RU2806564C1 - Method for assessing intraspecific competition of toxigenic and non-toxigenic strains of vibrio cholerae o1 and o139 serogroups using real-time pcr - Google Patents
Method for assessing intraspecific competition of toxigenic and non-toxigenic strains of vibrio cholerae o1 and o139 serogroups using real-time pcr Download PDFInfo
- Publication number
- RU2806564C1 RU2806564C1 RU2023110108A RU2023110108A RU2806564C1 RU 2806564 C1 RU2806564 C1 RU 2806564C1 RU 2023110108 A RU2023110108 A RU 2023110108A RU 2023110108 A RU2023110108 A RU 2023110108A RU 2806564 C1 RU2806564 C1 RU 2806564C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- toxigenic
- dna
- pcr
- strains
- primers
- Prior art date
Links
Abstract
Description
Предлагаемое изобретение относится к области медицинской микробиологии и генетической инженерии и может быть использовано в лабораторной диагностике при проведении мониторинга за холерой и проведении исследований связанных с изучением особенностей биологии возбудителя, включая идентификацию штаммов возбудителя холеры способных успешно конкурировать с нетоксигенными культурами.The present invention relates to the field of medical microbiology and genetic engineering and can be used in laboratory diagnostics when monitoring cholera and conducting research related to the study of the biology of the pathogen, including the identification of cholera pathogen strains capable of successfully competing with non-toxigenic cultures.
Эндемичные по холере регионы, являющиеся источником многочисленных заносов возбудителя, находятся в южных широтах характеризующихся теплым климатом. Для обширной территории Российской Федерации характерна низкая температура осенне-зимнего периода.Regions endemic for cholera, which are the source of numerous introductions of the pathogen, are located in southern latitudes characterized by a warm climate. The vast territory of the Russian Federation is characterized by low temperatures in the autumn-winter period.
В пробах воды поверхностных водоемов Российской Федерации регулярно обнаруживают нетоксигенные штаммы холерных вибрионов, что указывает на их возможное стабильное сохранение в окружающей среде в течение нескольких лет даже на территориях с холодным климатом (1-3). В тоже время выделение токсигенных культур из воды носит единичный и спорадический характер, причем практически все случаи являются завозными (4,5). Этот факт можно расценивать как отсутствие у токсигенных вибрионов механизмов способности успешно конкурировать с нетоксигенными культурами за счет устойчивости к неблагоприятному воздействию факторов внешней среды, в том числе к низким температурам. Совершенно очевидно, что токсигенный штамм, способный успешно конкурировать с нетоксигенными культурами, обитающими в водоемах РФ, будет представлять большую угрозу за счет повышенной выживаемости.Non-toxigenic strains of Vibrio cholerae are regularly found in water samples from surface water bodies of the Russian Federation, which indicates their possible stable persistence in the environment for several years, even in areas with a cold climate (1-3). At the same time, the release of toxigenic crops from water is isolated and sporadic, and almost all cases are imported (4,5). This fact can be regarded as the lack of mechanisms in toxigenic vibrios to successfully compete with non-toxigenic crops due to resistance to the adverse effects of environmental factors, including low temperatures. It is quite obvious that a toxigenic strain, capable of successfully competing with non-toxigenic crops living in water bodies of the Russian Federation, will pose a great threat due to increased survival.
Вместе с тем, проведение полномасштабной работы по оценке внутривидовой конкуренции между токсигенными и нетоксигенными штаммами Vibrio cholerae невозможно без простых и точных методов, способных уверенно дифференцировать в смеси токсигенные и нетоксигенные штаммы.At the same time, carrying out full-scale work to assess intraspecific competition between toxigenic and nontoxigenic strains of Vibrio cholerae is impossible without simple and accurate methods that can reliably differentiate toxigenic and nontoxigenic strains in a mixture.
Известен способ анализа внутривидовой конкуренции штаммов Vibrio cholerae с помощью INDEL-маркеров (6), заключающийся в том, что проводят ПЦР с праймерами к INDEL-маркеру «VC2429», позволяющего дифференцировать токсигенные и нетоксигенные штаммы холерных вибрионов, при этом токсигенные штаммы образовывали амплификат размером 100 п.о., а нетоксигенные штаммы из-за делеции участка в 16 нуклеотидов формировали амплификат размером 84 п.о.There is a known method for analyzing intraspecific competition of Vibrio cholerae strains using INDEL markers (6), which consists in performing PCR with primers to the INDEL marker “VC2429”, which makes it possible to differentiate toxigenic and non-toxigenic strains of Vibrio cholerae, while toxigenic strains formed an amplifier of the size 100 bp, and non-toxigenic strains, due to the deletion of a section of 16 nucleotides, formed an amplifier of 84 bp in size.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является способ выявления в одном образце нетоксигенных и токсигенных штаммов за счет способности формировать при проведении ПЦР с использованием праймеров к INDEL-локусу 1699 ампликоны различной молекулярной массы массой. Нетоксигенные культуры формируют ампликон массой 132 п.о., а токсигенные - массой 116 п.о. (7)The closest to the proposed invention in terms of the totality of essential features is a method for identifying non-toxigenic and toxigenic strains in one sample due to the ability to form amplicons of different molecular weights when performing PCR using primers to the INDEL locus 1699. Nontoxigenic cultures form an amplicon weighing 132 bp, and toxigenic cultures form an amplicon weighing 116 bp. (7)
Недостатком данного способа является невозможность точной оценки количества токсигенных и нетоксигенных вибрионов в исследуемом образце по интенсивности полосы специфического ампликона.The disadvantage of this method is the impossibility of accurately assessing the number of toxigenic and non-toxigenic vibrios in the test sample based on the intensity of the specific amplicon band.
Кроме того, проведение данного способа требует помимо постановки ПЦР этапа электрофоретического анализа для определения размера ампликона.In addition, this method requires, in addition to PCR, the stage of electrophoretic analysis to determine the size of the amplicon.
Осуществление электрофореза требует дополнительного времени, наличия сложного оборудования (как минимум, печи для плавления агарозы, прибора для проведения электрофореза, источника тока, трансиллюминатора, регистрирующей аппаратуры, набора расходных материалов) и средств защиты персонала.Carrying out electrophoresis requires additional time, the presence of complex equipment (at a minimum, an oven for melting agarose, an electrophoresis device, a current source, a transilluminator, recording equipment, a set of consumables) and personnel protection equipment.
При этом в соответствии с действующими нормативными документами (МУ 1.3.2569-09) для учета результатов реакции амплификации нуклеиновых кислот методом электрофореза необходима отдельная рабочая зона 4-1 которая должна быть расположена изолировано от других помещений для предотвращения контаминации продуктами амплификации через воздушный поток. Дополнительной трудностью при проведении работ по использованию электрофореза является необходимость проведения комплекса мероприятий по дегазации образовавшихся отходов (гели и буферы), содержащих крайне опасный интеркалирующий агент - бромистый этидий.At the same time, in accordance with current regulatory documents (MU 1.3.2569-09), to take into account the results of the nucleic acid amplification reaction by electrophoresis, a separate working area 4-1 is required, which should be located isolated from other rooms to prevent contamination with amplification products through the air flow. An additional difficulty when carrying out work using electrophoresis is the need to carry out a set of measures to degas the resulting waste (gels and buffers) containing an extremely dangerous intercalating agent - ethidium bromide.
Технической задачей предлагаемого изобретения является разработка нового способа, позволяющего быстро и достоверно проводить оценку внутривидовой конкуренции токсигенных и нетоксигенных штаммов Vibrio cholerae O1 и O139 серогруппы с помощью мультиплексной ПЦР в формате реального времени.The technical objective of the proposed invention is to develop a new method that allows for rapid and reliable assessment of intraspecific competition of toxigenic and non-toxigenic strains of Vibrio cholerae O1 and O139 serogroup using multiplex PCR in real time format.
Поставленная задача достигается тем, что в способе оценки внутривидовой конкуренции токсигенных и нетоксигенных штаммов Vibrio cholerae O1 и O139 с помощью ПЦР в режиме реального времени, включающем выделение ДНК из исследуемого материала, постановку ПЦР со специфическими праймерами и последующим анализом реакции амплификации, отличие заключается в том, что амплификацию исследуемой ДНК проводят с помощью двух пар праймеров и двух зондов:The goal is achieved by the fact that in the method of assessing intraspecific competition of toxigenic and non-toxigenic strains of Vibrio cholerae O1 and O139 using real-time PCR, including DNA extraction from the test material, PCR with specific primers and subsequent analysis of the amplification reaction, the difference is that that amplification of the DNA under study is carried out using two pairs of primers and two probes:
ctxA5; GTTCCTCTTGCATGATCATAAAGctxA5; GTTCCTCTTGCATGATCATAAAG
ctxA6; TATCGGGCAGATTCTAGACCctxA6; TATCGGGCAGATTCTAGACC
ctxA5Z; /ROX/-ACTCTGTCCTCTTGGCATAAGACCACCT-/BHQ2/ctxA5Z; /ROX/-ACTCTGTCCTCTTGGCATAAGACCACCT-/BHQ2/
иAnd
cold1 ACAGGTTCGGTTAAGTGGTTTcold1 ACAGGTTCGGTTAAGTGGTTT
cold2 ACCTGAAGTGATCGAATTGAAGTcold2 ACCTGAAGTGATCGAATTGAAGT
coldZ_12 /R6G/ACTCCTGATAGTGGCGGCTCTGA /BHQ1/coldZ_12 /R6G/ACTCCTGATAGTGGCGGCTCTGA /BHQ1/
при этом в одной пробе одновременно определяют концентрацию токсигенных и нетоксигенных холерных вибрионов, первая пара праймеров и зонд ctxA5Z фиксируют токсигенные вибрионы по присутствию гена ctx, а вторая пара использует в качестве маркерного гена для нетоксигенных штаммов ген холодового шока csh1, оценку внутривидовой конкуренции проводят по каналам HEX и ROX количества мишеней стандартных образцов ДНК, количественный результат вносят в соответствующие графы протокола, которые выражаются в виде десятичного логарифма количества клеток, чем больше концентрация при низких температурах, тем выше конкуренция штамма в возможности выживания.in this case, the concentration of toxigenic and non-toxigenic cholera vibrios is simultaneously determined in one sample, the first pair of primers and the ctxA5Z probe fix toxigenic vibrios by the presence of the ctx gene, and the second pair uses the cold shock gene csh1 as a marker gene for non-toxigenic strains, intraspecific competition is assessed through channels HEX and ROX numbers of targets of standard DNA samples, the quantitative result is entered into the corresponding columns of the protocol, which are expressed as the tenth logarithm of the number of cells, the higher the concentration at low temperatures, the higher the competition of the strain in the possibility of survival.
При этом перед постановкой ПЦР готовят стандартные препараты, содержащие известное количество ДНК токсигенных и нетоксигенных Vibrio cholerae, для этого массу токсигенного и нетоксигенного штаммов выращивают в течение суток на агаре Мартена рН 7,4 при температуре 37°С, потом готовят 1 млрд. бактериальной взвеси в 0,9% растворе хлорида натрия при рН 7,2 по стандартным образцам мутности, которые 10-кратно разводят до разведения 103, после смешивают полученные суспензии в разных разведениях, содержащих 108, 107 и 106 м.к./мл токсигенного и нетоксигенного штаммов, затем из трех полученных образцов выделяют ДНК, которые хранят при температуре 4°С до 30 суток для использования при постановке ПЦР.In this case, before performing PCR, standard preparations are prepared containing a known amount of DNA of toxigenic and non-toxigenic Vibrio cholerae; for this, a mass of toxigenic and non-toxigenic strains is grown for 24 hours on Marten agar pH 7.4 at a temperature of 37°C, then 1 billion bacterial suspension is prepared in a 0.9% sodium chloride solution at pH 7.2 according to standard turbidity samples, which are diluted 10-fold to a dilution of 10 3 , then the resulting suspensions are mixed in different dilutions containing 10 8 , 10 7 and 10 6 m.c./ ml of toxigenic and non-toxigenic strains, then DNA is isolated from the three samples obtained and stored at 4°C for up to 30 days for use in PCR.
Кроме того, ПЦР проводят в объеме 25 мкл, и реакционная смесь содержит: 2,5 мкл буфера, 1 Ед Taq ДНК-полимеразы, 0,2 мкМ смеси дНТФ, 1,0 мкМ каждого из четырех праймеров ctxA5, ctxA6 и зонд ctxA5Z, меченный по ROX для выявления токсигенных вибрионов по наличию гена ctx, cold1, cold2 и зонд coldZ_12, меченный по R6G, 0,5 мкМ каждого из двух праймеров 5 мкл ДНК -ДНК матрицы, оставшийся объем - вода.In addition, PCR is carried out in a volume of 25 μl, and the reaction mixture contains: 2.5 μl of buffer, 1 U Taq DNA polymerase, 0.2 μM dNTP mixture, 1.0 μM each of the four primers ctxA5, ctxA6 and probe ctxA5Z, labeled with ROX to detect toxigenic vibrios by the presence of the ctx, cold1, cold2 gene and probe coldZ_12, labeled with R6G, 0.5 μM of each of the two primers, 5 μl of DNA-DNA matrix, the remaining volume is water.
При этом ПЦР реакции проводят с соблюдением режимов: денатурация при 95°С - 2 мин (1 цикл); затем 30 циклов: денатурация при 95°С - 20 с, отжиг и учет по каналу FAM при 67°С - 20 с.In this case, PCR reactions are carried out in compliance with the following regimes: denaturation at 95°C - 2 min (1 cycle); then 30 cycles: denaturation at 95°C for 20 s, annealing and recording via the FAM channel at 67°C for 20 s.
Обоснование выбора праймеров.Rationale for choosing primers.
Важнейшим этапом при разработке ПЦР, обеспечивающим получение корректного результата, является правильный подбор мишеней для посадки праймеров. С помощью комплекса программного обеспечения, разработанного в ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора были проанализированы нуклеотидные последовательности с целью поиска генов характерных токсигенных и нетоксигенных штаммов холерного вибриона. В качестве гена, характерного для токсигенных штаммов выбран ген ctx, детерминирующий продукцию холерного токсина. В качестве маркерного гена для нетоксигенных штаммов выбран ген csh1, детерминирующий продукцию гена холодового шока (8).The most important step in the development of PCR, ensuring the correct result is obtained, is the correct selection of targets for landing primers. Using a software package developed at the Rostov-on-Don Anti-Plague Institute of Rospotrebnadzor, nucleotide sequences were analyzed to search for genes of characteristic toxigenic and non-toxigenic strains of Vibrio cholerae. The ctx gene, which determines the production of cholera toxin, was selected as a gene characteristic of toxigenic strains. The csh1 gene, which determines the production of the cold shock gene (8), was chosen as a marker gene for nontoxigenic strains.
В результате были сконструированы две пары праймеров первая пара ctxA5- ctxA6 и зонд ctxA5Z, меченный по ROX для выявления токсигенных вибрионов по наличию гена ctx и вторая пара cold1- cold2 и зонд coldZ_12, меченный по R6G:As a result, two pairs of primers were designed: the first pair ctxA5-ctxA6 and the ctxA5Z probe labeled with ROX to identify toxigenic vibrios by the presence of the ctx gene and the second pair cold1-cold2 and the coldZ_12 probe labeled with R6G:
ctxA5; GTTCCTCTTGCATGATCATAAAGctxA5; GTTCCTCTTGCATGATCATAAAG
ctxA6; TATCGGGCAGATTCTAGACCctxA6; TATCGGGCAGATTCTAGACC
ctxA5Z; /ROX/-ACTCTGTCCTCTTGGCATAAGACCACCT-/BHQ2/ctxA5Z; /ROX/-ACTCTGTCCTCTTGGCATAAGACCACCT-/BHQ2/
иAnd
cold1 ACAGGTTCGGTTAAGTGGTTTcold1 ACAGGTTCGGTTAAGTGGTTT
cold2 ACCTGAAGTGATCGAATTGAAGTcold2 ACCTGAAGTGATCGAATTGAAGT
coldZ_12[R6G] ACTCCTGATAGTGGCGGCTCTGA[BHQ1coldZ_12[R6G] ACTCCTGATAGTGGCGGCTCTGA[BHQ1
Объектом защиты настоящего изобретения является набор из двух пар праймеров и двух зондов первая пара ctxA5- ctxA6 и зонд ctxA5Z, меченный по ROX для выявления токсигенных вибрионов по наличию гена ctx и вторая пара cold1- cold2 и зонд coldZ_12, меченный по R6G для выявления нетоксигенных вибрионов по наличию гена холодового шока csh1. Результат достигается тем, что при постановке ПЦР в формате реального времени учет количества токсигенных и нетоксигенных клеток проводят каналам HEX и ROX амплификатора относительно стандартных образцов.The object of protection of the present invention is a set of two pairs of primers and two probes, the first pair ctxA5-ctxA6 and the ctxA5Z probe, labeled with ROX to identify toxigenic vibrios by the presence of the ctx gene, and the second pair cold1-cold2 and the coldZ_12 probe, labeled with R6G to identify non-toxigenic vibrios by the presence of the cold shock gene csh1. The result is achieved by the fact that when performing PCR in real time, the number of toxigenic and non-toxigenic cells is taken into account through the HEX and ROX channels of the amplifier relative to standard samples.
Способ осуществляется следующим образом.The method is carried out as follows.
Перед постановкой ПЦР проводят приготовление стандартных препаратов, содержащих известное количество ДНК токсигенных и нетоксигенных Vibrio cholerae. С этой целью Vibrio cholerae выращивают в течение суток на агаре Мартена рН 7,4±0,2 при температуре 37°С. Далее готовят 1 млрд. бактериальные взвеси в 0,9% растворе хлорида натрия (рН 7,2±0,1) по стандартным образцам мутности, которые 10-кратно разводят до разведения 103. Затем смешивают полученные суспензии в разных разведениях для получения суспензий, содержащих 108, 107 и 106 м.к./мл токсигенного и нетоксигенного штаммов.Before performing PCR, standard preparations containing a known amount of DNA of toxigenic and non-toxigenic Vibrio cholerae are prepared. For this purpose, Vibrio cholerae is grown for 24 hours on Marten agar pH 7.4±0.2 at a temperature of 37°C. Next, 1 billion bacterial suspensions are prepared in a 0.9% sodium chloride solution (pH 7.2±0.1) using standard turbidity samples, which are diluted 10-fold to a dilution of 10 3 . Then the resulting suspensions are mixed in different dilutions to obtain suspensions containing 10 8 , 10 7 and 10 6 mc/ml of toxigenic and nontoxigenic strains.
Из трех полученных образцов выделяют ДНК как принято (Метод. МУ 1.3.1791-9 «Организ. работы при исследовании методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами 1 и 2 группы патогенности-М.2003-38 с») с помощью любого коммерческого набора для выделения ДНК. Полученные таким образом препараты ДНК стандартов, содержащие по 108, 107и 106 м.к./мл токсигенного и нетоксигенного штаммов, хранят при 4°С до 30 суток и используют при постановке ПЦР.From the three samples obtained, DNA is isolated as usual (Method. MU 1.3.1791-9 “Organization of work in the study by PCR of material infected with microorganisms of pathogenicity groups 1 and 2 - M.2003-38 s”) using any commercial isolation kit DNA. The DNA standard preparations obtained in this way, containing 10 8 , 10 7 and 10 6 mc/ml of toxigenic and non-toxigenic strains, are stored at 4°C for up to 30 days and used for PCR.
Постановку ПЦР проводят согласно МУ 1.3.2569-09 с использованием двух пар праймеров и двух зондов первая пара ctxA5- ctxA6 и зонд ctxA5Z, меченный по ROX для выявления токсигенных вибрионов по наличию гена ctx и вторая пара cold1 - cold2 и зонд coldZ_12, меченный по R6G. В качестве стандартов используют три ранее полученных препарата ДНК стандартов.PCR is carried out according to MU 1.3.2569-09 using two pairs of primers and two probes, the first pair ctxA5-ctxA6 and the ctxA5Z probe labeled with ROX to identify toxigenic vibrios by the presence of the ctx gene and the second pair cold1 - cold2 and the coldZ_12 probe labeled with R6G. Three previously obtained DNA standard preparations are used as standards.
Инкубационная смесь объемом 25 мкл содержит: 2,5 мкл буфера, 1 Ед Taq ДНК-полимеразы, 0,2 мкМ смеси дНТФ, (производства ЗАО Евроген, Москва), 1,0 мкМ каждого из четырех праймеров ctxA5, ctxA6 и зонд ctxA5Z, меченный по ROX для выявления токсигенных вибрионов по наличию гена ctx, cold1, cold2 и зонд coldZ_12, меченный по R6G, 0,5 мкМ каждого из двух праймеров 5 мкл ДНК -ДНК матрицы, оставшийся объем - вода.An incubation mixture with a volume of 25 μl contains: 2.5 μl of buffer, 1 U Taq DNA polymerase, 0.2 μM dNTP mixture (manufactured by JSC Evrogen, Moscow), 1.0 μM each of the four primers ctxA5, ctxA6 and probe ctxA5Z, labeled with ROX to detect toxigenic vibrios by the presence of the ctx, cold1, cold2 gene and probe coldZ_12, labeled with R6G, 0.5 μM of each of the two primers, 5 μl of DNA-DNA matrix, the remaining volume is water.
Амплификацию проводят в амплификаторе, например, (DTlite5 производства НПФ, ДНК-технология), по следующей схеме: денатурация при 95°С - 2 мин (1 цикл); затем 30 циклов: денатурация при 95°С - 20 с, отжиг и учет по каналу FAM при 67°С - 20 с. Amplification is carried out in a thermal cycler, for example, (DTlite5 produced by NPF, DNA technology), according to the following scheme: denaturation at 95°C - 2 min (1 cycle); then 30 cycles: denaturation at 95°C for 20 s, annealing and recording via the FAM channel at 67°C for 20 s.
Учет проводят для выявления нетоксигенных вибрионов по каналу HEX, а токсигенных вибрионов по каналу ROX.Accounting is carried out to identify non-toxigenic vibrios through the HEX channel, and toxigenic vibrios through the ROX channel.
Для количественного учета ПЦР в соответствующие графы протокола вносят данные о количестве мишеней в стандартных образцах ДНК. Результат выражают в виде десятичного логарифма количества клеток используя встроенное программное обеспечение амплификатора.For quantitative accounting of PCR, data on the number of targets in standard DNA samples is entered into the corresponding columns of the protocol. The result is expressed as the decimal logarithm of the number of cells using the built-in software of the amplifier.
Сущность предлагаемого изобретения поясняется следующими примерами:The essence of the invention is illustrated by the following examples:
Пример 1. Анализ внутривидовой конкуренции токсигенного штамма Vibrio cholerae O139 №16077 ctx+tcpA+csh1- и нетоксигенного штамма Vibrio cholerae O1 №20000 ctx-tcpA-csh1+ в биопленке на хитиновом субстрате с помощью мультиплексной ПЦР в формате реального времени. Для проведения примеров все культуры взяты из коллекции Ростовского противочумного института.Example 1. Analysis of intraspecific competition between the toxigenic strain Vibrio cholerae O139 No. 16077 ctx+tcpA+csh1- and the nontoxigenic strain Vibrio cholerae O1 No. 20000 ctx-tcpA-csh1+ in a biofilm on a chitin substrate using multiplex real-time PCR. To provide examples, all cultures were taken from the collection of the Rostov Anti-Plague Institute.
Способ проводят по этапам:The method is carried out in stages:
Первоначально получают препарат хитина как описано (Патент RU 2685878) (7), для этого панцири широкопалого речного рака Astacusastacus разрезают на фрагменты величиной порядка 0,5×0,5 мм, помещают в количестве 10-15 штук во флакон емкостью 100 мл содержащий 30 мл отстоянной речной воды и автоклавируют 10 минут при 120°С. После охлаждения во флакон вносят взвесь исследуемых культур V. cholerae O139№. 16077 ctx+tcpA+csh1- и Vibrio cholerae O1 №20000 ctx-tcpA-csh1+ до конечной концентрации 104 м.к./мл. Инкубацию проводят при 25°С в течение 7 суток. Далее эти же образцы сформировавшихся зрелых биопленок переносят в условия 10°С и 25°С и продолжают инкубацию.Initially, a chitin preparation is prepared as described (Patent RU 2685878) (7), for this purpose the shells of the broad-toed crayfish Astacusastacus are cut into fragments measuring about 0.5×0.5 mm, placed in an amount of 10-15 pieces in a 100 ml bottle containing 30 ml of settled river water and autoclave for 10 minutes at 120°C. After cooling, a suspension of the studied cultures of V. cholerae O139№ is added to the bottle. 16077 ctx+tcpA+csh1- and Vibrio cholerae O1 No. 20000 ctx-tcpA-csh1+ to a final concentration of 10 4 m.k./ml. Incubation is carried out at 25°C for 7 days. Next, the same samples of formed mature biofilms are transferred to conditions of 10°C and 25°C and incubation is continued.
Образцы зрелой биопленки, сформированной токсигенным Vibrio cholerae O139 №16011 ctx+tcpA+csh1- и атоксигенным штаммом Vibrio cholerae O1 №20000 ctx-tcpA-csh1+ на хитиновом субстрате, получали как описано выше.Samples of mature biofilm formed by toxigenic Vibrio cholerae O139 No. 16011 ctx+tcpA+csh1- and atoxigenic strain Vibrio cholerae O1 No. 20000 ctx-tcpA-csh1+ on a chitin substrate were obtained as described above.
Анализ результатов образования биопленок проводят вторым этапом с помощью ПЦР. Предварительно в необходимые интервалы времени пластинки хитина извлекают стерильным пинцетом, избыток жидкости удаляют стерильной фильтровальной бумагой. Каждую отдельную пластинку переносят в пробирку емкостью 1,5 мл, содержащую 0,5 мл дистиллированной воды. Затем проводят лизис клеток и выделение путем прогревания при 99°С в течение 30 минут. Далее проводят высев на специфическую стерильность. Полученный препарат хранят при 4°С.Analysis of the results of biofilm formation is carried out in the second stage using PCR. Previously, at the required time intervals, the chitin plates are removed with sterile tweezers, and excess liquid is removed with sterile filter paper. Each individual plate is transferred to a 1.5 ml test tube containing 0.5 ml of distilled water. Cells are then lysed and isolated by heating at 99°C for 30 minutes. Next, seeding is carried out for specific sterility. The resulting preparation is stored at 4°C.
Постановку ПЦР проводят согласно МУ 1.3.2569-09 с использованием двух пар праймеров и двух зондов первая пара ctxA5- ctxA6 и зонд ctxA5Z, меченный по ROX для выявления токсигенных вибрионов по наличию гена ctx и вторая пара cold1 - cold2 и зонд coldZ_12, меченный по R6G. В качестве стандартов используют три ранее полученных препарата ДНК стандартов.PCR is carried out according to MU 1.3.2569-09 using two pairs of primers and two probes, the first pair ctxA5-ctxA6 and the ctxA5Z probe labeled with ROX to identify toxigenic vibrios by the presence of the ctx gene and the second pair cold1 - cold2 and the coldZ_12 probe labeled with R6G. Three previously obtained DNA standard preparations are used as standards.
Инкубационная смесь объемом 25 мкл содержит: 2,5 мкл буфера, 1 Ед Taq ДНК-полимеразы, 0,2 мкМ смеси дНТФ, (производства ЗАО Евроген, Москва), 1,0 мкМ каждого из четырех праймеров ctxA5, ctxA6 и зонд ctxA5Z, меченный по ROX для выявления токсигенных вибрионов по наличию гена ctx, cold1, cold2 и зонд coldZ_12, меченный по R6G, 0,5 мкМ каждого из двух праймеров 5 мкл ДНК -ДНК матрицы, оставшийся объем - вода.An incubation mixture with a volume of 25 μl contains: 2.5 μl of buffer, 1 U Taq DNA polymerase, 0.2 μM dNTP mixture (manufactured by JSC Evrogen, Moscow), 1.0 μM each of the four primers ctxA5, ctxA6 and probe ctxA5Z, labeled with ROX to detect toxigenic vibrios by the presence of the ctx, cold1, cold2 gene and probe coldZ_12, labeled with R6G, 0.5 μM of each of the two primers, 5 μl of DNA-DNA matrix, the remaining volume is water.
Амплификацию проводят в амплификаторе, например, (DTlite5 производства НПФ, ДНК-технология), по следующей схеме: денатурация при 95°С - 2 мин (1 цикл); затем 30 циклов: денатурация при 95°С - 20 с, отжиг и учет по каналу FAM при 67°С - 20 с. Amplification is carried out in a thermal cycler, for example, (DTlite5 produced by NPF, DNA technology), according to the following scheme: denaturation at 95°C - 2 min (1 cycle); then 30 cycles: denaturation at 95°C for 20 s, annealing and recording via the FAM channel at 67°C for 20 s.
Учет проводим по каналам HEX и ROX. Для количественного учета ПЦР в соответствующие графы протокола вносят данные о количестве мишеней в стандартных образцах ДНК. Результат выражают в виде десятичного логарифма количества клеток используя встроенное программное обеспечение амплификатора.We carry out accounting using HEX and ROX channels. For quantitative accounting of PCR, data on the number of targets in standard DNA samples is entered into the corresponding columns of the protocol. The result is expressed as the decimal logarithm of the number of cells using the built-in software of the amplifier.
Результаты анализ внутривидовой конкуренции штаммов токсигенного штамма Vibrio cholerae O139 №16077ctx+tcpA+csh1- и нетоксигенного штамма Vibrio choleraeO1 №20000 ctx-tcpA-csh1+ в зрелой биопленке на хитиновом субстрате с помощью мультиплексной ПЦР в формате реального времени представлены в таблице 1.The results of the analysis of intraspecific competition between the toxigenic strain Vibrio cholerae O139 No. 16077ctx+tcpA+csh1- and the non-toxigenic strain Vibrio choleraeO1 No. 20000 ctx-tcpA-csh1+ in a mature biofilm on a chitin substrate using multiplex PCR in real time are presented in Table 1.
Из таблицы видно, что при температуре 25°С концентрация токсигенных и нетоксигенных V. cholerae в составе биопленки на хитиновом субстрате до 21 суток нарастала на четыре-пять порядков по сравнению с первоначальной инфицирующей дозой. При этом разница в концентрации между токсигенным и нетоксигенным штаммов не превышала полтора порядка. Это наблюдение указывает, что клетки токсигенной культуры V. cholerae O139 №.16077 при 25°С способны противостоять ингибирующей активности V cholerae O1 №20000 и сохраняться на биотическом субстрате в составе зрелой биопленки.The table shows that at a temperature of 25°C, the concentration of toxigenic and nontoxigenic V. cholerae in the biofilm on a chitin substrate increased by four to five orders of magnitude up to 21 days compared to the initial infectious dose. At the same time, the difference in concentration between toxigenic and nontoxigenic strains did not exceed one and a half orders of magnitude. This observation indicates that cells of the toxigenic culture of V. cholerae O139 no. 16077 at 25°C are able to resist the inhibitory activity of V cholerae O1 no. 20000 and persist on the biotic substrate as part of a mature biofilm.
При инкубации зрелой биопленки при пониженной температуре 10°С, концентрация токсигенного штамма V. cholerae к 14 суткам снижалась на 2,5 порядка в то время как концентрация нетоксигенного штамма 20000 сохранялась на прежнем уровне.When a mature biofilm was incubated at a low temperature of 10°C, the concentration of the toxigenic strain of V. cholerae by day 14 decreased by 2.5 orders of magnitude, while the concentration of the nontoxigenic strain 20000 remained at the same level.
Полученные данные свидетельствуют, что предлагаемый способ оценки внутривидовой конкуренции штаммов V. cholerae с помощью мультиплексной ПЦР в формате реального времени позволяет в одной пробирке количественно определять концентрацию токсигенного и нетоксигенного штаммов V. cholerae в составе биопленки. Токсигенный штамм Vibrio cholerae Q139 №16077 обладает сниженной способностью к выживанию при 10°С по сравнению с условиями при 25°С.The data obtained indicate that the proposed method for assessing intraspecific competition of V. cholerae strains using multiplex real-time PCR allows one to quantify the concentration of toxigenic and nontoxigenic V. cholerae strains in the biofilm in one tube. Toxigenic strain Vibrio cholerae Q139 No. 16077 has a reduced ability to survive at 10°C compared to conditions at 25°C.
Пример 2. Анализ внутривидовой конкуренции штаммов токсигенного штамма Vibrio cholerae O1 №19613ctx+tcpA+csh1- и нетоксигенного штамма Vibrio cholerae O1 №20000 ctx-tcpA-csh1+ в зрелой биопленке на хитиновом субстрате с помощью мультиплексной ПЦР в формате реального времени.Example 2. Analysis of intraspecific competition between toxigenic strain Vibrio cholerae O1 No. 19613ctx+tcpA+csh1- and non-toxigenic strain Vibrio cholerae O1 No. 20000 ctx-tcpA-csh1+ in a mature biofilm on a chitin substrate using multiplex real-time PCR.
Образцы зрелой биопленки, сформированной токсигеннымУШгю cholerae O1 №19613 ctx+tcpA+csh1- и нетоксигенным штаммом Vibrio cholerae O1 №20000 ctx-tcpA-csh1+, получали как описано выше.Samples of mature biofilm formed by the toxigenic Vibrio cholerae O1 no. 19613 ctx+tcpA+csh1- and nontoxigenic strain Vibrio cholerae O1 no. 20000 ctx-tcpA-csh1+ were obtained as described above.
Результаты анализа внутривидовой конкуренции штаммов токсигенного штамма V. cholerae O1 №19613ctx+tcpA+csh1- и нетоксигенного штамма Vibrio cholerae O1 №20000 ctx-tcpA-csh1+ в зрелой биопленке на хитиновом субстрате с помощью мультиплексной ПЦР в формате реального времени смотри таблицу 2.The results of the analysis of intraspecific competition between the toxigenic strain V. cholerae O1 No. 19613ctx+tcpA+csh1- and the nontoxigenic strain Vibrio cholerae O1 No. 20000 ctx-tcpA-csh1+ in a mature biofilm on a chitin substrate using multiplex PCR in real time, see Table 2.
Полученные результаты свидетельствуют, что в составе биопленки на хитиновом субстрате клетки токсигенного штамма V. cholerae O1 №19613 успешно противостоят конкурентной активности нетоксигенного штамма V. cholerae O1 №20000 при двух изученных температурах инкубации 25°С и 10°С.The results obtained indicate that, as part of a biofilm on a chitin substrate, cells of the toxigenic strain V. cholerae O1 No. 19613 successfully resist the competitive activity of the nontoxigenic strain V. cholerae O1 No. 20000 at two studied incubation temperatures of 25°C and 10°C.
Этим они отличаются от клеток V. cholerae O139 №16077, неспособных конкурировать с клетками нетоксигенного штамма V. cholerae O1 №20000 при 10°С. Данный результат объясняет отсутствие укоренения штаммов V. cholerae серовара O139.In this they differ from the cells of V. cholerae O139 no. 16077, which are unable to compete with the cells of the nontoxigenic strain V. cholerae O1 no. 20000 at 10°C. This result explains the lack of establishment of V. cholerae serovar O139 strains.
Пример 3. Анализ внутривидовой конкуренции штаммов токсигенного штамма V.cholerae O1 №19613 ctx+tcpA+csh1- и нетоксигенного штамма Vibrio cholerae O1 №20000 ctx-tcpA-csh1+ в зрелой биопленке на пластиковом субстрате с помощью мультиплексной ПЦР в формате реального времени.Example 3. Analysis of intraspecific competition between toxigenic strain V. cholerae O1 No. 19613 ctx+tcpA+csh1- and non-toxigenic strain Vibrio cholerae O1 No. 20000 ctx-tcpA-csh1+ in a mature biofilm on a plastic substrate using multiplex real-time PCR.
Образцы зрелой биопленки, сформированной токсигенным Vibrio cholerae O1 №19613 ctx+tcpA+csh1- и нетоксигенным штаммом Vibrio cholerae O1 №20000 ctx-tcpA-csh1+ на пластиковом субстрате, получают как описано в примере 1.Samples of mature biofilm formed by toxigenic Vibrio cholerae O1 No. 19613 ctx+tcpA+csh1- and non-toxigenic strain Vibrio cholerae O1 No. 20000 ctx-tcpA-csh1+ on a plastic substrate are obtained as described in example 1.
С этой целью фрагменты пищевого пластика величиной порядка 0,5×0,5 мм, помещают в количестве 10-15 штук во флакон емкостью 100 мл содержащий 30 мл отстоянной речной воды и автоклавируют 10 минут при 120°С. Далее все манипуляции проводили как описано в Примерах 1 и 2.For this purpose, fragments of food plastic measuring about 0.5×0.5 mm are placed in an amount of 10-15 pieces in a 100 ml bottle containing 30 ml of settled river water and autoclaved for 10 minutes at 120°C. Further, all manipulations were carried out as described in Examples 1 and 2.
Результаты анализа внутривидовой конкуренции штаммов токсигенного штамма V.cholerae O1 №9613ctx+tcpA+csh1- и нетоксигенного штамма Vibrio cholerae O1 №20000 ctx-tcpA-csh1+ в зрелой биопленке на пластиковом субстрате с помощью мультиплексной ПЦР в формате реального времени, смотри таблицу 3.Results of the analysis of intraspecific competition between the toxigenic strain V. cholerae O1 No. 9613ctx+tcpA+csh1- and the non-toxigenic strain Vibrio cholerae O1 No. 20000 ctx-tcpA-csh1+ in a mature biofilm on a plastic substrate using multiplex real-time PCR, see Table 3.
Вывод в составе биопленки на пластиковом субстрате клетки токсигенного штамма Vcholerae O1 №19613 неспособны противостоят конкурентной активности нетоксигенного штамма V. cholerae O1 №20000 при 25°С поскольку к 21 и 30 суткам инкубации отсутствует ДНК токсигенного штамма, в то время как концентрация нетоксигенного штамма V. cholerae O1 №20000 сохраняется в пределах исходной величины. При снижении температуры инкубации до 10°С клетки токсигенного штамма V. cholerae O1 №19613 неспособны формировать биопленку, поскольку биопленка представлена исключительно клетками нетоксигенного штамма V. cholerae O1 №20000.When found in a biofilm on a plastic substrate, cells of the toxigenic strain Vcholerae O1 No. 19613 are unable to resist the competitive activity of the non-toxigenic strain V. cholerae O1 No. 20000 at 25°C since by the 21st and 30th days of incubation there is no DNA of the toxigenic strain, while the concentration of the nontoxigenic strain V cholerae O1 No. 20000 remains within the original value. When the incubation temperature is reduced to 10°C, cells of the toxigenic strain V. cholerae O1 No. 19613 are unable to form a biofilm, since the biofilm is represented exclusively by cells of the nontoxigenic strain V. cholerae O1 No. 20000.
Пример 4. Анализ внутривидовой конкуренции штаммов токсигенного штамма Vibrio cholerae O139 №17259ctx+tcpA+csh1- и ненетоксигенного штамма Vibrio cholerae O1 №20000 ctx-tcpA-csh1+ в планктонной форме в стерильной речной воды с помощью мультиплексной ПЦР в формате реального времениExample 4. Analysis of intraspecific competition between strains of the toxigenic strain Vibrio cholerae O139 No. 17259ctx+tcpA+csh1- and non-non-toxigenic strain Vibrio cholerae O1 No. 20000 ctx-tcpA-csh1+ in planktonic form in sterile river water using multiplex real-time PCR
В заданные интервалы времени отбирают 0,5 мл пробыречной воды, проводят лизис клеток и выделяют ДНК путем прогревания при 99°С в течение 30 минут. Далее проводят высев на специфическую стерильность. Полученный препарат до проведения мультиплексной ПЦР в формате реального времени хранят при 4°С.At specified time intervals, 0.5 ml of sample water is taken, cells are lysed and DNA is isolated by heating at 99°C for 30 minutes. Next, seeding is carried out for specific sterility. The resulting preparation is stored at 4°C before performing multiplex PCR in real time.
Результаты анализа внутривидовой конкуренции штаммов токсигенного штамма Vibrio cholerae O139 №17259 ctx+tcpA+csh1- и ненетоксигенного штамма Vibrio cholerae O1 №20000 ctx-tcpA-csh1+в планктонной форме в стерильной речной воде с помощью мультиплексной ПЦР в формате реального времени отражены в таблице4.The results of the analysis of intraspecific competition between the toxigenic strain Vibrio cholerae O139 No. 17259 ctx+tcpA+csh1- and the non-toxigenic strain Vibrio cholerae O1 No. 20000 ctx-tcpA-csh1+ in planktonic form in sterile river water using multiplex real-time PCR are shown in Table 4 .
Полученные результаты свидетельствуют, что при 25°С в стерильной речной воде планктонная форма токсигенного штамма Vibrio cholerae O139 №11259 ctx+tcpA+csh1- успешно конкурируют с неатоксигенным штаммом Vibrio cholerae O1 №2000 ctx-tcpA-csh1+. Однако при 10°С количество клеток нетоксигенного штамма Vibrio cholerae O1 №20000 ctx-tcpA-csh1+ более чем в 100 раз превышает аналогичный показатель токсигенного штамма. Это свидетельствует об сниженной способности токсигенного штамма Vibrio cholerae O139 №17259 ctx+tcpA+csh1- к выживанию при низких температурах.The results obtained indicate that at 25°C in sterile river water, the planktonic form of the toxigenic strain Vibrio cholerae O139 No. 11259 ctx+tcpA+csh1- successfully competes with the non-toxigenic strain Vibrio cholerae O1 No. 2000 ctx-tcpA-csh1+. However, at 10°C, the number of cells of the nontoxigenic strain Vibrio cholerae O1 No. 20000 ctx-tcpA-csh1+ is more than 100 times higher than that of the toxigenic strain. This indicates a reduced ability of the toxigenic strain Vibrio cholerae O139 No. 17259 ctx+tcpA+csh1- to survive at low temperatures.
Во всех примерах время проведения ПЦР и получения результата с момента получения образцов ДНК не превышало 1,5 часов.In all examples, the time to perform PCR and obtain the result from the moment the DNA samples were received did not exceed 1.5 hours.
Использование предлагаемого изобретения позволяет быстро и достоверно за счет подбора двух пар праймеров и двух зондов с помощью ПЦР в формате реального времени проводить оценку внутривидовой конкуренции штаммов Vibrio cholerae O1 и O139, что крайне важно при проведении мониторинга за холерой и анализе биологических свойств в случае выделения токсигенных штаммов Vibrio cholerae O1 и O139 серогрупп и их оценки к выживанию в водоемах при пониженной температуре.The use of the present invention makes it possible to quickly and reliably, by selecting two pairs of primers and two probes using real-time PCR, assess the intraspecific competition of Vibrio cholerae O1 and O139 strains, which is extremely important when monitoring cholera and analyzing biological properties in the case of the isolation of toxigenic strains of Vibrio cholerae O1 and O139 serogroups and their assessment of survival in water bodies at low temperatures.
Источники информации.Information sources.
1. Москвитина Э.А., Мазрухо А.Б., Адаменко О.Л., Кругликов В.Д.,«Холера в начале XXI века. Прогноз на глобальном уровне» // Проблемы особо опасных инфекций. 2012. №. 1. С. 11-16.1. Moskvitina E.A., Mazruho A.B., Adamenko O.L., Kruglikov V.D., “Cholera at the beginning of the 21st century. Forecast at the global level” // Problems of especially dangerous infections. 2012. No. 1. pp. 11-16.
2. Носков А.К., Кругликов В.В., Лопатин А.А., Чемисова О.С., Левченко Д.А., Иванова С.М., Монахова Е.В., Архангельская И.В., Водопьянов А.С., Гаевская Н.Е., Подойницына О.А., Ежова М.И., «Результаты мониторинга холеры на административных территориях России в период с 2013 по 2019 год» // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2021. №.2. С. 163-175.2. Noskov A.K., Kruglikov V.V., Lopatin A.A., Chemisova O.S., Levchenko D.A., Ivanova S.M., Monakhova E.V., Arkhangelskaya I.V., Vodopyanov A.S., Gaevskaya N.E., Podoynitsyna O.A., Ezhova M.I., “Results of monitoring cholera in the administrative territories of Russia from 2013 to 2019” // Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. 2021. No.2. pp. 163-175.
3. Носков А.К., Кругликов В.В., Лопатин А.А., Чемисова О.С., Левченко Д.А., Иванова С.М., Монахова Е.В., Архангельская И.В., Водопьянов А.С., Гаевская Н.Е., Подойницына О.А., Ежова М.И., «Результаты мониторинга холеры на административных территориях России в период с 2013 по 2019 год» // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2021. №. 2. С. 163-1753. Noskov A.K., Kruglikov V.V., Lopatin A.A., Chemisova O.S., Levchenko D.A., Ivanova S.M., Monakhova E.V., Arkhangelskaya I.V., Vodopyanov A.S., Gaevskaya N.E., Podoynitsyna O.A., Ezhova M.I., “Results of monitoring cholera in the administrative territories of Russia from 2013 to 2019” // Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. 2021. no. 2. pp. 163-175
4. Титова С.В., Кругликов В.Д., Ежова М.И., Водопьянов А.С., Архангельская И.В., Водопьянов C.O., Москвитина Э.А., «Анализ динамики выделения и биологических свойств штаммов V. cholerae O1 ElTor, изолированных из водных объектов на территории Ростовской области в 2003-2014 гг.» // Здоровье населения и среда обитания. 2015. №2. С. 39-41.4. Titova S.V., Kruglikov V.D., Ezhova M.I., Vodopyanov A.S., Arkhangelskaya I.V., Vodopyanov S.O., Moskvitina E.A., “Analysis of the dynamics of isolation and biological properties of V strains cholerae O1 ElTor, isolated from water bodies in the Rostov region in 2003-2014.” // Population health and habitat. 2015. No. 2. pp. 39-41.
5. Савельев В.Н., Ковалев Д.А., Савельева И.В., Таран Т.В., Подопригора Е.И., Васильева О.В., Шапаков Н.А., Алехина Ю.А., Куличенко А.Н., «Эволюция фенотипических свойств и молекулярно-генетической организации геномов штаммов Vibrio cholerae O1 биовара Эль Тор, выделенных от больных и из объектов окружающей среды на Кавказе с 1970 по 1998 год.», журнал Здоровье населения и среда обитания - ЗНиСО. 2020; (Т2): 56-61. https://doi.org/10.35627/2219-5238/2020-333-12-56-615. Savelyev V.N., Kovalev D.A., Savelyeva I.V., Taran T.V., Podoprigora E.I., Vasilyeva O.V., Shapakov N.A., Alekhina Yu.A., Kulichenko A.N., “Evolution of the phenotypic properties and molecular genetic organization of the genomes of Vibrio cholerae O1 biovar El Tor strains isolated from patients and from environmental objects in the Caucasus from 1970 to 1998,” Journal of Population Health and Habitat - ZNiSO . 2020; (T2): 56-61. https://doi.org/10.35627/2219-5238/2020-333-12-56-61
6. «Анализа внутривидовой конкуренции штаммов Vibrio cholerae с помощью INDEL-маркеров», Водопьянов C.O., Водопьянов А.С, Олейников И.П., Лысова Л.К., Титова С.В., журнал Здоровье населения и среда обитания, 2016 г., №4. С. 35-38.)6. “Analysis of intraspecific competition of Vibrio cholerae strains using INDEL markers”, Vodopyanov S.O., Vodopyanov A.S., Oleinikov I.P., Lysova L.K., Titova S.V., journal Population Health and Environment, 2016 g., No. 4. pp. 35-38.)
7. «Способ моделирования биопленок, формируемых Vibriocholerae 01 серогруппы на поверхности хитина », патент №2685878, кл. C12N 11/00, опубл. 23.04.2019 №12.7. “Method for modeling biofilms formed by Vibriocholerae 01 serogroup on the surface of chitin,” patent No. 2685878, class. C12N 11/00, publ. 04/23/2019 No. 12.
8.«Способ выявления гена холодового шока csh1 у штаммов Vibriocholerae с помощью ПЦР в режиме реального времени», патент №2783023, кл. C12N 15/00, C12Q 1/68, опубл. 08.11.2022 г., Бюл. №31.8. “Method for identifying the cold shock gene csh1 in Vibriocholerae strains using real-time PCR,” patent No. 2783023, class. C12N 15/00, C12Q 1/68, publ. 08.11.2022, Bull. No. 31.
--->--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?><?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing <!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru" <ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="en"
nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" dtdVersion="V1_3" nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" dtdVersion="V1_3"
fileName="Титова- конкуренция.xml" softwareName="WIPO Sequence" fileName="Titova-competition.xml" softwareName="WIPO Sequence"
softwareVersion="2.2.0" productionDate="2023-03-23">softwareVersion="2.2.0" productionDate="2023-03-23">
<ApplicationIdentification> <ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode> <IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>186</ApplicationNumberText> <ApplicationNumberText>186</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2023-03-23</FilingDate> <FilingDate>2023-03-23</FilingDate>
</ApplicationIdentification> </ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>186</ApplicantFileReference> <ApplicantFileReference>186</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">Ростовский- на –Дону противочумный <ApplicantName languageCode="ru">Rostov-on-Don anti-plague
институт Роспотребнадзора</ApplicantName>Institute of Rospotrebnadzor</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Rostov-on-Don Plague Control Research Institute <ApplicantNameLatin>Rostov-on-Don Plague Control Research Institute
of the Rospotrebnadzor</ApplicantNameLatin>of the Rospotrebnadzor</ApplicantNameLatin>
<InventorName languageCode="ru">Водопьянов Сергей <InventorName languageCode="ru">Vodopyanov Sergey
Олегович</InventorName>Olegovich</InventorName>
<InventorNameLatin>Vodopyanov Sergey Olegovich</InventorNameLatin> <InventorNameLatin>Vodopyanov Sergey Olegovich</InventorNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Способ оценки внутривидовой <InventionTitle languageCode="ru">Method for assessing intraspecific
конкуренции токсигенных и атоксигенных штаммов Vibrio cholerae 01 и competition between toxigenic and atoxigenic strains of Vibrio cholerae 01 and
0139 серогруппы с помощью ПЦР в режиме реального 0139 serogroups using real-time PCR
времени</InventionTitle>time</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>6</SequenceTotalQuantity> <SequenceTotalQuantity>6</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1"> <SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2"> <INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Vibrio cholerae</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Vibrio cholerae</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gttcctcttgcatgatcataaag</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>gttcctcttgcatgatcataaag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2"> <SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4"> <INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Vibrio cholerae </INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Vibrio cholerae </INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tatcgggcagattctagacc</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>tatcgggcagattctagacc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3"> <SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>28</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>28</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..28</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..28</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6"> <INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Vibrio cholerae </INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Vibrio cholerae </INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>actctgtcctcttggcataagaccacct</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>actctgtcctcttggcataagaccacct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4"> <SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q8"> <INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Vibrio cholerae </INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Vibrio cholerae </INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>acaggttcggttaagtggttt</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>acaggttcggttaagtggttt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5"> <SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q10"> <INSDQualifier id="q10">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Vibrio cholerae </INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Vibrio cholerae </INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>acctgaagtgatcgaattgaagt</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>acctgaagtgatcgaattgaagt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="6"> <SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q12"> <INSDQualifier id="q12">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Vibrio cholerae</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Vibrio cholerae</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>actcctgatagtggcggctctga</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>actcctgatagtggcggctctga</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
</ST26SequenceListing></ST26SequenceListing>
<---<---
Claims (12)
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2806564C1 true RU2806564C1 (en) | 2023-11-01 |
Family
ID=
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2360972C1 (en) * | 2007-12-18 | 2009-07-10 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека ("РосНИПЧИ "Микроб") | Method detection and evaluation of biotype, serogroup and toxigenicity of cholera agent and related kit |
RU2560280C2 (en) * | 2014-09-23 | 2015-08-20 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФКУЗ "РосНИПЧИ "Микроб") | Method of simultaneous identification of toxigenic strains of genovariants of el tor cholera causative agent and their differentiation on epidemic potential by method of multiplex polymerase chain reaction |
US20200299360A1 (en) * | 2010-11-23 | 2020-09-24 | Pantheryx, Inc. | Compositions and methods for treatment in broad-spectrum, undifferentiated or mixed clinical applications |
CN111826316A (en) * | 2020-07-28 | 2020-10-27 | 上海海洋大学 | Heavy metal tolerant non-O1/O139 type vibrio cholerae strain and application thereof |
RU2766192C1 (en) * | 2021-05-05 | 2022-02-09 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Method for detection of toxigenic strains 01 vibrio cholerae "postgaitian" line by pcr in real time |
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2360972C1 (en) * | 2007-12-18 | 2009-07-10 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека ("РосНИПЧИ "Микроб") | Method detection and evaluation of biotype, serogroup and toxigenicity of cholera agent and related kit |
US20200299360A1 (en) * | 2010-11-23 | 2020-09-24 | Pantheryx, Inc. | Compositions and methods for treatment in broad-spectrum, undifferentiated or mixed clinical applications |
RU2560280C2 (en) * | 2014-09-23 | 2015-08-20 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФКУЗ "РосНИПЧИ "Микроб") | Method of simultaneous identification of toxigenic strains of genovariants of el tor cholera causative agent and their differentiation on epidemic potential by method of multiplex polymerase chain reaction |
CN111826316A (en) * | 2020-07-28 | 2020-10-27 | 上海海洋大学 | Heavy metal tolerant non-O1/O139 type vibrio cholerae strain and application thereof |
RU2766192C1 (en) * | 2021-05-05 | 2022-02-09 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Method for detection of toxigenic strains 01 vibrio cholerae "postgaitian" line by pcr in real time |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Siqueira Jr et al. | PCR methodology as a valuable tool for identification of endodontic pathogens | |
JP2019201658A (en) | Multiplex pyrosequencing using non-interfering noise canceling polynucleotide identification tags | |
CN112522429A (en) | Method and reagent set for detecting bacillus anthracis by RPA (reverse transcriptase polymerase chain reaction) combined CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) technology | |
CN113249499B (en) | Salmonella typhi detection kit, and preparation method and application thereof | |
Fearnley et al. | The development of a real-time PCR to detect pathogenic Leptospira species in kidney tissue | |
WO2017139715A1 (en) | Systems and methods for the detection of infectious diseases | |
RU2612137C1 (en) | Method for identification of tularemia pathogen subspecies francisella tularensis subsp tularensis, francisella tularensis subsp mediasiatica and francisella tularensis subsp holarctica | |
JP5522820B2 (en) | Method for detecting pathogens of strawberry important diseases and primers for detection | |
CN108531627A (en) | One kind is for detecting the streptococcic RPA fluorescent quantitations primer pair of B races, probe, kit and detection method | |
CN106381340B (en) | Botrytis cinerea LAMP detection primer, detection kit and its application | |
RU2360972C1 (en) | Method detection and evaluation of biotype, serogroup and toxigenicity of cholera agent and related kit | |
Wang et al. | Development and application of quantitative real-time PCR based on the mitochondrial cytochrome oxidase subunit I gene for early detection of the grazer Poterioochromonas malhamensis contaminating Chlorella culture | |
RU2806564C1 (en) | Method for assessing intraspecific competition of toxigenic and non-toxigenic strains of vibrio cholerae o1 and o139 serogroups using real-time pcr | |
RU2736649C1 (en) | Method for genetic differentiation of yersinia pseudotuberculosis strains by molecular-genetic typing | |
RU2455364C2 (en) | Method of identifying mycobacteria by polymerase chain reaction | |
CN110157819B (en) | LAMP kit for rapidly detecting Salmonella indiana in livestock and poultry feces | |
RU2816184C1 (en) | Method for differentiating strains of pseudomonas aeruginosa using molecular genetic typing | |
CN104032000B (en) | The detection method of a kind of bacillus cereus and test kit | |
RU2729218C1 (en) | Method for detecting toxigenic strains of o1 vibrio cholerae of "haitian" group by pcr in real time on end point | |
RU2738358C1 (en) | Set of oligonucleotide primers and fluorescent-labelled probes and method for detecting dna of agents of glanders and melioidosis by pcr method with product detection in real time | |
RU2814556C1 (en) | Test system for detecting dna of causative agent of moraxellosis kpc (moraxella bovis) in biological material of animals and feed using polymerase chain reaction in real time | |
Hwang et al. | First identification of Taylorella equigenitalis from genital tracts of Thoroughbred horses from the inland area of South Korea by multilocus sequence typing | |
RU2792156C1 (en) | Method for molecular typing for typical (o1) and atypical (ro) non-toxigenic v. cholerae el tor strains using real-time pcr | |
RU2532845C1 (en) | FLUORESCENCE-LABELLED OLIGONUCLEOTIDE PROBE MS8 Flip-R FOR IDENTIFYING HISTOPLASMOSIS CAUSATIVE AGENT, Histoplasma capsulatum | |
RU2783023C1 (en) | Method for detecting the csh 1 cold shock gene in vibrio cholerae strains using real-time pcr |