RU2788734C2 - Set of sequences of primers and allele-specific probes for differentiation of kappa-casein alleles in cattle - Google Patents
Set of sequences of primers and allele-specific probes for differentiation of kappa-casein alleles in cattle Download PDFInfo
- Publication number
- RU2788734C2 RU2788734C2 RU2020111020A RU2020111020A RU2788734C2 RU 2788734 C2 RU2788734 C2 RU 2788734C2 RU 2020111020 A RU2020111020 A RU 2020111020A RU 2020111020 A RU2020111020 A RU 2020111020A RU 2788734 C2 RU2788734 C2 RU 2788734C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- kappa
- allele
- primers
- cattle
- casein
- Prior art date
Links
- 108060001966 CSN3 Proteins 0.000 title claims abstract description 18
- 102100002888 CSN3 Human genes 0.000 title claims abstract description 14
- 235000021246 κ-casein Nutrition 0.000 title claims abstract description 13
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 title claims abstract description 9
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title abstract description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 claims description 2
- 230000001488 breeding Effects 0.000 abstract description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 3
- 238000003975 animal breeding Methods 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 5
- 210000004080 Milk Anatomy 0.000 description 5
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 5
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 5
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 210000000349 Chromosomes Anatomy 0.000 description 1
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 210000004544 DC2 Anatomy 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 101700023910 GCAB Proteins 0.000 description 1
- 229960000310 ISOLEUCINE Drugs 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L MgCl2 Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 244000144980 herd Species 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory Effects 0.000 description 1
- 230000002530 ischemic preconditioning Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 229940108461 rennet Drugs 0.000 description 1
- 108010058314 rennet Proteins 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к области молекулярной биологии и селекции сельскохозяйственных животных и может быть использовано для дифференциации аллелей А и В гена каппа-казеина крупного рогатого скота.The invention relates to the field of molecular biology and breeding of farm animals and can be used to differentiate the A and B alleles of the bovine kappa-casein gene.
Каппа-казеин - белок молока, который отвечает за взаимодействие с сычужным ферментом и образование казеинового сгустка, тем самым, являясь основным белком для сыроварения. От конформационной структуры данного белка зависит качество сыродельческой продукции и общий выход сыра и, соответственно, количество используемого сырья для его производства. Белок, входящий в состав молока, полученного от коров с гомозиготным генотипом ВВ гена каппа-казеина, обладает лучшими коагуляционными свойствами, что сказывается на сокращение времени образования казеинового сгустка на 24% и повышение общего выхода сыра из данного молока на 10%. Знание информации о генотипе животного по данному гену позволит производителям молока формировать стада животных для получения узконаправленной продукции, которую можно будет сдавать на перерабатывающие предприятия на 2-3 рубля (10%) выше, чем среднерыночная, а перерабатывающим предприятиям - повысить собственную производительность и снизить себестоимость конечной продукции, что позволит увеличить оборот на 20%.Kappa-casein is a milk protein that is responsible for interacting with rennet and forming a casein clot, thus being the main protein for cheese making. The quality of cheese products and the overall yield of cheese and, accordingly, the amount of raw materials used for its production depend on the conformational structure of this protein. The protein, which is part of the milk obtained from cows with homozygous genotype BB of the kappa-casein gene, has better coagulation properties, which affects the reduction in the formation of a casein clot by 24% and an increase in the total yield of cheese from this milk by 10%. Knowing the information about the genotype of an animal for this gene will allow milk producers to form herds of animals to obtain highly specialized products that can be delivered to processing enterprises 2-3 rubles (10%) higher than the market average, and processing enterprises to increase their own productivity and reduce costs final products, which will increase turnover by 20%.
Ген каппа-казеина располагается в 6 хромосоме и на текущий момент имеет 13 аллелей, из которых А и В являются самыми часто встречаемыми. Основой, влияющей на технологические свойства белка каппа-казеина, являются замены в позициях 136 и 148 белковой цепи IV экзона. Это замена аминокислоты Треонин (аллель А) на Изолейцин (аллель В), вследствие нуклеотидной замены (SNP) C>T, и Аспаргина на Аланин, вследствие нуклеотидной замены А>С в позициях 136 и 148, соответственно. При этом, по данным базы данных NCBI в IV экзоне имеются еще две синонимические мутации (SNP), отличающие аллель А от аллеля В, одна из которых, позиция 168 A>G (Ala>Ala), подтверждена Федерацией разведения крупного рогатого скота Ирландии.The kappa-casein gene is located on chromosome 6 and currently has 13 alleles, of which A and B are the most common. The basis that affects the technological properties of the kappa-casein protein are substitutions in positions 136 and 148 of the protein chain of exon IV. This is the substitution of the amino acid Threonine (allele A) for Isoleucine (allele B), due to the nucleotide substitution (SNP) C>T, and Aspargine to Alanine, due to the nucleotide substitution A>C at positions 136 and 148, respectively. At the same time, according to the NCBI database, exon IV contains two more synonymous mutations (SNPs) that distinguish the A allele from the B allele, one of which, position 168 A>G (Ala>Ala), was confirmed by the Cattle Breeding Federation of Ireland.
Известен набор последовательностей праймеров и аллель-специфических зондов для одновременной генодиагностики четырех мутантных аллелей каппа-казеина κ-CNA, κ-CNB, κ-CNC, κ-CNE у крупного рогатого скота путем проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (патент РФ 2646140, МПК C12Q 1/68, опубл. 01.03.2018). Однако использование шести аллель-специфических зондов значительно усложняет диагностику, а идентификация генотипов по четырем мутантным аллелям является излишней для сортировки животных по показателям молочной продуктивности и технологическим свойствам молока. Патент РФ №2646140, принятый за прототип, основан на распознавании стандартной SNP-мутации А>С и, соответственно, применении ДНК-зондов, отличающихся только одним mismatch-нуклеотидом.Known set of primer sequences and allele-specific probes for simultaneous gene diagnostics of four mutant kappa-casein alleles κ-CN A , κ-CN B , κ-CN C , κ-CN E in cattle by real-time polymerase chain reaction (RF patent 2646140,
Задачей настоящего изобретения была разработка методики ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией (ПЦР в режиме «реального времени») для определения аллельного полиморфизма гена каппа-казеина крупного рогатого скота.The aim of the present invention was to develop a PCR technique with hybridization fluorescence detection (real-time PCR) for determining the allelic polymorphism of the bovine kappa-casein gene.
Технический результат заключается в специфичной дифференциации аллелей А и В гена каппа-казеина крупного рогатого скота более точным и менее трудозатратным способом.The technical result consists in the specific differentiation of the A and B alleles of the bovine kappa-casein gene in a more accurate and less labor-intensive way.
Технический результат достигается проведением полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флюоресцентной детекцией в режиме «реального времени» с использованием праймеров CSN3-RT-F-114 и CSN3-RT-R-114 и аллель-специфических зондов Probe 1 и Probe 2.The technical result is achieved by carrying out a polymerase chain reaction with hybridization-fluorescent detection in the "real time" mode using primers CSN3-RT-F-114 and CSN3-RT-R-114 and allele-specific probes Probe 1 and
На фиг. 1 приведена схема расположения SNP в IV экзоне гена каппа-казеина.In FIG. Figure 1 shows the location of SNPs in exon IV of the kappa-casein gene.
Предложенная последовательность праймеров и олигонуклеотидных ДНК-зондов отличается от прототипа тем, что олигонуклеотидные зонды подобраны к участку IV экзона гена каппа-казеина, содержащего две синонимические мутации (SNP), располагающиеся на расстоянии друг от друга в 8 п.о., и отличающиеся друг от друга двумя mismatch-нуклеотидами. Использование данной конструкции олигонуклеотидных ДНК-зондов приводит к большей разнице в температурах плавления между mismatch и комплементарных ДНК-зондом и усилению конкурентных условий при одновременном присутствии обоих ДНК-зондов в реакционной смеси, что приводит к полному ингибированию неспецифического связывания олигонуклеотидных зондов.The proposed sequence of primers and oligonucleotide DNA probes differs from the prototype in that the oligonucleotide probes are matched to region IV of the kappa-casein gene exon containing two synonymous mutations (SNPs) located at a distance of 8 bp from each other and differing from each other from each other by two mismatch nucleotides. The use of this design of oligonucleotide DNA probes leads to a greater difference in melting temperatures between mismatch and complementary DNA probes and increased competitive conditions with the simultaneous presence of both DNA probes in the reaction mixture, which leads to complete inhibition of non-specific binding of oligonucleotide probes.
Указанный технический результат достигается тем, что проводят выделение ДНК из биологического материала, постановку полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием указанных олигонуклеотидных праймеров и ДНК-зондов. Реакционную смесь для ПЦР готовят из расчета количества имеющихся образцов и дополнительно контрольные образцы в количестве 4 шт.: отрицательный, положительный с генотипом АА, положительный с генотипом АВ, положительный с генотипом ВВ. Смешанные реактивы, содержащие 50 мМ KCl, 50 мМ TRIS-HCl, 200 нМ dNTP, 2,5 мМ MgCl2, праймеры в концентрации 0,2 рМ/мкл, аллель-специфические зонды в концентрации 0,1 рМ/мкл, разливают в ПЦР-пробирки или ПЦР-планшеты объемом 0,2 мл, в количестве 19 мкл и добавляют 1 мкл выделенной ДНК или контрольных образцов. Пробирки помещают в амплификатор с функцией «real-time». Для анализа используется следующий протокол:Said technical result is achieved by extracting DNA from biological material, setting up a real-time polymerase chain reaction using said oligonucleotide primers and DNA probes. The reaction mixture for PCR is prepared based on the number of available samples and additional control samples in the amount of 4 pieces: negative, positive with the AA genotype, positive with the AB genotype, positive with the BB genotype. Mixed reagents containing 50 mM KCl, 50 mM TRIS-HCl, 200 nM dNTP, 2.5 mM MgCl 2 , primers at a concentration of 0.2 pM/μl, allele-specific probes at a concentration of 0.1 pM/μl, are poured into PCR tubes or PCR plates with a volume of 0.2 ml, in the amount of 19 µl and add 1 µl of isolated DNA or control samples. The tubes are placed in a real-time cycler. The following protocol is used for analysis:
Инициация: 37°С - 5 минутInitiation: 37°C - 5 minutes
Предварительная денатурация: 94°С - 5 минутPre-denaturation: 94°C - 5 minutes
Цикл из 40 повторовCycle of 40 repetitions
Денатурация: 94°С - 15 секундDenaturation: 94°C - 15 seconds
Совмещенный отжиг и элонгация: 60°С - 1 минутаCombined annealing and elongation: 60°C - 1 minute
Считывание уровня флюоресценции каждый цикл по окончанию этапа отжига и элонгации.Reading the fluorescence level every cycle at the end of the annealing and elongation step.
Интерпретация результатов проводится на основании пересечения кривой флюоресценции в соответствующих каналах детекции с пороговой линией и по конечному уровню флюоресценции. Пересечение пороговой линии и величина уровня флюоресценции в пределах 25-29 и 1200-1800, соответственно, в канале FAM и отсутствие в канале HEX, интерпретируется как гомозигота ВВ. Пересечение пороговой линии и величина уровня флюоресценции в пределах 22-27 и 1800-2300, соответственно, в канале HEX и отсутствие в канале FAM, интерпретируется как гомозигота АА. Пересечение пороговой линии и величина уровня флюоресценции в пределах 24-30 и 900-1500, соответственно, в обоих каналах, интерпретируется как гетерозигота АВ.The interpretation of the results is based on the intersection of the fluorescence curve in the respective detection channels with the threshold line and on the final level of fluorescence. The intersection of the threshold line and the value of the fluorescence level within 25-29 and 1200-1800, respectively, in the FAM channel and the absence in the HEX channel, is interpreted as a BB homozygote. The intersection of the threshold line and the value of the fluorescence level within 22-27 and 1800-2300, respectively, in the HEX channel and the absence in the FAM channel, is interpreted as an AA homozygote. The intersection of the threshold line and the value of the level of fluorescence in the range of 24-30 and 900-1500, respectively, in both channels, is interpreted as an AB heterozygote.
Перечень последовательностейSequence listing
Праймеры:Primers:
SEQ ID No1 CSN3-RT-F-114: 5'-agagcccacctgagatcaac-3'SEQ ID NO1 CSN3-RT-F-114: 5'-agagcccacctgagatcaac-3'
SEQ ID No2 CSN3-RT-R-114: 5'-tcttggctgttattcattttgc-3'SEQ ID NO2 CSN3-RT-R-114: 5'-tcttggctgttattcattttgc-3'
Зонды:Probes:
SEQ ID No3 Probe 1: FAM-caactgcggtctaaatactctaaggag-BHQ1SEQ ID No3 Probe 1: FAM-caactgcggtctaaatactctaaggag-BHQ1
SEQ ID No4 Probe 2: HEX-caactgcagtctaaaaactctaaggag-BHQ1SEQ ID No4 Probe 2: HEX-caactgcagtctaaaaactctaaggag-BHQ1
Claims (7)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020111020A RU2788734C2 (en) | 2020-03-16 | Set of sequences of primers and allele-specific probes for differentiation of kappa-casein alleles in cattle |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020111020A RU2788734C2 (en) | 2020-03-16 | Set of sequences of primers and allele-specific probes for differentiation of kappa-casein alleles in cattle |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2020111020A RU2020111020A (en) | 2021-09-16 |
| RU2788734C2 true RU2788734C2 (en) | 2023-01-24 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007107862A2 (en) * | 2006-03-22 | 2007-09-27 | Universita' Degli Studi Di Milano | Method for the identification of bovine milk protein genetic polymorphisms |
| RU2646140C1 (en) * | 2017-03-24 | 2018-03-01 | Общество с ограниченной ответственностью "АгроВет" | Set of primers sequence and allele-specific probes for simultaneous four mutant kappa-casein alleles gene diagnostics in bovine cattle |
| RU2701648C2 (en) * | 2018-02-19 | 2019-10-01 | Рамиль Ришадович Вафин | Method for carrying out real time pcr for genotyping cattle on alleles a and b of the csn3 gene |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007107862A2 (en) * | 2006-03-22 | 2007-09-27 | Universita' Degli Studi Di Milano | Method for the identification of bovine milk protein genetic polymorphisms |
| RU2646140C1 (en) * | 2017-03-24 | 2018-03-01 | Общество с ограниченной ответственностью "АгроВет" | Set of primers sequence and allele-specific probes for simultaneous four mutant kappa-casein alleles gene diagnostics in bovine cattle |
| RU2701648C2 (en) * | 2018-02-19 | 2019-10-01 | Рамиль Ришадович Вафин | Method for carrying out real time pcr for genotyping cattle on alleles a and b of the csn3 gene |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Д. В. РЕБРИКОВ и др., ПЦР в реальном времени, 6-е издание, БИНОМ, лаборатория знаний, Москва, 2015, стр. 85, 86. SITKOWSKA B. et al., Relations between kappa-casein polymorphism (CSN3) and milk performance traits in heifer cows, Journal of Central European Agriculture, 2008, Volume 9, No. 4, pp.641-644. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hallén et al. | Effect of genetic polymorphism of milk proteins on rheology of chymosin-induced milk gels | |
| US5856104A (en) | Polymorphisms in the glucose-6 phosphate dehydrogenase locus | |
| AU2010200649B2 (en) | Leptin promoter polymorphisms and uses thereof | |
| KR101213217B1 (en) | SNP Markers Associated with Meat Quantity and Beef Quality in Hanwoo | |
| US20060275793A1 (en) | Association between markers in the leptin gene and carcass traits in commercial feedlot steer and heifers | |
| RU2788734C2 (en) | Set of sequences of primers and allele-specific probes for differentiation of kappa-casein alleles in cattle | |
| RU2791519C1 (en) | Method for pcr with allele-specific probes for genotyping cattle by alleles a and b of the kappa-casein gene | |
| KR101472000B1 (en) | SNP for determination of meat quantity in Hanwoo and diagnosis method of meat quantity using the same | |
| Letaief et al. | Tunisian camel casein gene characterization reveals similarities and differences with Sudanese and Nigerian populations | |
| Ilie et al. | Screening of RYR1 genotypes in swine population by a rapid and sensitive method | |
| Kyseľová et al. | Simultaneous identification of CSN3 and LGB genotypes in cattle by high-resolution melting curve analysis | |
| US20080096207A1 (en) | Leptin and Growth Hormone Receptor Gene Markers Associated with Rearing, Carcass Traits and Productive Life in Cattle | |
| KR101438524B1 (en) | DNA marker for detecting increase of porcine meat quality using a SNP in porcine MYF5 gene | |
| Ladyka et al. | The Comparison of CSN2 (rs43703011) Beta-Casein Gene Options Frequencies in Different Breeds of Ukraine Cows and the Prospect of Creating Herds with the A2/А2 Genotype | |
| Ladyka et al. | Study of beta-casein gene polymorphism in dairy cattle populations of Ukraine | |
| US20070026404A1 (en) | Production characteristics of cattle | |
| Remus-Alexandru et al. | Analysis of Beta-Lactoglobulin and Kappa-Casein genotypes in cattle | |
| AU2004201351B2 (en) | CRH and POMC effects on animal growth | |
| WO2023141462A2 (en) | Selection method for domestic animal breeding | |
| KR20230090167A (en) | SNP marker set and method to identify Korean black cornish population | |
| ANCA et al. | IDENTIFICATION OF BETA-LACTOGLOBULIN AND KAPPA-CASEIN GENOTYPES IN CATTLE IDENTIFICAREA GENOTIPURILOR BETA-LACTOGLOBULINEI ŞI KAPA-CASEINEI LA BOVINE | |
| VĂTĂŞESCU-BALCAN et al. | Alpha-lactalbumin genotypes identification in Romanian Black Spotted cattle breed |