RU2809198C1

RU2809198C1 - Nutrient medium for cultivation of methanotrophic bacteria

Info

Publication number: RU2809198C1
Application number: RU2023113185A
Authority: RU
Inventors: Ольга Владимировна Прокудина; Анастасия Валерьевна Третьякова; Георгий Вячеславович Песцов
Original assignee: Ольга Владимировна Прокудина
Filing date: 2023-05-22
Publication date: 2023-12-07

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention is a solid nutrient medium for the cultivation of methanotrophic bacteria, containing sources of nitrogen, phosphorus, mineral salts and methanol (CH₃OH) as the only source of carbon and energy, while to accelerate the growth and increase the activity of bacterial colonies, 0. 01% CaCl₂, which corresponds to 0.1 g per 1 liter of medium.

EFFECT: invention makes it possible to increase the growth rate of colonies of methanotrophic bacteria.

1 cl, 2 tbl

Description

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно: к способу культивирования метанотрофных бактерий, который может быть использован для получения микробиологического белка, для кормления животных.The invention relates to the microbiological industry, namely to a method for cultivating methanotrophic bacteria, which can be used to obtain microbiological protein for animal feeding.

На сегодняшний день в России дефицит кормового белка составляет более 2,5 млн т в год. По данным Минсельхоза России за 2018 год производство белковых кормов в России составило 11,8 млн. тонн, что удовлетворят потребность сельскохозяйственных предприятий только на 70%, поэтому спрос на белковые корма продолжает расти. Недостаточное количество белка в рационе сельскохозяйственных животных приводит к снижению их продуктивности и увеличению риска болезней. Одним из перспективных путей решения данной проблемы является использование метанотрофных бактерий, продуцирующих микробиологический белок. Метанотрофные бактерии в оптимальных условиях активно перерабатывают одноуглеродные соединения (метан, метанол и др.), быстро размножаются и наращивают свою биомассу, богатую ценным белком, витаминами и другими биологически активными веществами.Today in Russia the deficit of feed protein is more than 2.5 million tons per year. According to the Ministry of Agriculture of Russia, in 2018, the production of protein feed in Russia amounted to 11.8 million tons, which will satisfy the needs of agricultural enterprises by only 70%, so the demand for protein feed continues to grow. Insufficient protein in the diet of farm animals leads to a decrease in their productivity and an increased risk of disease. One of the promising ways to solve this problem is the use of methanotrophic bacteria that produce microbiological protein. Under optimal conditions, methanotrophic bacteria actively process one-carbon compounds (methane, methanol, etc.), quickly multiply and increase their biomass, rich in valuable protein, vitamins and other biologically active substances.

Известны различные штаммы метанотрофных бактерий, продуцирующие кормовой микробиологический белок, например, штаммы видов Pseudomonas methanica, Methylococcus capsulatus, Methylocystis parvus, Methylosinus sporium, Methylosinus trichospohum, Methylobacter acidophilus, Methylomonas rubra, Methylococcus sp., Methylococcus capsulatus, Methylococcus minimus, Methylomonas methanica, Methylomonas agile. Штаммы этих видов характеризуются различными скоростями роста и выходом биомассы. В качестве потенциальных продуцентов микробиологической биомассы мы использовали штамм Methylomonas methanica B-2110 и штамм Methylococcus capsulatus B-2990, так как эти штаммы сохраняют способность окислять метан после культивирования на питательной среде с метанолом.Various strains of methanotrophic bacteria are known that produce feed microbiological protein, for example, strains of the species Pseudomonas methanica, Methylococcus capsulatus, Methylocystis parvus, Methylosinus sporium, Methylosinus trichospohum, Methylobacter acidophilus, Methylomonas rubra, Methylococcus sp., Methylococcus capsulatus, Methylococcus minimus , Methylomonas methanica, Methylomonas agile. Strains of these species are characterized by different growth rates and biomass yield. We used the Methylomonas methanica strain B-2110 and the Methylococcus capsulatus strain B-2990 as potential producers of microbiological biomass, since these strains retain the ability to oxidize methane after cultivation on a nutrient medium with methanol.

Наиболее близким аналогом является способ культивирования штамма Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13479 в питательной среде, содержащей следующие минеральные компоненты (на 1 литр среды): (NH₄)₂SO₄ - 0,56 г; MgSO₄⋅7H₂O - 0,02 г; KCl - 0,025 г; (NH₄)HPO₄- 0,04 г; (NH₄)H₂PO₄- 0,04 г; ZnSO₄⋅7H₂O - 0,3 мг; MnSO₄⋅5H₂O - 0,54 мг; CuSO₄⋅5H₂O - 0,54 мг; H₃BO₃- 0,6 мг; FeSO₄⋅7H₂O - 2,0 мг; Na₂MoO₄⋅2H₂O - 0,045 мг; CoSO₄⋅7H₂O - 0,048 мг; Трилон Б - 5,0 мг; рН среды 5,6-5,8 (патент RU 2 728 345 C1). Но в данном составе отсутствует CaCl₂, который является стимулятором роста метанотрофов и стабилизирует кислотность питательной среды.The closest analogue is the method of cultivating the strain Methylococcus capsulatus VKPM B-13479 in a nutrient medium containing the following mineral components (per 1 liter of medium): (NH ₄ ) ₂ SO ₄ - 0.56 g; MgSO ₄ ⋅7H ₂ O - 0.02 g; KCl - 0.025 g; (NH ₄ )HPO ₄ - 0.04 g; (NH ₄ )H ₂ PO ₄ - 0.04 g; ZnSO ₄ ⋅7H ₂ O - 0.3 mg; MnSO ₄ ⋅5H ₂ O - 0.54 mg; CuSO ₄ ⋅5H ₂ O - 0.54 mg; H ₃ BO ₃ - 0.6 mg; FeSO ₄ ⋅7H ₂ O - 2.0 mg; Na ₂ MoO ₄ ⋅2H ₂ O - 0.045 mg; CoSO ₄ ⋅7H ₂ O - 0.048 mg; Trilon B - 5.0 mg; pH of the medium is 5.6-5.8 (patent RU 2 728 345 C1). But this composition does not contain CaCl ₂ , which is a growth stimulator of methanotrophs and stabilizes the acidity of the nutrient medium.

Также существует способ культивирования метанотрофных бактерий, в минеральную питательную среду дополнительно вводится угольная кислота в виде бикарбоната натрия или углекислого газа. Питательная среда имеет следующий состав (г/л): CH₃OH -1,4 мл; NaHCO₃- 1,4 г; KNO₃- 1,0 г; NaHPO₄- 1,5 г; MgSO₄- 0,2 г; CaCl₂- 0,02 г; Трилон Б - 0,05 мг; FeSO₄⋅7 H₂O - 0,002 г/л; H₃BO₃ - 0,3 мг; MnCl₂⋅4 H₂O - 0,03 мг/л; CoCl₂⋅6 H₂O - 0,2 мг/л; ZnSO₄⋅7 H₂O - 0,1 мг/л; Na₂MoO₄ - 0,03 мг/л; NiCl₂⋅6 H₂O - 0,02 мг/л; CuCl₂⋅2 H₂O - 0,01 мг/л, рН среды 6,8 (патент SU770174A1). Но недостатком данного способа является то, что угольная кислота распадается на углекислый газ и воду, а в процессе жизнедеятельности бактерий также выделяется углекислый газ, известно, что избыток CO₂ приводит к ингибированию роста и развития бактериальных клеток.There is also a method for cultivating methanotrophic bacteria; carbonic acid is additionally introduced into the mineral nutrient medium in the form of sodium bicarbonate or carbon dioxide. The nutrient medium has the following composition (g/l): CH ₃ OH -1.4 ml; NaHCO ₃ - 1.4 g; KNO ₃ - 1.0 g; NaHPO ₄ - 1.5 g; MgSO ₄ - 0.2 g; CaCl ₂ - 0.02 g; Trilon B - 0.05 mg; FeSO ₄ ⋅7 H ₂ O - 0.002 g/l; H ₃ BO ₃ - 0.3 mg; MnCl ₂ ⋅4 H ₂ O - 0.03 mg/l; CoCl ₂ ⋅6 H ₂ O - 0.2 mg/l; ZnSO ₄ ⋅7 H ₂ O - 0.1 mg/l; Na ₂ MoO ₄ - 0.03 mg/l; NiCl ₂ ⋅6 H ₂ O - 0.02 mg/l; CuCl ₂ ⋅2 H ₂ O - 0.01 mg/l, pH 6.8 (patent SU770174A1). But the disadvantage of this method is that carbonic acid breaks down into carbon dioxide and water, and during the life of bacteria, carbon dioxide is also released; it is known that excess CO ₂ leads to inhibition of the growth and development of bacterial cells.

Цель изобретения - увеличить скорость роста колоний метанотрофных бактерий при культивировании на твердой питательной среде (на примере штаммов Methylomonas methanica B-2110 и Methylococcus capsulatusB-2990) путем добавления к питательной среде № 221 0,01% CaCl₂. Преимущество экспериментальной питательной среды состоит в том, что она способствует более эффективному росту штаммов метанотрофных бактерий за счет количества CaCl₂, обеспечивающего наилучший рост и развитие колоний штаммов метанотрофных бактерий.The purpose of the invention is to increase the growth rate of colonies of methanotrophic bacteria when cultivated on a solid nutrient medium (using the example of strains Methylomonas methanica B-2110 and Methylococcus capsulatus B-2990) by adding 0.01% CaCl ₂ to nutrient medium No. 221. The advantage of the experimental nutrient medium is that it promotes more efficient growth of strains of methanotrophic bacteria due to the amount of CaCl ₂ that ensures the best growth and development of colonies of strains of methanotrophic bacteria.

Чтобы приготовить питательную среду для культивирования метанотрофных бактерий предварительно растворяли каждый компонент в дистиллированной воде, смешивали, добавляли 10 г/л агар-агара, разогревали на водяной бане до полного растворения агар-агара. Полученную питательную среду разливали в пробирки и стерилизовали в автоклаве при давлении 1,2 атм. в течение 45 мин., стерильный метанол вносили пипеткой в пробирки с питательной средой после стерилизации. Посев чистых культур микроорганизмов проводили в ламинарном боксе LORICA БАВнп-01-«Ламинар-С»-1,2. пробирки инокулировали 7-ми суточными штаммами Methylomonas methanica B-2110 и Methylococcus capsulatus B-2990. Далее пробирки помещали в вакуумный эксикатор. С помощью вакуумного насоса DSZH WK-115N откачивали воздух из эксикатора, что обеспечивало создание анаэробных условий. Затем эксикатор с пробирками помещали в термостат ТС-1/20, где инкубировали пробирки 21 сутки, штамм Methylomonas methanica B-2110 при температуре 30°C и штамм Methylococcus capsulatus B-2990 при температуре 37°C. Рост колоний оценивали визуально. На плотных средах образовывались кремовые и розовые ослизненные колонии. Рост колоний измеряли под микроскопом при помощи окуляр-микрометра. Замеры производили на 7-е, 14-е и 21-е сутки. Результаты представлены в табл.1, 2.To prepare a nutrient medium for the cultivation of methanotrophic bacteria, each component was first dissolved in distilled water, mixed, 10 g/l agar-agar was added, and heated in a water bath until the agar-agar was completely dissolved. The resulting nutrient medium was poured into test tubes and sterilized in an autoclave at a pressure of 1.2 atm. for 45 minutes, sterile methanol was pipetted into tubes with nutrient medium after sterilization. Inoculation of pure cultures of microorganisms was carried out in a laminar flow hood LORICA BAVnp-01-“Laminar-S”-1,2. the tubes were inoculated with 7-day-old strains of Methylomonas methanica B-2110 and Methylococcus capsulatus B-2990. Next, the tubes were placed in a vacuum desiccator. Using a DSZH WK-115N vacuum pump, air was pumped out from the desiccator, which ensured the creation of anaerobic conditions. Then the desiccator with the test tubes was placed in a TS-1/20 thermostat, where the test tubes were incubated for 21 days, the Methylomonas methanica strain B-2110 at a temperature of 30°C and the Methylococcus capsulatus strain B-2990 at a temperature of 37°C. Colony growth was assessed visually. Cream and pink slimy colonies formed on solid media. Colony growth was measured under a microscope using an eyepiece micrometer. Measurements were taken on the 7th, 14th and 21st days. The results are presented in tables 1, 2.

Таблица 1. Рост штамма Methylomonas methanica B-2110 на твердой питательной среде № 221 с разными концентрациями CaCl₂.Table 1. Growth of strain Methylomonas methanica B-2110 on solid nutrient medium No. 221 with different concentrations of CaCl ₂ . №No. W_CaCl2, % _WCaCl2 ,% 7 сутки, мм7 days, mm 14 сутки, мм14 days, mm 21 сутки, мм21 days, mm % к контролю% to control 11 0,02 (контроль)0.02 (control) 1,4 ± 0,121.4 ± 0.12 3,1 ± 0,223.1 ± 0.22 4,7 ± 0,414.7 ± 0.41 5555 22 0,002 (эталон)0.002 (reference) 3,0 ± 0,273.0 ± 0.27 5,1 ± 0,485.1 ± 0.48 8,7 ± 0,788.7 ± 0.78 100100 33 0,010.01 3,7 ± 0,283.7 ± 0.28 6,9 ± 0,586.9 ± 0.58 10,5 ± 0,8910.5 ± 0.89 125125 44 0,0010.001 1,7 ± 0,161.7 ± 0.16 3,7 ± 0,343.7 ± 0.34 5,6 ± 0,645.6 ± 0.64 6565

Сравнительный анализ роста колоний при разных концентрациях CaCl₂ показал, что при добавлении 0,01% хлористого кальция рост штамма Methylomonas methanica B-2110 был на 25% выше, чем в контрольном варианте. A comparative analysis of colony growth at different CaCl ₂ concentrations showed that with the addition of 0.01% calcium chloride, the growth of the Methylomonas methanica B-2110 strain was 25% higher than in the control variant.

Таблица 2. Рост штамма Methylococcus capsulatusB-2990 на твердой питательной среде № 221 с разными концентрациями CaCl₂.Table 2. Growth of the Methylococcus capsulatusB-2990 strain on solid nutrient medium No. 221 with different concentrations of CaCl ₂ . №No. W_CaCl2, % _WCaCl2 ,% 7 сутки, мм7 days, mm 14 сутки, мм14 days, mm 21 сутки, мм21 days, mm % к контролю% to control 11 0,02 (контроль)0.02 (control) 1,5 ± 0,111.5 ± 0.11 2,8 ± 0,142.8 ± 0.14 3,9 ± 0,313.9 ± 0.31 5353 22 0,002 (эталон)0.002 (reference) 2,7 ± 0,172.7 ± 0.17 4,9 ± 0,424.9 ± 0.42 7,8 ± 0,717.8 ± 0.71 100100 33 0,010.01 3,0 ± 0,223.0 ± 0.22 5,7 ± 0,455.7 ± 0.45 9,4 ± 0,879.4 ± 0.87 117,5117.5 44 0,0010.001 1,6 ± 0,121.6 ± 0.12 3,1 ± 0,233.1 ± 0.23 4,7 ± 0,374.7 ± 0.37 6161

Рост штамма Methylococcus capsulatus B-2990 при добавлении 0,01% CaCl₂был выше на 17,5%, чем в контрольном варианте.The growth of the Methylococcus capsulatus B-2990 strain with the addition of 0.01% CaCl ₂ was 17.5% higher than in the control variant.

Таким образом, результаты исследования показали, что наилучшей для роста колоний исследованных штаммов концентрацией CaCl₂в питательной среде является 0,01%. Использование данной концентрации способствовало активному росту и развитию бактериальных колоний.Thus, the results of the study showed that the best concentration of CaCl ₂ in the nutrient medium for the growth of colonies of the studied strains is 0.01%. The use of this concentration contributed to the active growth and development of bacterial colonies.

Claims

Solid nutrient medium for the cultivation of methanotrophic bacteria, containing sources of nitrogen, phosphorus, mineral salts and methanol (CH ₃ OH) as the only source of carbon and energy, characterized in that to accelerate the growth and increase the activity of bacterial colonies, 0.01 was added to the nutrient medium % CaCl ₂ , which corresponds to 0.1 g per 1 liter of medium.