RU2560280C2 - Method of simultaneous identification of toxigenic strains of genovariants of el tor cholera causative agent and their differentiation on epidemic potential by method of multiplex polymerase chain reaction - Google Patents
Method of simultaneous identification of toxigenic strains of genovariants of el tor cholera causative agent and their differentiation on epidemic potential by method of multiplex polymerase chain reaction Download PDFInfo
- Publication number
- RU2560280C2 RU2560280C2 RU2014138534/10A RU2014138534A RU2560280C2 RU 2560280 C2 RU2560280 C2 RU 2560280C2 RU 2014138534/10 A RU2014138534/10 A RU 2014138534/10A RU 2014138534 A RU2014138534 A RU 2014138534A RU 2560280 C2 RU2560280 C2 RU 2560280C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strains
- cholerae
- tor
- genes
- toxigenic
- Prior art date
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности к идентификации токсигенных штаммов геновариантов Vibrio cholerae O1 серогруппы биовара Эль Тор и их дифференциации по эпидемическому потенциалу, и может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях медицинского профиля и службах Роспотребнадзора.The invention relates to the field of medical microbiology, in particular to the identification of toxigenic strains of Vibrio cholerae O1 genovariants of the El Tor biovar serogroup and their differentiation by epidemic potential, and can be used in medical research institutions and Rospotrebnadzor services.
Эпидемиологическая ситуация в мире по холере - острой, особо опасной инфекционной болезни, остается напряженной, продолжается 7-я пандемия. Как известно, пандемии и эпидемии холеры способны вызывать только токсигенные штаммы V. cholerae O1 (классического и Эль Тор биоваров) и O139 серогрупп. Так возбудителями текущей, 7-ой, пандемии холеры, начавшейся в 1961 году в Юго-Восточной Азии, являются типичные токсигенные штаммы V. cholerae O1 серогруппы Эль Тор биовара. Имея на момент возникновения высокий эпидемический потенциал, который характеризуется как способность быстро проникать на территорию многих стран и вызывать там эпидемии, Эль Тор вибрионы полностью вытеснили возбудителя предыдущей 6-й пандемии - V. cholerae классического биовара с эндемичной территории и распространились по многим странам Азии, Африки и Латинской Америки. Однако продолжающиеся эволюционные преобразования Эль Тор вибрионов и приобретение ими генов холерных вибрионов классического биовара (ген ctxB из оперона ctxAB, кодирующего биосинтез холерного токсина) привели к появлению в 1992 году генетически измененных штаммов или геновариантов V. cholerae биовара Эль Top [9]. Геноварианты отличались повышенной вирулентностью и обладали более высоким эпидемическим потенциалом, чем типичные Эль Тор вибрионы, эпидпотенциал которых снизился. В итоге уже геноварианты заменили типичные штаммы Эль Тор вибрионов и быстро распространились по всему миру. Необходимо отметить, что на фоне 7-й пандемии в том же 1992 году в Индии возникли вспышки холеры, вызванные холерными вибрионами O139 серогруппы. Быстрое распространение данных вибрионов вызвало опасения о начале 8-й пандемии. Однако в настоящее время холерные вибрионы O139 серогруппы циркулируют только в Индии, и доминирующими являются Эль Тор вибрионы.The epidemiological situation in the world of cholera - an acute, especially dangerous infectious disease, remains tense, the 7th pandemic continues. As you know, pandemic and epidemic cholera can cause only toxigenic strains of V. cholerae O1 (classical and El Tor biovars) and O139 serogroups. So, the causative agents of the current, 7th pandemic of cholera, which began in 1961 in Southeast Asia, are typical toxigenic strains of V. cholerae O1 serogroup El Tor biovar. Having a high epidemic potential at the time of occurrence, which is characterized as the ability to quickly penetrate the territory of many countries and cause epidemics there, El Tor vibrioes completely replaced the causative agent of the previous 6th pandemic - V. cholerae of the classic biovar from endemic territory and spread to many countries of Asia, Africa and Latin America. However, the ongoing evolutionary transformations of the El Tor vibrios and their acquisition of the classical biovar cholera vibrio genes (ctxB gene from the ctxAB operon encoding the cholera toxin biosynthesis) led to the appearance in 1992 of genetically modified strains or genovariants of V. cholerae El Top biovar [9]. Genovariants were characterized by increased virulence and had a higher epidemic potential than the typical El Tor vibrios, whose epidemiological potential decreased. As a result, genovariants have already replaced the typical El Tor strains of vibrios and quickly spread throughout the world. It should be noted that against the backdrop of the 7th pandemic in the same 1992, outbreaks of cholera caused by cholera vibrio O139 serogroups occurred in India. The rapid spread of these vibrios has raised concerns about the onset of the 8th pandemic. However, at present, O139 serogroup cholera vibrios circulate only in India, and El Tor vibrios are dominant.
Завоз на новые территории, загрязнение водоемов, совместное существование во внешней среде с другими микроорганизмами и т.д., способствовали дальнейшим преобразованиям генома геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор. В современный период причиной холеры являются новые штаммы геновариантов, одной из генетических особенностей которых является наличие обширной делеции (21 ген) в центральной части острова пандемичности VSP-II (VSP-IIΔvc0495-vc0512). Глобальное распространение штаммов геновариантов с измененной структурой VSP-II и вытеснение ими ранее возникших геновариантов, имеющих интактный VSP-II, указывает на снижение эпидпотенциала у последних и наличие более высокого эпидемического потенциала у новых штаммов геновариантов [2, 12].The importation into new territories, pollution of water bodies, coexistence in the external environment with other microorganisms, etc., contributed to further transformations of the genome of the V. cholerae biovar El Tor genome. In the modern period, the cause of cholera is new strains of genovariants, one of the genetic features of which is the presence of an extensive deletion (21 genes) in the central part of the island of pandemic VSP-II (VSP-IIΔvc0495-vc0512). The global spread of VSP-II genovariant strains with altered structure and their displacement of previously emerged genovariants with intact VSP-II indicate a decrease in the epidemiological potential of the latter and a higher epidemic potential in new genovariant strains [2, 12].
Таким образом, в настоящее время в мире циркулируют штаммы геновариантов V. cholerae O1 серогруппы биовара Эль Тор с разной структурой генома и разным эпидемическим потенциалом, способные нанести в разной степени ущерб здоровью населения и экономике страны. Учитывая, что штаммы геновариантов уже с 1993 года завозятся в Российскую Федерацию, вызывая как единичные случаи болезни, так и вспышки холеры, для повышения эффективности системы эпидемиологического надзора необходима разработка быстрого и достоверного способа идентификации токсигенных штаммов геновариантов и определении их эпидемического потенциала.Thus, strains of V. cholerae O1 genovariants of the El Tor biovar serogroup with different genome structures and different epidemic potential are currently circulating in the world, which can cause damage to the health of the population and the economy of the country to different degrees. Considering that strains of genovariants have already been imported into the Russian Federation since 1993, causing both single cases of the disease and outbreaks of cholera, in order to increase the effectiveness of the epidemiological surveillance system, it is necessary to develop a quick and reliable method for identifying toxigenic strains of genovariants and determining their epidemic potential.
Известна комплексная гено- и иммунодиагностическая тест-система, позволяющая выявлять природные штаммы холерного вибриона O1 и O139 серогрупп и определять их вирулентность [1]. Однако данная тест-система не способна идентифицировать токсигенные геноварианты V. cholerae O1 биовара Эль Тор.A comprehensive gene and immunodiagnostic test system is known, which makes it possible to identify natural strains of cholera vibrio O1 and O139 of serogroups and determine their virulence [1]. However, this test system is not able to identify toxigenic gene variants of V. cholerae O1 El Tor biovar.
Известен способ дифференциации штаммов V. cholerae O139 серогруппы на токсигенные, эпидемически значимые и нетоксигенные, не имеющие эпидемической значимости, изоляты по алкилсульфатазной активности [5]. Известен способ выявления эпидемически значимых штаммов холерных вибрионов V. cholerae eltor и V. cholerae O139 по их адгезивной способности [3]. Описанные способы предусматривают дифференциацию эпидемически значимых штаммов O139 серогруппы и типичных штаммов O1 серогруппы Эль Тор биовара на основе анализа их фенотипических свойств, проявление которых является вариабельным признаком и может утрачиваться при хранении, а также сильно зависит от качества используемых сред и реактивов. Кроме того, ни один из вышеперечисленных способов не позволяет выявлять токсигенные штаммы геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор.A known method for the differentiation of strains of V. cholerae O139 serogroups to toxigenic, epidemiologically significant and non-toxigenic, not having epidemic significance, isolates on alkyl sulfatase activity [5]. A known method for identifying epidemiologically significant strains of cholera vibrios V. cholerae eltor and V. cholerae O139 by their adhesive ability [3]. The described methods provide for the differentiation of epidemiologically significant strains of O139 serogroup and typical O1 strains of serogroup El Tor biovar based on the analysis of their phenotypic properties, the manifestation of which is a variable sign and may be lost during storage, and also depends on the quality of the media and reagents used. In addition, none of the above methods can detect toxigenic strains of V. cholerae genovariants El Tor biovar.
Известно изобретение по патенту WO 2004020406, в котором описан способ выявления штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор на основе исследования структуры генов tcpA и rstR [10]. Однако применение данных ДНК мишеней является не достаточным для выявления штаммов геновариантов и не предусматривает возможность их дифференциации по эпидемическому потенциалу.The invention is known according to patent WO2004020406, which describes a method for detecting strains of V. cholerae genovariants El Tor biovar based on the study of the structure of the tcpA and rstR genes [10]. However, the use of these target DNAs is not sufficient to identify strains of genovariants and does not provide for the possibility of their differentiation by epidemic potential.
Известен способ и тест-система для идентификации токсигенных штаммов Vibrio cholerae O1, определения их биовара и дифференциации штаммов биовара Эль Тор на типичные и измененные методом мультиплексной ПЦР в один прием в двух реакционных смесях [4]. Первая реакционная смесь содержит праймеры к генам rfbO1, cas3 и ctxBClass, вторая - к генам rfbO1, rtxC и ctxBEltor. Изобретение позволяет быстро и достоверно определять серогруппу, биовар, токсигенность исследуемого штамма и проводить дифференциацию выявленных токсигенных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор на типичные изоляты и геноварианты. Вместе с тем это изобретение не способно определять эпидемический потенциал выявленных геновариантов, что является необходимым для получения полной характеристики выявленного изолята V. cholerae.A known method and test system for identifying toxigenic strains of Vibrio cholerae O1, determining their biovar and differentiating El Tor biovar strains into typical and changed by multiplex PCR in one step in two reaction mixtures [4]. The first reaction mixture contains primers for the rfbO1, cas3 and ctxB Class genes, and the second contains primers for the rfbO1, rtxC and ctxB Eltor genes . The invention allows to quickly and reliably determine the serogroup, biovar, toxigenicity of the studied strain and to differentiate the identified toxigenic strains of V. cholerae El Tor biovar into typical isolates and genovariants. However, this invention is not able to determine the epidemic potential of the identified genovariants, which is necessary to obtain the full characteristics of the identified V. cholerae isolate.
Таким образом, в данной области существует очевидная потребность в разработке простого, надежного и быстрого способа одновременного выявления токсигенных штаммов геновариантов холерных вибрионов биовара Эль Тор и их дифференциации по эпидемическому потенциалу.Thus, in this area there is an obvious need to develop a simple, reliable and fast method for the simultaneous detection of toxigenic strains of genetics of cholera vibrios of the El Tor biovar and their differentiation by epidemic potential.
Технический результат заключается в расширении диагностических возможностей способа за счет одновременного выявления токсигенных геновариантов V. cholerae O1 серогруппы биовара Эль Тор и их дифференцировании по эпидемическому потенциалу.The technical result consists in expanding the diagnostic capabilities of the method by simultaneously identifying the toxigenic genovariants of V. cholerae O1 serogroup El Tor biovar and their differentiation by epidemic potential.
Технический результат достигается благодаря тому, что способ идентификации и дифференциации токсигенных штаммов геновариантов включает выделение ДНК исследуемого штамма, проведение одностадийной мультиплексной полимеразной цепной реакцией в двух реакционных смесях, каждая из которых содержит специально подобранное сочетание праймеров к генам rfbO1, rfbR, rstC, ctxA в первой, и ctxBClass, vc0502, vc0514 во второй, с температурой отжига праймеров 58°C в течение 10 сек при числе циклов амплификации, равном 25, с последующим анализом полученных амплифицированных фрагментов генов исследуемых и контрольных штаммов. Для токсигенных штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор с низким эпидемическим потенциалом характерно наличие ампликонов генов rfbO1, rstC, ctxA, ctxBClass, vc0502, vc0514, у токсигенных геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор с высоким эпидемическим потенциалом определяются ампликоны фрагментов генов rfbO1, rstC, ctxA, ctxBClass, vc0514.The technical result is achieved due to the fact that the method of identification and differentiation of toxigenic strains of genovariants involves the isolation of the DNA of the studied strain, a one-step multiplex polymerase chain reaction in two reaction mixtures, each of which contains a specially selected combination of primers for the rfbO1, rfbR, rstC, ctxA genes in the first and ctxB Class , vc0502, vc0514 in the second, with an annealing temperature of primers 58 ° C for 10 sec with the number of amplification cycles equal to 25, followed by analysis of the amplified fragments of genes of the studied and control strains. The toxigenic strains of the V. cholerae el Tor biovar genovariants with a low epidemic potential are characterized by the presence of rfbO1, rstC, ctxA, ctxB Class amplicons, vc0502, vc0514 genes, the toxigenic genes of the V. cholerae El Tor biovar with a high epidemic potential determine amplicon fragments; rstC, ctxA, ctxB Class , vc0514.
Праймеры к участкам генов rfbO1, rfbR, rstC, ctxA, и аллель-специфические праймеры для гена ctxBClass взяты из литературных источников [1, 6, 7, 8, 11]. Праймеры rfbO1-F - rfbO1-R к участкам генов из кластера rfbO1, кодирующего биосинтез O1-антигена, образуют амлликон размером 638 п.н., праймеры rfbR-F - rfbR-R к участку гена rfbR, входящего в кластер генов, кодирующих биосинтез O139 антигена, формируют ПЦР-продукт размером 428 п.н., праймеры rstC-F - rstC-R на участок гена rstC, входящего в состав профага RS1, присутствующего только у холерных вибрионов биовара Эль Тор, обеспечивают образование фрагмента размером 238 п.н., праймеры ctxA-F - ctxA-R к участку гена ctxA, кодирующего А субъединицу холерного токсина, обеспечивают специфическую амплификацию фрагмента ДНК размером 564 п.н., праймеры ctxBClass-F - ctxBClass-R на аллель гена ctxB классического типа обеспечивают образование фрагмента размером 189 п.н.Primers for regions of the rfbO1, rfbR, rstC, ctxA genes, and allele-specific primers for the ctxB Class gene were taken from literature [1, 6, 7, 8, 11]. Primers rfbO1-F - rfbO1-R to the gene regions from the rfbO1 cluster encoding the biosynthesis of the O1 antigen form 638 bp amplicon, rfbR-F - rfbR-R primers to the region of the rfbR gene that is part of the biosynthesis gene coding O139 antigen, form a PCR product with a size of 428 bp, primers rstC-F - rstC-R to the site of the rstC gene, which is part of the RS1 prophage, which is present only in the cholera vibrios of El Tor biovar, provide the formation of a 238 bp fragment ., primers ctxA-F - ctxA-R to the site of the ctxA gene encoding the A subunit of cholera toxin, provide specific amplification of a 564 bp DNA fragment; ctxB Class- F to ctxB Class- R primers on the ctxB gene allele of the classical type provide the formation of a 189 bp fragment.
Выбор ДНК-мишеней для определения эпидемического потенциала геновариантов осуществляли на основании анализа нуклеотидных последовательностей острова пандемичности VSP-II у токсигенных штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, изолированных в современный период 7-й пандемии и содержащих разные типы этого геномного острова. В качестве первой мишени был выбран ген vc0514, кодирующий метил-акцепторный белок хемотаксиса, наличие которого характерно для всех типов VSP-II. В качестве второй мишени был выбран ген vc0502, кодирующий пили IV-ого типа, отсутствующий у штаммов с протяженной делецией данного геномного острова и имеющих высокий эпидемический потенциал. Праймеры сконструированы с помощью программы Oligo 6.0 на основании представленных в базе данных нуклеотидных последовательностей выбранного гена и являются высокоспецифичными. Праймеры VSPIIpilin-F - 5′-CTGTGATTCGGGCTTTATCGG-3′ и VSPIIpilin-R - 5′-GCGTAAACTGAGCCAATAAGC-3′ к участку гена vc0502 обеспечивают образование фрагмента размером 761 п.н., праймеры VSPIIchem-F - 5′-CTTGATGGAGCGGAGAAAAC-3′, VSPIIchem-R - 5′-CGATGAATAGCCTGTTGAAC-3′ к участку гена vc0514 обеспечивают образование фрагмента размером 604 п.н.The selection of DNA targets for determining the epidemic potential of genovariants was carried out on the basis of the analysis of the nucleotide sequences of the VSP-II pandemic island in toxigenic strains of the V. cholerae El Tor biovar genovariants isolated in the modern period of the 7th pandemic and containing different types of this genomic island. The vc0514 gene encoding a methyl-acceptor chemotaxis protein, the presence of which is characteristic of all types of VSP-II, was chosen as the first target. The vc0502 gene was selected as the second target, which encodes type IV drank, which is absent in strains with an extended deletion of this genomic island and having a high epidemic potential. The primers were designed using the Oligo 6.0 program based on the nucleotide sequences of the selected gene presented in the database and are highly specific. Primers VSPIIpilin-F - 5′-CTGTGATTCGGGCTTTATCGG-3 ′ and VSPIIpilin-R - 5′-GCGTAAACTGAGCCAATAAGC-3 ′ to the gene site vc0502 provide the formation of a fragment of 761 bp in size, primers VSPIIGAGGTAG-CTGGAG-FAG CTGGAG-FAG , VSPIIchem-R - 5′-CGATGAATAGCCTGTTGAAC-3 ′ to the vc0514 gene region provide the formation of a fragment of 604 bp
Праймеры на гены vc0514, vc0502 подобраны таким образом, чтобы минимизировать вероятность их неспецифического отжига. Праймеры были проверены на возможность образования шпилечных структур с высокими температурами плавления, а также образования димерных соединений как одноименных праймеров, так и разноименных праймеров между собой. Размер получаемых фрагментов был подобран для упрощения процесса визуализации и учета результатов.Primers for the vc0514, vc0502 genes are selected in such a way as to minimize the likelihood of their nonspecific annealing. The primers were tested for the possibility of the formation of hairpin structures with high melting points, as well as the formation of dimeric compounds of the same name as primers and unlike primers with each other. The size of the resulting fragments was selected to simplify the process of visualization and recording of results.
Оптимизация концентраций праймеров была достигнута при их смешивании в различных соотношениях, в результате предлагаемые концентрации позволяют получить легко детектируемые ампликоны. Концентрация каждого из дезоксинуклеозидтрифосфатов дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ составляет 2 мМ. Экспериментально отработаны качественный и количественный состав буфера для амплификации и являются оптимальными для проведения исследования, определен режим постановки ПЦР.The optimization of the primer concentrations was achieved by mixing them in various ratios, as a result of the proposed concentration allow to obtain easily detectable amplicons. The concentration of each of the deoxynucleoside triphosphates dATP, dGTP, dTCP, dTTP is 2 mm. The qualitative and quantitative composition of the buffer for amplification was experimentally tested and are optimal for the study, the PCR formulation mode was determined.
Заявляемый способ идентификации включает следующие этапы:The inventive identification method includes the following steps:
а) выделение ДНК;a) DNA isolation;
б) проведение ПЦР;b) PCR;
в) анализ результатов.c) analysis of the results.
Выделение ДНКDNA isolation
ДНК извлекают из клеток с помощью любого комплекта реагентов для выделения ДНК (например, «Набор реагентов для выделения ДНК» Рег. уд. № ФСР 2011/11172-280611 производства РосНИПЧИ «Микроб», содержащий водную суспензию нуклеосорбента, буфер 1, включающий гуанидинзотиоцианат и ЭДТА, буферы 2, 3 - для отмывки и элюент для ДНК (ТЕ-буфер).DNA is extracted from the cells using any set of reagents for DNA isolation (for example, “Set of reagents for DNA extraction” Reg. Ud. No. ФСР 2011 / 11172-280611 manufactured by RosNIPCHI “Microbe” containing an aqueous suspension of nucleosorbent, buffer 1, including guanidinezothiocyanate and EDTA, buffers 2, 3 - for washing and eluent for DNA (TE buffer).
Проведение ПЦРPCR
ПЦР проводят в один этап по следующей программе: предварительная денатурация при температуре 96°C - 2 мин, 25 циклов, включающих 96°C - 10 с, 58°C - 10 с, 72°C - 30 с, заключительная достройка цепи при температуре 72°C - 7 мин 20 сек.PCR is carried out in one step according to the following program: preliminary denaturation at 96 ° C - 2 min, 25 cycles, including 96 ° C - 10 s, 58 ° C - 10 s, 72 ° C - 30 s, final chain completion at a temperature 72 ° C - 7 min 20 sec.
Анализ результатовResults Analysis
Детекцию амплифицированной ДНК после ПЦР осуществляют методом горизонтального гель-электрофореза в 2% агарозном геле. Учет результатов ПЦР проводят путем сравнения полученных ампликонов с контрольными образцами в соответствии с идентификационной таблицей (табл.1).The amplified DNA after PCR is detected by horizontal gel electrophoresis in a 2% agarose gel. The PCR results are taken into account by comparing the obtained amplicons with control samples in accordance with the identification table (Table 1).
Способ осуществляют следующим образом.The method is as follows.
1. Подготовку проб проводят согласно МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности» в боксе биологической безопасности II класса в противочумном костюме IV типа в резиновых или латексных перчатках. Клетки холерных вибрионов, выращенные на LB-агаре в течение 18 часов, ресуспендируют в 0,9% растворе натрия хлорида до концентрации 109 микробных клеток в 1 мл и последующим разведением в деионизованной воде доводят до концентрации 1×107 м.к./мл. Затем к суспензии добавляют мертиолят натрия до конечной концентрации 1:10000 (0,01%) и прогревают при температуре 56°C в течение 30 мин. Далее, 100 мкл образца переносят в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, добавляют лизирующий раствор, приготовленный на основе 6М гуанидинизотиоцианата, и инкубируют 15 мин при температуре 65°C. После выполнения данных процедур материал считается обеззараженным.1. Sample preparation is carried out according to MU 1.3.2569-09 “Organization of the work of laboratories using nucleic acid amplification methods when working with material containing microorganisms of pathogenicity groups I-IV” in a class II biological safety box in type IV anti-plague suit in rubber or latex gloves. Vibrio cholerae cells grown on LB agar for 18 hours are resuspended in a 0.9% sodium chloride solution to a concentration of 10 9 microbial cells in 1 ml and then diluted in deionized water to a concentration of 1 × 10 7 m.k. / ml Then sodium merthiolate is added to the suspension to a final concentration of 1: 10000 (0.01%) and heated at a temperature of 56 ° C for 30 minutes. Next, 100 μl of the sample was transferred to a 1.5 ml microcentrifuge tube, a lysis solution prepared on the basis of 6M guanidine isothiocyanate was added, and incubated for 15 min at a temperature of 65 ° C. After performing these procedures, the material is considered disinfected.
2. Выделение ДНК исследуемых штаммов холерного вибриона проводят с использованием комплекта реагентов для выделения ДНК. Комплект для выделения ДНК извлекают из холодильника и выдерживают при комнатной температуре. Выделение ДНК проводят согласно инструкции к набору. Очищенную ДНК хранят при температуре +4°C.2. DNA isolation of the studied strains of cholera vibrio is carried out using a set of reagents for DNA isolation. The DNA isolation kit is removed from the refrigerator and kept at room temperature. DNA isolation is carried out according to the instructions for the kit. The purified DNA is stored at + 4 ° C.
3. Для проведения ПЦР готовят необходимое количество микропробирок, соответствующее числу исследуемых проб, а также еще по шесть для каждой реакционной смеси: пять дифференцирующих положительных контролей и одного отрицательного контроля (деионизованная вода).3. For PCR, the required number of microtubes is prepared corresponding to the number of samples tested, as well as six more for each reaction mixture: five differentiating positive controls and one negative control (deionized water).
ПЦР проводят в объеме 25 мкл реакционной смеси на 1 пробу ДНК. Составы реакционной смеси №1 и №2 представлены в таблице 2. Для предотвращения испарения реакционной пробы в пробирки сверху осторожно наслаивают минеральное масло. В подготовленную смесь под масло вносят по 10 мкл пробы. В пробирку, обозначенную как отрицательный контроль, вносят 10 мкл деионизованной воды, а в пробирки с положительными контролями соответственно по 10 мкл ДНК контрольных штаммов. В качестве положительных контролей используют ДНК токсигенного штамма V. cholerae 569В O1 серо-группы классического биовара (rfbO1+, rfbR-, rstC-, ctxA+, ctxBClass+, vc0502-, vc0514-), типичного токсигенного штамма V. cholerae M738 O1 серогруппы биовара Эль Top (rfbO1+, rfbR-, rstC+, ctxA+, ctxBClass-, vc0502+, vc0514+), токсигенного штамма геноварианта V. cholerae M1266 Эль Top с интактным островом пандемичности VSP-II и низким эпидемическим потенциалом (rfbO1+, rfbR-, rstC+, ctxA+, ctxBClass+, vc0502+, vc0514+), токсигенного штамма геноварианта V. cholerae M1509 Эль Top, содержащего VSP-II с протяженной делецией и имеющего высокий эпидемический потенциал (rfbO1+, rfbR-, rstC+, ctxA+, ctxBClass+, vc0502-, vc0514+), токсигенного штамма V. cholerae P16064 O139 серогруппы (rfbO1-, rfbR+, rstC+, ctxA+, ctxBClass-, vc0502+, vc0514+).PCR is carried out in a volume of 25 μl of the reaction mixture per 1 DNA sample. The compositions of the reaction mixture No. 1 and No. 2 are presented in table 2. To prevent evaporation of the reaction sample in the tubes carefully layered mineral oil on top. In the prepared mixture under oil contribute 10 μl of sample. 10 μl of deionized water are added to a test tube designated as a negative control, and 10 μl of DNA of the control strains, respectively, are added to test tubes with positive controls. The DNA of the toxigenic strain V. cholerae 569B O1 of the gray group of the classic biovar (rfbO1 + , rfbR - , rstC - , ctxA + , ctxB Class + , vc0502 - , vc0514 - ), a typical toxigenic strain of V. cholerae M738 O1 serogroup, is used as positive controls El Top biovar (rfbO1 + , rfbR - , rstC + , ctxA + , ctxB Class- , vc0502 + , vc0514 + ), a toxigenic strain of the genovariant V. cholerae M1266 El Top with an intact VSP-II pandemic island and low epidemic potential (rfbO + , rfbR - , rstC + , ctxA + , ctxB Class + , vc0502 + , vc0514 + ), a toxigenic strain of the gene variant V. cholerae M1509 El Top, containing VSP-II with an extended deletion and having a high e theidemic potential (rfbO1 + , rfbR - , rstC + , ctxA + , ctxB Class + , vc0502 - , vc0514 + ), toxigenic strain V. cholerae P16064 O139 serogroup (rfbO1 - , rfbR + , rstC + , ctxA + , ctxA + , vc0502 + , vc0514 + ).
Амплификацию ДНК осуществляют с использованием программируемого амплификатора «Терцик» (ДНК-Технология, Россия) при следующих температурных режимах (по матричному способу регулирования): температура денатурации - 96°C в течение 2 мин; 25 циклов - денатурация ДНК при температуре 96°C в течение 10 сек, отжиг праймеров 58°C - 10 сек, синтез комплементарной цепи при температуре 72°C - 30 сек; заключительный синтез комплементарной цепи при температуре 72°C в течение 7 мин 20 сек. Амплификацию контрольных образцов проводят одновременно с исследуемыми пробами в том же приборе и при тех же условиях.Amplification of DNA is carried out using the programmable thermocycler “Tertzik” (DNA-Technology, Russia) at the following temperature conditions (according to the matrix method of regulation): denaturation temperature - 96 ° C for 2 min; 25 cycles — DNA denaturation at 96 ° C for 10 sec, primer annealing at 58 ° C — 10 sec, complementary chain synthesis at 72 ° C — 30 sec; final synthesis of the complementary chain at a temperature of 72 ° C for 7 min 20 sec. Amplification of control samples is carried out simultaneously with the test samples in the same device and under the same conditions.
4. Для анализа результатов ПЦР готовят 2% агарозный гель. Для этого к 1 г агарозы добавляют 50 мл ТАЕ буфера. Агарозу доводят до кипения, охлаждают при комнатной температуре примерно до температуры +65°C, добавляют 5 мкл этидиума бромида, осторожно перемешивают содержимое колбы равномерными вращательными движениями и заливают в специальный мостик, чтобы толщина геля составила примерно 4 мм. Затем устанавливают гребенку и оставляют застывать. После полимеризации осторожно извлекают гребенку и переносят гель в камеру для проведения электрофореза. К полученным ампликонам добавляют 5 мкл буфера для нанесения проб, перемешивают при помощи того же наконечника и вносят в лунки геля под буферный раствор. Камеру подключают к источнику тока и задают напряжение 7-10 В/см. Электрофоретическое разделение продолжают в течение 80 мин до прохождения лидирующим красителем около 4/5 длины трека (рекомендуемая длина трека - 10 см), после чего гель извлекают из камеры и помещают на стекло траисиллюминатора с УФ-излучением 310 нм. Фрагменты анализируемой ДНК проявляются в виде оранжево-красных полос.4. To analyze the results of PCR, a 2% agarose gel is prepared. For this, 50 ml of TAE buffer is added to 1 g of agarose. The agarose is brought to a boil, cooled at room temperature to about + 65 ° C, 5 μl of ethidium bromide are added, the contents of the flask are gently mixed with uniform rotational movements and poured into a special bridge so that the gel thickness is about 4 mm. Then set the comb and leave to harden. After polymerization, the comb is carefully removed and the gel is transferred to the chamber for electrophoresis. To the resulting amplicons add 5 μl of sample buffer, mix with the same tip and add to the gel wells under the buffer solution. The camera is connected to a current source and a voltage of 7-10 V / cm is set. Electrophoretic separation is continued for 80 min until the leading dye passes about 4/5 of the track length (recommended track length is 10 cm), after which the gel is removed from the chamber and placed on a traisilluminator glass with UV radiation of 310 nm. Fragments of the analyzed DNA appear as orange-red bands.
Результаты оценивают путем сравнения полученных в ПЦР ампликонов с маркерными фрагментами контрольных штаммов V. cholerae. Учет результатов проводят в соответствии с идентификационной таблицей (табл.1).The results are evaluated by comparing PCR amplicons with marker fragments of control V. cholerae strains. The results are taken into account in accordance with the identification table (Table 1).
С помощью праймеров, содержащихся в первой реакционной смеси, определяют серогруппу исследуемого штамма V. cholerae - O1 (rfbO1+) или 0139 (rfbR+), биовар (классический - rstC-, Эль Top - rstC+) и токсигенность (ctxA+). Праймеры, входящие в состав второй реакционной смеси, позволяют разделять штаммы V. cholerae O1 серогруппы биовара Эль Тор на типичные изоляты (ctxBClass-) и геноварианты (ctxBClass+) и дифференцировать геноварианты по структуре острова пандемичности VSP-II на штаммы с низким (vc0502+, vc0514+) и высоким (vc0502-, vc0514+) эпидемическим потенциалом.Using the primers contained in the first reaction mixture, the serogroup of the studied strain V. cholerae - O1 (rfbO1 + ) or 0139 (rfbR + ), biovar (classic - rstC - , El Top - rstC + ) and toxigenicity (ctxA + ) are determined. The primers that make up the second reaction mixture allow the V. cholerae O1 strains of the El Tor biogar serogroup to be separated into typical isolates (ctxB Class- ) and genovariants (ctxB Class + ) and differentiate genovariants according to the structure of the VSP-II pandemic island into low strains (vc0502 + , vc0514 + ) and high (vc0502 - , vc0514 + ) epidemic potential.
На фиг. 1 приведена электрофореграмма ампликонов, полученных при постановке мультиплексной ПЦР с контрольными штаммами V. cholerae. На дорожке 1 показано положение ампликонов токсигенного штамма V. cholerae 569B O1 серогруппы классического биовара; на дорожке 2 - типичного токсигенного штамма V. cholerae M738 O1 серогруппы Эль Тор биовара, на дорожке 3 - токсигенного штамма геноварианта V. cholerae М1266 O1 серогруппы биовара Эль Тор с интактным островом пандемичности VSP-II и низким эпидемическим потенциалом, на дорожке 4 - токсигенного штамма геноварианта V. cholerae M1509 O1 серогруппы биовара Эль Top, несущего VSP-II с протяженной делецией, и имеющего высокий эпидемический потенциал, на дорожке 5 - токсигенного штамма V. cholerae P16064 O139 серогруппы. Дорожка 6 - отрицательный контроль.In FIG. Figure 1 shows the electrophoregram of amplicons obtained by staging multiplex PCR with control strains of V. cholerae. Lane 1 shows the position of the amplicons of the toxigenic strain V. cholerae 569B O1 serogroup classic biovar; in lane 2 - a typical toxigenic strain of V. cholerae M738 O1 serogroup El Tor biovar, on lane 3 - of a toxigenic strain of genovariant V. cholerae M1266 O1 serogroup El Tor with intact pandemic island VSP-II and low epidemic potential, on lane 4 - toxigenic genovariant strain V. cholerae M1509 O1 serogroup El Topovar, carrying VSP-II with an extended deletion, and having a high epidemic potential, on track 5 - toxigenic strain V. cholerae P16064 O139 serogroup. Lane 6 - negative control.
Специфичность заявляемого способа подтверждена на основе использования штаммов близкородственных видов - V. mimicus, V. anguillarum, V. parahaemolyticus, a также энтеробактерий - Е. coli, S. enteritidis, Sh. flexneri. Результаты ПЦР тестирования указанных штаммов были отрицательными, что указывает на специфичность способа.The specificity of the proposed method is confirmed through the use of strains of closely related species - V. mimicus, V. anguillarum, V. parahaemolyticus, as well as enterobacteria - E. coli, S. enteritidis, Sh. flexneri. The results of PCR testing of these strains were negative, which indicates the specificity of the method.
Изобретение иллюстрируется следующим примером.The invention is illustrated by the following example.
Пример 1. Для определения эффективности заявляемого способа исследовано 28 клинических штаммов V. cholerae, выделенных на различных территориях и в разные годы.Example 1. To determine the effectiveness of the proposed method investigated 28 clinical strains of V. cholerae isolated in different territories and in different years.
У 22 исследуемых штаммов выявлены ампликоны размером 638 п.н. и 564 п.н., свидетельствующие об их принадлежности к токсигенным штаммам O1 серогруппы, два штамма (V. cholerae 14300 и М14380) были атоксигенными, так как у них отсутствовал ампликон размером 564 п.н. (табл.3). У 18 штаммов V. cholerae при ПЦР-анализе кроме гена rfbO1 обнаружен биовароспецифический ген rstC, выявляемый с помощью реакционной смеси №1, поскольку идентифицировался ампликон размером 238 п.н., что указывает на их принадлежность к токсигенным холерным вибрионам O1 биовара Эль Тор. При этом у 6 штаммов отсутствует ген ctxBClass (ампликон размером 189 п.н. в реакционной смеси №2), как и у штамма М738, взятого в качестве контрольного, что указывает на их отношение к типичным токсигенным штаммами V. cholerae O1 биовара Эль Тор (фиг 1., дорожка 2, табл.3). В то же время у остальных 12 изолятов обнаружено присутствие данного гена, что доказывает их принадлежность к токсигенным геновариантам V. cholerae 01 биовара Эль Тор. При анализе структуры острова пандемичности VSP-II данная группа штаммов была разделена на две. Первая состояла из 7 штаммов, которые содержали в реакционной смеси №2 два фрагмента размером 761 п.н. и 604 п.н. (табл.3). Данные штаммы геновариантов имеют низкий эпидемический потенциал. В то же время у второй группы, включающей 5 изолятов, амплифицировался только фрагмент размером 604 п.н., как у контрольного V. cholerae M1509, содержащего VSP-II с протяженной делецией (фиг. 1, дорожка 4, табл.3). Данные штаммы, изолированные в последние годы (2004-2012), являются геновариантами с высоким эпидемическим потенциалом, которые практически вытеснили геноварианты с низким эпидемическим потенциалом во многих регионах мира.In 22 studied strains, amplicons of 638 bp were detected. and 564 bp, indicating their belonging to the toxigenic O1 strains of the serogroup, two strains (V. cholerae 14300 and M14380) were atoxigenic, since they lacked an amplicon of 564 bp in size. (table 3). In addition to the rfbO1 gene, in 18 strains of V. cholerae, in addition to the rfbO1 gene, a biovar-specific rstC gene was detected using reaction mixture No. 1, since an amplicon of 238 bp was identified, which indicates their belonging to the El Tor biovar O1 toxigenic vibrio. Moreover, the ctxB Class gene is absent in 6 strains (an amplicon of 189 bp in reaction mixture No. 2), as is the case of strain M738, taken as a control, which indicates their relation to typical toxigenic strains of V. cholerae O1 El biovar Thor (Fig 1., lane 2, table 3). At the same time, the presence of this gene was found in the remaining 12 isolates, which proves their belonging to the toxigenic genovariants of V. cholerae 01 El Tor biovar. When analyzing the structure of the VSP-II pandemic island, this group of strains was divided into two. The first consisted of 7 strains that contained two fragments of 761 bp in the reaction mixture No. 2 and 604 bp (table 3). These genovariant strains have low epidemic potential. At the same time, in the second group, including 5 isolates, only a fragment of 604 bp was amplified, as in the control V. cholerae M1509 containing VSP-II with an extended deletion (Fig. 1, lane 4, Table 3). These strains, isolated in recent years (2004-2012), are genovariants with high epidemic potential, which have practically replaced genovariants with low epidemic potential in many regions of the world.
Кроме того, с помощью данной ПЦР можно также идентифицировать штаммы O1 серогруппы классического биовара и штаммы O139 серогруппы. Так, среди исследованных нами изолятов пять штаммов идентифицированы как токсигенные штаммы классического биовара. У данных штаммов происходила амплификация фрагментов ДНК размером 638 и 564 п.н. в реакционной смеси №1 и 189 п.н. в реакционной смеси №2, что свидетельствует о присутствии в их геноме генов rfbO1, ctxA и ctxBClass (фиг. 1., дорожка 1, табл.3). По присутствию ампликонов размером 428, 238 и 564 п.н. в реакционной смеси №1 и 761, 604 п.н. в реакционной смеси №2, что указывает на наличие соответственно генов rfbR, rstC, ctxA, vc0502, vc0514 пять исследованных штаммов отнесены к токсигенным штаммам V. cholerae O139 серогруппы (фиг. 1., дорожка 5, табл.3).In addition, using this PCR, it is also possible to identify O1 strains of the serogroup of the classic biovar and O139 strains of the serogroup. So, among the isolates studied by us, five strains were identified as toxigenic strains of the classic biovar. The amplification of DNA fragments of 638 and 564 bp in size occurred in these strains. in the reaction mixture No. 1 and 189 bp in the reaction mixture No. 2, which indicates the presence of rfbO1, ctxA and ctxB Class genes in their genome (Fig. 1., lane 1, table 3). According to the presence of amplicons in sizes 428, 238 and 564 bp in the reaction mixture No. 1 and 761, 604 bp in the reaction mixture No. 2, which indicates the presence of the rfbR, rstC, ctxA, vc0502, vc0514 genes, respectively, the five studied strains were assigned to the toxigenic strains of V. cholerae O139 serogroup (Fig. 1., lane 5, table 3).
Таким образом, разработанный способ позволяет быстро и достоверно выявлять токсигенные штаммы геновариантов V. cholerae O1 серогруппы биовара Эль Тор, несущие в геноме ген ctxB классического типа, и дифференцировать их на основе анализа структуры острова пандемичности VSP-II на геноварианты с высоким и низким эпидемическим потенциалом.Thus, the developed method makes it possible to quickly and reliably identify toxigenic strains of V. cholerae O1 genovariants of the El Tor biovar serogroup that carry the classical type ctxB gene in the genome and differentiate them based on the analysis of the structure of the VSP-II pandemic island into genes with high and low epidemic potential .
Список литературыBibliography
1. Комплексная гено- и иммунодиагностическая тест-система для идентификации холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп и оценки их вирулентности. Патент на изобретение №2404257, опубликован 20.11.2010 г.1. A comprehensive gene and immunodiagnostic test system for the identification of cholera vibrios O1 and O139 serogroups and assessment of their virulence. Patent for invention No. 2404257, published November 20, 2010
2. Смирнова Н.И., Заднова С.П., Агафонов ДА., Шашкова А.В., Челдышова Н.Б., Черкасов А.В. Сравнительный молекулярно-генетический анализ мобильных элементов природных штаммов возбудителя холеры. 2013; 49(9): 1036-1047.2. Smirnova NI, Zadnova SP, Agafonov DA., Shashkova AV, Cheldyshova NB, Cherkasov AV Comparative molecular genetic analysis of the mobile elements of natural strains of the cholera pathogen. 2013; 49 (9): 1036-1047.
3. Способ выявления эпидемически значимых холерных вибрионов Vibrio cholerae eltor и Vibrio cholerae 0139 по их адгезивной способности. Патент РФ №2332460, опубликован 27.08.2008 г.3. A method for identifying the epidemically significant cholera vibrios of Vibrio cholerae eltor and Vibrio cholerae 0139 by their adhesive ability. RF patent No. 2332460, published August 27, 2008
4. Способ идентификации токсигенных штаммов V. cholerae O1, определения их биовара и дифференциации штаммов биовара эльтор на типичные и измененные методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления. Патент РФ №2458141, опубликован 10.08.2012 г.4. A method for identifying toxigenic strains of V. cholerae O1, determining their biovar and differentiating the biovar eltor strains into typical and modified multiplex polymerase chain reaction and test system for its implementation. RF patent No. 2458141, published on 08/10/2012.
5. Способ дифференциации штаммов Vibrio cholerae O139 серогруппы по алкилсульфатазной активности. Патент РФ №2473697, опубликован 21.01.2013 г.5. A method for differentiating strains of Vibrio cholerae O139 serogroup by alkyl sulfatase activity. RF patent No. 2473697, published January 21, 2013.
6. Fields P.I., Popovic Т., Wachsmuth K., Olsvik O. Use of polymerase chain reaction for detection of toxigenic Vibrio cholerae O1 strains from the Latin American cholera epidemic. J. Clin. Microbiol. 1992; 30: 2118-2121.6. Fields P.I., Popovic T., Wachsmuth K., Olsvik O. Use of polymerase chain reaction for detection of toxigenic Vibrio cholerae O1 strains from the Latin American cholera epidemic. J. Clin. Microbiol. 1992; 30: 2118-2121.
7. Goel A.K., Ponmariappan S., Kamboj D.V., Singh L. Single multiplex polymerase chain reaction for environmental surveillance of toxigenic-pathogenic O1 and non-O1 Vibrio cholerae. Folia Microbiol. 2007, 52: 81-85.7. Goel A.K., Ponmariappan S., Kamboj D.V., Singh L. Single multiplex polymerase chain reaction for environmental surveillance of toxigenic-pathogenic O1 and non-O1 Vibrio cholerae. Folia Microbiol. 2007, 52: 81-85.
8. Morita M., Ohnishi M., Arakawa E. et al. Development and validation of a mismatch amplification mutation PCR assay to monitor the dissemination of an emerging variant of Vibrio cholerae O1 biotype E1 Tor. Microbiol. bnmunol. 2008, 52 (6): 314-317.8. Morita M., Ohnishi M., Arakawa E. et al. Development and validation of a mismatch amplification mutation PCR assay to monitor the dissemination of an emerging variant of Vibrio cholerae O1 biotype E1 Tor. Microbiol. bnmunol. 2008, 52 (6): 314-317.
9. Nair G.B., Faruque S.M., Bhuiyan N.A. et al. New Variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2002, 40(9): 3296-3299.9. Nair G. B., Faruque S. M., Bhuiyan N. A. et al. New Variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2002, 40 (9): 3296-3299.
10. Variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of classical biotype. Invention WO 2004020406, publication 03.11.2004.10. Variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of classical biotype. Invention WO 2004020406, publication 11/03/2004.
11. Waldor M.K., Rubin E.J., Pearson G.D.N. et al. Regulation, replication, and integration functions of the Vibrio cholerae CTXφ are encoded by region RS2. Mol. Microbiol. 1997, 24 (5): 917-926.11. Waldor MK, Rubin EJ, Pearson GDN et al. Regulation, replication, and integration functions of the Vibrio cholerae CTX φ are encoded by region RS2. Mol. Microbiol. 1997, 24 (5): 917-926.
12. Taviani E., Grim C.J., Choi J. et al. Discovery of novel Vibrio cholerae VSP-II genomic islands using comparative genomic analysis. FEMS Microbiol. Lett 2010; 308: 130-137.12. Taviani E., Grim C. J., Choi J. et al. Discovery of novel Vibrio cholerae VSP-II genomic islands using comparative genomic analysis. FEMS Microbiol. Lett 2010; 308: 130-137.
Claims (2)
VSPIIpilin-F - 5′-CTGTGATTCGGGCTTTATCGG-3′, VSPIIpilin-R - 5′-GCGTAAACTGAGCCAATAAGC-3′, VSPIIchem-F - 5′-CTTGATGGAGCGGAGAAAAC-3′ VSPIIchem-R - 5′-CGATGAATAGCCTGTTGAAC-3′. 2. The method according to p. 1, characterized in that the primers designed for sections of the vc0502, vc0514 genes have the following nucleotide sequences:
VSPIIpilin-F - 5′-CTGTGATTCGGGCTTTATCGG-3 ′, VSPIIpilin-R - 5′-GCGTAAACTGAGCCAATAAGC-3 ′, VSPIIchem-F - 5′-CTTGATGGAGCGGAGAAAAC-3 ′ VSPIIAGT-5GTGAGTGA-3GTGAGTGA-3GTGATGTGA-3GTGAGTGA-3GTGATGTGA-3G.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2014138534/10A RU2560280C2 (en) | 2014-09-23 | 2014-09-23 | Method of simultaneous identification of toxigenic strains of genovariants of el tor cholera causative agent and their differentiation on epidemic potential by method of multiplex polymerase chain reaction |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2014138534/10A RU2560280C2 (en) | 2014-09-23 | 2014-09-23 | Method of simultaneous identification of toxigenic strains of genovariants of el tor cholera causative agent and their differentiation on epidemic potential by method of multiplex polymerase chain reaction |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2014138534A RU2014138534A (en) | 2014-12-20 |
RU2560280C2 true RU2560280C2 (en) | 2015-08-20 |
Family
ID=53278278
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2014138534/10A RU2560280C2 (en) | 2014-09-23 | 2014-09-23 | Method of simultaneous identification of toxigenic strains of genovariants of el tor cholera causative agent and their differentiation on epidemic potential by method of multiplex polymerase chain reaction |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2560280C2 (en) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2671412C1 (en) * | 2018-01-10 | 2018-10-31 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека ("РосНИПЧИ "Микроб") | Method of differentiation of o1 vibrio cholerae strains of el tor biotype with various epidemiological significance by method of multiplex polymerase chain reaction |
RU2806564C1 (en) * | 2023-04-19 | 2023-11-01 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Method for assessing intraspecific competition of toxigenic and non-toxigenic strains of vibrio cholerae o1 and o139 serogroups using real-time pcr |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20060171966A1 (en) * | 2002-08-30 | 2006-08-03 | Centre For Health And Population Research | Variants of vibrio cholerae 01 biotype e1 tor with attributes of classical biotype |
RU2458141C1 (en) * | 2011-03-14 | 2012-08-10 | Российская Федерация, от имени которой выступает Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Method for identifying toxigenic v cholerae o1 strains, determining its biovar and differentiating biovar eltor strains by typical and changed by multiplex polymerase chain reaction, and test system for implementation thereof |
-
2014
- 2014-09-23 RU RU2014138534/10A patent/RU2560280C2/en active IP Right Revival
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20060171966A1 (en) * | 2002-08-30 | 2006-08-03 | Centre For Health And Population Research | Variants of vibrio cholerae 01 biotype e1 tor with attributes of classical biotype |
RU2458141C1 (en) * | 2011-03-14 | 2012-08-10 | Российская Федерация, от имени которой выступает Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Method for identifying toxigenic v cholerae o1 strains, determining its biovar and differentiating biovar eltor strains by typical and changed by multiplex polymerase chain reaction, and test system for implementation thereof |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
N.I. SMIRNOVA et al., Genovariants of Vibrio cholerae Biovar El Tor: Construction, Molecular, Genetic, and Proteomic Analyses; Molecular Genetics, Microbiology and Virology, January 2014, Vol. 29, No. 1, pp.23-33. TAVIANI E. et al., Discovery of novel Vibrio cholerae VSP-II genomic islands using comparative genomic analysis, FEMS Microbiol. Lett., 2010, vol.308, pp.130-137. DZIEJMAN M. et al., Comparative genomic analysis of Vibrio cholerae: Genes that correlate with cholera endemic and pandemic disease, PNAS, 2002, vol. 99 no. 3, pp.1556-1561. А.В. ШАШКОВА и др., Фенотипический и молекулярно-генетический анализ генетически измененного токсигенного штамма Vibrio cholerae 301 биовара эльтор, изолированного в 2011 году в России, Проблемы особо опасных инфекций, 2012, вып. 114, стр.61-64 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2671412C1 (en) * | 2018-01-10 | 2018-10-31 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека ("РосНИПЧИ "Микроб") | Method of differentiation of o1 vibrio cholerae strains of el tor biotype with various epidemiological significance by method of multiplex polymerase chain reaction |
RU2815711C2 (en) * | 2022-07-11 | 2024-03-20 | Федеральное казенное учреждение науки "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФКУН "Российский противочумный институт "Микроб" Роспотребнадзора) | Method for identification of toxigenic genetic variants of cholera causative agent el tor with set of mutations in genes of virulence and pandemic island genes by multiplex polymerase chain reaction |
RU2806564C1 (en) * | 2023-04-19 | 2023-11-01 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Method for assessing intraspecific competition of toxigenic and non-toxigenic strains of vibrio cholerae o1 and o139 serogroups using real-time pcr |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2014138534A (en) | 2014-12-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Fukuda et al. | Molecular approaches to studying microbial communities: targeting the 16S ribosomal RNA gene | |
RU2458141C1 (en) | Method for identifying toxigenic v cholerae o1 strains, determining its biovar and differentiating biovar eltor strains by typical and changed by multiplex polymerase chain reaction, and test system for implementation thereof | |
EP2929051B1 (en) | Method for detecting helicobacter pylori dna in a stool sample | |
US20220325324A1 (en) | Systems and methods for the detection of infectious diseases | |
Ranjbar et al. | Rapid molecular approach for simultaneous detection of Salmonella spp., Shigella spp., and Vibrio cholera | |
Benga et al. | Development of a multiplex PCR assay based on the 16S–23S rRNA internal transcribed spacer for the detection and identification of rodent Pasteurellaceae | |
EP1338657B9 (en) | Sequences specifcally deleted from Mycobacterium tuberculosis genome and their use in diagnosistics and as vaccines | |
US20110287965A1 (en) | Methods and compositions to detect clostridium difficile | |
RU2360972C1 (en) | Method detection and evaluation of biotype, serogroup and toxigenicity of cholera agent and related kit | |
ES2327593A1 (en) | Method for the detection of bacterial species of the genera Anaplasma/Ehrlichia and Bartonella | |
RU2560280C2 (en) | Method of simultaneous identification of toxigenic strains of genovariants of el tor cholera causative agent and their differentiation on epidemic potential by method of multiplex polymerase chain reaction | |
RU2332464C1 (en) | Method of plague and pseudotuberculosis microbe differentiation with parallel interspecies differentiation of plague microbe strains | |
US9234248B2 (en) | Simultaneous quantitative multiple primer detection of Clostridium difficile | |
RU2556127C2 (en) | Method of differentiation of toxigenic genetically modified strains vibrio cholerae of biovar el tor with different epidemic potential by method of multiplex polymerase chain reaction and test system for its implementation | |
RU2736649C1 (en) | Method for genetic differentiation of yersinia pseudotuberculosis strains by molecular-genetic typing | |
Shivachandra et al. | Molecular diagnostic approaches for haemorrhagic septicaemia [HS]: A Review | |
RU2415947C1 (en) | SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE KIT FOR IDENTIFYING HUMAN MONOCYTIC EHRLICHIOSIS Ehrlichia spp AGENT DNA BY REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION | |
CN107937584B (en) | Meat salmonella molecular detection kit and non-diagnostic detection method thereof | |
RU2455364C2 (en) | Method of identifying mycobacteria by polymerase chain reaction | |
ES2839874T3 (en) | Method to detect the presence of a hypervirulent strain of Clostridium difficile | |
RU2671412C1 (en) | Method of differentiation of o1 vibrio cholerae strains of el tor biotype with various epidemiological significance by method of multiplex polymerase chain reaction | |
TWI558815B (en) | Method for detecting whether a strain of salmonella typhimurium is a highly invasive strain | |
AU2005203358A1 (en) | Clonal identification of bacteria | |
RU2738358C1 (en) | Set of oligonucleotide primers and fluorescent-labelled probes and method for detecting dna of agents of glanders and melioidosis by pcr method with product detection in real time | |
RU2163638C1 (en) | Method of detection of dna of tuberculosis mycobacterium complex with differential revealing mycobacterium tuberculosis dna and reagent set for its realization |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160924 |
|
NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20170704 |
|
PD4A | Correction of name of patent owner | ||
TK4A | Correction to the publication in the bulletin (patent) |
Free format text: CORRECTION TO CHAPTER -PD4A- IN JOURNAL 22-2018 FOR INID CODE(S) (73) |