RU2747583C1 - Method for synthesis of (2r, 3s)-isocitric acid from sunflower seed oil using yarrowia lipolytica yeast - Google Patents
Method for synthesis of (2r, 3s)-isocitric acid from sunflower seed oil using yarrowia lipolytica yeast Download PDFInfo
- Publication number
- RU2747583C1 RU2747583C1 RU2020117261A RU2020117261A RU2747583C1 RU 2747583 C1 RU2747583 C1 RU 2747583C1 RU 2020117261 A RU2020117261 A RU 2020117261A RU 2020117261 A RU2020117261 A RU 2020117261A RU 2747583 C1 RU2747583 C1 RU 2747583C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- acid
- yarrowia lipolytica
- strain
- medium
- cultivation
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/44—Polycarboxylic acids
- C12P7/48—Tricarboxylic acids, e.g. citric acid
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Botany (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Область техникиTechnology area
Изобретение относится к области микробиологического получения органических кислот, в частности, (2R,3S)-изолимонной кислоты (традиционное название: Tpeo-DS-изолимонная кислота), обладающей гепатопротекторным, актопротекторным и антигипоксическим действием, которая может быть использована для спортивного питания и в качестве биологически активной добавки к пище.The invention relates to the field of microbiological production of organic acids, in particular, (2R, 3S) -isolymonic acid (traditional name: Tpeo-D S -isolymonic acid), which has a hepatoprotective, actoprotective and antihypoxic effect, which can be used for sports nutrition and as a biologically active food supplement.
Уровень техникиState of the art
Известны способы получения (2R,3S)-изолимонной кислоты с помощью различных штаммов дрожжей Yarrowia lipolytica. Кислоту получают путем культивирования указанных выше дрожжей в жидких минеральных средах, содержащих источники азота, фосфора и минеральные соли.Known methods for producing (2R, 3S) -isolytic acid using various strains of the yeast Yarrowia lipolytica. The acid is obtained by cultivating the above yeast in liquid mineral media containing sources of nitrogen, phosphorus and mineral salts.
Описан способ получения (2R,3S)-изолимонной кислоты в среде с н-алканами с Candida lipolytica ИБФМ Y-160 с выходом продукта - 68,3 г/л (109,8% от использованного субстрата) (А.с. №849780, 1983). Однако канцерогенность парафинов (Otto et al., 2011), и, следовательно, неприемлемость применения продукта в пищевой промышленности и медицине ограничивают применение этого метода.Described is a method of obtaining (2R, 3S) -isolymonic acid in a medium with n-alkanes with Candida lipolytica IBPM Y-160 with a product yield of 68.3 g / l (109.8% of the used substrate) (Inventor's Certificate No. 849780 , 1983). However, the carcinogenicity of paraffins (Otto et al., 2011) and, therefore, the unacceptability of the product's use in the food industry and medicine limits the application of this method.
Известны способы получения (2R,3S)-изолимонной кислоты из этилового спирта с помощью природного штамма Yarrowia lipolytica ВКМ Y-2373 с выходом продукта 90,5 г/л (77% от субстрата) в условиях периодического режима (Kamzolova et al., 2018) и с выходом 109,6 г/л (80% от субстрата) в условиях отъемно-доливного культивирования (Morgunov et al., 2019). Недостаток вышеприведенных способов получения (2R,3S)-изолимонной кислоты из этилового спирта - низкий выход продукта и сложность проведения ферментации из-за токсичности высоких концентраций этанола для клетки.Known methods for the production of (2R, 3S) -isolytic acid from ethyl alcohol using the natural strain Yarrowia lipolytica VKM Y-2373 with a product yield of 90.5 g / l (77% of the substrate) under batch conditions (Kamzolova et al., 2018 ) and with a yield of 109.6 g / L (80% of the substrate) under the conditions of weaning-topping cultivation (Morgunov et al., 2019). The disadvantage of the above methods for producing (2R, 3S) -isolytic acid from ethyl alcohol is the low yield of the product and the complexity of fermentation due to the toxicity of high concentrations of ethanol for the cell.
Известен способ получения (2R,3S)-изолимонной кислоты из глицерин-содержащих отходов производства биодизеля. Генно-модицифированный трансформант Yarrowia lipolytica AJD pADUTGut1/2 с суперэкспрессией генов Gut1 и Gut2 характеризовался быстрым ростом на глицерин-содержащих отходах и продуцировал наряду с лимонной кислотой значительное количество (2R,3S)-изолимонной кислоты (42,5 г/л) (Rzechonek et al., 2019). Недостаток способа заключается в том, что он не обеспечивает достаточно высокого выхода (2R,3S)-изолимонной кислоты.A known method of producing (2R, 3S) -isolytic acid from glycerin-containing waste from biodiesel production. The genetically modified transformant Yarrowia lipolytica AJD pADUTGut1 / 2 with overexpression of the Gut1 and Gut2 genes was characterized by rapid growth on glycerol-containing waste and produced, along with citric acid, a significant amount of (2R, 3S) -isolymonic acid (42.5 g / L) (Rzechone et al., 2019). The disadvantage of this method is that it does not provide a sufficiently high yield of (2R, 3S) -isolytic acid.
Известны способы получения (2R,3S)-изолимонной кислоты из рапсового масла: с помощью природного штамма Yarrowia lipolytica ВКМ Y-2373 достигнут выход продукта - 70,6 г/л (82% от субстрата) (Kamzolova et al., 2013), а с использованием мутантных штаммов Yarrowia lipolytica 704-UV4-A-NG50 (Kamzolova et al., 2013) и Yarrowia lipolytica УФ/НГ (Камзолова и др., 2015) достигнуты выходы 86 г/л (95% от субстрата) и 88,7 г/л (90% от субстрата), соответственно. Однако наличие в составе рапсового масла эруковой кислоты (токсичной для человека) ограничивают применение этого субстрата в микробном синтезе продуктов для пищевой промышленности и медицины.Known methods for obtaining (2R, 3S) -isolymonic acid from rapeseed oil: using the natural strain Yarrowia lipolytica VKM Y-2373, a product yield of 70.6 g / l (82% of the substrate) was achieved (Kamzolova et al., 2013), and with the use of mutant strains Yarrowia lipolytica 704-UV4-A-NG50 (Kamzolova et al., 2013) and Yarrowia lipolytica UV / NG (Kamzolova et al., 2015), yields of 86 g / L (95% of the substrate) and 88 , 7 g / l (90% of the substrate), respectively. However, the presence of erucic acid (toxic to humans) in rapeseed oil limits the use of this substrate in the microbial synthesis of products for the food industry and medicine.
Наиболее близким к предполагаемому по достигаемому эффекту и совокупности существенных признаков является способ получения (2R,3S)-изолимонной кислоты из подсолнечного масла с помощью природного штамма Yarrowia lipolytica ВКМ Y-2373 (Kamzolova et al., 2008). Согласно этому способу дрожжи выращивают на среде, содержащей в качестве источника углерода и энергии подсолнечное масло, а также источники азота, фосфора, минеральные соли и тиамин. Подсолнечное масло вносят дискретно - по 20 г/л в начале и далее по мере снижения концентрации масла ниже 5 г/л. Культивирование проводят при 28°С, концентрация растворенного кислорода 55-60% от насыщения, рН 6 (поддерживают добавлением 10-20% NaOH). В процессе ферментации накапливается 70 г/л (2R,3S)-изолимонной кислоты, что составляет - 75% от использованного субстрата. Также хорошие результаты по накоплению (2R,3S)-изолимонной кислоты в среде с подсолнечным маслом получаются при использовании штамма Yarrowia lipolytica EH 59 (Aurich et al., 2012, p.406): в процессе ферментации накапливается 93 г/л (2R,3S)-изолимонной кислоты, что составляет - 65% от использованного субстрата. Недостаток этих способов заключается в том, что они не обеспечивают достаточно высокого выхода (2R,3S)-изолимонной кислоты.The closest to the expected one in terms of the achieved effect and a set of essential features is the method for obtaining (2R, 3S) -isolymonic acid from sunflower oil using the natural strain Yarrowia lipolytica VKM Y-2373 (Kamzolova et al., 2008). According to this method, yeast is grown on a medium containing sunflower oil as a source of carbon and energy, as well as sources of nitrogen, phosphorus, mineral salts and thiamine. Sunflower oil is added discretely - 20 g / l at the beginning and then as the oil concentration decreases below 5 g / l. The cultivation is carried out at 28 ° C, the concentration of dissolved oxygen is 55-60% of saturation, pH 6 (maintained by adding 10-20% NaOH). During the fermentation, 70 g / l of (2R, 3S) -isolymonic acid is accumulated, which is 75% of the used substrate. Also, good results on the accumulation of (2R, 3S) -isolytic acid in a medium with sunflower oil are obtained using the Yarrowia lipolytica EH 59 strain (Aurich et al., 2012, p. 406): 93 g / L (2R, 3S) -isolytic acid, which is 65% of the used substrate. The disadvantage of these methods is that they do not provide a sufficiently high yield of (2R, 3S) -isolytic acid.
Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, заключается в получении нового высокоактивного штамма-продуцента (2R,3S)-изолимонной кислоты. Другой задачей является повышение выхода (2R,3S)-изолимонной кислоты при росте дрожжей Yarrowia lipolytica на среде с подсолнечным маслом.The problem to be solved by the claimed invention is to obtain a new highly active producer strain (2R, 3S) -isolymonic acid. Another task is to increase the yield of (2R, 3S) -isolymonic acid during the growth of Yarrowia lipolytica yeast on a medium with sunflower oil.
Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в обеспечении высокого уровня активности нового штамма Yarrowia lipolytica, адаптированного к высокому уровню изолимонной кислоты при ее производстве в промышленных условиях для фармацевтического и пищевого применения.The technical result that can be obtained with the implementation of the invention is to provide a high level of activity of the new strain of Yarrowia lipolytica, adapted to a high level of isolic acid during its production under industrial conditions for pharmaceutical and food use.
Сущность изобретенияThe essence of the invention
Один из аспектов изобретения относится к штамму Yarrowia lipolytica ВКМ Y-3044D-продуценту (2R,3S) - изолимонной кислоты.One aspect of the invention relates to the Yarrowia lipolytica strain VKM Y-3044D-producer of (2R, 3S) - isocitric acid.
Другой аспект изобретения относится к способу получения (2R,3S)-изолимонной кислоты путем аэробного культивирования с использованием штамма дрожжей Yarrowia lipolytica ВКМ Y-3044D на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода и энергии подсолнечное масло. С целью увеличения выхода целевого продукта за счет повышения степени утилизации субстрата, в период с 20-24 часов культивирования в среду для ферментации вносят итаконовую кислоту в виде натриевой соли в количестве от 3,0 до 4,5 г/л, предпочтительно 3,9 г/л.Another aspect of the invention relates to a method for producing (2R, 3S) -isolymonic acid by aerobic cultivation using the Yarrowia lipolytica yeast strain VKM Y-3044D on a nutrient medium containing sunflower oil as a carbon and energy source. In order to increase the yield of the target product by increasing the degree of substrate utilization, in the period from 20-24 hours of cultivation, itaconic acid is introduced into the fermentation medium in the form of sodium salt in an amount of 3.0 to 4.5 g / l, preferably 3.9 g / l.
Описание изобретенияDescription of the invention
При совершенствовании промышленной технологии получения изолимонной кислоты технические задачи решались в области повышения эффективности способа непрерывного культивирования нового штамма-продуцента.With the improvement of industrial technology for the production of isocitric acid, technical problems were solved in the field of increasing the efficiency of the method of continuous cultivation of a new producer strain.
Штамм Yarrowia lipolytica LAMM 704-9 был получен путем многоступенчатой адаптации природного штамма Yarrowia lipolytica ВКМ Y-2373 к высокой концентрации (2R,3S)-изолимонной кислоты. Для проведения адаптации был выбран ступенчатый режим увеличения концентрации изолимонной кислоты в диапазоне от 0 до 1,4 г изолимонной кислоты на 1 г клеток в ростовых средах с подсолнечным маслом с концентрацией 30 г/л. Штамм Yarrowia lipolytica LAMM 704-9 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под регистрационным номером ВКМ Y-3044D.The Yarrowia lipolytica LAMM 704-9 strain was obtained by multi-stage adaptation of the natural Yarrowia lipolytica VKM Y-2373 strain to a high concentration of (2R, 3S) -isolytic acid. To carry out the adaptation, a stepwise mode of increasing the concentration of isocitric acid in the range from 0 to 1.4 g of isocitric acid per 1 g of cells in growth media with sunflower oil with a concentration of 30 g / L was chosen. The Yarrowia lipolytica LAMM 704-9 strain was deposited in the All-Russian collection of microorganisms at the I. G.K. Scriabin RAS under registration number VKM Y-3044D.
Условия хранения: штамм может храниться в лиофилизированном состоянии в течение нескольких лет и/или в пробирках на скошенной агаризованной среде Ридер с парафином или на сусло-агаре при +4°C с обязательным пересевом не реже одного раза в течение 3-6 месяцев.Storage conditions: the strain can be stored in a lyophilized state for several years and / or in test tubes on a slant agar medium Reeder with paraffin or on wort agar at + 4 ° C with obligatory reseeding at least once within 3-6 months.
Штамм Yarrowia lipolytica ВКМ Y-3044D имеет следующие характеристики:The Yarrowia lipolytica strain VKM Y-3044D has the following characteristics:
Культурально-морфологические признакиCultural and morphological characteristics
3-суточная культура в жидком сусле и на агаризованном сусле представлена овальными, удлиненно-овальными и округлыми клетками размером 4,0-6,5×4,5-13 мкм. Встречаются мелкие клетки 2,0-2,5×3,0-3,5 мкм. Часть крупных клеток имеет неправильную форму. Почкование полярное или латеральное. Клетки одиночные или соединены в цепочки из 2-3 клеток. Штрих на сусло-агаре (возраст 10 суток) сплошной, плоский, кремового цвета, гладкий, пастообразный, края ровные. Колонии на сусло-агаре округлые, диаметр большинства колоний 6 мм, встречаются мелкие колонии диаметром 3 мм (5-6% популяции). Колонии беловато-кремового цвета, пастообразные, края ровные, центр колоний приподнят. У 90% колоний поверхность гладкая, у 10% колоний - морщинистая. Колонии, выращенные на сусло-агаре за 4 недели, кремового цвета, края бахромчатые, поверхность колонии шероховатая, пастообразная, центр колонии приподнят. На стекле, в картофельном агаре за 5 сут культура образует псевдомицелий типа Candida и Mycocandida. Спор не образует. Строгий аэроб.3-day culture in liquid wort and on agar wort is represented by oval, elongated-oval and rounded cells measuring 4.0-6.5 × 4.5-13 microns. Small cells of 2.0-2.5 × 3.0-3.5 microns are found. Some of the large cells have an irregular shape. The budding is polar or lateral. The cells are single or connected in chains of 2-3 cells. The line on wort agar (age 10 days) is solid, flat, cream-colored, smooth, pasty, smooth edges. Colonies on wort agar are round, the diameter of most of the colonies is 6 mm, there are small colonies with a diameter of 3 mm (5-6% of the population). Colonies are whitish-creamy, pasty, smooth edges, raised center of colonies. In 90% of the colonies, the surface is smooth, in 10% of the colonies it is wrinkled. Colonies grown on wort agar for 4 weeks are cream-colored, fringed edges, the surface of the colony is rough, pasty, the center of the colony is raised. On glass, in potato agar for 5 days, the culture forms a pseudomycelium of the Candida and Mycocandida types. Does not form a dispute. Strict aerobic.
Физиологические и биохимические характеристикиPhysiological and biochemical characteristics
Ассимилирует: рапсовое масло, подсолнечное масло, глюкозу, D-галактозу (медленно), L-сорбозу, D-рибозу, этанол, глицерин, глицерин-содержащие отходы производства биодизельного топлива, эритрит, адонит, D-маннит, сорбит, молочную, янтарную, лимонную, глюконовую кислоты. Не ассимилирует: сахарозу, мальтозу, лактозу, целлобиозу, трегалозу, мелибиозу, раффинозу, мелицитозу, инулин, крахмал, D-ксилозу, L- и D-арабинозу, раммозу, дульцит, инозит, D-глюкозамин и глюкуроновую, 2-кетоглюконовую, 5-кетоглюконовую кислоты. Не ассимилирует нитраты. Не растет в безвитаминной среде, требует тиамин, не требует биотин. Растет в среде с 10-14% изолимонной кислоты. Оптимальное значение рН для роста составляет 4,0-6,0, для синтеза изолимонной кислоты 5,5-6,0. Оптимальная температура 29°С. Максимальная температура роста 35°С. Штамм не растет при 37°С.Assimilates: rapeseed oil, sunflower oil, glucose, D-galactose (slow), L-sorbose, D-ribose, ethanol, glycerin, glycerin-containing waste from biodiesel production, erythritol, adonite, D-mannitol, sorbitol, milk, amber , citric, gluconic acid. Does not assimilate: sucrose, maltose, lactose, cellobiose, trehalose, melibiose, raffinose, melicytosis, inulin, starch, D-xylose, L- and D-arabinose, ramlose, dulcite, inositol, D-glucosamine, 2-glucuronoglucuronium 5-ketogluconic acid. Does not assimilate nitrates. Does not grow in a vitamin-free environment, requires thiamine, does not require biotin. It grows in an environment with 10-14% isocitric acid. The optimum pH value for growth is 4.0-6.0, for the synthesis of isocitric acid, 5.5-6.0. The optimum temperature is 29 ° C. The maximum growth temperature is 35 ° C. The strain does not grow at 37 ° C.
Штамм Yarrowia lipolytica ВКМ Y-3044D культивируют в аэробных условиях на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода и энергии - подсолнечное масло, источник азота, фосфора, минеральные соли и тиамин. Культивирование осуществляется в ферментерах. Подсолнечное масло вносят дискретно в процессе культивирования по мере потребления его из среды. Для повышения эффективности в среду культивирования дополнительно вводят ионы железа - 1,2 мг/л (активатор аконитатат-гидратазы) и итаконовую кислоту (ингибитор изоцитрат-лиазы). При выращивании дрожжей без итаконовой кислоты при температуре 29°С и рН 6,0, выход (2R,3S)-изолимонной кислоты составляет 95,7 г/л, т.е. 85,8% от субстрата, а с итаконовой кислотой - 109,2 г/л, т.е. 99,8% от субстрата (см. таблицу 1).The Yarrowia lipolytica strain VKM Y-3044D is cultivated under aerobic conditions on a nutrient medium containing sunflower oil, a source of nitrogen, phosphorus, mineral salts and thiamine as a source of carbon and energy. The cultivation is carried out in fermenters. Sunflower oil is added discretely during cultivation as it is consumed from the environment. To increase efficiency, iron ions are additionally introduced into the culture medium - 1.2 mg / l (activator of aconitate hydratase) and itaconic acid (inhibitor of isocitrate lyase). When growing yeast without itaconic acid at a temperature of 29 ° C and pH 6.0, the yield of (2R, 3S) -isolymonic acid is 95.7 g / l, i.e. 85.8% of the substrate, and with itaconic acid - 109.2 g / l, i.e. 99.8% of the substrate (see table 1).
Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.The possibility of using the invention is illustrated by examples, which do not limit the scope and essence of the claims associated with them.
Пример 1. Хранение штаммаExample 1. Storing the strain
Штамм хранят на агаризованной минеральной среде Ридер следующего состава (г/л): парафин - 20; (NH4)2SO4 - 3,0; MgSO4⋅7H2O - 0,7; Ca(NO3)2 - 0,4; NaCl - 0,5; KH2PO4 - 1,0; K2HPO4 - 0,1; агар-агар -25,0; дрожжевой автолизат - 2 мл; смесь Буркгольдера - состав смеси микроэлементов по прописи Буркгольдера, мг/мл: KJ - 0,1; В3+ - 0,01; Mn2+ - 0,01; Zn2+ - 0,01; Cu2+ - 0,01; Мо2+ - 0,01; Fe2+ - 0,05; вода дистиллированная - до 1 л.The strain is stored on an agar mineral Reeder medium of the following composition (g / l): paraffin - 20; (NH 4 ) 2 SO 4 - 3.0; MgSO 4 ⋅7H 2 O 0.7; Ca (NO 3 ) 2 - 0.4; NaCl - 0.5; KH 2 PO 4 1.0; K 2 HPO 4 - 0.1; agar-agar -25.0; yeast autolysate - 2 ml; Burkholder mixture - the composition of the mixture of trace elements according to the Burkholder recipe, mg / ml: KJ - 0.1; B 3+ - 0.01; Mn 2+ - 0.01; Zn 2+ - 0.01; Cu 2+ - 0.01; Mo 2+ - 0.01; Fe 2+ - 0.05; distilled water - up to 1 liter.
Пример 2. Подготовка и инкубирование посевного материала Дрожжи выращивают на косяках агаризованной среды в течение трех суток при 28-30°С.Example 2. Preparation and incubation of inoculum Yeast is grown on shoals of agar medium for three days at 28-30 ° C.
Клетки с двух косяков суспендируют в 5 мл стерильной дистиллированной среды и переносят в колбу объемом 750 мл, содержащую 100 мл среды следующего состава (г/л): подсолнечное масло - 20,0; (NH4)2SO4 - 3,0; MgSO4⋅7H2O - 0.7; Ca(NO3)2 - 0,4; NaCl - 0,5; KH2PO4 - 1,0; K2HPO4 - 0,1; микроэлементы (удвоенная смесь Буркгольдера); тиамин - 500 мкг, вода дистиллированная.Cells from two schools are suspended in 5 ml of sterile distilled medium and transferred into a 750 ml flask containing 100 ml of medium of the following composition (g / l): sunflower oil - 20.0; (NH 4 ) 2 SO 4 - 3.0; MgSO 4 ⋅7H 2 O - 0.7; Ca (NO 3 ) 2 - 0.4; NaCl - 0.5; KH 2 PO 4 1.0; K 2 HPO 4 - 0.1; trace elements (double Burkholder mixture); thiamine - 500 mcg, distilled water.
Инкубирование посевного материала проводят на качалке (220 об/мин) в течение 20-24 ч при 28-30°С. Выросшие клетки (из расчета 100 мг/л по сухому весу) переносят в другую партию колб со средой того же состава, что и для посевного материала и инкубируют в течение 48 ч при 28-30°С. На 24 ч и 48 от начала культивирования измеряют рН культуральной среды и проводят подтитровку среды стерильным раствором 10%-ной KOH до рН среды 4,5-6,0. В конце культивирования выросшую культуру (5-6 колб) сливают в колбу с отростком и используют для засева; сухой вес посевного материала - 3-4 г/л (для ферментера с рабочим объемом 6 л).Incubation of inoculum is carried out on a shaker (220 rpm) for 20-24 hours at 28-30 ° C. The grown cells (at the rate of 100 mg / L by dry weight) are transferred to another batch of flasks with the medium of the same composition as for the inoculum and incubated for 48 h at 28-30 ° C. At 24 hours and 48 from the beginning of cultivation, the pH of the culture medium is measured and the medium is titrated with a sterile solution of 10% KOH to a pH of 4.5-6.0. At the end of cultivation, the grown culture (5-6 flasks) is poured into a flask with a shoot and used for inoculation; dry weight of seed - 3-4 g / l (for a fermenter with a working volume of 6 l).
Пример 3. Культивирование штамма Yarrowia lipolytica ВКМ Y-3044D с подсолнечным маслом.Example 3. Cultivation of the Yarrowia lipolytica strain VKM Y-3044D with sunflower oil.
Среда для ферментации имеет следующий состав (г/л): (NH4)2SO4 - 3,0; MgSO4⋅7H2O - 1,4; Ca(NO3)2 - 0,8; NaCl - 0,5; KH2PO4 - 2,0; K2HPO4 - 0,2; дрожжевой автолизат - 6 мл; удвоенная смесь Буркгольдера; Fe2+ - 1, 2 мг/л; вода дистиллированная.The fermentation medium has the following composition (g / l): (NH 4 ) 2 SO 4 - 3.0; MgSO 4 ⋅7H 2 O 1.4; Ca (NO 3 ) 2 - 0.8; NaCl - 0.5; KH 2 PO 4 2.0; K 2 HPO 4 0.2; yeast autolysate - 6 ml; doubled Burkholder mix; Fe 2+ - 1.2 mg / l; distilled water.
До засева в ферментер вносят тиамин - 0,5 мг/л. Подсолнечное масло вносят дискретно - по 20 г/л в начале и далее в момент повышения концентрации растворенного кислорода на 10% в сравнении со стабильным уровнем насыщения кислорода. Такое повышение концентрации растворенного кислорода указывает на полное потребление дрожжами ранее присутствующего субстрата.Before sowing, thiamine is introduced into the fermenter - 0.5 mg / l. Sunflower oil is added discretely - 20 g / l at the beginning and then at the moment when the concentration of dissolved oxygen increases by 10% in comparison with a stable level of oxygen saturation. This increase in dissolved oxygen concentration indicates complete consumption of the previously present substrate by the yeast.
Культивирование проводят при 29°С, концентрация растворенного кислорода 55-60% от насыщения, рН 6 (поддерживают добавлением 20%-ного раствора KOH). В процессе ферментации на 144 ч накапливается 95,7 г/л (2R,3S)-изолимонной кислоты, что составляет 85,8% от использованного субстрата.The cultivation is carried out at 29 ° C, the concentration of dissolved oxygen is 55-60% of saturation, pH 6 (maintained by adding a 20% KOH solution). During the fermentation, 95.7 g / L of (2R, 3S) -isolymonic acid is accumulated for 144 h, which is 85.8% of the used substrate.
Пример 4. Культивирование штамма Yarrowia lipolytica ВКМ Y-3044D с внесением итаконовой кислоты.Example 4. Cultivation of the Yarrowia lipolytica strain VKM Y-3044D with the addition of itaconic acid.
Выращивание дрожжей на агаризованной среде, подготовку посевного материала, подготовку среды для ферментации, период подачи подсолнечного масла, а также установку параметров температуры, концентрации растворенного кислорода и рН среды, проводят как в примерах 2-3. В период 20-24 ч культивирования штамма Yarrowia lipolytica ВКМ Y-3044D в среду ферментации вносят итаконовую кислоту в виде натриевой соли в количестве от 3,0 до 4,5 г/л, предпочтительно 3,9 г/л. Итаконовая кислота является ингибитором изоцитрат-лиазы, ключевого фермента метаболизма изолимонной кислоты.Growing yeast on an agar medium, preparing inoculum, preparing the medium for fermentation, the period of sunflower oil supply, as well as setting the parameters of temperature, dissolved oxygen concentration and pH of the medium, are carried out as in examples 2-3. During the period of 20-24 hours of cultivation of the Yarrowia lipolytica strain VKM Y-3044D, itaconic acid is introduced into the fermentation medium in the form of sodium salt in an amount of 3.0 to 4.5 g / l, preferably 3.9 g / l. Itaconic acid is an inhibitor of isocitrate lyase, a key enzyme in the metabolism of isocitric acid.
В процессе ферментации на 144 ч накапливается 109,2 г/л (2R,3S)-изолимонной кислоты, что составляет 99,8% от использованного субстрата.During the fermentation, 109.2 g / l of (2R, 3S) -isolymonic acid is accumulated for 144 h, which is 99.8% of the used substrate.
Результаты испытания способов представлены в таблице 1.The results of testing the methods are presented in table 1.
Промышленная применимостьIndustrial applicability
В настоящем изобретении описан новый способ получения (2R,3S)-изолимонной кислоты, в котором с целью увеличения выхода целевого продукта из подсолнечного масла за счет повышения степени утилизации субстрата, в качестве продуцирующих дрожжей используют новый штамм Yarrowia lipolytica ВКМ Y-3044D. При этом в процессе культивации в период с 20-24 часов в среду ферментации вносят итаконовую кислоту. Применение нового штамма Yarrowia lipolytica в усовершенствованном способе культивации позволяет добиться синергетического эффекта от применения нового штамма и усовершенствованного способа культивирования высокоактивной и нетоксичной (2R,3S)-изолимонной кислоты для пищевой промышленности и медицины. Это создает возможность использовать ее в качестве компонента гепатопротекторного, актопротекторного и антигипоксического средств, применяемых в спортивном питании и в биологически активных добавках к пище. Предлагаемый способ позволяет получить выход (2R,3S)-изолимонной кислоты при культивировании на среде с подсолнечным маслом в 1,22-1,42 раза выше, чем ранее известный способ-прототип на подсолнечном масле.The present invention describes a new method for producing (2R, 3S) -isolytic acid, in which in order to increase the yield of the target product from sunflower oil by increasing the degree of substrate utilization, a new Yarrowia lipolytica strain VKM Y-3044D is used as a producing yeast. At the same time, itaconic acid is introduced into the fermentation medium during cultivation from 20-24 hours. The use of a new strain Yarrowia lipolytica in an improved cultivation method allows achieving a synergistic effect from the use of a new strain and an improved method of cultivating highly active and non-toxic (2R, 3S) -isolymonic acid for the food industry and medicine. This makes it possible to use it as a component of hepatoprotective, actoprotective and antihypoxic agents used in sports nutrition and in biologically active food supplements. The proposed method allows you to obtain the yield of (2R, 3S) -isolymonic acid when cultivated on a medium with sunflower oil 1.22-1.42 times higher than the previously known prototype method on sunflower oil.
Источники информацииInformation sources
1. Илларионова В.И. и др. Способ получения изолимонной кислоты. Авторское свидетельство № SU 849780 (1983).1. Illarionova V.I. and other Method of obtaining isocitric acid. Copyright certificate No. SU 849780 (1983).
2. Otto Ch. et al. Overproduction and secretion of α-ketoglutaric acid by microorganisms // Appl Microbiol Biotechnol 92, pp. 689-695 (2011).2. Otto Ch. et al. Overproduction and secretion of α-ketoglutaric acid by microorganisms // Appl Microbiol Biotechnol 92, pp. 689-695 (2011).
3. Kamzolova S.V. et al. Fermentation conditions and media optimization for isocitric acid production from ethanol by Yarrowia lipolytica // Biomed Research International, Feb 7; 2018:2543210(2018).3. Kamzolova S.V. et al. Fermentation conditions and media optimization for isocitric acid production from ethanol by Yarrowia lipolytica // Biomed Research International, Feb 7; 2018: 2543210 (2018).
4. Morgunov I.G. et al. Biosynthesis of isocitric acid in repeated-batch culture and testing of its stress-protective activity // Appl Microbiol Biotechnol 103(8), pp. 3549-3558 (2019).4. Morgunov I.G. et al. Biosynthesis of isocitric acid in repeated-batch culture and testing of its stress-protective activity // Appl Microbiol Biotechnol 103 (8), pp. 3549-3558 (2019).
5. Rzechonek D.A. et al. Aseptic production of citric and isocitric acid from crude glycerol by genetically modified Yarrowia lipolytica // Bioresour Technol 271: pp. 340-344 (2019).5. Rzechonek D.A. et al. Aseptic production of citric and isocitric acid from crude glycerol by genetically modified Yarrowia lipolytica // Bioresour Technol 271: pp. 340-344 (2019).
6. Kamzolova S.V. et al. Isocitric acid production from rapeseed oil by Yarrowia lipolytica yeast // Appl Microbiol Biotechnol, V. 97, pp. 9133-9144 (2013).6. Kamzolova S.V. et al. Isocitric acid production from rapeseed oil by Yarrowia lipolytica yeast // Appl Microbiol Biotechnol, V. 97, pp. 9133-9144 (2013).
7. Камзолова С.В. и др. Биосинтез изолимонной кислоты дрожжами Yarrowia lipolytica и его регуляция // Прикладная биохимия и микробиология, т. 51, №2, с. 251-257 (2015).7. Kamzolova S.V. et al. Biosynthesis of isolic acid by yeast Yarrowia lipolytica and its regulation // Applied biochemistry and microbiology, vol. 51, no. 2, p. 251-257 (2015).
8. Kamzolova S.V. et al. Microbiological production of citric and isocitric acid from sunflower oil // Food Technol. Biotechnol. V. 46, №1, pp. 51-59 (2008).8. Kamzolova S.V. et al. Microbiological production of citric and isocitric acid from sunflower oil // Food Technol. Biotechnol. V. 46, no. 1, pp. 51-59 (2008).
9. Aurich A. et al. Microbiologically produced carboxylic acids used as building blocks in organic synthesis. In: Wang X., Chen J., Quinn P. (eds) Reprogramming Microbial Metabolic Pathways // Subcellular Biochemistry, vol 64. Springer, Dordrecht, pp. 391-423 (2012).9. Aurich A. et al. Microbiologically produced carboxylic acids used as building blocks in organic synthesis. In: Wang X., Chen J., Quinn P. (eds) Reprogramming Microbial Metabolic Pathways // Subcellular Biochemistry, vol 64. Springer, Dordrecht, pp. 391-423 (2012).
Claims (3)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020117261A RU2747583C1 (en) | 2020-05-26 | 2020-05-26 | Method for synthesis of (2r, 3s)-isocitric acid from sunflower seed oil using yarrowia lipolytica yeast |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020117261A RU2747583C1 (en) | 2020-05-26 | 2020-05-26 | Method for synthesis of (2r, 3s)-isocitric acid from sunflower seed oil using yarrowia lipolytica yeast |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2747583C1 true RU2747583C1 (en) | 2021-05-11 |
Family
ID=75919693
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2020117261A RU2747583C1 (en) | 2020-05-26 | 2020-05-26 | Method for synthesis of (2r, 3s)-isocitric acid from sunflower seed oil using yarrowia lipolytica yeast |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2747583C1 (en) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2713124C2 (en) * | 2018-07-18 | 2020-02-03 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Method for increasing production of isocitric acid in yeast yarrowia lipolytica, yeast of yarrowia lipolytica type, capable of producing isocitric acid |
-
2020
- 2020-05-26 RU RU2020117261A patent/RU2747583C1/en active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2713124C2 (en) * | 2018-07-18 | 2020-02-03 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Method for increasing production of isocitric acid in yeast yarrowia lipolytica, yeast of yarrowia lipolytica type, capable of producing isocitric acid |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
AURICH A. et al. Microbiologically produced carboxylic acids used as building blocks in organic synthesis. In: Wang X., Chen J., Quinn P. (eds) Reprogramming Microbial Metabolic Pathways // Subcellular Biochemistry, 2012, vol. 64. Springer, Dordrecht, pp. 391-423. * |
АЛЛАЯРОВ Р.К. и др. Микробиологический способ получения изолимонной кислоты, Тезисы пятой научно-практической конференции "Молодежные научно-инновационные проекты Московской области", г. Серпухов - п. Дубровицы Подольского района, 14-15 мая 2013, с. 61-63. * |
АЛЛАЯРОВ Р.К. и др. Перспективы разработки новых препаратов на основе биосентетических органический кислот для профилактики и лечения гипоксии в условиях длительных космических экспедиций. Бизнес в законе, Экономико-юридический журнал, 2016, N 6, с. 168-171. * |
КАМЗОЛОВА С.В. и др. Биосинтез изолимонной кислоты дрожжами Yarrowia lipolytica и его регуляция // Прикладная биохимия и микробиология, 2015, т. 51, N2, с.215-257. * |
ЛАПТЕВ И.А. и др. Новые рекомбинантные штаммы дрожжей Yarrowia lipolytica с суперэкспрессией гена аконитат-гидратазы для получения изолимонной кислоты из рапсового масла, Биотехнология 2015, N 6, с. 35-41. * |
ЛАПТЕВ И.А. и др. Новые рекомбинантные штаммы дрожжей Yarrowia lipolytica с суперэкспрессией гена аконитат-гидратазы для получения изолимонной кислоты из рапсового масла, Биотехнология 2015, N 6, с. 35-41. КАМЗОЛОВА С.В. и др. Биосинтез изолимонной кислоты дрожжами Yarrowia lipolytica и его регуляция // Прикладная биохимия и микробиология, 2015, т. 51, N2, с.215-257. АЛЛАЯРОВ Р.К. и др. Микробиологический способ получения изолимонной кислоты, Тезисы пятой научно-практической конференции "Молодежные научно-инновационные проекты Московской области", г. Серпухов - п. Дубровицы Подольского района, 14-15 мая 2013, с. 61-63. АЛЛАЯРОВ Р.К. и др. Перспективы разработки новых препаратов на основе биосентетических органический кислот для профилактики и лечения гипоксии в условиях длительных космических экспедиций. Бизнес в законе, Экономико-юридический журнал, 2016, N 6, с. 168-171. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Kong et al. | The characteristics of biomass production, lipid accumulation and chlorophyll biosynthesis of Chlorella vulgaris under mixotrophic cultivation | |
KR101577820B1 (en) | Novel culture process for a heterotrophic microalga | |
CN102229889B (en) | Chlorella, its culture method and applications | |
US20090068715A1 (en) | Method of producing bio-ethanol | |
EP2084290B1 (en) | Production of omega-3 fatty acids in microflora of thraustochytriales using modified media | |
SU701545A3 (en) | Method of preparing biomass | |
WO2015085631A1 (en) | Method for culturing botryococcus spp. with high yield | |
CN1837352A (en) | Method for culturing heterotrophic chlorella with high density | |
CN102676406B (en) | Candida tropicalis for producing ribonucleic acid through fermentation and application thereof | |
AU2020101953A4 (en) | A method of cultivating microalgae with high oil content | |
CN1067725C (en) | Process for producing alpha, omega-long chain binary acid by using microorganism fermentation | |
KR20120110295A (en) | Composition of culture medium for algae and method of culturing algae | |
RU2747583C1 (en) | Method for synthesis of (2r, 3s)-isocitric acid from sunflower seed oil using yarrowia lipolytica yeast | |
CN107841464A (en) | A kind of cultural method of algae | |
KR101750286B1 (en) | Composition for Controlling Aphid and Method for Controlling Aphid Using the Same | |
CN101153297A (en) | Novel single-tank hemicontinuous high-strength ferment high optical purity L- lactic acid technique for rhizopus oryzae bacterium ball | |
CN101481656A (en) | Method for cultivating chlorella by heterotrophic nutrition fermentation | |
Okauchi et al. | Optimum medium for large-scale culture of Tetraselmis tetrathele | |
CN108085283A (en) | A kind of helotism high density Algaculture method | |
RU2096461C1 (en) | Yeast strain yarrowia lipolytica - producer of citric acid and method of citric acid production | |
CN101528939B (en) | Production of omega-3 fatty acids in microflora of thraustochytriales using modified media | |
JP4537862B2 (en) | Highly efficient production method of organic acid by aerobic bacteria | |
CN117904009B (en) | Bacillus subtilis applicable to non-grain bio-based carbon source and fermentation production method thereof | |
CN110183260A (en) | A kind of plant nutrition liquid and its application using fermented liquid for biologically producing hydrogen preparation | |
CN113293119B (en) | Bacterial high-density liquid fermentation medium and fermentation method thereof |