RU2808445C1 - Применение фармацевтической композиции, обладающей антиоксидантным, вирулицидным, иммуностимулирующим, противогипоксическим и антиагрегантным действием - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области медицины и фармацевтики и касается средства, обладающего антиоксидантным, вирулицидным, иммуностимулирующим, противогипоксическим и антиагрегантным действием. Раскрывается применение 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния-гаммалактон-2,3-дегидро-L-гулоноат (аскорбината) формулы (I) для лечения гриппа, коронавирусной инфекции COVID-19, а также их осложнений, связанных с развитием тромбоза. Использование изобретения позволяет оказывать комплексное воздействие на разные патофизиологические пути развития гриппа, коронавирусной инфекции COVID-19 при их лечении, а также влиять на их осложнения, связанные с развитием тромбоза. 6 табл., 6 пр.

Description

Изобретение относится к области медицины и касается средства, обладающего антиоксидантным, вирулицидным, иммуностимулирующим, противогипоксическим и антиагрегантным действием. [A61P 31/12, A61P 37/04, A61P 39/06, A61K31/4425].

По данным Всемирной организации здравоохранения острые респираторные вирусные заболевания (ОРВИ) и грипп до настоящего времени составляют 90% от всех инфекционных заболеваний. Ежегодно в мире ОРВИ и гриппом заражаются более 10% мировой популяции населения.

Острая респираторная вирусная инфекция - острая, в большинстве случаев, самоограничивающаяся инфекция респираторного тракта, проявляющаяся катаральным воспалением верхних дыхательных путей и протекающая с лихорадкой, насморком, чиханием, кашлем, болью в горле, нарушением общего состояния разной выраженности. Возбудителями заболеваний респираторного тракта являются вирусы, тропные к респираторному эпителию. К числу респираторных вирусных болезней, как правило, относят грипп, парагриппозные болезни, аденовирусные болезни, респираторно-синцитиальную инфекцию, риновирусную болезнь, болезни, вызываемые коронавирусами. Различные возбудители ОРВИ могут вызывать более или менее схожую симптоматику.

Основной проблемой в лечении ОРВИ, стоящей перед практическим врачом, является объективное отсутствие возможности назначения этиотропной терапии, что приводит к необходимости проведения симптоматического лечения. При диагнозе ОРВИ назначают различные препараты - нестероидные противовоспалительные средства (НПВС), противокашлевые средства, антиконгексанты, бронхолитики, противовирусные, иммуномодулирующие препараты и т.д. (Крюков А. И., Туровский А. Б. Симптоматическая терапия при острых респираторных заболеваниях // Справочник поликлинического врача. 2005. № 4. Т. 4). Более предпочтительным для ОРВИ больных является использование препаратов, проявляющих комплекс фармакологических эффектов.

Среди острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ) у людей в особую группу выделяют грипп. Это связано в первую очередь с возможным тяжёлым течением болезни. Вирусы гриппа относятся к РНК-содержащим сложноорганизованным вирусам, способным присоединяться к гликопротеинам - поверхностным рецепторам клеток. Семейство включает род Influenza virus, содержащий вирусы 3 серотипов: А, В и С. Среди них вирусы серотипа А обладают наиболее высокой вирулентностью и имеют наибольшее эпидемиологическое значение. Внутренние антигены вирусов представлены типоспецифическими антигенами- NP- и М-белками, антитела к которым не оказывают существенного защитного действия. Поверхностные антигены вирусов данного серотипа характеризуются постоянной изменчивостью. Для гриппа характерно эпидемическое, а нередко и пандемическое распространение в относительно короткие сроки, высокая восприимчивость людей к возбудителю. При этом практически в каждой эпидемии (пандемии) регистрируется появление нового серовара возбудителя, к которому население не имеет иммунитета. В инкубационном периоде развития процесса наблюдается выраженная вирусемия. Ее клинические проявления представляют собой токсические и токсико-аллергические реакции. Интоксикация при гриппе способствуют нарушению гемодинамики, микроциркуляции, возникновению гипоксии, что вызывает возникновение дистрофических изменений в миокарде. Также установлена роль свободных радикалов кислорода, поддерживающих воспалительный процесс в реализации патогенного действия вирусов. Вирус гриппа может вызвать повреждение тканей активацией окислительного метаболизма нейтрофилов, в результате которого происходит выброс во внеклеточную среду активных форм кислорода. Установлено, что липидная пероксидация, активируемая вирусом гриппа, наряду с генерацией активных форм кислорода является одним из узловых метаболических процессов, определяющих тяжесть инфекционного заболевания.

Таким образом, исходя из вышесказанного, в качестве препаратов выбора при гриппе целесообразно рассматривать противовирусные лекарственные средства с интерферон индуцирующими, иммуномодулирующими, антиоксидантными и антигипоксантными свойствами.

Особое внимание в настоящее время уделяется заболеваниям, вызванным коронавирусами. Среди населения циркулируют четыре сезонных коронавируса (HCoV-229E, -OC43, -NL63 и -HKU1), которые круглогодично присутствуют в структуре ОРВИ, и, как правило, вызывают поражение верхних дыхательных путей легкой и средней степени тяжести, а также два высокопатогенных коронавируса - вирус ближневосточного респираторного синдрома (MERS) и новой коронавирусной инфекции COVID-19.

COVID-19 - заболевание, вызываемое вирусом тяжелого острого респираторного синдрома 2, впервые обнаруженное у человека в декабре 2019 года (Na Zhu, Ph.D., et al. A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019. N Engl J Med 2020; 382(8):727-733). До 29 сентября 2020 года в мире зарегистрировано боле 30 млн. случаев заражения и 950 тыс. смертельных случаев.

В связи с широким распространением инфекции проводится интенсивное изучение клинических и эпидемиологических особенностей заболевания, разработка новых средств его профилактики и лечения.

В частности, Министерством Здравоохранения РФ утверждены и постоянно пересматриваются «Временные методические рекомендации «Профилактика, диагностика и лечение новой коронавирусной инфекции (COVID-19)». В список рекомендованных препаратов, которые могут быть использованы для лечения COVID-19, включены такие препараты как фавипиравир, гидроксихлорохин, азитромицин (в сочетании с гидроксихлорохином), препараты интерферона-альфа, а также ремдесивир. В более поздних версиях (начиная с 03.09. 2020) добавлен препарат умифеновир (Арбидол) - оригинальный противовирусный препарат для лечения и профилактики гриппа и других острых респираторных вирусных инфекций, известный как антиоксидант и иммуномодулятор (Drug of the Future, 1992, № 17, р. 1079-1081).

В настоящее время изучается также возможность включения в терапию больных COVID-19 других антиоксидантов. Одним из таких препаратов является отечественный оригинальный препарат с антиоксидантным и антигипоксантным действием Мексидол (2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат). Данный препарат является аналогом АСК-19.

Известен ПРЕПАРАТ ДЛЯ КОМПЛЕКСНОЙ ТЕРАПИИ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗВАННЫХ БЕТА-КОРОНАВИРУСАМИ [RU2739212, опубл.: 21.12.2020], где раскрывается применение 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината в комплексной терапии и профилактике коронавирусной инфекции. Отмечается, что ранее Мексидол уже показал свою эффективность в комплексной терапии гриппа (Павелкина В.Ф. Клинико-патогенетические аспекты эндогенной интоксикации и ее коррекция при заболеваниях вирусной и бактериальной этиологии. Автореферат диссертации докт мед/ наук, Москва, 2010). В данной работе раскрывается применение мексидола с целью коррекции эндотоксикоза и повышения антиоксидантной защиты организма. Данный препарат является аналогом АСК-19, может быть указан в качестве ближайшего аналога.

Несмотря на тот факт, что скорость эволюционных изменений коронавирусов ниже, чем у вирусов сезонного гриппа, они также со временем изменяются. На сегодняшний день во всем мире выявлено сотни вариантов этого вируса.

То есть проблема расширения спектра противовирусных препаратов и формирование новых подходов к лечению вирусных заболеваний человека остается актуальной.

При разработке настоящего изобретения учитывались различные аспекты, связанные с вирусными заболеваниями, в особенности их иммунопатогенез.

Основное звено иммунопатогенеза при коронавирусной инфекции (SARS-CoV-2) состоит в нарушении процесса продуцирования специфичных иммуноглобулинов. Причина этого связана с избыточным формированием нейтрофильных экстраклеточных ловушек. Формирование нейтрофильных ловушек, захватывающих инфицированные вирусом клетки, сопровождается секрецией аргиназы, ингибирующей адаптивный иммунитет [Kazimirskii AN, et al., 2017]. На ранних стадиях воспаления развивается выраженная реципроктность между врожденным и адаптивным иммунитетом [Kazimirskii AN, et al., 2019]. Физиологическая роль секретируемой нейтрофилами аргиназы состоит в организации правильной и последовательной активации двух частей иммунной системы. Нарушение порядка активации врожденного и адаптивного иммунитета ведет к развитию тяжелых форм воспаления [Kazimirskii AN, et al., 2020]. Фактор, значительно осложняющий лечение коронавирусной инфекции (COVID-19), это зависимость между развитием гемокоагуляции и формированием нейтрофильных экстраклеточных ловушек. Наиболее тяжелые в клиническом отношении пациенты - это те, у которых развивается вирус - индуцированный апоптоз только в части инфицированных клеток. Эти клетки индуцируют раскрытие нейтрофильных экстраклеточных ловушек, которые захватывают апоптозирующие клетки и их остатки. Другая часть инфицированных клеток не входит в апоптоз из-за функциональной недостаточности внутриклеточной системы распознавания вирусной РНК, принимают участие в вирусной репликации и поддерживают распространение вируса по организму. В ответ на гибнущие вирус инфицированные клетки нейтрофилы реагируют формированием нейтрофильных экстраклеточных ловушек. В этих условиях происходит непрерывное и продолжительное раскрытие нейтрофильных ловушек, сопровождающееся непрерывной секрецией ферментов, цитокинов (цитокиновый шторм), пептидов с порообразующей активностью и активных форм кислорода. Развивается тканевое повреждение, образование тромбов и возникновение острого воспалительного процесса с развитием COVID-19 пневмонии. Выраженная избыточность этой специфической реакции нейтрофилов в ответ на контактные взаимодействия с гибнущими вирус инфицированными клетками определяется исходным уровнем активации нейтрофилов.

На основании изучения этих механизмов может быть сделан вывод о том, что отсутствие избыточной или чрезмерной активации NADPH-оксидазы нейтрофилов (в отличие от бактериальных инфекций) открывает перспективы применения препаратов у пациентов с COVID-19 инфекцией.

Известно НОВОЕ ПРОИЗВОДНОЕ 3-ГИДРОКСИПИРИДИНА, ОБЛАДАЮЩЕЕ ЛИПИДРЕГУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ [RU2743923 опубл.: 29.05.2020], где раскрыто получение соединения, обладающего липидрегулирующими свойствами, с большей, чем у этоксидола и аторвастатина, эффективностью и широтой терапевтического действия, где эта задача решается новым соединением, а именно 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния-гамма-лактон-2,3-дегидро-L-гулонатом (аскорбинатом)

Задачей настоящего изобретения является поиск безопасных препаратов комплексного действия для лечения вирусных инфекций респираторного тракта, не оказывающих избыточную активацию NADPH-оксидазы нейтрофилов.

Технический результат заключается в применении фармацевтической композиции, 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния-гаммалактон-2,3-дегидро-L-гулоноат (аскорбината), проявляющего комплексное воздействие, что позволяет оказывать влияние на разные патофизиологические пути развития острых респираторных вирусных заболеваний, в частности предотвратить развитие тяжелых форм воспаления и тромбозов.

Указанный технический результат достигается тем, что применяется фармацевтическая композиция, представляющего собой 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния-гаммалактон-2,3-дегидро-L-гулоноат (аскорбинат) формулы:

обладающее антиоксидантным, вирулицидным, иммуностимулирующим, противогипоксическим и антиагрегантным действием для лечения острых респираторных вирусных инфекций гриппа и коронавирусной инфекции COVID-19.

В частности, применение композиции пригодно для профилактики и лечения осложнений после заболевания острыми респираторными вирусными инфекциями гриппа и коронавирусной инфекции COVID-19.

Возможность осуществления изобретения может быть продемонстрирована ниже представленными примерами.

Пример 1 Синтез соединения.

Синтез раскрыт и приведен в патенте [RU2743923 опубл.: 29.05.2020].

В гомогенизатор загружают просеянные порошки: 27,43г (0,2м) 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина и 35,23г (0,2м) гамма-лактон-2,3-дегидро-L-гулоновой кислоты (L-аскорбиновой). Массу тщательно гомогенизируют в течение 30-40 минут, затем при тщательном перемешивании приливают 250 мл пропанола-2. Реакционную массу перемешивают при температуре 30-35°C в течение 30 минут. Массу охлаждают, осадок отделяют, промывают пропанолом-2, сушат до постоянной массы. Получают 54,85г (87,2%) белого с кремоватым оттенком гигроскопичного порошка с температурой плавления 150-151°C. Найдено, %: C 53,62; H 6,19; N 4,43 C14H19NO7. Вычислено, %: C 53,67; H 6,12; N 4.47, O 35,74.

ИК-спектр, ν см-1: 3524 (OH), 3412 (NH), 2970, 2875 (CH), 2361 (N+), 1578 (C=C), 1560 (COO-).

УФ-спектр, нм: 270±2 (0,001% раствор в воде).

Пример 2 Иммуномодулирующие свойства препарата, на примере системы врожденного иммунитета с использованием лимфоцитов, полученных от больных с острым воспалительным процессом.

В работе использовали 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния-гаммалактон-2,3-дегидро-L-гулоноат (АСК-19) в экспериментах по определению жизнеспособности лимфоцитов в конечной концентрации в пробах 2 мкг/мл; 20 мкг/мл; 200 мкг/мл и 2 мг/мл. В экспериментах по активации NADPH-оксидазы в нейтрофилах использовали препарат в конечной концентрации в пробах 2 мкг/мл.

Культивирование клеток крови с препаратами. К стерильно выделенным лимфоцитам и нейтрофилам добавляли исследуемый препарат и проводили инкубацию их с клетками в при 37°С в атмосфере СО2 во всех экспериментах.

Определение проницаемости мембран лимфоцитов с использованием трипанового синего. Этот подход характеризуется надежностью и высокой воспроизводимостью и, поэтому, метод окрашивания клеток трипановым синим, принят как обязательный экспресс-метод оценки жизнеспособности клеточных культур. Неповрежденные клеточные мембраны непроницаемы для трипанового синего при кратковременной инкубации. Включения красителя в цитозоле свидетельствуют о нарушении интактности клеточной мембраны. Для визуальной оценки повреждения клеток используется способность ядерных белков адсорбировать краситель. Даже самое слабое окрашивание ядра клетки указывает на повреждение клеточной мембраны. Суспензию лимфоцитов после инкубирования с препаратами смешивали с 0,5% раствором трипанового синего в Na-фосфатном буферном растворе в соотношении 1:1. Клеточную суспензию переносили в камеру Горяева и вели подсчет окрашенных лимфоцитов и общего их количества. Результаты выражали в процентах как отношение окрашенных клеток к общему количеству лимфоцитов поле зрения.

Спонтанный тест с нитросиним тетразолием - НСТ тест позволяет оценить функциональное состояние нейтрофилов крови in vitro. Он характеризует состояние и степень активации внутриклеточной NADPH-оксидазной антибактериальной системы. Метод основан на восстановлении поглощённого нейтрофилами растворимого нитросинего тетразолия и его превращения в клетках в нерастворимый диформазан под влиянием супероксиданион-радикала (O2∙). Голубые гранулы диформазана накапливаются в нейтрофилах и определяются при микроскопировании. Метод включает в себя инкубирование 0,1 мл суспензии нейтрофилов (после обработки соответствующими фармакологическими препаратами) с 0,05 мл 0,2% раствора нитросинего тетразолия в Na-фосфатном буфере и 0,05 мл того же буфера. Суспензию нейтрофилов инкубировали 1 час при 37°С, делали мазки средней плотности, высушивали на воздухе, фиксировали в этиловом спирте (20 мин), окрашивали водным раствором нейтрального красного (0,1%, 20 мин) и микроскопировали под иммерсией. Среди 100 клеток подсчитывали долю активированных нейтрофилов, содержащих гранулы диформазана. Результаты выражали в процентах как отношение количества нейтрофилов накопивших гранулы формазана к общему количеству нейтрофилов поле зрения [Виксман М.Е., Маянский А.Н. 1979; Герасимов И. Г., Игнатов Д. Ю. 2001].

Результаты исследования проницаемости мембран лимфоцитов после их инкубации с препаратом в различных концентрациях приведены в таблице 1.

2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния-гаммалактон-2,3-дегидро-L-гулоноат (АСК-19) не вызывает повреждение клеточных мембран лимфоцитов периферической крови при использовании его в дозах заведомо превышающих терапевтические. Это означает, что препарат не влияет на моделирование собственной иммунной активности лимфоцитов.

Оценка показателей местного иммунитета по активации NADPH-оксидазы проводилась на основе результатов исследования влияния препарата на нейтрофилы больных с острым воспалительным процессом приведены, приведенных в таблице 2.

Исходное количество НСТ-позитивных нейтрофилов в экспериментах составляет 9,25±0,82%. Инкубирование нейтрофилов больных с препаратом вызывает увеличение количества НСТ-позитивных клеток, что свидетельствует об активации NADPH-оксидазы. Так через 30 мин культивирования количество клеток активирующих активирующих NADPH-оксидазу практически не изменяется. Культивирование клеток с препаратом в течение 1 и 2 часов увеличивает численность НСТ позитивных нейтрофилов до 12,82±0,87 и 15,26±1,22 %% соответственно. Продолжение культивирования в течение 3 часов практически не изменяет количество клеток экспрессирующих NADPH-оксидазу и составляет 15,34±1,37%.

Результаты исследований показывают, что исследуемый препарат весьма умеренно активирует NADPH-оксидазу - главный фермент генерации активных форм кислорода. На основании этого можно предполагать, что активирующая способность исследуемого препарата по отношению к NADPH-оксидазе нейтрофилов позволит с одной стороны повлиять на профилактику присоединения вторичной бактериальной инфекции, за счет ведущей роли активированных нейтрофилов в этом. С другой стороны, отсутствие избыточной стимуляции NADPH-оксидазы нейтрофилов позволит избежать дополнительного тканевого повреждения при его применении в качестве лекарственного средства при вирусной инфекции.

Пример 3 Изучение антиоксидантных свойств.

Антиоксидантная активность препарата определялась в тесте Hb-пероксид водорода-люминол.

При проведении анализа свежеприготовленный раствор исследуемого препарата в концентрации 2,17х10-6 М и выше гасил хемилюминесцентную (ХЛ) активность радикалов, генерируемых в системе (таблица 3). При повторном измерении (спустя 2 часа после приготовления водного р-ра вещества) регистрировали снижение его антирадикальных свойств. В интервале концентраций препарата (0,9-6,0)х10-6М определяли увеличение латентного периода развития ХЛ. Антирадикальная активность этих концентраций препарата через 2 часа после приготовления была сопоставима с аналогичным показателем для аскорбиновой кислоты (таблица 3). Снижение максимальных значений ХЛ под воздействием исследуемого препарата происходит за счет взаимодействия его с радикалами модельной системы и, по существу, отражает антиоксидантные свойства препарата.

Таким образом, результаты анализа АОА препарата подтвердили его выраженные антиоксидантные свойства.

Пример 4 Вирулицидное действие АСК-19 в отношении респираторных вирусов, на примере вируса гриппа А/IIV-Москва/01/2009 (H1N1)pdm09.

Вирулицидное действие АСК-19 в отношении пандемического штамма вируса гриппа А/IIV-Москва/01/2009 (H1N1)pdm09 изучали сравнением результатов инфекционной активности вируса после контакта с разными концентрациями вещества (12,5 - 50,0 мг/мл) в разных режимах инкубации: +4°C в течение 3 и 24 часов. После завершения режима инкубации, вируссодержащей жидкостью заражали клетки MDCK, выращенные на 96-луночных планшетах, проводя 10-кратные разведения вируса (1:10, 1:100, 1:1000 и т.д.). Панели оставляли в термостате при 37°C с 5% подачей СО2 до развития ЦПД в течение 24 часов. Инфекционный титр вируса определяли по методу Рида и Менча в РГА с 0,75% суспензией эритроцитов человека (I группа) в физиологическом растворе.

В таблице 4 представлены результаты расчета инфекционных титров для вируса А/IIV-Москва/01/2009 (H1N1)pdm09 при различных концентрациях препарата АСК-19 и режимах инкубации.

Как видно, из представленных результатов двух независимых опытов, в 1 и 2 режимах инкубации вируса гриппа А/IIV-Москва/01/2009 (H1N1)pdm09 с препаратом в концентрациях 25,0 и 50,0 мг/мл инфекционная активность вируса снижалась практически до нулевых значений по сравнению с контрольными (исключение составил 2 режим для второго опыта и концентрации 25,0 мг/мл - lgТЦИД50=2,2). Также наблюдали чёткий дозозависимый эффект: при повышении концентрации препарата показатели инфекционного титра вируса снижались.

Таким образом, так как снижение показателей инфекционных титров для вируса в обоих режимах являлось статистически значимым (2,0lg и более по сравнению с вирусным контролем), результаты позволяют сделать вывод о наличии вирулицидного действия препарата АСК-19 в концентрациях 25,0 и 50,0 мг/мл в отношении пандемического вируса гриппа А/IIV-Москва/01/2009 (H1N1)pdm09.

Вирулицидное действие (подавление концентрации вируса до проникновения после проникновения); цитопротекторное действие (увеличение процента выживших клеток культуры ткани MDCK, заражённых вирусом А(H1N1)pdm09, с возрастанием концентрации препарата, свидетельствует о его способности поддерживать жизнеспособность клеток (цитопротекторный эффект).

Пример 5 Исследование антигипоксической активности

Антигипоксическая активность изучается в экспериментах на следующих моделях гипоксии: гиперкапнической, гемической, гистотоксической гипоксии и при лигировании трахеи у мышей в трех дозах (препарат сравнения Этоксидол).

Модель гипоксической гипоксии (гипоксия с гиперкапнией в гермообъеме)

Мышей массой 20-22 г поодиночке сажали в стеклянные банки объемом 260 мл, которые герметично закрывали. По мере потребления кислорода животными его концентрация в сосуде и в организме снижается, напротив концентрация углекислого газа возрастает. У животных развивается нормобарическая гипоксическая гипоксия с гиперкапнией, что приводило их к гибели. Регистрировали длительность жизни мышей.

Исследуемые препараты вводили одноразово внутримышечно за 60 минут до начала эксперимента. Контрольные животные получали соответствующий объем растворителя (вода для инъекций).

Для моделирования гемической гипоксии использовали нитрит натрия, который вызывает образование метгемоглобина у лабораторных животных. Метгемоглобинемия - патологическое состояние организма, в основе которого лежит превращение оксигемоглобина (Fe ++) эритроцитов крови в метгемоглобин (Fe+++). Окисленное железо метгемоглобина не способно транспортировать кислород от легких к тканям, в результате чего развивается гемическая гипоксия).

Нитрит натрия вводили мышам массой 20-22 г в дозе 200 мг/кг подкожно. Исследуемые препараты вводили внутримышечно за 60 минут до начала эксперимента. Регистрировали длительность жизни животных. Контрольные животные получали соответствующий объем растворителя (вода для инъекций).

Модель гистотоксической (тканевой) гипоксии создавали путем внутрибрюшинного введения натрия нитропруссида в дозе 20 мг/кг. Исследуемые препараты вводили внутримышечно за 60 минут до начала эксперимента. Регистрировали длительность жизни животных. Контрольные животные получали соответствующий объем растворителя.

Гипоксия при перевязке трахеи у мышей (сохранение биоэлектрической активности миокарда).

У наркотизированных этаминалом натрия мышей массой 20-22 г перевязывали трахею и регистрировали ЭКГ во II стандартном отведении. О прекращении биоэлектрической активности миокарда судили по критерию уменьшения положительных зубцов ЭКГ до 0,1 мв. Исследуемые препараты вводили внутримышечно за 30 минут до начала эксперимента. Контрольные животные получали соответствующий объем растворителя.

В таблице 5 представлены результаты исследования влияния препарата на выживаемость мышей на различных моделях гипоксии.

Анализ полученных данных свидетельствует, что АСК-19 оказывает дозозависимое противогипоксическое действие.

Пример 6 Изучение антиагрегантной активности

6.1. В опытах in vitro в качестве объекта исследований использовали плазму доноров мужчин и женщин возрастом 19-21 год. Кровь брали из локтевой вены и стабилизированную гепарином в соотношении 9:1.

Антиагрегантную активность оценивали фотометрическим и импедансным методами. Фотометрический метод основан на определении оптической плотности по G.Born при помощи агрегометра на базе ФЭК М-56. Обогащенную тромбоцитами плазму получали путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 мин после 3-х минутного охлаждения. Бедную тромбоцитами плазму получали путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 30 мин. В качестве агрегирующего агента использовали малые дозы АДФ.

Импедансный метод основан на регистрации микротоков, протекающих в специальном электродном блоке, при погружении его в образец крови. Кинетика импеданса, определяемая на агрегометре Chrono-log 590 2d, позволяет количественно судить о процессах агрегации. Импедансный метод является более современным, технологически упрощённым тестом и лишен недостатков фотометрического метода по Born, 1963, к числу которых относится сильная зависимость от соблюдения условий многоэтапного процесса подготовки проб.

В экспериментах in vitro в качестве препарата сравнения использовали препарат из группы производных 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина Мексидол, являющийся аналогом АСК-19 в концентрации 0,40 мг/мл.

Полученные данные обрабатывались общепринятым методом вариационной статистики с вычислением среднего значения (М) и стандартной ошибки среднего значения (m).

Анализ полученных данных свидетельствует, что АСК-19 в опытах in vitro с использованием фотометрического метода по G.Born проявляет антиагрегантные свойства. При этом препарат был более активен в низких концентрациях. Так, в концентрации 0,05 мг/мл АСК-19 достоверно (р<0,05) удлинял латентный период, снижал скорость и интенсивность агрегации. Однако, время агрегации, как основной показатель процесса, достоверно не увеличивалось (таблица 6).

6.2. В экспериментах in vivo использовали цельную кровь кролика, полученную из ушной вены и стабилизированную гепарином в соотношении 9:1. Антиагрегантную активность оценивали импедансным методом. С этой целью кровь в объёме 500 мкл помещали в пробирку Eppendorf и смешивали с 500 мкл 0,9% NaCl после чего термостатировали при 37°С в течении 10 минут. В пробирку помещался якорь для магнитной мешалки, покрытый слоем оксида кремния. Скорость перемешивания устанавливали на 1200 об/мин после чего на агрегометре модели Chrono-log 590 2d произвели калибровку по цельной крови.

Кровь для исследований у кроликов забирали до начала эксперимента (исход) и через 10 дней после введения испытуемых препаратов. Общий объем крови, взятой у кролика, не превышал 10 мл. Исследуемые вещества вводили через зонд внутрижелудочно в виде раствора в дозе 7 мг/кг на предварительно прогретом подсолнечном масле в течение 10 дней. Объем вводимого раствора составлял 3 мл, что допустимо для данного вида животных.

Препарат сравнения «Аторвастатин» вводили в дозе 1 мг/кг, что соответствует дозе 30 мг для человека с учетом межвидового переноса доз. Препарат вводили через зонд внутрижелудочно в виде раствора на предварительно прогретом подсолнечном масле в течение 10 дней. Объем вводимого раствора составлял 3 мл.

Опыты, проведенные с использованием импедансного метода, показали, что АСК-19 при введении кроликам в дозе 7 мг/кг в течение 10 дней, также замедляет процессы агрегации тромбоцитов крови, индуцированные АДФ.

Известно, что одно из самых распространенных осложнений при тяжелой форме COVID-19 - тромбоз, то есть формирование внутри кровеносных сосудов сгустков крови, тромбов. Ключевой механизм образования тромбов при COVID-19 - активация так называемой системы комплемента - совокупности белков плазмы крови, участвующих в реализации иммунного ответа. Но, когда ее активация становится слишком высокой, например, при тяжелых инфекциях, система начинает воздействовать на собственные клетки организма. Предлагаемый новый препарат может предотвращать развитие осложнения.

Кроме того, антиагрегантная активность может являться еще одним дополнительным преимуществом для ряда категорий больных, например, у пациентов с сердечной недостаточностью или ИБС она снижает высокий риск осложнений вследствие разрыва атеросклеротической бляшки при вирус-индуцированном воспалении.

Таким образом, предлагаемое нами средство 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния-гаммалактон-2,3-дегидро-L-гулоноат - АСК-19 ранее описана в Патенте [RU2743923 опубл. 29.05.2020] с липидрегулирующей активности. В доступной патентной и научно-технической литературе отсутствуют данные по изучению свойств АСК-19 по показателям, приведенным в данной заявке.

Claims (3)

1. Применение 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния-гаммалактон-2,3-дегидро-L-гулоноат (аскорбината) формулы:
3. для лечения гриппа, коронавирусной инфекции COVID-19, а также их осложнений, связанных с развитием тромбоза.