RU2809521C2 - Method of diagnosing polymorphism g.114437192-114439942del of slac4a2 gene, which causes lethal genetic defect of osteopetrosis in cattle - Google Patents
Method of diagnosing polymorphism g.114437192-114439942del of slac4a2 gene, which causes lethal genetic defect of osteopetrosis in cattle Download PDFInfo
- Publication number
- RU2809521C2 RU2809521C2 RU2019122687A RU2019122687A RU2809521C2 RU 2809521 C2 RU2809521 C2 RU 2809521C2 RU 2019122687 A RU2019122687 A RU 2019122687A RU 2019122687 A RU2019122687 A RU 2019122687A RU 2809521 C2 RU2809521 C2 RU 2809521C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cattle
- polymorphism
- gene
- osteopetrosis
- allele
- Prior art date
Links
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 title claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 208000002865 osteopetrosis Diseases 0.000 title claims abstract description 19
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 title claims abstract description 9
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 101150024559 SLC4A2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 13
- NOIRDLRUNWIUMX-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3,7-dihydropurin-6-one;6-amino-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1.O=C1NC(N)=NC2=C1NC=N2 NOIRDLRUNWIUMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000007844 allele-specific PCR Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 4
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 9
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 9
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 abstract description 7
- -1 skin Substances 0.000 abstract description 4
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 abstract description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 abstract description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 abstract description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 abstract description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 244000309466 calf Species 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 241001400033 Omia Species 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 244000309464 bull Species 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000004579 marble Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000020084 Bone disease Diseases 0.000 description 1
- 102000006786 Chloride-Bicarbonate Antiporters Human genes 0.000 description 1
- 208000032170 Congenital Abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108091006260 SLC4A2 Proteins 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003975 animal breeding Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000005008 domestic process Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N veratrole Chemical compound COC1=CC=CC=C1OC ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к молекулярной генетике, а именно к способам определения полиморфизма гена SLC4A2, обуславливающего летальный рецессивный генетический дефект остеопетроза (OS), проявляющегося у крупного рогатого скота абердин-ангусской, герефордской, голштинской, фризской и симментальской пород [https://omia.org/OMIA000755/9913/], и может быть использовано в селекции крупного рогатого скота.The invention relates to molecular genetics, namely to methods for determining polymorphism of the SLC4A2 gene, which causes the lethal recessive genetic defect osteopetrosis (OS), manifested in Aberdeen-Angus, Hereford, Holstein, Friesian and Simmental cattle [https://omia.org /OMIA000755/9913/], and can be used in cattle breeding.
Одним из направлений Федеральной научно-технической программы развития сельского хозяйства на 2017-2025 годы является создание и внедрение отечественных конкурентоспособных технологий по направлениям контроля качества сельскохозяйственной продукции, сырья и продовольствия, и экспертизы генетического материала, в результате чего ожидается снижение уровня импортозависимости не менее чем на 50 процентов [Постановление правительства Российской Федерации от 25 августа 2017 г. №996].One of the directions of the Federal Scientific and Technical Program for the Development of Agriculture for 2017-2025 is the creation and implementation of domestic competitive technologies in the areas of quality control of agricultural products, raw materials and food, and examination of genetic material, as a result of which the level of import dependence is expected to decrease by at least 50 percent [Resolution of the Government of the Russian Federation of August 25, 2017 No. 996].
Одной из проблем современного скотоводства является проявление у животных генетических дефектов, что приводит к появлению мертворожденных или нежизнеспособных телят, нанося тем самым, огромный экономический ущерб [Gholap P.N., Kale D.S. and Sirothia A.R. Genetic Diseases in Cattle: A Review. Research Journal of Animal, Veterinary and Fishery Sciences. 2014; 2(2): 24-33]. В связи с этим, разработка средств диагностики с целью дальнейшей профилактики врожденных аномалий является актуальным и своевременным.One of the problems of modern cattle breeding is the manifestation of genetic defects in animals, which leads to the appearance of stillborn or non-viable calves, thereby causing enormous economic damage [Gholap P.N., Kale D.S. and Sirothia A.R. Genetic Diseases in Cattle: A Review. Research Journal of Animal, Veterinary and Fishery Sciences. 2014; 2(2): 24-33]. In this regard, the development of diagnostic tools for the further prevention of congenital anomalies is relevant and timely.
Одним из летальных генетических дефектов крупного рогатого скота является остеопетроз (Osteopetrosis, OS, мраморная болезнь костей). Летальный гаплотип был картирован на хромосоме 4 [OMIA, Online Mendelian Inheritance in Animals // URL: https://omia.org/OMIA000755/9913/ (дата обращения 19.02.2019)].One of the lethal genetic defects in cattle is osteopetrosis (OS, marbled bone disease). The lethal haplotype was mapped to chromosome 4 [OMIA, Online Mendelian Inheritance in Animals // URL: https://omia.org/OMIA000755/9913/ (accessed 02/19/2019)].
Причиной OS является делеция g.114437192_114439942del (2784 п.о.), охватывающая полностью экзон 2 и почти половину экзона 3 гена SLC4A2 [Meyers et al., 2010].The cause of OS is the deletion g.114437192_114439942del (2784 bp), covering the entire exon 2 and almost half of exon 3 of the SLC4A2 gene [Meyers et al., 2010].
Телята, гомозиготные по мутантному аллелю, обычно рождаются мертворожденными раньше срока (на 250-275 день стельности). Они часто имеют небольшой размер тела, плоский череп, плотно сжатые коренные зубы, укороченную нижнюю челюсть, выступающий язык; длинные кости очень хрупкие и легко ломаются, так как не содержат костномозговых полостей, при гистологическом исследовании имеют вид мрамора (отсюда второе название дефекта «мраморная болезнь») [Meyers et al., 2010; McClure M., McClure J., 2016].Calves homozygous for the mutant allele are usually stillborn prematurely (at 250-275 days of pregnancy). They often have a small body size, a flat skull, tightly clenched molars, a shortened lower jaw, and a protruding tongue; long bones are very fragile and easily break, since they do not contain bone marrow cavities; upon histological examination they have the appearance of marble (hence the second name for the defect “marble disease”) [Meyers et al., 2010; McClure M., McClure J., 2016].
Анализ коров и быков, зарегистрированных в Американской ассоциации абердин-ангусской породы, проведенный по данным 2008-2017 гг., показал, что 1,7% животных являлись носителями остеопетроза [Konovalova E.N., Gladyr` Е.А., Kostiunina O.V., Zinovieva N.A. Congenital defects of beef cattle breeds and general principles of their prevention. Veterinariya, Zootekhniya i Biotekhnologiya, 2017, p. 49].An analysis of cows and bulls registered in the American Aberdeen Angus Breed Association, carried out according to data from 2008-2017, showed that 1.7% of animals were carriers of osteopetrosis [Konovalova E.N., Gladyr` E.A., Kostiunina O.V., Zinovieva N.A. Congenital defects of beef cattle breeds and general principles of their prevention. Veterinariya, Zootekhniya i Biotekhnologiya, 2017, p. 49].
Известен способ диагностики полиморфизма в гене SLC4A2, ассоциированного с OS, и взятый в качестве прототипа, заключающийся в том, что выделенная из биоматериала животных (кожа, кровь, сперма, молоко и пр.) ДНК исследуется методом аллель-специфичной ПЦР с использованием трех олигонуклеотидных праймеров: одного прямого и двух обратных, имеющих длину 21 нуклеотид, температуру плавления 64°С и содержание гуанина-цитозина 52,4%. При этом у животных-носителей порока выявляется два фрагмента ДНК: 475 п.о., соответствующий здоровому аллелю, и 330 п.о., соответствующий мутантному аллелю [Meyers et al., 2010].There is a known method for diagnosing polymorphism in the SLC4A2 gene associated with OS, and taken as a prototype, which consists in the fact that DNA isolated from animal biomaterial (skin, blood, sperm, milk, etc.) is examined by allele-specific PCR using three oligonucleotides primers: one forward and two reverse, having a length of 21 nucleotides, a melting point of 64°C and a guanine-cytosine content of 52.4%. In this case, two DNA fragments are detected in animals carrying the defect: 475 bp, corresponding to the healthy allele, and 330 bp, corresponding to the mutant allele [Meyers et al., 2010].
Данный способ является высокоспецифичным и позволяет выявлять животных-носителей остеопетроза независимо от пола и возраста, однако, его недостатками является длина олигонуклеотидных праймеров, превышающая 20 п.н., и относительно низкое содержание в праймерах гуанина-цитозина.This method is highly specific and makes it possible to identify animals that carry osteopetrosis, regardless of gender and age; however, its disadvantages are the length of the oligonucleotide primers, which exceeds 20 bp, and the relatively low content of guanine-cytosine in the primers.
При создании настоящего изобретения задача состояла в разработке отечественного способа обнаружения дефектного аллеля гена SLC4A2, ассоциированного с гаплотипом OSC, с целью идентификации скрытых носителей OS и разработки программ их использования в селекции без риска получения нежизнеспособных телят.When creating the present invention, the task was to develop a domestic method for detecting a defective allele of the SLC4A2 gene associated with the OSC haplotype in order to identify hidden OS carriers and develop programs for their use in breeding without the risk of producing non-viable calves.
Задача нашего изобретения - создание простого, не требующего использования дорогостоящего оборудования, специфичного способа идентификации полиморфизма g.114437192_114439942del в гене SLC4A2, ассоциированного с гаплотипом OSC, для использования в селекции крупного рогатого скота.The objective of our invention is to create a simple, specific method for identifying the g.114437192_114439942del polymorphism in the SLC4A2 gene associated with the OSC haplotype, which does not require the use of expensive equipment, for use in cattle breeding.
Технический результат изобретения достигается тем, что предложен способ диагностики полиморфизма g.114437192_114439942del гена SLC4A2, обуславливающего летальный генетический дефект остеопетроза крупного рогатого скота абердин-ангусской, герефордской, фризской, голштинской и симментальской пород, включающий анализ выделенной из биоматериала животных (кожа, кровь, сперма, молоко и пр.) ДНК методом аллель-специфичной ПЦР с использованием трех праймеров: одного прямого и двух обратных с последующим электрофорезом в агарозном геле, отличающийся тем, что для амплификации искомых фрагментов ДНК используют олигонуклеотидные праймеры длиной 20 пар нуклеотидов с температурой плавления 62°С и содержанием гуанина-цитозина 55%, и амплифицированные фрагменты ДНК длиной 532 п.о. для здорового аллеля и 229 п.о. - для мутантного.The technical result of the invention is achieved by the fact that a method is proposed for diagnosing polymorphism g.114437192_114439942del of the SLC4A2 gene, which causes a lethal genetic defect of osteopetrosis in Aberdeen-Angus, Hereford, Friesian, Holstein and Simmental breeds, including analysis of animal biomaterial (skin, blood, sperm) , milk, etc.) DNA by allele-specific PCR using three primers: one forward and two reverse, followed by electrophoresis in an agarose gel, characterized in that oligonucleotide primers with a length of 20 nucleotide pairs with a melting point of 62° are used to amplify the desired DNA fragments C and guanine-cytosine content of 55%, and amplified DNA fragments 532 bp long. for the healthy allele and 229 bp. - for the mutant.
Данный подход имеет следующие преимущества: 1) использование олигонуклеотидных праймеров меньшей длины снижает себестоимость анализа; 2) более высокое содержание гуанина-цитозина в праймерах делает их более термостабильными, что снижает риск образования в ходе ПЦР праймер-димеров или других вторичных структур; 3) разница в длине между нормальным и мутантным аллелем составляет 303 п.о., что очень четко визуализируется на электрофореграмме и облегчает интерпретацию результатов.This approach has the following advantages: 1) the use of oligonucleotide primers of shorter length reduces the cost of analysis; 2) a higher content of guanine-cytosine in primers makes them more thermostable, which reduces the risk of the formation of primer dimers or other secondary structures during PCR; 3) the difference in length between the normal and mutant allele is 303 bp, which is very clearly visualized on the electropherogram and facilitates the interpretation of the results.
Принцип действия разрабатываемого способа основан на использовании двух обратных праймеров, специфичных для здорового и дефектного аллеля и одного общего прямого праймера. При этом мутантному аллелю, ассоциированному с OSC, соответствует фрагмент длиной 229 п.о., а нормальному (не мутантному аллелю) - фрагмент длиной 532 п.о., что позволяет дифференцировать мутантный и нормальный аллели полиморфизма g.114437192_114439942del гена SLC4A2 методом электрофореза в агарозном геле.The operating principle of the developed method is based on the use of two reverse primers, specific for the healthy and defective allele, and one common forward primer. In this case, the mutant allele associated with OSC corresponds to a fragment of 229 bp in length, and the normal (non-mutant allele) corresponds to a fragment of 532 bp in length, which makes it possible to differentiate the mutant and normal alleles of the g.114437192_114439942del polymorphism of the SLC4A2 gene by electrophoresis in agarose gel.
Разрабатываемый способ базируется на определении делеции, охватывающей экзон 2 и около половины экзона 3 гена SLC4A2, размером 2781 п.о. С этой целью был выбран участок гена SLC4A2 крупного рогатого скота внутри делеции и за ее пределами.The method being developed is based on identifying a deletion covering exon 2 and about half of exon 3 of the SLC4A2 gene, measuring 2781 bp. For this purpose, a region of the cattle SLC4A2 gene within and outside the deletion was selected.
Для создания серии референтных образцов с известными генотипами по SLC4A2 (n=79) были использованы образцы ткани (ушной выщип) быков и коров абердин-ангусской породы. ДНК выделяли при помощи набора реагентов «ДНК-Экстран-1» (ЗАО «Синтол», Россия) согласно инструкции. Создание серии референтных генотипов проводили посредством использования способа-прототипа. С этой целью проводили амплификацию фрагментов длиной 330 п.о., характерного для мутантного аллеля, и 475 п.о., характерного для здорового аллеля.To create a series of reference samples with known SLC4A2 genotypes (n=79), tissue samples (ear plucks) from Aberdeen Angus bulls and cows were used. DNA was isolated using the DNA-Extran-1 reagent kit (ZAO Synthol, Russia) according to the instructions. The creation of a series of reference genotypes was carried out using a prototype method. For this purpose, fragments with a length of 330 bp, characteristic of the mutant allele, and 475 bp, characteristic of the healthy allele, were amplified.
Краткое описание чертежейBrief description of drawings
Фиг. 1 - теоретическая модель тест-системы определения гаплотипа OSC на основе метода ПЦР (А) и результаты генотипирования образцов (Б).Fig. 1 - theoretical model of the test system for determining the OSC haplotype based on the PCR method (A) and the results of genotyping samples (B).
В результате проведенного генотипирования была создана серия референтных образцов (n=79), в том числе 1 образец с генотипом OSC (носитель OS) и 78 образцов с генотипом OSF (не носитель).As a result of the genotyping, a series of reference samples (n=79) was created, including 1 sample with the OSC genotype (OS carrier) and 78 samples with the OSF genotype (non-carrier).
Определение полиморфизма g.114437192_114439942del гена SLC4A2 предложенным способом выполняли следующим образом:Determination of the g.114437192_114439942del polymorphism of the SLC4A2 gene using the proposed method was performed as follows:
1. Исходя из локализации делеции были подобраны два обратных специфичных для амплификации здорового и дефектного аллеля праймера (OSRn, OSRm) и одного общего прямого праймера (OSF):1. Based on the localization of the deletion, two reverse primers specific for amplification of healthy and defective alleles (OSRn, OSRm) and one general forward primer (OSF) were selected:
Продукт амплификации праймеров OSF и OSRn характерен для «здорового» аллеля и имеет длину 532 п.о., продукт амплификации праймеров OSF и OSRm характерен для «мутантного» аллеля и имеет длину 229 п.о. Участок делеции помечен звездочками. Фиг. 1А иллюстрирует описанный выше вариант настоящего изобретения.The amplification product of the OSF and OSRn primers is characteristic of the “healthy” allele and has a length of 532 bp; the amplification product of the OSF and OSRm primers is characteristic of the “mutant” allele and has a length of 229 bp. The deletion site is marked with asterisks. Fig. 1A illustrates the embodiment of the present invention described above.
2. Выполняли 37 циклов ПЦР в 10 мкл реакционной смеси следующего состава: 1хПЦР буфер (16.6 мМ (NH4)2SO4, 67.7 мМ Трис-HCl, рН=8.8, 0.1% (v/v) Tween 20, 1.5 мМ MgCl2), 0,2 мМ дНТФ, 10 пмол каждого из праймеров, 1 Ед Taq-полимеразы и 1 мкл ДНК при следующем температурно-временном режиме: начальная денатурация при 95°С - 3 мин, 35 циклов последовательно - 95°С - 0,75 мин, 60,0°С - 0,5 мин, 72°С - 0,5 мин, заключительная элонгация при 72°С - 7 мин;2. 37 PCR cycles were performed in 10 μl of the reaction mixture of the following composition: 1xPCR buffer (16.6 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 67.7 mM Tris-HCl, pH = 8.8, 0.1% (v/v) Tween 20, 1.5 mM MgCl 2 ), 0.2 mM dNTPs, 10 pmol of each primer, 1 U of Taq polymerase and 1 μl of DNA under the following temperature-time conditions: initial denaturation at 95°C - 3 min, 35 cycles sequentially - 95°C - 0 .75 min, 60.0°C - 0.5 min, 72°C - 0.5 min, final elongation at 72°C - 7 min;
3. Определение аллелей OSC и OSF гена SLC4A2 осуществляли методом гель-электрофореза, нанося по 5 мкл амплификата в 3% агарозный гель, электрофоретически разделяли в 1x ТАЕ буфере 25 мин при 110 В и детектировали под ультрафиолетовым светом (УФ). При этом генотипу OSF (не носителю OS) соответствует фрагмент длиной 532 п.о., генотипу АМС (носителю OS) - два фрагмента длиной 532 и 229 п.о. и генотипу OSA (летальный, может быть выявлен только среди плодов или новорожденных телят) - фрагмент длиной 229 п.о. (Фиг. 1Б). Длины фрагментов сравнивали в сопоставлении с K- - отрицательный контроль ПЦР и М - маркером длины 100 п.о. (500×2), Биосан, Россия;3. Determination of the OSC and OSF alleles of the SLC4A2 gene was carried out by gel electrophoresis, applying 5 μl of the amplifier to a 3% agarose gel, electrophoretically separated in 1x TAE buffer for 25 min at 110 V and detected under ultraviolet light (UV). In this case, the OSF genotype (not an OS carrier) corresponds to a fragment with a length of 532 bp, and the AMC genotype (an OS carrier) corresponds to two fragments with a length of 532 and 229 bp. and the OSA genotype (lethal, can only be detected among fetuses or newborn calves) - a fragment 229 bp long. (Fig. 1B). The lengths of the fragments were compared in comparison with the K- negative PCR control and the M marker of 100 bp length. (500×2), Biosan, Russia;
4. Результативность разработанной тест-системы оценивали посредством сравнения результатов генотипирования референтных образцов.4. The effectiveness of the developed test system was assessed by comparing the genotyping results of reference samples.
Пример. Контрольное использование предложенного способа определения полиморфизма g.114437192_114439942del гена SLC4A2 было апробировано на выборке племенного поголовья крупного рогатого скота абердин-ангусской (n=424, три популяции), герефордской (n=49, одна популяция), голштинской (n=63, одна популяция) и симментальской (n=52, одна популяция) пород. Исследование выявило наличие 3 животных с генотипом OSC (носители OS) в одной из популяций абердин-ангусской породы. Таким образом, разработанный способ может быть использован для выявления животных, являющихся скрытыми носителями делеции в гене SLC4A2, ассоциированной с гаплотипом OSC.Example. The control use of the proposed method for determining the g.114437192_114439942del polymorphism of the SLC4A2 gene was tested on a sample of breeding stock of Aberdeen Angus cattle (n=424, three populations), Hereford (n=49, one population), Holstein (n=63, one population ) and Simmental (n=52, one population) breeds. The study revealed the presence of 3 animals with the OSC genotype (OS carriers) in one of the populations of the Aberdeen Angus breed. Thus, the developed method can be used to identify animals that are latent carriers of a deletion in the SLC4A2 gene associated with the OSC haplotype.
Положительный результат изобретения заключается в том, что с применением технически простых методов, не требующих использования дорогостоящих реактивов, оборудования, больших затрат сил и времени, возможно выявление мутантного аллеля OSC гена SLC4A2, что позволит применить данный метод в селекции животных.The positive result of the invention is that using technically simple methods that do not require the use of expensive reagents, equipment, or much effort and time, it is possible to identify the mutant OSC allele of the SLC4A2 gene, which will allow the use of this method in animal breeding.
Предложенный способ применим в генетике сельскохозяйственных животных для выявления полиморфизма g.114437192_114439942del в гене SLC4A2 крупного рогатого скота, ассоциированного с гаплотипом OSC, с целью последующего использования полученных результатов в разведении и селекции крупного рогатого скота в племенных и товарных хозяйствах отрасли мясного скотоводства.The proposed method is applicable in the genetics of farm animals to identify the g.114437192_114439942del polymorphism in the SLC4A2 gene of cattle associated with the OSC haplotype, with the aim of subsequently using the results obtained in the breeding and selection of cattle in breeding and commercial farms of the beef cattle industry.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019122687A RU2809521C2 (en) | 2019-07-15 | Method of diagnosing polymorphism g.114437192-114439942del of slac4a2 gene, which causes lethal genetic defect of osteopetrosis in cattle |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019122687A RU2809521C2 (en) | 2019-07-15 | Method of diagnosing polymorphism g.114437192-114439942del of slac4a2 gene, which causes lethal genetic defect of osteopetrosis in cattle |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2019122687A RU2019122687A (en) | 2021-01-15 |
| RU2809521C2 true RU2809521C2 (en) | 2023-12-12 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2703396C2 (en) * | 2018-03-19 | 2019-10-16 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр животноводства - ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста" (ФГБНУ ФНЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста) | Diagnostic technique for polymorphism of genes agrn, isg15 and hes4 causing lethal genetic defect of multiple arthrogryposis of cattle meat breeds |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2703396C2 (en) * | 2018-03-19 | 2019-10-16 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр животноводства - ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста" (ФГБНУ ФНЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста) | Diagnostic technique for polymorphism of genes agrn, isg15 and hes4 causing lethal genetic defect of multiple arthrogryposis of cattle meat breeds |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| STACEY N, Meyers et al. Research article A deletion mutation in bovine SLC4A2 is associated with osteopetrosis in Red Angus cattle, l. BMC Genomics 2010, 11:337, 14 p. КОНОВАЛОВА Е. Н. и др. Генетический дефект множественного артрогрипоза и его ДНК-диагностика у крупного рогатого скота абердин-ангусской породы, Достижения науки и техники АПК. 2018. Т. 32., N 2., с. 58-61. doi: 10.24411/0235-2451-2018-10215. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cavanagh et al. | Bulldog dwarfism in Dexter cattle is caused by mutations in ACAN | |
| JP2007525217A (en) | Leptin promoter polymorphism and use thereof | |
| Selionova et al. | Polymorphism of the gene GDF9 in sheep of Prikatun type of Altai Mountains breedand its correlation with indices of meat rate productivity | |
| KR20050049430A (en) | Animal genotyping method | |
| JP2008537674A (en) | Linkage between markers in leptin gene and carcass characteristics in steers and heifers in commercial fattening farms | |
| RU2601151C2 (en) | Method of simultaneous genodiagnostic of two mutant alleles causing cvm and blad in cattle, and test system for it | |
| RU2809521C2 (en) | Method of diagnosing polymorphism g.114437192-114439942del of slac4a2 gene, which causes lethal genetic defect of osteopetrosis in cattle | |
| RU2703396C2 (en) | Diagnostic technique for polymorphism of genes agrn, isg15 and hes4 causing lethal genetic defect of multiple arthrogryposis of cattle meat breeds | |
| US8124344B2 (en) | Method of determining an amount of fatty acid contents in bovine intramuscular fat on the basis of genotype of fatty acid synthase gene and method of determining goodness of eating quality of beef on the basis of the results thereof | |
| Mindek et al. | Genetic diversity and structure of Slovak domestic goose breeds. | |
| Gencheva et al. | Genetic polymorphism of alpha S1-casein in Bulgarian sheep breeds and its effect on milk composition | |
| RU2715330C2 (en) | Method of diagnosing polymorphism of nhlrc2 gene causing genetic defect of duplication of aberdeen-angus breed cattle development | |
| RU2646140C1 (en) | Set of primers sequence and allele-specific probes for simultaneous four mutant kappa-casein alleles gene diagnostics in bovine cattle | |
| RU2787249C1 (en) | Method for applying dna testing by the diacylglycerol o-acyltransferase 1 (dgat1) gene for preserving the gene pool of cattle of the belarus red breed group | |
| Radko et al. | Application of 19 microsatellite DNA markers for parentage control in Borzoi dogs | |
| RU2639510C2 (en) | Method of diagnostics of smc2 polymorphism, associated with hh3 fertility haplotype of cattle stock | |
| WO2007068936A2 (en) | Diagnostic method | |
| JP7465485B2 (en) | DNA marker for use in determining risk of developing mastitis and method for determining risk of mastitis using the same | |
| Gongora et al. | Interspecific amplification of peccary microsatellite markers using porcine primers. | |
| RU2688336C2 (en) | Method for determination of genetic potential of dairy products of meat heifers of beef cattle | |
| Al-Awadi et al. | Sex determination of unknown ovine samples gathered from slaughters. | |
| Srinivas et al. | Genotyping and protein profiling of milk β-casein variants (A1 and A2) in Ongole and Punganur breeds of milch cattle | |
| Ardiçli et al. | Genetic variation in the bovine myogenic determination factor 1 (g. 782G> Apolymorphism) and its influence on carcass traits in Turkish Grey Steppe cattle | |
| Schubbert | Molecular Biology Laboratory Layout | |
| Nyoni et al. | Polymorphism of the KAP1. 3 and KRT33A genes in the Swakara sheep of Namibia |