RU2797189C1

RU2797189C1 - Способ выявления микротопографии нейронов в центральной нервной системе

Info

Publication number: RU2797189C1
Application number: RU2022111604A
Authority: RU
Inventors: Олег Юрьевич Хорев; Юрий Николаевич Майборода; Светлана Михайловна Безроднова; Оксана Олеговна Кравченко
Original assignee: Олег Юрьевич Хорев; Юрий Николаевич Майборода
Filing date: 2022-04-27
Publication date: 2023-05-31

Abstract

Изобретение относится к области медицины, в частности нейроморфологии, и может быть использовано для выявления микротопографии нейронов в центральной нервной системе у представителей различных видов млекопитающих. Способ включает: усыпление животного, последующую перфузию, фиксацию, получение исследуемых блоков мозга, приготовление срезов, помещение их в красящий раствор, промывание срезов, наслаивание кисточкой на предметное стекло, проведение их через спирты и бальзам. При этом отдельно готовят на дистиллированной воде растворы NaH₂PO₄×2H₂O - 58 мг в 2 л H₂O и NaOH - 12,6 г в 0,5 л H₂O; фосфатный буфер, состоящий из смеси растворов 660 мл NaH₂PO₄ и 340 мл NaOH, при рН=7,2. Затем приготавливают перфузат, состоящий из 5 г NaCl, растворенного в 0,5 л H₂O. Добавляют в него 0,4 л полиглюкина и 2,0 г гепарина, причем температура раствора должна быть 37°С. Далее готовят раствор, состоящий из 0,5 мг пероксидазы хрена (ПХ), растворенной в 4 мл 2% диметилсульфоксида (ДМСО), 0,1 мл которого, с помощью стереотаксического столика, гидравлически, стеклянным градуированным электродом с диаметром кончика 4-6 мкм. Медленно вводят перфузатором в исследуемый объект мозга, который далее хранят в термостате при температуре 18-20°С и через 24-48 часов, в зависимости от объекта исследования. После инъекции ПХ и ДМСО, производят перфузию объекта мозга смесями растворов: 1% параформальдегида и 2,5% глютарадегида на фосфатном буфере при рН 7,2. Фиксируют его в этой смеси в течение 4 часов и готовят замороженные срезы толщиной 40 мкм, помещают их на 40-50 минут в 30% раствор сахарозы на фосфатном буфере, предварительно разбавленный 1:1 дистиллированной водой. Затем осуществляют далее обработку срезов по методике М.М. Mesulam. Изобретение обеспечивает повышение чувствительности анализируемых корково-корковых и корково-подкорковых связей мозга, локализации нейронов на уровне световой микроскопии.

Description

Изобретение относится к области медицины, в частности нейроморфологии, может использовано для выявления связей и локализации нейронов в нервной системе у представителей различных видов млекопитающих.

Известна методика выявления топографии нейронов, их связей в периферической и центральной нервной системе, основанная на ретроградном аксональном транспорте экзогенной пероксидазы хрена (ПХ), в базовой основе которой использована классическая методика «Fixation variebles in horseradish peroxidase neurohistochemistry» [M.M. Mesulam, J. Histochem Cytjchem, 1978. - v. 24. - p. 1273-1280]. Суть методики заключается в следующем:

1. Животное усыпляют этаминалом натрия с последующей перфузией и фиксацией.

2. Мозг животного режут на блоки, фиксируют в фиксаторе и помещают в холодильник на 4 часа.

3. Затем отмывают блоки в 30% растворе сахарозы на фосфатном буфере в течение 1-3 суток, со сменой раствора 3 раза, с хранением в холодильнике.

4. Далее готовят срезы толщиной 30-40 мкм на замораживающем микротоме и помещают в ванночки с 30% сахарозой на фосфатном буфере на 30-40 минут в холодильник.

5. Срезы промывают через ряд ванночек с дистиллированной водой и помещают на 20 минут в красящийся раствор, состоящий из двух растворов. Растворы готовят ex tempore: первый раствор - на основе 5 мг тетраметилбензидина в 2 мл абсолютного спирта, а второй раствор - на основе 70 мг нитрапруссида натрия в 5 мл ацетатного буфера. Эти два раствора перед окраской смешивают.

6. Затем к полученному раствору добавляют 1 мл 1% раствора Н₂О₂ на 3-5 минут, до получения срезами голубоватого оттенка.

7. Срезы промывают через ряд ванночек с ацетатным буфером и кисточкой наслаивают на предметное стекло. Далее предметные стекла подкрашивают нейтральным красным, проводят через спирты и бальзам.

Однако данным исследованием полностью не выявляются гранулы нейронов в центральной нервной системе, т.к. гранулы окрашиваются не полностью.

Поставлена задача повышения чувствительности анализируемых корково-корковых и корково-подкорковых связей мозга, локализации нейронов на уровне световой микроскопии.

Поставленная задача достигается медленным равномерным введением перфузатором раствора, состоящего из пероксидазы хрена и диметилсульфоксида, стеклянным градуированным микроэлектродом с диаметром кончика 4-6 мкм в исследуемый объект, хранением его в термостате при температуре 18-20°С в течение 24-48 часов, дальнейшей перфузией смеси растворов параформальдегида и глютарадегида на фосфатном буфере, фиксацией исследуемого объекта в этой же смеси, приготовления замороженных срезов и помещения их в раствор сахарозы на фосфатном буфере, предварительно разбавленном дистиллированной водой.

Способ осуществляют следующим образом.

1. Отдельно готовят растворы:

NaH₂PO₄x2H₂O - 58 мг в 2 л H₂O

NaOH - 12,6 г в 0,5 л H₂O

2. Готовят фосфатный буфер, состоящий из смеси растворов: 660 мл NaH₂PO₄+340 мл NaOH при рН=7,2.

3. Приготавливают перфузат:

NaCl - 5 г растворяют в 0,5 л H₂O, добавляют 0,4 л полиглюкина и 2,0 г гепарина. Температура раствора должна быть 37°С. Все растворы готовят на дистиллированной воде.

4. Далее готовят раствор: 0,5 мг пероксидазы хрена (ПХ) растворяют в 4 мл 2% раствора диметилсульфоксида (ДМСО). С помощью стереотаксического столика гидравлически вводят в объект 0,1 мл приготовленного раствора стеклянным градуированным микроэлектродом диаметром кончика 4-6 мкм.

Перфузатором осуществляют медленное и равномерное введение раствора ПХ+ДМСО в мозг исследуемого объекта, что способствует оптимальному пиноцитозу пероксидазы аксонными терминалями.

Далее исследуемый объект хранят в термостате при температуре 18-20°С.

Через 24-48 часов, в зависимости от объекта исследования, после инъекции ПХ+ДМСО, производят перфузию мозга объекта смесями растворов 1% параформальдегида и 2,5% глютарадегида на фосфатном буфере при рН 7,2.

Затем исследуемый мозг объекта, после перфузии, фиксируют в этой же смеси в течении 4 часов и готовят замороженные срезы толщиной 40 мкм с последующим помещением их в 30% раствор сахарозы на фосфатном буфере на 40-50 минут, который предварительно разбавляют дистиллированной водой 1:1.

Дальнейшую обработку срезов осуществляют согласно методике по M.M. Mesulam(1978):

- Срезы помещают в красящийся раствор на 20 минут. Красящий раствор, состоит из двух растворов, которые готовят ex tempore.

Первый - на основе 5 мг тетраметилбензидина в 2 мл абсолютного спирта, второй - 70 мг нитрапруссида натрия добавляют в 5 мл ацетатного буфера. Перед окраской исследуемых срезов эти растворы смешивают. Затем в красящий раствор, с находящимися в нем срезами, добавляют 1 мл 1% раствора Н₂О₂ на 3-5 минут, до получения срезами коричневого оттенка. - Далее срезы проводят через 5 ванночек с ацетатным буфером.

- Кисточкой срезы наслаивают на предметное стекло, подкрашивают (на ночь) нейтральным красным и проводят через спирты и бальзам.

Благодаря применению 2% ДМСО выявляют - гранулы фермента интенсивно коричневой окраски в нейронах, что обусловлено увеличением числа сульфгидрильных (SH) групп. ДМСО увеличивает проницаемость клеточной мембраны. Добавление его в раствор фиксатора уменьшает экспозицию объектов исследования. Это имеет немаловажное значение для сохранения активности пероксидазы хрена, поскольку длительное воздействие фиксатора резко ингибирует его. ДМСО увеличивает проницаемость мембранных структур до фиксации, в момент фиксации и после фиксации. Нельзя не учитывать и другой момент. Сродство к ДМСО нервных структур можно трактовать исходя из химической конструкции их молекул, в состав которых входят SH-группы. Молекулы ДМСО вступают во взаимодействие с реагентоспособными группами биологических субстратов, входящих в состав нервной ткани. Благодаря ДМСО, концентрация пероксидазы хрена в аксонах мультиполярных нейронов становится более высокой, что способствует усилению проницаемости клеточной мембраны и тем самым облегчает захват синаптическими бутонами. Существующие методики перерезки на различных уровнях аксонов приводят к тому, что неизбежно рассекаются и находящиеся в этих образованиях транзиторные волокна, что усложняет трактовку результатов исследования нервных путей и их связей.

Предлагаемый способ выявления микротопографии нейронов в центральной нервной системе, позволяет одновременно изучать морфологию и микротопографию самих релейных нейронов, их дендритные и аксонные ветвления в органах и тканях, а глубокое окрашивание нейронов, и их аксонов, является более чувствительным для изучения корково-корковых и корково-подкорковых связей мозга на уровне световой микроскопии.

Способ выявления микротопографии нейронов в центральной нервной системе эффективен при исследованиях в области нейроморфологии, патологической анатомии и гистологии, может быть использован в лабораториях медицинских учреждений.

Claims

Способ выявления микротопографии нейронов в центральной нервной системе, включающий усыпление животного, последующую перфузию, фиксацию, получение исследуемых блоков мозга, приготовление срезов, помещение их в красящий раствор, промывание срезов, наслаивание кисточкой на предметное стекло, проведение их через спирты и бальзам, отличающийся тем, что отдельно готовят на дистиллированной воде растворы NaH₂PO₄×2H₂O - 58 мг в 2 л H₂O и NaOH - 12,6 г в 0,5 л H₂O, фосфатный буфер, состоящий из смеси растворов 660 мл NaH₂PO₄ и 340 мл NaOH, при рН=7,2, затем приготавливают перфузат, состоящий из 5 г NaCl, растворенного в 0,5 л H₂O, добавляют в него 0,4 л полиглюкина и 2,0 г гепарина, причем температура раствора должна быть 37°С, далее готовят раствор, состоящий из 0,5 мг пероксидазы хрена (ПХ), растворенной в 4 мл 2% диметилсульфоксида (ДМСО), 0,1 мл которого, с помощью стереотаксического столика, гидравлически, стеклянным градуированным электродом с диаметром кончика 4-6 мкм, медленно вводят перфузатором в исследуемый объект мозга, который далее хранят в термостате при температуре 18-20°С и через 24-48 часов, в зависимости от объекта исследования, после инъекции ПХ и ДМСО, производят перфузию объекта мозга смесями растворов: 1% параформальдегида и 2,5% глютарадегида на фосфатном буфере при рН 7,2, фиксируют его в этой смеси в течение 4 часов и готовят замороженные срезы толщиной 40 мкм, помещают их на 40-50 минут в 30% раствор сахарозы на фосфатном буфере, предварительно разбавленный 1:1 дистиллированной водой, и осуществляют далее обработку срезов по методике М.М. Mesulam (1978).