой коронавирусной инфекцией (COVID-19) и здоровых волонтеров. Достоверность различий определялась с использованием непараметрического критерия Краскела-Уоллиса с множественными сравнениями. * - P < 0,05; ** - P < 0,01; **** - P < 0,0001.In fig. Figure 6 shows the determination of the expression level of the MxA, OAS1 and EIF2AK2 genes in peripheral mononuclear blood cells of patients with influenza infection, new coronavirus infection (COVID-19) and healthy volunteers. The significance of differences was determined using the nonparametric Kruskal-Wallis test with multiple comparisons. * - P < 0.05; ** - P < 0.01; **** - P < 0.0001.
Для определения уровня экспрессии генов MxA, OAS1, EIF2AK2 был проведен дизайн праймеров и олигонуклеотидных зондов. Оригинальные последовательности всех праймеров и зондов для количественной оценки мРНК генов MxA, OAS, EIF2AK2 были подобраны к белок-кодирующей области генов таким образом, чтобы праймеры были разделены областью интрона, температуры их плавления были схожи, а длины ампликонов, образующихся в процессе ПЦР, не превышали 300 п.н. В качестве эндогенного контроля, используемого для нормировки экспрессии генов MxA, OAS1, EIF2AK2, был предложен ген глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) (табл.1).To determine the level of expression of the MxA, OAS1, EIF2AK2 genes, primers and oligonucleotide probes were designed. The original sequences of all primers and probes for quantitative assessment of the mRNA of the MxA, OAS, EIF2AK2 genes were selected to the protein-coding region of the genes in such a way that the primers were separated by the intron region, their melting temperatures were similar, and the lengths of the amplicons formed during the PCR process were not exceeded 300 bp. The glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene was proposed as an endogenous control used to normalize the expression of the MxA, OAS1, and EIF2AK2 genes (Table 1).
NM_001256799.3 NM_001289745.3 NM_001289746.2 NM_001357943.2NM_002046.7
NM_001256799.3 NM_001289745.3 NM_001289746.2 NM_001357943.2
Подобранные праймеры выявляют все транскрипционные варианты мРНК генов (3 транскрипционных варианта MxA, 4 транскрипционных варианта OAS1, 3 транскрипционных варианта EIF2AK2, 5 транскрипционных вариантов GAPDH).Selected primers detect all transcriptional variants of mRNA genes (3 transcriptional variants of MxA, 4 transcriptional variants of OAS1, 3 transcriptional variants of EIF2AK2, 5 transcriptional variants of GAPDH).
Подбор и оптимизация условий ПЦРSelection and optimization of PCR conditions
На данном этапе работы была проведена оценка качества подобранных пар праймеров и зондов, а также возможность образования ими гетеро- и гомодимеров и неспецифических продуктов. В качестве матрицы для проведения данного исследования использовали образцы кДНК, полученные из препаратов тотальной РНК, выделенных из клеток A549, инфицированных вирусом гриппа A. Работа проводилась с использованием 2× реакционной смеси, содержащей Taq ДНК-полимеразу с «горячим» стартом, для проведения ПЦР с контролем по конечной точке (БиоМастер HS-Taq ПЦР (2×), Биолабмикс). Реакцию проводили в объёме 25 мкл, содержащем от 6,25 до 12,5 пмоль прямого и обратного праймеров и TaqMan зонда. Для определения оптимального термального профиля реакций были проведены ПЦР с температурным градиентом отжига праймеров: 1) 95°С - 300 c; 2) [95°С - 10 c; градиент температур 57,5°С - 63,5°С - 30 c; 72°С - 30 c] - 40 циклов.At this stage of the work, the quality of selected pairs of primers and probes was assessed, as well as the possibility of their formation of hetero- and homodimers and nonspecific products. As a template for this study, we used cDNA samples obtained from total RNA preparations isolated from A549 cells infected with influenza A virus. The work was carried out using a 2× reaction mixture containing Taq DNA polymerase with a “hot” start for PCR with endpoint control (BioMaster HS-Taq PCR (2×), Biolabmix). The reaction was carried out in a volume of 25 μl containing from 6.25 to 12.5 pmol of forward and reverse primers and TaqMan probe. To determine the optimal thermal profile of the reactions, PCR was carried out with a temperature gradient of primer annealing: 1) 95°C - 300 s; 2) [95°С - 10 s; temperature gradient 57.5°C - 63.5°C - 30 s; 72°C - 30 s] - 40 cycles.
Детекцию результатов осуществляли по росту флуоресценции, наличие неспецифических продуктов оценивали электрофоретическим разделением продуктов в агарозном геле.The results were detected by fluorescence growth; the presence of nonspecific products was assessed by electrophoretic separation of the products in an agarose gel.
С учётом полученных результатов в качестве оптимального температурного профиля проводимой мультиплексной ПЦР было предложено использовать следующий:Taking into account the results obtained, it was proposed to use the following as the optimal temperature profile for multiplex PCR:
1) первичная денатурация 95°С - 5 мин,1) primary denaturation 95°C - 5 min,
далее 40 двухступенчатых циклов:further 40 two-stage cycles:
2) денатурация 95°С - 10 с;2) denaturation 95°C - 10 s;
3) отжиг праймеров и элонгация цепи 61°С - 30 c.3) primer annealing and chain elongation 61°C - 30 s.
Расчет эффективностей ПЦРCalculation of PCR efficiencies
Для корректного проведения относительного количественного анализа экспрессии ИФН-индуцируемых генов в мультиплексном формате значения эффективностей амплификации соответствующих мРНК должны быть идентичными или максимально приближенными друг к другу. Поэтому далее при подобранных оптимальных условиях были рассчитаны эффективности проводимых ПЦР.To correctly carry out relative quantitative analysis of the expression of IFN-induced genes in a multiplex format, the amplification efficiencies of the corresponding mRNAs must be identical or as close as possible to each other. Therefore, further, under selected optimal conditions, the efficiencies of the PCR reactions were calculated.
Для определения эффективностей реакций использовали специфические очищенные ампликоны, полученные в неколичественных ПЦР (без использования TaqMan зонда). Расчёт проводили по углу наклона кривой, полученной в результате постановки qПЦР с серией последовательных разбавлений подготовленных ампликонов.To determine the efficiency of the reactions, specific purified amplicons obtained in non-quantitative PCR (without using a TaqMan probe) were used. The calculation was carried out using the slope of the curve obtained as a result of qPCR with a series of serial dilutions of the prepared amplicons.
На Фиг. 1Б показаны результаты расчёта эффективности ПЦР при амплификации гена MxA в формате моноплексной ПЦР. Рассчитанная эффективность ПЦР на MxA (Фиг. 1Б) составила 106%, что является хорошим параметром амплификации. Аналогичным образом были получены эффективности амплификации ПЦР для OAS1 (Фиг. 2Б) и для EIF2AK2 (Фиг. 3Б). Таким образом, продемонстрировано, что в моноплексном формате эффективности амплификации продуктов трех генов MxA, OAS1 и EIF2AK2 составили: 106%, 90%, 118%, соответственно. Стандартные калибровочные кривые, представленные на Фиг. 1-3Б, имеют похожие углы наклона, т.е. параллельны.In FIG. Figure 1B shows the results of calculating the efficiency of PCR for amplification of the MxA gene in the monoplex PCR format. The calculated PCR efficiency for MxA (Fig. 1B) was 106%, which is a good amplification parameter. PCR amplification efficiencies for OAS1 (Fig. 2B) and for EIF2AK2 (Fig. 3B) were obtained similarly. Thus, it was demonstrated that in the monoplex format, the amplification efficiencies of the products of the three genes MxA, OAS1 and EIF2AK2 were: 106%, 90%, 118%, respectively. Standard calibration curves shown in Fig. 1-3B, have similar angles of inclination, i.e. parallel.
При постановке мультиплексной ПЦР амплификация всех генов MxA, OAS1 и EIF2AK2 проводилась одновременно в одной пробирке. При этом в пробу ПЦР, содержащую фермент ДНК-зависимую ДНК-полимеразу и прилагаемый к ней буфер, также добавлялись все подобранные пары праймеров и олигонуклеотидные зонды, специфически выявляющие заявленные гены. Конечные концентрации праймеров и зондов, содержащиеся в пробе при проведении мультиплексной ПЦР, представлены в таблице 2.When performing multiplex PCR, amplification of all MxA, OAS1 and EIF2AK2 genes was carried out simultaneously in one tube. At the same time, all selected pairs of primers and oligonucleotide probes that specifically detect the declared genes were also added to the PCR sample containing the enzyme DNA-dependent DNA polymerase and the buffer attached to it. The final concentrations of primers and probes contained in the sample during multiplex PCR are presented in Table 2.
Ввиду того, что во время реакции пары праймеров могут давать неспецифические химерные продукты, был проведен анализ продуктов мультиплексной и моноплексной ПЦР методом электрофоретического разделения в агарозном геле (Фиг. 5).Due to the fact that during the reaction, pairs of primers can give nonspecific chimeric products, the products of multiplex and monoplex PCR were analyzed by electrophoretic separation in an agarose gel (Fig. 5).
Результаты, представленные на Фиг. 5, свидетельствуют о том, что при проведении моноплексной ПЦР в пробирках амплифицировались только целевые продукты, соответствующие заявленным генам MxA, OAS1, EIF2AK2. Продукты ПЦР представлены яркими бэндами с длинами, соответствующими расчётным: 105 п.н., 200 п.н. и 175 п.н. для каждого анализируемого гена (MxA, OAS1, EIF2AK2, соответственно). При проведении мультиплексной ПЦР в пробирке одновременно выявлялись все три гена, имеющие аналогичные длины. Таким образом, в ходе мультиплексной ПЦР не образовывались какие-либо нежелательные неспецифические продукты.The results presented in Fig. 5 indicate that when performing monoplex PCR in test tubes, only target products corresponding to the declared genes MxA, OAS1, EIF2AK2 were amplified. PCR products are represented by bright bands with lengths corresponding to the calculated ones: 105 bp, 200 bp. and 175 bp for each gene analyzed (MxA, OAS1, EIF2AK2, respectively). When performing multiplex PCR in vitro, all three genes of similar lengths were simultaneously detected. Thus, no unwanted nonspecific products were generated during multiplex PCR.
Далее были рассчитаны эффективности амплификации каждого из заявленных генов при проведении мультиплексной ПЦР. Как продемонстрировано на Фиг. 4А, эффективности амплификации всех специфических продуктов MxA, OAS1 и EIF2AK2 при проведении ПЦР в одной пробирке составили: 102%, 93%, 113%, соответственно. Кроме того, мультиплексирование праймеров приводит к снижению амплификации не более чем на 3-5% по сравнению с амплификацией в моноплексном формате для каждого из специфических продуктов (Фиг. 4Б-Г).Next, the amplification efficiencies of each of the declared genes were calculated when performing multiplex PCR. As shown in FIG. 4A, the amplification efficiencies of all specific products of MxA, OAS1 and EIF2AK2 when performing PCR in one tube were: 102%, 93%, 113%, respectively. In addition, multiplexing the primers resulted in a reduction in amplification of no more than 3-5% compared to amplification in a monoplex format for each of the specific products (Fig. 4B-D).
Верификация тест-системы на клинических образцахVerification of the test system on clinical samples
Разработанная тест-система применялась для одновременного измерения экспрессии генов MxA, OAS1 и EIF2AK2 в периферических мононуклеарных клетках крови пациентов с диагнозом COVID-19, гриппозной инфекцией, а также контрольной группы здоровых доноров. Диагностика инфекций была проведена ПЦР-наборами, сертифицированными для проведения подобных исследований.The developed test system was used to simultaneously measure the expression of the MxA, OAS1 and EIF2AK2 genes in peripheral mononuclear blood cells of patients diagnosed with COVID-19, influenza infection, as well as a control group of healthy donors. Diagnosis of infections was carried out using PCR kits certified for such studies.
В результате измерения было установлено, что у пациентов с COVID-19 происходило повышение экспрессии OAS1 практически на два порядка по сравнению с контрольной группой пациентов, тогда как у пациентов с гриппозной инфекцией экспрессия OAS1 была достоверно ниже, чем у пациентов с COVID-19, но достоверно выше, чем у контрольной группы. Экспрессия генов MxA и EIF2AK2 возрастала как в случае гриппозной инфекции, так и в случае заражения COVID-19.As a result of the measurement, it was found that in patients with COVID-19, there was an increase in OAS1 expression by almost two orders of magnitude compared to the control group of patients, while in patients with influenza infection, OAS1 expression was significantly lower than in patients with COVID-19, but significantly higher than that of the control group. The expression of the MxA and EIF2AK2 genes increased in both influenza infection and COVID-19 infection.
Использование разработанной мультиплексной ПЦР тест-системы позволяет с высокой эффективностью проводить количественный анализ генов MxA, OAS1 и EIF2AK2 в клинических образцах.The use of the developed multiplex PCR test system allows for highly efficient quantitative analysis of the MxA, OAS1 and EIF2AK2 genes in clinical samples.
Список литературыBibliography
1. Anthony J. Sadler and Bryan R. G. Williams. Interferon-inducible antiviral effectors// Nature Reviews Immunology. - 2008. - 8(7). - С. 559-568.1. Anthony J. Sadler and Bryan R. G. Williams. Interferon-inducible antiviral effectors // Nature Reviews Immunology . - 2008. - 8(7). - pp. 559-568.
2. Haller, O. et al. Protective role of interferon-induced Mx GTPases against influenza viruses// Scientific and Technical Review. - 2009. - 28(1). С. 219-231.2. Haller, O. et al. Protective role of interferon-induced Mx GTPases against influenza viruses // Scientific and Technical Review. - 2009. - 28(1). pp. 219-231.
3. Knapp, S. et al. Polymorphisms in interferon-induced genes and the outcome of hepatitis C virus infection: roles of MxA, OAS-1 and PKR// Genes & Immunity. - 2003. - 4(6). - С. 411-419.3. Knapp, S. et al. Polymorphisms in interferon-induced genes and the outcome of hepatitis C virus infection: roles of MxA, OAS-1 and PKR // Genes & Immunity . - 2003. - 4(6). - pp. 411-419.
4. Compositions and Methods for Diagnosing and Assessing Inflammatory Myopathies: patent application US2010190659A1, the United States of America, filed 07.07.2008, publ. 29.07.2010.4. Compositions and Methods for Diagnosing and Assessing Inflammatory Myopathies: patent application US2010190659A1, the United States of America, filed 07/07/2008, publ. 07/29/2010.
5. Test system for determination of interferon, IL23 interleukine and MXA anti-virus protein RNA: patent RU2627179, Russian Federation, appl. RU2016131205, filed 28.07.2016, publ. 03.08.2017.5. Test system for determination of interferon, IL23 interleukine and MXA anti-virus protein RNA: patent RU2627179, Russian Federation, appl. RU2016131205, filed 07/28/2016, publ. 08/03/2017.
6. Dengue diagnosis and treatment: patent application US2010068147, the United States of America, filed 05.10.2007, publ. 18.03.2010.6. Dengue diagnosis and treatment: patent application US2010068147, the United States of America, filed 10/05/2007, publ. 03/18/2010.
--->--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?><!DOCTYPE ST26SequenceListing <?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?><!DOCTYPE ST26SequenceListing
PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing 1.3//EN" PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing 1.3//EN"
"ST26SequenceListing_V1_3.dtd"><ST26SequenceListing "ST26SequenceListing_V1_3.dtd"><ST26SequenceListing
dtdVersion="V1_3" fileName="/Users/fedorivanov/Downloads/Seq. dtdVersion="V1_3" fileName="/Users/fedorivanov/Downloads/Seq.
list.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.2.0" list.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.2.0"
productionDate="2023-03-15"> <ApplicationIdentification> productionDate="2023-03-15"> <ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode> <IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText></ApplicationNumberText> <ApplicationNumberText></ApplicationNumberText>
<FilingDate></FilingDate> </ApplicationIdentification> <FilingDate></FilingDate> </ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>MxA, OAS1, EIF2AK2</ApplicantFileReference> <ApplicantFileReference>MxA, OAS1, EIF2AK2</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное <ApplicantName languageCode="ru">Federal state
автономное образовательное учреждение высшего образования autonomous educational institution of higher education
"Санкт-Петербургский политехнический университет Петра "St. Petersburg Polytechnic University Petra
Великого" (ФГАОУ ВО "СПбПУ")</ApplicantName> Great" (Federal State Autonomous Educational Institution of Higher Education "SPbPU")</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Federal State Autonomous Educational Institution <ApplicantNameLatin>Federal State Autonomous Educational Institution
of Higher Education "Peter the Great St. Petersburg Polytechnic of Higher Education "Peter the Great St. Petersburg Polytechnic
University" (SPbPU)</ApplicantNameLatin> <InventionTitle University" (SPbPU)</ApplicantNameLatin> <InventionTitle
languageCode="ru">Тест-система для количественной диагностики мРНК languageCode="ru">Test system for quantitative diagnosis of mRNA
генов MxA, OAS1, EIF2AK2 человека на основе ПЦР</InventionTitle> human MxA, OAS1, EIF2AK2 genes based on PCR</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>9</SequenceTotalQuantity> <SequenceData <SequenceTotalQuantity>9</SequenceTotalQuantity> <SequenceData
sequenceIDNumber="1"> <INSDSeq> sequenceIDNumber="1"> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDQualifier> <INSDFeature_quals> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> <INSDQualifier id="q2"> </INSDQualifier> <INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature> </INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>GAGACAATCGTGAAACAGCAAATCA</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>GAGACAATCGTGAAACAGCAAATCA</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </SequenceData> <SequenceData sequenceIDNumber="2"> </INSDSeq> </SequenceData> <SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq> <INSDSeq_length>25</INSDSeq_length> <INSDSeq> <INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDQualifier> <INSDFeature_quals> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> <INSDQualifier id="q4"> </INSDQualifier> <INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature> </INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>TATCGAAACATCTGTGAAAGCAAGC</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>TATCGAAACATCTGTGAAAGCAAGC</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </SequenceData> <SequenceData sequenceIDNumber="3"> </INSDSeq> </SequenceData> <SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq> <INSDSeq_length>26</INSDSeq_length> <INSDSeq> <INSDSeq_length>26</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..26</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..26</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDQualifier> <INSDFeature_quals> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> <INSDQualifier id="q6"> </INSDQualifier> <INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature> </INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>CACTGGAAGAGCCGGCTGTGGATATG</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>CACTGGAAGAGCCGGCTGTGGATATG</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </SequenceData> <SequenceData sequenceIDNumber="4"> </INSDSeq> </SequenceData> <SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq> <INSDSeq_length>21</INSDSeq_length> <INSDSeq> <INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDQualifier> <INSDFeature_quals> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> <INSDQualifier id="q8"> </INSDQualifier> <INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature> </INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>CCAAGGTGGTAAAGGGTGGCT</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>CCAAGGTGGTAAAGGGTGGCT</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </SequenceData> <SequenceData sequenceIDNumber="5"> </INSDSeq> </SequenceData> <SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq> <INSDSeq_length>23</INSDSeq_length> <INSDSeq> <INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDQualifier> <INSDFeature_quals> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> <INSDQualifier id="q10"> </INSDQualifier> <INSDQualifier id="q10">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature> </INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>CTGGACCTCAAACTTCACGGAAA</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>CTGGACCTCAAACTTCACGGAAA</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </SequenceData> <SequenceData sequenceIDNumber="6"> </INSDSeq> </SequenceData> <SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq> <INSDSeq_length>27</INSDSeq_length> <INSDSeq> <INSDSeq_length>27</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDQualifier> <INSDFeature_quals> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> <INSDQualifier id="q12"> </INSDQualifier> <INSDQualifier id="q12">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature> </INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>AGGCCGATCTGACGCTGACCTGGTTGT</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>AGGCCGATCTGACGCTGACCTGGTTGT</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </SequenceData> <SequenceData sequenceIDNumber="7"> </INSDSeq> </SequenceData> <SequenceData sequenceIDNumber="7">
<INSDSeq> <INSDSeq_length>23</INSDSeq_length> <INSDSeq> <INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDQualifier> <INSDFeature_quals> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> <INSDQualifier id="q14"> </INSDQualifier> <INSDQualifier id="q14">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature> </INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>GAAAGCGAACAAGGAGTAAGGGA</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>GAAAGCGAACAAGGAGTAAGGGA</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </SequenceData> <SequenceData sequenceIDNumber="8"> </INSDSeq> </SequenceData> <SequenceData sequenceIDNumber="8">
<INSDSeq> <INSDSeq_length>21</INSDSeq_length> <INSDSeq> <INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDQualifier> <INSDFeature_quals> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> <INSDQualifier id="q16"> </INSDQualifier> <INSDQualifier id="q16">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature> </INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>CCATCCCGTAGGTCTGTGAAA</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>CCATCCCGTAGGTCTGTGAAA</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </SequenceData> <SequenceData sequenceIDNumber="9"> </INSDSeq> </SequenceData> <SequenceData sequenceIDNumber="9">
<INSDSeq> <INSDSeq_length>27</INSDSeq_length> <INSDSeq> <INSDSeq_length>27</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDQualifier> <INSDFeature_quals> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> <INSDQualifier id="q18"> </INSDQualifier> <INSDQualifier id="q18">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature> </INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>AGCCCCAAAGCGTAGAGGTCCACTTCC</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>AGCCCCAAAGCGTAGAGGTCCACTTCC</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </SequenceData></ST26SequenceListing></INSDSeq> </SequenceData></ST26SequenceListing>
<---<---
Claims (7)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2811690C1 true RU2811690C1 (en) | 2024-01-17 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2527068C2 (en) * | 2006-12-06 | 2014-08-27 | Медиммун, Ллк | Pharmacodynamic markers, induced by alpha interferon |
| US20150218641A1 (en) * | 2010-11-30 | 2015-08-06 | Vereniging Voor Christelijk Hoger Onderwijs, Wetenschappelijk Onderzoek En Patiëntenzorg | Method for prognosticating the clinical response of a patient to b-lymphocyte inhibiting or depleting therapy in interferon-driven diseases such as sle |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2527068C2 (en) * | 2006-12-06 | 2014-08-27 | Медиммун, Ллк | Pharmacodynamic markers, induced by alpha interferon |
| US20150218641A1 (en) * | 2010-11-30 | 2015-08-06 | Vereniging Voor Christelijk Hoger Onderwijs, Wetenschappelijk Onderzoek En Patiëntenzorg | Method for prognosticating the clinical response of a patient to b-lymphocyte inhibiting or depleting therapy in interferon-driven diseases such as sle |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Plotnikova M., Lozhkov A., Romanovskaya-Romanko E., Baranovskaya I., Sergeeva M., Kаа K., Klotchenko S., Vasin A. IFN-λ1 Displays Various Levels of Antiviral Activity In Vitro in a Select Panel of RNA Viruses. Viruses. 2021 Aug 12;13(8):1602. doi: 10.3390/v13081602. PMID: 34452467; PMCID: PMC8402797. Johansson, Mary. (2006). Choosing Reporter-Quencher Pairs for Efficient Quenching Through Formation of Intramolecular Dimers. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 335. 17-29. 10.1385/1-59745-069-3:17. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Singh et al. | Gene expression changes in peripheral blood mononuclear cells from multiple sclerosis patients undergoing β-interferon therapy | |
| RU2766004C1 (en) | Method for assessing normal state of immune repertoire and its application | |
| JP2024103481A (en) | Novel genetic classification and its use in autoimmune diseases | |
| EP3129496B1 (en) | Molecular predictors of sepsis | |
| RU2727054C1 (en) | Method for detecting cdna of sars-cov-2 coronavirus using synthetic oligonucleotide primers in polymerase chain reaction | |
| WO2009151628A2 (en) | Monitoring tcr-b to determine hiv therapy and disease progression | |
| JP2013526845A (en) | Genes and combinations of genes that predict an initial response or non-response of a subject suffering from an inflammatory disease to a cytokine targeted drug (CyTD) | |
| JP2017519498A5 (en) | ||
| RU2811690C1 (en) | Test system for quantitative diagnostics of human mrna of mxa, oas1, eif2ak2 genes based on pcr | |
| CN105950766B (en) | Primer group and kit for detecting HLA-B5801 allele | |
| JP2023532444A (en) | Methods for diagnosing respiratory pathogens and predicting outcomes associated with COVID-19 | |
| Russell et al. | Host gene expression changes in cattle infected with Alcelaphine herpesvirus 1 | |
| US20210079456A1 (en) | Method for detecting mutant gene | |
| van Rijn et al. | Single step high-throughput determination of Toll-like receptor 4 polymorphisms | |
| RU2782428C1 (en) | Multiparametric diagnostic test system for quantitative determination of mrna level of human rig-1, ifit-1, ifih-1 genes | |
| Jiao et al. | Gene analysis of two cases with CisAB/B blood subgroup | |
| Werling et al. | Ability to differentiate between cp and ncp BVDV by microarrays: Towards an application in clinical veterinary medicine? | |
| RU2671156C1 (en) | Method of preimplantation genetic diagnostics of type 1 spinal muscular atrophy | |
| US20200399698A1 (en) | Methods of determining response to tnf alpha blockers | |
| RU2644233C2 (en) | Method for leukosis diagnosis in cattle | |
| de Waal et al. | Development of a cytokine gene expression assay for the relative quantification of the African elephant (Loxodonta africana) cell-mediated immune responses | |
| RU2777086C1 (en) | Method for pre-implantation genetic testing of epidermolysis bullosa | |
| Rabea et al. | Serum interleukin 33 levels and single nucleotide polymorphism rs1929992 in Egyptian patients with chronic asthma | |
| Al-Hwas et al. | Role of IL-23 gene expression in development of psoriatic arthritis among psoriasis patients | |
| RU2751791C1 (en) | Test system for quantitative diagnosis of mrna of human interferon type i, ii and iii based on pcr |