RU2646140C1 - Set of primers sequence and allele-specific probes for simultaneous four mutant kappa-casein alleles gene diagnostics in bovine cattle - Google Patents
Set of primers sequence and allele-specific probes for simultaneous four mutant kappa-casein alleles gene diagnostics in bovine cattle Download PDFInfo
- Publication number
- RU2646140C1 RU2646140C1 RU2017109820A RU2017109820A RU2646140C1 RU 2646140 C1 RU2646140 C1 RU 2646140C1 RU 2017109820 A RU2017109820 A RU 2017109820A RU 2017109820 A RU2017109820 A RU 2017109820A RU 2646140 C1 RU2646140 C1 RU 2646140C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- csn3
- casein
- kappa
- allele
- alleles
- Prior art date
Links
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 title claims abstract description 45
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 title claims abstract description 26
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 title claims abstract description 24
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 23
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 235000021246 κ-casein Nutrition 0.000 claims abstract description 19
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims abstract description 6
- 208000034454 F12-related hereditary angioedema with normal C1Inh Diseases 0.000 claims abstract 4
- 208000016861 hereditary angioedema type 3 Diseases 0.000 claims abstract 4
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- 101710138623 Kappa-casein Proteins 0.000 abstract description 75
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 13
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 12
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 12
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 9
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 9
- 244000309464 bull Species 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 7
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283699 Bos indicus Species 0.000 description 2
- 101000761239 Bos taurus Kappa-casein Proteins 0.000 description 2
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 2
- 102000008192 Lactoglobulins Human genes 0.000 description 2
- 108010060630 Lactoglobulins Proteins 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100007835 Bos taurus COPS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100219630 Bos taurus CSN3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000009946 DNA mutation Effects 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 101000829171 Hypocrea virens (strain Gv29-8 / FGSC 10586) Effector TSP1 Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 241000276420 Lophius piscatorius Species 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000002542 deteriorative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 244000144980 herd Species 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области молекулярной генетики и может быть использовано в ветеринарной практике и зоотехнии для диагностики четырех важных аллелей каппа-казеина (κ-CNA, κ-CNB, κ-CNC, κ-CNE). Предложенный способ и тест-система для его осуществления позволяют одновременно идентифицировать четыре аллеля в локусе каппа-казеина с помощью ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) на основе праймеров и аллель-специфических зондов.The invention relates to the field of molecular genetics and can be used in veterinary practice and zootechnology for the diagnosis of four important kappa-casein alleles (κ-CN A , κ-CN B , κ-CN C , κ-CN E ). The proposed method and the test system for its implementation can simultaneously identify four alleles in the kappa-casein locus using real-time PCR (PCR-RV) based on primers and allele-specific probes.
У крупного рогатого скота известно 15 вариантов каппа-казеина, однако в силу лабораторных возможностей наиболее часто выявлялись CNA и CNB аллеля (Prinzenberg Е.М. et al., 1999; Strzalkowska N. et al., 2002). Установлено, что CNB аллель принимает участие в формировании устойчивости к температурному режиму белков молока, сокращению времени коагуляции, лучшему створаживанию и формированию мицелл различных размеров, которые наиболее приемлемы для изготовления сыра (Мао I.L. et al., 1992; Prinzenberg Е.М. et al., 1999). Выход сыра из молока коров с κ-CNBB генотипом на 10% выше по сравнению с κ-CNAA вариантом. Наличие κ-CNB аллели способствует не только увеличению выхода сыра и улучшению его качества, он еще коррелирует с другими ценными параметрами молочной продуктивности (содержанием белка в молоке и молочной продуктивностью). Влияние κ-CNB аллеля на содержание белка в молоке показано на многих породах, включая черно-пеструю голштинизированную и даже гибридов зебу х черно-пестрая. Данное положение может быть объяснено явлением, вызываемым замещением аминокислот в белке из-за мутаций в IV экзоне каппа-казеинового гена. Поэтому отбор животных по κ-CNB аллелю интегрирован в селекционные программы молочного скота многих стран мира (Marziali A.S., Ng-Kwai-Hang K.F., 1986; Fox P.F., 1992; Freyer G. et al, 1999; Lunden A., Afforselles J., 2000; Амерханов X.A., Марзанов H.C., 1999; Марзанов H.C. и др., 2010; 2014).In cattle, 15 variants of kappa-casein are known, however, due to laboratory capabilities, the CN A and CN B alleles are most often detected (Prinzenberg E.M. et al., 1999; Strzalkowska N. et al., 2002). It has been established that the CN B allele takes part in the formation of resistance to temperature conditions of milk proteins, reduction of coagulation time, better curdling and formation of micelles of various sizes, which are most suitable for the manufacture of cheese (Mao IL et al., 1992; Prinzenberg EM et al., 1999). The yield of cheese from cow milk with κ-CN BB genotype is 10% higher compared to the κ-CN AA variant. The presence of the κ-CN B allele contributes not only to an increase in the yield of cheese and an improvement in its quality, it also correlates with other valuable parameters of milk productivity (protein content in milk and milk productivity). The influence of the κ-CN B allele on the protein content in milk has been shown in many breeds, including black-and-white Holstein and even black-and-white zebu hybrids. This position can be explained by the phenomenon caused by the substitution of amino acids in the protein due to mutations in the fourth exon of the kappa-casein gene. Therefore, the selection of animals for the κ-CN B allele is integrated into the breeding programs of dairy cattle in many countries of the world (Marziali AS, Ng-Kwai-Hang KF, 1986; Fox PF, 1992; Freyer G. et al, 1999; Lunden A., Afforselles J ., 2000; Amerkhanov XA, Marzanov HC, 1999; Marzanov HC et al., 2010; 2014).
В Российской Федерации племенных животных тестируют на носительство только двух аллелей каппа-казеина (κ-CNA, κ-CNB), а результаты в обязательном порядке, наряду с группами крови и мутантными аллелями, вызывающими наследственные болезни, регулярно публикуют в каталогах по племенным быкам (Шапочкин В.В., Ескин Г.В., 2004; Савенко Н.А. и др., 2007; Ескин Г.В. и др., 2010; 2014-2015).In the Russian Federation, breeding animals are tested for the carriage of only two kappa-casein alleles (κ-CN A , κ-CN B ), and the results without fail, along with blood groups and mutant alleles that cause hereditary diseases, are regularly published in breeding catalogs bulls (Shapochkin V.V., Eskin G.V., 2004; Savenko N.A. et al., 2007; Eskin G.V. et al., 2010; 2014-2015).
В открытой печати есть ряд работ, в которых предложены не только методы диагностики, но и показано, что качество молока от животных с κ-CNB аллелем лучше, чем с κ-CNA (Rahali V., Menard J.L., 1991), κ-CNC (Macheboeuf D. et al., 1993) и κ-CNE (Gravert H.О. et al., 1991). Знание точковых мутаций, по которым различаются данные аллели, позволило разработать ПЦР-ПДРФ методы их выявления для κ-CNA и κ-CNB (Denicourt D. et al., 1990; Medrano J.F., Aguilar-Cordova E., 1990; Zadworny D., Kuhnlein U., 1990), κ-CNC (Schlee P., Rotmann O., 1992) и κ-CNE (Schlieben S. et al., 1991). Однако диагностика при раздельном их выявлении занимает много времени. Orita М. et al. (1989) опубликовали, как они считали в то время, простой метод для определения мутаций ДНК и назвали его «Метод определения однонитевого конформационного полиморфизма ДНК (PCR-single strand conformation polymorphism, PCR-SSCP). Метод позволял выявлять наличие нуклеотидных замен, делеций и инсерций на протяжении всей длины амплифицированного продукта. Метод PCR-SSCP заключается в следующем: продукт амплификации денатурируют и полученные однонитевые молекулы разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Любая, даже однонуклеотидная замена приводит к изменению заряда и, как следствие, изменению конформации однонитевого фрагмента и его электрофоретической подвижности в геле, что дает возможность выявлять полиморфные варианты. Однако этот метод не позволяет определить, какие именно изменения произошли? Поэтому метод PCR-SSCP часто проводят вместе с последующим секвенированием.There are a number of works in the open press in which not only diagnostic methods were proposed, but also showed that the quality of milk from animals with the κ-CN B allele is better than with κ-CN A (Rahali V., Menard JL, 1991), κ -CN C (Macheboeuf D. et al., 1993) and κ-CN E (Gravert H.O. et al., 1991). The knowledge of point mutations that distinguish these alleles made it possible to develop PCR-RFLP detection methods for κ-CN A and κ-CN B (Denicourt D. et al., 1990; Medrano JF, Aguilar-Cordova E., 1990; Zadworny D., Kuhnlein U., 1990), κ-CN C (Schlee P., Rotmann O., 1992) and κ-CN E (Schlieben S. et al., 1991). However, diagnosis with their separate identification takes a lot of time. Orita M. et al. (1989) published what they thought was a simple method for determining DNA mutations at that time and called it the “Method for the determination of single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP). The method made it possible to detect the presence of nucleotide substitutions, deletions and insertions throughout the entire length of the amplified product. The PCR-SSCP method is as follows: the amplification product is denatured and the obtained single-stranded molecules are separated by polyacrylamide gel electrophoresis. Any, even single-nucleotide substitution leads to a change in charge and, as a consequence, a change in the conformation of a single-stranded fragment and its electrophoretic mobility in the gel, which makes it possible to identify polymorphic variants. However, this method does not allow to determine exactly what changes have occurred? Therefore, the PCR-SSCP method is often carried out along with subsequent sequencing.
Таким образом, в молекулярной генетике существует очевидная потребность в оценке наиболее часто встречаемых четырех аллелей каппа-казеина (κ-CNA, κ-CNB, κ-CNC, κ-CNE). Кроме того, из-за незнания этих вопросов, закупаемый племенной материал не тестируют на κ-CNA, κ-CNB, κ-CNC, κ-CNE аллели, в результате происходит засорение российских пород крупного рогатого скота нежелательными генотипами по каппа-казеину.Thus, there is an obvious need for molecular genetics to evaluate the most common four kappa casein alleles (κ-CN A , κ-CN B , κ-CN C , κ-CN E ). In addition, due to ignorance of these issues, purchased pedigree material is not tested for κ-CN A , κ-CN B , κ-CN C , κ-CN E alleles, as a result, Russian cattle are clogged with undesirable kappa genotypes casein.
Из технического уровня известен генетический тест для идентификации двух аллелей каппа-казеина (κ-CNA, κ-CNB) крупного рогатого скота (Патент на изобретение №2386700, опубликован 20.04.2010). Данное изобретение принято в качестве ближайшего аналога.A genetic test is known from the technical level for the identification of two alleles of kappa-casein (κ-CN A , κ-CN B ) in cattle (Patent for invention No. 2386700, published April 20, 2010). This invention is accepted as the closest analogue.
Отличительной особенностью заявленного изобретения от выявленного аналога является возможность определения сразу четырех наиболее часто встречаемых аллелей (κ-CNA, κ-CNB, κ-CNC, κ-CNE), т.е. идет одновременное определение четырех вариантов по методике ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ), с помощью праймеров и аллель-специфических зондов, зная точки мутаций, при этом подход детекции принципиально иной. Кроме того, по имеющемуся патенту возможно выявление только двух аллелей (κ-CNA, κ-CNB), что недостаточно в современных условиях оценки технологических возможностей животного, поскольку под κ-CNA аллелью скрываются практически все его известные варианты каппа-казеина. В качестве примера приведем результаты аттестации племенного быка Смайл 91941 англерской породы на каппа-казеин. При диаллельном (κ-CNA, κ-CNB) его анализе он имел бы генотип κ-CNAA, в то же время по предлагаемому нами методу на самом деле, у него κ-CNAC гетерозигота. Таким образом, κ-CNA аллель как бы скрывает засорение стад и пород крупного рогатого скота другими своими производными, в частности κ-CNC и κ-CNE, которые являются наиболее встречаемыми и ухудшателями качества молока на сыропригодность у разводимого молочного скота.A distinctive feature of the claimed invention from the identified analogue is the ability to immediately identify the four most common alleles (κ-CN A , κ-CN B , κ-CN C , κ-CN E ), i.e. four variants are being simultaneously determined by real-time PCR (PCR-RV) using primers and allele-specific probes, knowing the mutation points, and the detection approach is fundamentally different. In addition, according to the patent, it is possible to identify only two alleles (κ-CN A , κ-CN B ), which is insufficient in modern conditions to assess the technological capabilities of an animal, since almost all its known variants of kappa-casein are hidden under the κ-CN A allele. As an example, we give the results of certification of the breeding bull Smile 91941 Angler breed for kappa-casein. In the diallelic (κ-CN A , κ-CN B ) analysis, he would have the κ-CN AA genotype, but at the same time, according to our method, he actually has a κ-CN AC heterozygous. Thus, the κ-CN A allele, as it were, conceals the clogging of cattle and breeds of cattle by its other derivatives, in particular, κ-CN C and κ-CN E , which are the most common and deteriorating milk quality for cheese suitability in farmed dairy cattle.
В заявленном изобретении осуществляется идентификация полиморфизма в локусе каппа-казеина с помощью ПЦР-РВ и использованием TaqMan зондов. В ближайшем аналоге диагностируют каппа-казеин, с использованием электрофоретического метода детекции, что является принципиально другим методом диагностики данного полиморфизма и занимает больше времени, необходимого оборудования и реактивов.In the claimed invention, the identification of polymorphism at the kappa-casein locus is carried out using PCR-RV and using TaqMan probes. In the closest analogue, kappa-casein is diagnosed using the electrophoretic detection method, which is a fundamentally different method for diagnosing this polymorphism and takes more time, the necessary equipment and reagents.
Целью настоящего изобретения является создание способа одновременной диагностики четырех аллелей (κ-CNA, κ-CNB, κ-CNC, κ-CNE) с помощью ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) и разработка тест-системы для его осуществления с использованием наборов олигонуклеотидов-праймеров и зондов, имеющих специфические последовательности.The aim of the present invention is to provide a method for the simultaneous diagnosis of four alleles (κ-CN A , κ-CN B , κ-CN C , κ-CN E ) using real-time PCR (PCR-RV) and the development of a test system for its implementation using sets of primer oligonucleotides and probes having specific sequences.
Предлагаемый к патентованию набор праймеров и зондов в сравнении со всеми изученными аналогами имеет следующие преимущества:The set of primers and probes proposed for patenting in comparison with all the analogues studied has the following advantages:
специфическая структура праймеров и зондов, а также с помощью предлагаемого к патентованию набора праймеров и зондов можно одновременно в одной пробирке провести полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени (ПЦР-РВ), что обеспечивает быстроту проведения диагностики и получение результата сразу по четырем наиболее часто встречаемым аллелям (κ-CNA, κ-CNB, κ-CNC, κ-CNE).the specific structure of primers and probes, as well as using the set of primers and probes proposed for patenting, it is possible to simultaneously conduct a polymerase chain reaction in real time (PCR-RV) in one test tube, which ensures the speed of diagnostics and results immediately in the four most common alleles (κ-CN A , κ-CN B , κ-CN C , κ-CN E ).
В настоящем изобретении представлен способ одновременной диагностики четырех аллелей у различных пород крупного рогатого скота. Тест-система разработана для аттестации всех половозрастных групп животных: быков-производителей, быковоспроизводящих групп коров, ремонтного молодняка, а также семени из спермобанка и эмбрионов.The present invention provides a method for simultaneously diagnosing four alleles in various cattle breeds. The test system is designed to certify all sex and age groups of animals: producer bulls, bull reproducing groups of cows, repair young animals, as well as seed from a sperm bank and embryos.
Техническим результатом заявленного изобретения является возможность диагностики одновременно четырех аллелей (κ-CNA, κ-CNB, κ-CNC, κ-CNE); сокращение времени выполнения полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) (через 3 часа получен результат); нетрудоемкость; возможность выполнять повторности; проводить контроль правильности исследования.The technical result of the claimed invention is the ability to diagnose simultaneously four alleles (κ-CN A , κ-CN B , κ-CN C , κ-CN E ); real-time reduction of the polymerase chain reaction (PCR-RV) (after 3 hours the result was obtained); laboriousness; the ability to perform repetitions; to control the accuracy of the study.
Указанный технический результат достигается тем, что проводят выделение ДНК из биологического материала, постановку полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием реактивов. Реактивы в виде трех комплектов. Каждый комплект состоит из компонентов (реакционная смесь, разбавитель и полимераза), которые необходимо смешать в нужном объеме непосредственно перед проведением исследования.The specified technical result is achieved by the fact that they carry out the extraction of DNA from biological material, the formulation of the polymerase chain reaction in real time using reagents. Reagents in the form of three sets. Each kit consists of components (reaction mixture, diluent and polymerase), which must be mixed in the right volume immediately before the study.
При подготовке к проведению реакции рассчитывают необходимый объем компонентов, исходя из количества исследуемых образцов плюс 4, из которых три положительных контрольных образца и один отрицательный контрольный образец для каждой реакционной смеси. Реактивы смешивают, затем в подготовленные для ПЦР пробирки вносят по 20 мкл приготовленной ПЦР-смеси, в каждую ПЦР пробирку добавляют по 5 мкл контрольных и исследуемых образцов. Пробирки помещают в амплификатор. Отжиг праймеров происходит на этапе циклирования при 64°С в течение 30 с при числе циклов амплификации, равном 40. Анализ полученных данных проводят путем сравнения амплифицированных участков генов, результаты интерпретируют на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией.In preparation for the reaction, the required volume of components is calculated based on the number of test samples plus 4, of which three are positive control samples and one negative control sample for each reaction mixture. The reagents are mixed, then 20 μl of the prepared PCR mixture is added to the prepared for PCR tubes, 5 μl of control and test samples are added to each PCR tube. The tubes are placed in an amplifier. The primers are annealed at the cycling stage at 64 ° С for 30 s with the number of amplification cycles equal to 40. The data obtained are analyzed by comparing the amplified regions of the genes, the results are interpreted based on the presence or absence of the intersection of the fluorescence curve with the threshold line set at the corresponding level.
Тест-система содержит 3 реакционных смеси (50 мМ KCl, 50 мМ TRIS-НСl, 250 нМ dNTP, 2,5 мМ MgCl2, праймеры - в концентрации 200 нМ, аллель-специфические зонды - в концентрации 100 нМ), разбавитель - деионизированная вода 1 мл, 2,5 ед. Taq ДНК-полимеразы, а также 3 положительных контрольных образца, один отрицательный контрольный образец - для каждой реакционной смеси. Праймеры и флуоресцентно-меченные олигонуклеотидные пробы имеют следующие последовательности:The test system contains 3 reaction mixtures (50 mM KCl, 50 mM TRIS-Hcl, 250 nM dNTP, 2.5 mM MgCl 2 , primers at a concentration of 200 nM, allele-specific probes at a concentration of 100 nM), diluent deionized water 1 ml, 2.5 units Taq DNA polymerase, as well as 3 positive control samples, one negative control sample for each reaction mixture. Primers and fluorescently-labeled oligonucleotide probes have the following sequences:
Экспериментально установлен оптимальный состав реакционной смеси для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, подобрано сочетание праймеров, необходимое и достаточное соотношение компонентов реакционной смеси и определен режим постановки ПЦР, что является важным при проведении ПЦР-анализа. Система рассчитана на проведение 100 реакций объемом 25 мкл (20 мкл реакционной смеси +5 мкл исследуемого образца).The optimal composition of the reaction mixture for real-time polymerase chain reaction was experimentally established, a combination of primers, the necessary and sufficient ratio of the components of the reaction mixture were selected, and the PCR formulation mode was determined, which is important when conducting PCR analysis. The system is designed to carry out 100 reactions with a volume of 25 μl (20 μl of the reaction mixture + 5 μl of the test sample).
Подбор праймеров и аллель-специфических зондов (табл. 1) проводили при помощи пакета прикладных программ «Oligo 6.0» на основании анализа нуклеотидных последовательностей локуса каппа-казеина, опубликованных в базе данных Национального центра биотехнологической информации США (NCBI - National Center for Biotechnology Information USA).The selection of primers and allele-specific probes (Table 1) was performed using the Oligo 6.0 application package based on the analysis of nucleotide sequences of the kappa-casein locus published in the database of the National Center for Biotechnology Information USA (NCBI) )
Источником для проведения диагностики служит предварительно выделенная ДНК из образцов биологического материала (цельной крови, спермы, эмбрионов, молока или кожи).The source for the diagnosis is pre-isolated DNA from samples of biological material (whole blood, sperm, embryos, milk or skin).
Выделение ДНК проводили сорбентным методом (ДНК-сорб-В, ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва). Далее выделенную ДНК использовали в реакции: 5 мкл образца добавляют к реакционной смеси ПЦР.DNA was isolated by the sorbent method (DNA-sorb-B, FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Moscow). Next, the extracted DNA was used in the reaction: 5 μl of the sample was added to the PCR reaction mixture.
Реакционная смесь для ПЦР-анализа имеет следующий состав: 50 мМ KCl, 50 мМ TRIS-HCl, 25 мМ dNTP, 250 мМ MgCl2, 2,5 ед. Taq ДНК-полимеразы, праймеры в концентрации 200 нМ, флуоресцентные зонды - в концентрации 100 нМ, при этом праймеры и флуоресцентно-меченные олигонуклеотидные пробы имеют определенные специфические последовательности (табл. 1).The reaction mixture for PCR analysis has the following composition: 50 mm KCl, 50 mm TRIS-HCl, 25 mm dNTP, 250 mm MgCl 2 , 2.5 units Taq DNA polymerases, primers at a concentration of 200 nM, fluorescent probes at a concentration of 100 nM, while primers and fluorescently-labeled oligonucleotide probes have specific specific sequences (Table 1).
Подготовку к проведению реакции осуществляли следующим образом.Preparation for the reaction was carried out as follows.
Необходимый объем компонентов рассчитывали исходя из количества исследуемых образцов плюс 4 (три положительных контрольных образца и один отрицательный контрольный образец) для каждой из трех реакционных смесей. Набор компонентов для реакции представлен в табл. 2.The required volume of components was calculated based on the number of test samples plus 4 (three positive control samples and one negative control sample) for each of the three reaction mixtures. The set of components for the reaction are presented in table. 2.
Примечание: * - содержит все необходимые компоненты для проведения ПЦР-РВ. Условия хранения: №1-3, при температуре -16-20°С.Note: * - contains all the necessary components for PCR-RV. Storage conditions: No. 1-3, at a temperature of -16-20 ° C.
Компоненты размораживали, перемешивали и центрифугировали. Готовили смесь компонентов, добавляя их в порядке, указанном в табл. 3.The components were thawed, mixed and centrifuged. A mixture of components was prepared by adding them in the order indicated in the table. 3.
ПЦР пробирки маркировали. В подготовленные для ПЦР пробирки вносили по 20 мкл смеси компонентов. Затем в каждую ПЦР пробирку вносили по 5 мкл контрольных и исследуемых образцов в соответствии с маркировкой, перемешивали многократным пипетированием и плотно закрывали крышку. Пробирки помещали в амплификатор, затем программировали работу прибора.PCR tubes were labeled. 20 μl of a mixture of components were added to tubes prepared for PCR. Then, 5 μl of control and test samples were added to each PCR tube in accordance with the marking, mixed by repeated pipetting, and the lid was tightly closed. The tubes were placed in an amplifier, then the operation of the device was programmed.
Профиль реакции:Reaction Profile:
1. Удержание температуры 94°С - 3 мин, один повтор.1. Holding the temperature at 94 ° C for 3 minutes, one repeat.
2. Циклирование 1 (без детекции)2. Cycle 1 (without detection)
94°С - 20 сек94 ° C - 20 sec
61°С - 20 сек61 ° C - 20 sec
64°С - 30 сек64 ° C - 30 sec
Цикл повторяли 10 раз.The cycle was repeated 10 times.
3. Циклирование 2 (с детекцией)3. Cycle 2 (with detection)
94°С - 20 сек94 ° C - 20 sec
61°С - 20 сек61 ° C - 20 sec
64°С - 30 сек - детекция по каналам: Green, Yellow64 ° С - 30 sec. - detection through channels: Green, Yellow
Цикл повторяли 30 раз.The cycle was repeated 30 times.
В процессе циклирования отжиг праймеров и синтез новой цепи ДНК происходил при температуре 64°С. При первом циклировании детекцию не проводили, так как данные не репрезентативны. При втором циклировании проводили 30 повторов, в результате получали стабильные данные, которые являются окончательными в плане диагностики генотипов.During cycling, annealing of the primers and synthesis of a new DNA strand occurred at a temperature of 64 ° C. At the first cycling, no detection was performed, since the data are not representative. In the second cycle, 30 repetitions were performed, as a result, stable data were obtained, which are final in terms of the diagnosis of genotypes.
Создание шаблона ПЦР-РВ, а также анализ результатов исследования осуществляли при помощи программного обеспечения «Rotor-Gene 6000 1.8» к прибору Rotor Gene Q (Corbett Research, Австралия).The creation of the PCR-RV template, as well as the analysis of the results of the study was carried out using the software "Rotor-Gene 6000 1.8" to the device Rotor Gene Q (Corbett Research, Australia).
Результатом анализа является определение сочетания четырех аллелей гена каппа-казеина (κ-CNA, κ-CNB, κ-CNC, κ-CNE) у крупного рогатого скота.The result of the analysis is the determination of the combination of four alleles of the kappa-casein gene (κ-CN A , κ-CN B , κ-CN C , κ-CN E ) in cattle.
Интерпретацию результатов анализа исследуемых образцов проводили в соответствии с табл. 4.The interpretation of the results of the analysis of the studied samples was carried out in accordance with table. four.
Примечание: PC1, РС2, РС3 - реакционные смеси 1, 2, 3, содержащие флуоресцентно-меченные олигонуклеотидные пробы со следующими азотистыми основаниями: аденин (А), цитозин (С), гуанин (G), используемые для диагностики генотипов и аллелей в локусе каппа-казеина; Green и Yellow - каналы флуоресценции в приборе Rotor Gene Q (Corbett Research, Австралия), по которым определяются генотипы и аллели в локусе каппа-казеина. Note: PC1, PC2, PC3 - reaction mixtures 1, 2, 3 containing fluorescently labeled oligonucleotide samples with the following nitrogen bases: adenine (A), cytosine (C), guanine (G), used to diagnose genotypes and alleles at the locus kappa casein; Green and Yellow are the fluorescence channels in a Rotor Gene Q instrument (Corbett Research, Australia), which determine genotypes and alleles at the kappa-casein locus.
Для достоверного результата анализа должны выполняться следующие условия:For a reliable analysis result, the following conditions must be met:
1. Результат реакции для ПКО1 должен быть положительным по каналу Green, отрицательным по каналу Yellow.1. The reaction result for PKO1 should be positive on the Green channel , negative on the Yellow channel.
2. Результат реакции для ПКО2 должен быть положительным по каналам Green и Yellow.2. The result of the reaction for PKO2 should be positive on the channels Green and Yellow .
3. Результат реакции для ПКО3 должен быть положительным по каналу Yellow, отрицательным по каналу Green.3. The reaction result for PKO3 should be positive on the Yellow channel, negative on the Green channel.
4. Результат реакции для ОКО должен быть отрицательным по обоим каналам.4. The result of the reaction for the JCE should be negative on both channels.
В случае получения положительных результатов для ОКО по любому из каналов детекции результаты исследования считаются недействительными. Требуется предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации и провести повторный анализ.In the case of obtaining positive results for JCE on any of the detection channels, the results of the study are considered invalid. It is required to take measures to identify and eliminate the source of contamination and conduct a second analysis.
Результат анализа для образца считается неопределенным, если реакция по каналам Green и Yellow отрицательная. В этом случае необходимо повторное исследование образца.The result of the analysis for the sample is considered uncertain if the response on the Green and Yellow channels is negative. In this case, re-examination of the sample is necessary.
В заявленном изобретении использована технология дифференциации аллелей с помощью олигонуклеотидных проб. При использовании флуоресцентно-меченных олигонуклеотидных проб для различения однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) применяют подход, основанный на различии в эффективности гибридизации аллель-специфичных проб на каждом цикле ПЦР. Используют пару гибридизационных проб для каждой реакционной смеси, специфичных для каждого аллельного варианта, меченных разными флуорофорами и разрушаемых в ходе ПЦР за счет 5' - экзонуклеазной активности Taq - полимеразы. Детекция каждого из аллелей основана на различии в эффективности гибридизации пробы на каждом цикле ПЦР с полностью комплементарным пробе аллелем и аллелем с заменой одного нуклеотида. Поскольку только гибридизованные пробы разрушаются ферментом, накопление сигнала пропорционально эффективности гибридизации. Различие в эффективности гибридизации проб очень незначительно, однако эта небольшая разница накапливается от цикла к циклу и в итоге позволяет достоверно различать аллели.In the claimed invention used the technology of differentiation of alleles using oligonucleotide samples. When using fluorescently-labeled oligonucleotide samples to distinguish single nucleotide polymorphisms (SNPs), an approach based on the difference in the hybridization efficiency of allele-specific samples on each PCR cycle is used. A pair of hybridization samples is used for each reaction mixture specific for each allelic variant, labeled with different fluorophores and destroyed during PCR due to the 5 '- exonuclease activity of Taq polymerase. The detection of each of the alleles is based on the difference in the efficiency of the hybridization of the sample on each PCR cycle with a fully complementary sample by the allele and allele with the replacement of one nucleotide. Since only hybridized samples are destroyed by the enzyme, signal accumulation is proportional to the efficiency of hybridization. The difference in the efficiency of the hybridization of the samples is very insignificant, however, this small difference accumulates from cycle to cycle and as a result allows one to reliably distinguish alleles.
Результаты интерпретируются на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией. В качестве примера рассмотрен образец №1 κ-CNAС (табл. 4, рис. 1).The results are interpreted based on the presence or absence of the intersection of the fluorescence curve with a threshold line set at an appropriate level. Sample No. 1 κ-CN AC was considered as an example (Table 4, Fig. 1).
Результатом реакции являются кривые накопления флуоресцентного сигнала, пересекающие пороговую линию. Для РС1 на рисунке присутствует две кривые, пересекающие пороговую линию, что соответствует гетерозиготе АС. Для РС2 на рисунке присутствует одна кривая пересекающая пороговую линию, что соответствует дикому типу или гомозиготе AG. Для РС3 на рисунке присутствует две кривые, пересекающие пороговую линию, что соответствует гетерозиготе GA. Совокупность результатов по трем реакционным смесям позволяет сделать вывод о принадлежности испытуемого образца к генотипу к-CNAC.The result of the reaction is the fluorescence signal accumulation curves crossing the threshold line. For PC1 in the figure, there are two curves crossing the threshold line, which corresponds to the heterozygote of the AS. For PC2, in the figure, there is one curve crossing the threshold line, which corresponds to the wild type or homozygote AG. For PC3, in the figure, there are two curves crossing the threshold line, which corresponds to the GA heterozygote. The set of results for the three reaction mixtures allows us to conclude that the test sample belongs to the k-CN AC genotype.
Основными преимуществами заявляемого изобретения являются:The main advantages of the claimed invention are:
1. Одновременная аттестация элитных животных различных пород крупного рогатого скота по четырем аллелям (κ-CNA, κ-CNB, κ-CNC, κ-CNE) при помощи заявленной тест-системы позволит целенаправленно формировать аллелофонд быков-производителей, быковоспроизводящих групп коров, ремонтный молодняк, а также накапливать племенной материал (банк семени и эмбрионов).1. The simultaneous certification of elite animals of various breeds of cattle in four alleles (κ-CN A , κ-CN B , κ-CN C , κ-CN E ) using the claimed test system will allow you to purposefully form the allele pool of bulls, bulls groups of cows, repair young animals, and also accumulate breeding material (seed and embryo bank).
2. Наличие генетического паспорта по четырем аллелям каппа-казеина (κ-CNA, κ-CNB, κ-CNC, κ-CNE), а также тест-системы для его осуществления позволит эффективно вести селекционную работу в племенных стадах крупного рогатого скота Российской Федерации.2. The presence of a genetic passport for the four alleles of kappa-casein (κ-CN A , κ-CN B , κ-CN C , κ-CN E ), as well as a test system for its implementation, will allow for efficient breeding in large herds of large cattle of the Russian Federation.
3. При завозе племенного материала в Российскую Федерацию из-за рубежа обязательно наличие генетического паспорта по четырем аллелям каппа-казеина (κ-CNA, κ-CNB, κ-CNC, κ-CNE). С целью подтверждения генотипа по каппа-казеину, закупленные животные после карантина должны пройти повторную аттестацию.3. When importing breeding material into the Russian Federation from abroad, it is mandatory to have a genetic passport for the four kappa-casein alleles (κ-CN A , κ-CN B , κ-CN C , κ-CN E ). In order to confirm the kappa-casein genotype, purchased animals must be re-certified after quarantine.
ЛитератураLiterature
1. Амерханов Х.А., Марзанов Н.С. Генетики смотрят в будущее // Племенное дело. - 1999. - №1. - С. 7-9.1. Amerkhanov H.A., Marzanov N.S. Genetics look to the future // Breeding. - 1999. - No. 1. - S. 7-9.
2. Каталог быков-производителей ОАО «Головной центр по воспроизводству сельскохозяйственных животных» / под ред. Ескина Г.В. Быково. - 2010. - 36 с.2. Catalog of manufacturing bulls of the OJSC “Head Center for the Reproduction of Farm Animals” / ed. Yeskina G.V. Bykovo. - 2010 .-- 36 p.
3. Каталог быков-производителей ОАО «Головной центр по воспроизводству сельскохозяйственных животных» / Ескин Г.В. и др. Быково. - 2014-2015. - 36 с.3. Catalog of manufacturing bulls of the OJSC “Head Center for the Reproduction of Farm Animals” / Eskin G.V. and others. Bykovo. - 2014-2015. - 36 p.
4. Марзанов Н.С, Родригез К.С., Иолчиев Б.С., Тохов М.Х., Саморуков Ю.В., Скок Н.М., Марзанова Л.К., Амерханов Х.А. Генетические особенности гибридов зебу х крупный рогатый скот по полиморфным системам белков крови и молока // Доклады РАСХН. - 2010. - №4. - С. 38-43.4. Marzanov N.S., Rodriguez K.S., Iolchiev B.S., Tokhov M.Kh., Samorukov Yu.V., Skok N.M., Marzanova L.K., Amerkhanov H.A. Genetic features of zebu hybrids x cattle by polymorphic systems of blood and milk proteins // Reports of the Russian Academy of Agricultural Sciences. - 2010. - No. 4. - S. 38-43.
5. Марзанов Н.С., Ескин Г.В., Турбина И.С., Попов Н.А., Попов А.Н., Марзанова Л.К., Тохов М.Х., Петров С.Н., Гетоков О.О., Начоев Х.Х., Дохова З.Л., Лось Н.Ф., Марзанова С.Н. Использование генной технологии для характеристики коров бурой швицкой породы, разводимой в предгорной зоне Северного Кавказа. Методическое пособие. Москва. ФГБНУ «Росинформагротех». - 2014. - 53 с.5. Marzanov N.S., Eskin G.V., Turbina I.S., Popov N.A., Popov A.N., Marzanova L.K., Tokhov M.Kh., Petrov S.N., Getokov O.O., Nachoev Kh.Kh., Dohova Z.L., Elk N.F., Marzanova S.N. The use of genetic technology to characterize cows of brown Schwyz breed bred in the foothill zone of the North Caucasus. Toolkit. Moscow. Federal State Budgetary Institution "Rosinformagroteh". - 2014 .-- 53 s.
6. Савенко Н.А., Бошляков В.Н., Жуков В.Ф. и др. Каталог быков-производителей ОАО «Московское» по племенной работе. - Москва: МСХиП МО. - 2007. - 104 с.6. Savenko N.A., Boshlyakov V.N., Zhukov V.F. and other Catalog of bulls-producers of JSC "Moscow" for breeding. - Moscow: Moscow Agricultural Ministry. - 2007. - 104 p.
7. Шапочкин В.В., Ескин Г.В. Каталог быков-производителей ФГУП «ЦСИО». Подольск. - 2002. - 51 с.7. Shapochkin VV, Eskin G.V. Catalog of manufacturing bulls FSUE "TsSIO". Podolsk. - 2002. - 51 p.
8. Denicourt, D., Sabour M.P., McAllister A.J. Detection of bovine k-casein genomic variants by the polymerase chain reaction method // Anim. Genet. - 1990. - Vol. 21. - P. 215-216.8. Denicourt, D., Sabour M.P., McAllister A.J. Detection of bovine k-casein genomic variants by the polymerase chain reaction method // Anim. Genet. - 1990. - Vol. 21. - P. 215-216.
9. Fox P.F. Advanced Dairy Chemistry Proteins. London: Elsevier Science Publisher. - 1992. - Vol. 1.9. Fox P.F. Advanced Dairy Chemistry Proteins. London: Elsevier Science Publisher. - 1992. - Vol. one.
10. Freyer G., Liu Z., Erhardt G., Panicke L. Casein polymorphism and between milk production traits // J. Anim. Breed Genet. - 1999. - Vol. 116. - P. 87-97.10. Freyer G., Liu Z., Erhardt G., Panicke L. Casein polymorphism and between milk production traits // J. Anim. Breed Genet. - 1999. - Vol. 116.- P. 87-97.
11. Gravert, H.O., Schulte-Coerno H., Oloffs K. The relevance of k-casein for genetic differences in cheesemaking properties. Paper presented at Specialists mtg of the Int. Circle of Dairy Research Leaders on Genetic Polymorphism of Milk Proteins. April 11-12, 1991. Laboratory of Dairy Science, Swiss Federal Institute of Technology, Zurich. - 1991.11. Gravert, H. O., Schulte-Coerno H., Oloffs K. The relevance of k-casein for genetic differences in cheesemaking properties. Paper presented at Specialists mtg of the Int. Circle of Dairy Research Leaders on Genetic Polymorphism of Milk Proteins. April 11-12, 1991. Laboratory of Dairy Science, Swiss Federal Institute of Technology, Zurich. - 1991.
12. Lunden A., Afforselles J. Gene frequency of κ-casein in Swedish Red and White breeding bulls // Animal Genomics: Synthesis of Past, Present, and Future Directions. 27th International Conference on Animal Genetics. Minnesota. USA. - 2000. - P. 84.12. Lunden A., Afforselles J. Gene frequency of κ-casein in Swedish Red and White breeding bulls // Animal Genomics: Synthesis of Past, Present, and Future Directions. 27th International Conference on Animal Genetics. Minnesota. USA - 2000 .-- P. 84.
13. Macheboeuf D., Coulon J.B., D'Hour P. Effect of breed, protein genetic variants and feeding on cows' milk coagulation properties // J. Dairy Res. - 1993. - Vol .60. - P. 43-54.13. Macheboeuf D., Coulon J.B., D'Hour P. Effect of breed, protein genetic variants and feeding on cows' milk coagulation properties // J. Dairy Res. - 1993 .-- Vol. 60. - P. 43-54.
14. Mao I.L., Buttazzoni L.G., Aleandri R. Effects of polymorphic milk protein genes on milk yield and composition traits in Holstein cattle // Acta Agric. Scand. - 1992. - Vol. 42. - P. 1-7.14. Mao I.L., Buttazzoni L.G., Aleandri R. Effects of polymorphic milk protein genes on milk yield and composition traits in Holstein cattle // Acta Agric. Scand. - 1992. - Vol. 42. - P. 1-7.
15. Marziali A.S., Ng-Kwai-Hang K.F. Effects of milk composition and genetic polymorphism on cheese composition // J. Dairy Sci. - 1986. - Vol. 69. - P. 2533-2542.15. Marziali A.S., Ng-Kwai-Hang K.F. Effects of milk composition and genetic polymorphism on cheese composition // J. Dairy Sci. - 1986. - Vol. 69. - P. 2533-2542.
16. Medrano J.F., Aguilar-Cordova E. Genotyping of bovine k-casein loci following DNA sequence amplification // Bio/Technology. - 1990. - Vol. 8. - P. 144-146.16. Medrano J.F., Aguilar-Cordova E. Genotyping of bovine k-casein loci following DNA sequence amplification // Bio / Technology. - 1990. - Vol. 8. - P. 144-146.
17. Orita M., Suzuki Y., Sekiya Т., Hayashi K. Rapid and sensitive detection of point mutations and DNA polymorphisms using the polymerase chain reaction // Genomics. - 1989. - Vol. 5. - P. 874-879.17. Orita M., Suzuki Y., Sekiya T., Hayashi K. Rapid and sensitive detection of point mutations and DNA polymorphisms using the polymerase chain reaction // Genomics. - 1989. - Vol. 5. - P. 874-879.
18. Prinzenberg E.M., Krause I., Erhardt G. SSCP analysis at the bovine CSN3 locus discriminates six alleles corresponding to known protein variants (А, В, С, E, F, G) and three new DNA polymorphisms (H, I, A1) // Anim. Biotechnol. - 1999. - Vol. 10. - P 49-62.18. Prinzenberg EM, Krause I., Erhardt G. SSCP analysis at the bovine CSN3 locus discriminates six alleles corresponding to known protein variants (A, B, C, E, F, G) and three new DNA polymorphisms (H, I, A1) // Anim. Biotechnol. - 1999. - Vol. 10. - P 49-62.
19. Rahali V., Menard J.L. Influence of genetic variants of β-lactoglobulin and k-casein on milk composition and cheesemaking properties // Lait. - 1991. - Vol. 71. - P. 275-297.19. Rahali V., Menard J.L. Influence of genetic variants of β-lactoglobulin and k-casein on milk composition and cheesemaking properties // Lait. - 1991. - Vol. 71. - P. 275-297.
20. Schlee, P., Rotmann O. Identification of bovine kappacasein С by using the polymerase chain reaction // J. Anim. Breed. Genet. - 1992. - Vol. 109. - P. 153-155.20. Schlee, P., Rotmann O. Identification of bovine kappacasein C by using the polymerase chain reaction // J. Anim. Breed Genet. - 1992. - Vol. 109. - P. 153-155.
21. Schlieben S., Erhardt G., Senft B. Genotyping of bovine kappa-casein (k-CnA, k-CnB, k-CnC, k-CnE) following DNA sequence amplification and direct sequencing of k-CnE PCR product // Anim. Genet. - 1991. - Vol. 22. - P. 333-342.21. Schlieben S., Erhardt G., Senft B. Genotyping of bovine kappa-casein (k-CnA, k-CnB, k-CnC, k-CnE) following DNA sequence amplification and direct sequencing of k-CnE PCR product / / Anim. Genet. - 1991. - Vol. 22. - P. 333-342.
22. Strzalkowska N., Krzyzewski J., Zwierzchowski L., Ryniewicz Z. Effects of к-casein and β-lactoglobulin loci polymorphism, cows' age, stage of lactation and somatic cell count on daily milk yield and milk composition in Polish Black - and - White cattle // Animal Science Papers and Reports. - 2002. - Vol. 20. - N1. - P. 21-35.22. Strzalkowska N., Krzyzewski J., Zwierzchowski L., Ryniewicz Z. Effects of k-casein and β-lactoglobulin loci polymorphism, cows' age, stage of lactation and somatic cell count on daily milk yield and milk composition in Polish Black - and - White cattle // Animal Science Papers and Reports. - 2002. - Vol. 20. - N1. - P. 21-35.
23. Zadworny D., Kuhnlein U. The identification of the kappa-casein genotype in Holstein dairy cattle using the polymerase chain reaction // Theor. Appl. Genet. - 1990. - Vol. 80. - P. 631-634.23. Zadworny D., Kuhnlein U. The identification of the kappa-casein genotype in Holstein dairy cattle using the polymerase chain reaction // Theor. Appl. Genet. - 1990. - Vol. 80. - P. 631-634.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017109820A RU2646140C1 (en) | 2017-03-24 | 2017-03-24 | Set of primers sequence and allele-specific probes for simultaneous four mutant kappa-casein alleles gene diagnostics in bovine cattle |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017109820A RU2646140C1 (en) | 2017-03-24 | 2017-03-24 | Set of primers sequence and allele-specific probes for simultaneous four mutant kappa-casein alleles gene diagnostics in bovine cattle |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2646140C1 true RU2646140C1 (en) | 2018-03-01 |
Family
ID=61568370
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017109820A RU2646140C1 (en) | 2017-03-24 | 2017-03-24 | Set of primers sequence and allele-specific probes for simultaneous four mutant kappa-casein alleles gene diagnostics in bovine cattle |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2646140C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109321639A (en) * | 2018-10-10 | 2019-02-12 | 北京奶牛中心 | κ-casein genotype method is detected based on KASP technology |
| RU2788734C2 (en) * | 2020-03-16 | 2023-01-24 | Общество с ограниченной ответственностью "Плем-Анализ" (ООО "Плем-Анализ") | Set of sequences of primers and allele-specific probes for differentiation of kappa-casein alleles in cattle |
-
2017
- 2017-03-24 RU RU2017109820A patent/RU2646140C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Валиуллина Э.Ф. и др. Характеристика быков-производителей с различными комбинациями генотипов каппа-казеина/бета-лактоглобулина по молочной продуктивности их матерей //Ветеринарная практика. - 2007. - n. 4. - С. 59-63. * |
| Лоретц О.Г., Матушкина Е.В. Влияние генотипа каппа-казеина на технологические свойства молока // Аграрный вестник Урала. - 2014. - n. 3 (121). * |
| Лоретц О.Г., Матушкина Е.В. Влияние генотипа каппа-казеина на технологические свойства молока // Аграрный вестник Урала. - 2014. - n. 3 (121). Валиуллина Э.Ф. и др. Характеристика быков-производителей с различными комбинациями генотипов каппа-казеина/бета-лактоглобулина по молочной продуктивности их матерей //Ветеринарная практика. - 2007. - n. 4. - С. 59-63. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109321639A (en) * | 2018-10-10 | 2019-02-12 | 北京奶牛中心 | κ-casein genotype method is detected based on KASP technology |
| RU2788734C2 (en) * | 2020-03-16 | 2023-01-24 | Общество с ограниченной ответственностью "Плем-Анализ" (ООО "Плем-Анализ") | Set of sequences of primers and allele-specific probes for differentiation of kappa-casein alleles in cattle |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2310528B1 (en) | A genetic marker test for brachyspina and fertility in cattle | |
| US20150344974A1 (en) | Dna markers for feed efficiency in cattle | |
| Tyul’kin et al. | Polymorphism of somatotropin, prolactin, leptin, and thyreoglobulin genes in bulls | |
| Riaz et al. | Molecular marker assisted study of kappa-casein gene in Nili-Ravi (buffalo) breed of Pakistan | |
| JP2008526252A (en) | DNA markers for bovine growth | |
| WO2011028134A9 (en) | Biological markers and uses therefor | |
| RU2646140C1 (en) | Set of primers sequence and allele-specific probes for simultaneous four mutant kappa-casein alleles gene diagnostics in bovine cattle | |
| RU2601151C2 (en) | Method of simultaneous genodiagnostic of two mutant alleles causing cvm and blad in cattle, and test system for it | |
| RU2691995C2 (en) | Method for simultaneous genodiagnostic of four mutant alleles of kappa-casein in cattle and test system for implementation thereof | |
| Parihar et al. | Genetic polymorphism study in prolactin receptor (PRLR) gene and their association with milk production traits in indian cattle breeds | |
| Dige et al. | Association of single nucleotide polymorphism in leptin gene with growth traits of Jamunapari goat | |
| RU2815238C2 (en) | Method for simultaneous gene diagnosis of four alleles of beta-casein in cattle and test system for its implementation | |
| NZ574724A (en) | Association of single nucleotide polymorphisms, dairy form and productive life | |
| RU2639510C2 (en) | Method of diagnostics of smc2 polymorphism, associated with hh3 fertility haplotype of cattle stock | |
| RU2791519C1 (en) | Method for pcr with allele-specific probes for genotyping cattle by alleles a and b of the kappa-casein gene | |
| Dreger et al. | A case of canine chimerism diagnosed using coat color tests | |
| US20060121472A1 (en) | Method for determining the allelic state of the 5'-end of the $g(a)s1- casein gene | |
| RU2664454C2 (en) | Method for genetic diagnosis of mutant allele that causes short spine syndrome or brachyspine syndrome in cattle and a test system for implementation thereof | |
| RU2386700C1 (en) | Method of detemining a- and b-alleles of cattle kappa casein gene through tetra-primer pcr | |
| RU2798281C1 (en) | Set of sequences of primers and allele-specific probes for simultaneous genodiagnosis of four mutant alleles of beta-casein in cattle | |
| RU2708559C1 (en) | Method for real-time pcr for cattle genotyping by alleles 337c/g of fshr (rs43745234) gene | |
| RU2734964C1 (en) | Method for determining productivity of cows of cattle by polymorphism in lep gene | |
| RU2577990C1 (en) | Set of sequence of primers and allele-specific probes for simultaneous gene diagnostics of two mutant alleles causing cvm and blad in cattle | |
| US8101354B2 (en) | Method for screening for a tobiano coat color genotype | |
| Georgescu et al. | The correlation of production characteristics with the genetic variants of the encoding locus of β-lactoglobulin in three sheep breeds from Romania |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200325 |